Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn Streptomyces toxytricini VN08 A12 kháng bệnh bạc lá lúa do Xanthomonas oryzae

Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn Streptomyces toxytricini VN08 A12 kháng bệnh bạc lá lúa do Xanthomonas oryzae Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn Streptomyces toxytricini VN08 A12 kháng bệnh bạc lá lúa do Xanthomonas oryzae luận văn tốt nghiệp thạc sĩ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ VÂN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CHỦNG XẠ KHUẨN Streptomyces toxytricini (VN08 - A12) KHÁNG BỆNH BẠC LÁ LÚA DO Xanthomonas oryzae LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ VÂN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CHỦNG XẠ KHUẨN Streptomyces toxytricini (VN08 - A12) KHÁNG BỆNH BẠC LÁ LÚA DO Xanthomonas oryzae Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Dương Văn Hợp TS Phạm Thế Hải Hà Nội - 2014 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS TS Dương Văn Hợp TS Phạm Thế Hải, người thầy trực tiếp hướng dẫn em tận tình trình thực đề tài, giúp em vượt qua khó khăn hồn thành tốt luận văn Em xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo Khoa Sinh học, trường Đại Học Khoa học Tự nhiên nhiệt tình giảng dạy, hướng dẫn cung cấp cho em kiến thức bổ ích suốt hai năm học vừa qua giúp đỡ em nhiều việc nắm bắt kiến thức động viên em lớn mặt tinh thần Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Kim Nữ Thảo Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội tận tình giúp đỡ, bảo, động viên tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt luận văn Em xin chân thành cảm ơn TS Phan Thị Phương Hoa (chủ nhiệm đề tài Nafosted số 106.03 - 2010.34 “Sàng lọc chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn dùng cho đấu tranh sinh học diệt vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae gây bệnh bạc lúa Việt Nam”) thành viên tham gia đề tài hỗ trợ cho em kỹ thuật chun mơn để em hồn thành luận văn Em xin gửi lời cảm ơn Ban lãnh đạo anh chị Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học chia sẻ, giúp đỡ tạo điều kiện lớn suốt trình em thực luận văn Em xin cảm ơn TS Kyung Sook Bae, TS Song Gun Kim cử nhân Hyangmi Kim Bảo tàng giống chuẩn (KCTC), Viện Khoa học Công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em thời gian học tập ngắn hạn Hàn Quốc để em hoàn thành luận văn Em xin cảm ơn TS Hiroshi Kinoshita trường Đại học Osaka Nhật Bản hỗ trợ giúp đỡ em trình nghiên cứu để em hoàn thành luận văn i Xin cảm ơn sinh viên Vũ Thị Kim Chi hỗ trợ em số cơng việc thí nghiệm q trình nghiên cứu để em hoàn thành luận văn Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình thân yêu bạn bè bên, động viên, giúp đỡ em suốt thời gian học tập thực luận văn Hà Nội, ngày tháng 10 năm 2014 Học viên Nguyễn Thị Vân ii MỤC LỤC MỞ ĐẦU MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CHƢƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Bệnh bạc lúa tác hại bệnh bạc lúa 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Tác nhân gây bệnh bạc lúa 1.2 Các cách phòng trừ bệnh bạc lúa 1.2.1 Sử dụng thuốc hóa học 1.2.2 Chọn giống lúa kháng bệnh 1.2.3 Khống chế sinh học 11 1.3 Xạ khuẩn 12 1.3.1 Giới thiệu chung xạ khuẩn 12 1.3.2 Khả sinh chất kháng sinh xạ khuẩn 14 1.3.3 Sử dụng xạ khuẩn khống chế sinh học .16 1.4 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn kiểm soát bệnh bạc lúa 17 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Nguyên liệu hóa chất 19 2.1.1 Nguyên liệu 19 2.1.1.1 Các chủng Xoo 19 iii 2.1.1.2 Các chủng xạ khuẩn 20 2.1.1.3 Vi sinh vật kiểm định 20 2.1.2 Hóa chất, dụng cụ thiết bị .20 2.1.2.1 Hóa chất 20 2.1.2.2 Dụng cụ thiết bị 21 2.1.2.3 Môi trƣờng nghiên cứu 21 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Phƣơng pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật 22 2.2.1.1 Phƣơng pháp thỏi thạch 22 2.2.1.2 Phƣơng pháp đục lỗ thạch 23 2.2.2 Phân loại đặc điểm hình thái .23 2.2.2.1 Hình thái khuẩn lạc 23 2.2.2.2 Hình thái chuỗi sinh bào tử bề mặt bào tử 23 2.2.3 Hóa phân loại .24 2.2.3.1 Phân tích thành phần axit amin thành tế bào 24 2.2.3.2 Phân tích thành phần menaquinone 24 2.2.3.3 Phân tích thành phần axit béo 25 2.2.3.4 Phân tích thành phần G+C ADN 25 2.2.4 Phân loại sinh học phân tử giải trình tự 16S - rADN 25 2.2.5 Tối ƣu hóa điều kiện nuôi cấy xạ khuẩn 27 2.2.5.1 Lựa chọn mơi trƣờng ni cấy thích hợp 27 2.2.5.2 Lựa chọn thời gian ni cấy thích hợp 27 2.2.5.3 Lựa chọn thể tích ni cấy thích hợp 28 2.2.5.4 Lựa chọn nhiệt độ nuôi cấy 28 iv 2.2.5.5 Lựa chọn cách cấy giống 28 2.2.6 Tinh hoạt chất kháng Xoo 28 2.2.6.1 Tách dịch chiết thô 28 2.2.6.2 Tinh silica gel 28 2.2.6.3 Tinh HPLC 29 2.2.7 Xác định khối lƣợng phân tử khối phổ (MS) 29 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Khả kháng vi sinh vật chủng xạ khuẩn VN08 - A12 31 3.2 Phân loại chủng VN08 - A12 32 3.2.1 Phân loại hình thái 32 3.2.2 Hóa phân loại 33 3.2.2.1 Thành phần axit amin thành tế bào 33 3.2.2.2 Thành phần menaquinone 34 3.2.2.3.Thành phần axit béo 35 3.2.2.4 Thành phần G + C ADN 37 3.2.3 Trình tự 16S rADN 38 3.3 Tối ƣu hóa điều kiện nuôi cấy chủng VN08 - A12 39 3.3.1 Mơi trƣờng ni cấy thích hợp 39 3.3.2 Thời gian ni cấy thích hợp .40 3.3.3 Thể tích ni cấy thích hợp .41 3.3.4 Nhiệt độ ni cấy thích hợp 41 3.3.5 Cách cấy giống thích hợp 42 3.4 Tinh phân tích hoạt chất kháng Xoo chủng VN08 - A12 43 3.4.1 Tinh hoạt chất kháng Xoo chủng VN08 - A12 43 v 3.4.2 Phân tích trọng lƣợng phân tử 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 4.1 Kết luận 51 4.2 Kiến nghị 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC - - vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Đặc điểm nguồn gốc gen Xa kháng bệnh bạc lúa [37] Bảng Trình tự đoạn mồi đặc hiệu để phát gen Xa lúa [15] Bảng Danh sách 10 chủng Xoo phân lập đƣợc miền Bắc Việt Nam đƣợc sử dụng nghiên cứu 19 Bảng Chƣơng trình phân tích HPLC 29 Bảng Hoạt tính kháng 10 chủng Xoo chủng xạ khuẩn VN08 - A12 31 Bảng Hoạt tính kháng vi sinh vật chủng xạ khuẩn VN08 - A12 31 Bảng Hoạt tính kháng vi sinh vật có lợi chủng xạ khuẩn VN08 - A12 32 Bảng : Kết phân tích thành phần menaquinone chủng VN08 - A12 35 Bảng Kết phân tích thành phần menaquinone chủng VN08 - A12 36 Bảng 10 Kết phân tích thành phần GC chủng VN08 - A12 38 Bảng 11 Hoạt chất VN08 - A12 thu đƣợc từ phân đoạn tinh silica gel 44 Bảng 12 Hoạt chất VN08 - A12 thu đƣợc từ HPLC từ phân đoạn 4.1 45 Bảng 13 Chƣơng trình chạy HPLC phân tích thành phần axit amin - Bảng 14 Phân tích thành phần menaquinone chuẩn - Bảng 15 Phân tích thành phần axit béo chuẩn - Bảng 16 Trình tự mồi dùng cho phản ứng đọc trình tự ADNr 16S - - vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Lúa bị nhiễm bệnh bạc vi khuẩn Xoo Hình Khuẩn lạc tế bào vi khuẩn Xoo [9] Hình Tổn thƣơng giống lúa IRBB21 chứa gen Xa21 bệnh bạc lúa Ấn Độ [19] 10 Hình Khuẩn lạc số chủng xạ khuẩn 14 Hình Cuống sinh bào tử số chủng xạ khuẩn 14 Hình Bản đồ phân bố 10 chủng Xoo miền Bắc Việt Nam đƣợc sử dụng nghiên cứu 20 Hình Khuẩn lạc chuỗi bào tử chủng VN08 - A12 33 Hình Chuỗi bào tử bào tử chủng VN08 - A12 33 Hình Kết chạy sắc ký mỏng thành phần axit amin thành tế bào chủng VN08 - A12 34 Hình 10 Kết phân tích LC thành phần menaquinone chủng VN08 - A12 35 Hình 11 Sắc ký đồ thành phần axit béo chủng VN08 - A12 36 Hình 12 Sắc ký đồ thành phần GC chủng VN08 - A12 37 Hình 13 Cây phân loại chủng VN08 - A12 dựa trình tự gen 16S – rADN 39 Hình 14 Ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi cấy khác đến sản sinh hợp chất kháng sinh ức chế vi khuẩn Xoo chủng VN08 - A12 40 Hình 15 Ảnh hƣởng thời gian cấy khác đến sản sinh hợp chất kháng sinh ức chế vi khuẩn Xoo chủng VN08 - A12 40 Hình 16 Ảnh hƣởng thể tích mơi trƣờng ni cấy khác đến sản sinh hợp chất kháng sinh ức chế vi khuẩn Xoo chủng VN08 - A12 (S toxytricini) 41 Hình 17 Ảnh hƣởng nhiệt độ mơi trƣờng nuôi cấy khác đến sản sinh hợpOVA following by Tukey s test for each column and each row; groups sharing at least one common letter were not significantly differentp>0.05 ; groups sharing no common letter were significantly differentp