Nghiên cứu xây dựng bộ dữ liệu phân tích định tính, định lượng hoạt chất trong dược liệu hà thủ ô đỏ fallopia multiflora (thunberg) haraldson bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao TT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGUYỄN THỊ THOA NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG BỘ DỮ LIỆU PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG HOẠT CHẤT TRONG DƯỢC LIỆU HÀ THỦ Ô ĐỎ FALLOPIA MULTIFLORA (THUNBERG) HARALDSON BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Chun ngành: Hóa hữu Mã số: 9.44.01.14 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội - 2021 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS Nguyễn Tiến Đạt Người hướng dẫn khoa học 2: TS Nguyễn Hải Đăng Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 2021 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Ngày nay, việc sử dụng dược phẩm có nguồn gốc thiên nhiên có xu hướng tăng mạnh, cần có biện pháp quản lý chất lượng dược liệu từ khâu nguyên liệu đến sản phẩm Chất lượng dược liệu phần lớn phụ thuộc vào thành phần hoạt chất, chất hoá học có hoạt tính sinh học đóng góp vào tác dụng dược lý dược liệu Có nhiều nguyên nhân ảnh hưởng đến thành phần hoạt chất dược liệu bao gồm nguồn gốc nguyên liệu không đảm bảo; địa hình địa lí trồng trọt, thu hoạch bảo quản dược liệu Cũng q trình chế biến dược liệu không kỹ thuật dẫn đến hoạt chất biến đổi hoạt chất, từ hoạt chất có lợi thành chất gây hại cho người Ngồi ra, hố chất độc hại sử dụng bảo quản dược liệu Thậm chí, số dược liệu có thành phần hoạt chất thấp dược liệu giả mạo bán thị trường với danh nghĩa dược liệu quý Do dược liệu nói chung cần kiểm tra chất lượng sản phẩm đặc biệt hàm lượng hoạt chất có thành phần dược liệu nhằm đảm bảo quyền lợi người tiêu dùng, bảo vệ sức khỏe người Hà thủ ô đỏ loại dược liệu phổ biến sử dụng chế biến thuốc đông dược Dược liệu sử dụng sản phẩm đông dược dùng làm thuốc bổ, nhuận tràng, trị thần kinh suy nhược, bệnh thần kinh, bổ máu, làm đen râu tóc Ở Việt Nam, hà thủ đỏ coi vị thuốc quý an tồn quan niệm dân gian có nguồn gốc tự nhiên Ngày nay, hà thủ ô đỏ chế nhiều dạng khác như: dược liệu miếng hà thủ ô chế, bột hà thủ ô, trà hà thủ ô, viên thuốc hà thủ ô đỏ Các sản phẩm bày bán hiệu thuốc tây y, hiệu thuốc đơng y mua cách dễ dàng Điều khẳng định dược liệu hà thủ ô đỏ đỏ coi sản phẩm an toàn Tuy nhiên, sản phẩm, hàm lượng hoạt chất dược liệu công bố không chi tiết khơng có cảnh báo dùng Do dẫn đến hàm lượng hoạt chất khơng đủ để cải thiện trình trạng bệnh, tác dụng tích cực khơng đáng kể Trên giới có nhiều nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính, quy trình phân tích định tính định lượng hoạt chất hà thủ ô đỏ Tuy nhiên, Việt Nam nghiên cứu khoa học hà thủ đỏ cịn khiêm tốn Một số nghiên cứu tiến hành thiết bị sắc ký lỏng hiệu cao, song kết nghiên cứu dừng lại phân tích định tính định lượng số hoạt chất hà thủ ô đỏ Để đánh giá chất lượng hà thủ ô đỏ, cần thiết phải xác định thành phần hóa học thực q trình phân tích định lượng nhiều hoạt chất loại dược liệu Tuy nhiên, Việt Nam đến chưa có nhiều cơng trình cơng bố quy trình định lượng đồng thời nhiều hợp chất dược liệu sản phẩm từ dược liệu hà thủ ô đỏ Dược điển Việt Nam V chưa đưa quy trình định lượng đồng thời nhiều hoạt chất hà thủ ô đỏ Sự hạn chế phần thiếu chất làm thị phân tích số nước khác có ngân hàng chất sạch, cung cấp phục vụ rộng rãi cho nghiên cứu Mặt khác, gần có số báo cáo khoa học cơng bố số tác dụng phụ có liên quan đến hà thủ ô đỏ Các công bố chủ yếu đưa cảnh báo tác dụng phụ sử dụng chế phẩm hà thủ ô đỏ thời gian dài Tuy chế gây độc chưa làm sáng tỏ cảnh báo liều dùng không phù hợp gây lên tác động xấu đến sức khỏe người tiêu dùng Vì vậy, nhằm sử dụng dược liệu cách an toàn hiệu cần tăng cường quản lý chất lượng thông qua đánh giá hàm lượng hoạt chất dược liệu hà thủ đỏ Để góp phần đánh giá chất lượng dược liệu hà thủ ô đỏ thị trường Việt Nam, trước tiên phải xác định rõ thành phần hoá học chúng, phân lập xác định cấu trúc hoạt chất Từ thiết lập điều kiện phân tích sắc ký lỏng hiệu cao nhằm phân tích định tính định lượng hoạt chất mẫu dược liệu hà thủ ô đỏ Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, lựa chọn đề tài “Nghiên cứu xây dựng liệu phân tích định tính, định lượng hoạt chất dược liệu hà thủ ô đỏ Fallopia multiflora (Thunberg) Haraldson sắc ký lỏng hiệu cao” Mục tiêu nghiên cứu luận án Nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học chủ yếu rễ củ hà thủ ô đỏ Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích định tính, định lượng đồng thời số hoạt chất phân lập Ứng dụng quy trình phân tích thiết lập đánh giá hàm lượng hoạt chất số mẫu dược liệu hà thủ ô đỏ Các kết nghiên cứu đạt làm sở khoa học cho nghiên cứu Các nội dung nghiên cứu luận án Nghiên cứu phân lập xác định cấu trúc hợp chất từ rễ củ hà thủ ô đỏ thu hái Hà Giang, Việt Nam Thiết lập số điều kiện phân tích sắc ký HPLC thiết bị HPLC-DAD-MS từ chất phân lập Lập đường chuẩn định lượng thẩm định quy trình phân tích thiết lập theo tiêu chuẩn hiệp hội nhà hóa học phân tích thức AOAC Ứng dụng quy trình phân tích thiết lập phân tích định tính, định lượng đồng thời số hoạt chất số mẫu dược liệu hà thủ ô đỏ lưu hành thị trường Việt Nam, so sánh đưa kết luận CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chi Fallopia 1.2 Giới thiệu chung hà thủ ô đỏ 1.3 Tình hình nghiên cứu hà thủ đỏ giới 1.3.1 Các nghiên cứu thành phần hóa học 1.3.2 Các nghiên cứu hoạt tính sinh học 1.3.3 Các nghiên cứu khả gây độc gan hà thủ ô đỏ 1.3.4 Các nghiên cứu phân tích định tính, định lượng hoạt chất hà thủ đỏ 1.4 Tình hình nghiên cứu hà thủ ô đỏ Việt Nam 1.5 Tổng quan thẩm định phương pháp phân tích CHƯƠNG THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1 Đối tượng nghiên cứu Mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ thu hái huyện Phó Bảng, tỉnh Hà Giang vào tháng 10 năm 2014 Kích cỡ củ tươi khoảng 2-5 x 15-20 cm, khoảng 3÷4 năm tuổi Tên khoa học xác định TS Nguyễn Thế Cường, Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Mẫu tiêu lưu trữ Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ thu hái tự nhiên thu mua từ thị trường dược liệu mã hóa Mẫu HG mẫu sử dụng để tiến hành phân lập xác định cấu trúc thành phần hóa học hợp chất hà thủ đỏ Đồng thời chất phân lập từ mẫu HG sử dụng làm chất chuẩn sử dụng trình định lượng Mẫu TT6 sử dụng nghiên cứu xác định độ thu hồi phương pháp định lượng Các mẫu lại sử dụng nhằm định lượng hoạt chất mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ từ nhiều nguồn khác thị trường Việt Nam 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp phân lập hợp chất Sắc ký lớp mỏng (TLC): sắc ký lớp mỏng thực mỏng tráng sẵn TLC Silica gel 60 F254 (Merck 1,05715), RP-18 F254S (Merck) Vị trí chất mỏng phát đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nm 365 nm dùng thuốc thử dung dịch H2SO4 10% phun lên mỏng, sấy khơ hơ nóng từ từ đến màu Sắc ký cột (CC): Sắc ký cột tiến hành với pha tĩnh silica gel pha thường pha đảo, sephadex LH-20 nhựa trao đổi diaion HP-20 (Sigma) Bột sắc ký silica gel pha thường có cỡ hạt 0,040-0,063 mm (Merck) Bột sắc ký silica gel pha đảo RP-C18 có cỡ hạt 12 nm 2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập kết hợp thông số vật lý với phương pháp phổ đại, bao gồm: Phương pháp phổ khối lượng (MS): Phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS) đo hệ máy Agilent 1260 series LC-MS single quadrupole 6120 Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Phương pháp phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS): phổ khối phân giải cao đo máy Mass Spectrometter LTQ Orbitrap XL khoa Hóa học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR: phổ cộng hưởng từ hạt nhân đo máy Bruker AM500 FT-NMR Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Chất nội chuẩn TMS (tetramethyl silan) Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân sử dụng xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập bao gồm: + Phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều: 1H-NMR, 13C-NMR DEPT + Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMBC, 1H-1H COSY NOESY Điểm nóng chảy (Mp): đo máy Kofler micro-hotstage Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Độ quay cực riêng [α]D: đo máy JASCO P-2000 Polarimeter Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam 2.2.3 Phương pháp xử lí mẫu Mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ sau thu hái thu mua thái lát mỏng, phơi khô bóng râm nghiền nhỏ Mẫu phân tích định tính, định lượng chiết siêu âm với dung môi methanol, chiết lặp lại lần nhằm chiết tách tối ưu hoạt chất mẫu Lọc dịch chiết qua giấy lọc chuyển vào bình định mức định mức đến vạch 2.2.4 Phương pháp phân tích định tính, định lượng hợp chất Hàm lượng hợp chất xác định phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) thực thiết bị HPLC-DAD-MS Agilent Technologies 1260 Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Chất chuẩn sử dụng thiết lập đường chuẩn chất phân lập từ mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ Hà Giang Chất sau phân lập chạy kiểm tra độ tinh khiết để đảm bảo độ cho thiết bị HPLC 6 2.3 Phân lập hợp chất Q trình tiến hành thực nghiệm mơ tả theo hình 2.2, 2.3 2.4: Củ hà thủ ô khô (FM) (3,5 kg) Ngâm chiết methanol (10 Lít x lần) Cặn chiết methanol (430,0 g) Hòa với lít nước, chiết với lít n-hexane (3 lần), cất loại dung môi Cặn n-hexane (FMH, 51,7 g) Lớp nước Chiết với lít ethyl acetate (3 lần), cất loại dung môi Cặn ethyl acetate (FME, 214,5 g) Dịch nước (FMW) CC, diaion HP-20, M/W (gradient) M/W-0/100 M/W-25/75 M/W-100/0 FMWA FMWB (28,8 g) FMWC (62,9 g) CC: Column chromatography M: methanol W: nước Hình 2.2 Sơ đồ chiết phân đoạn mẫu củ hà thủ ô đỏ FMWC (62,9 g) CC, silica gel Gradient, 100%D → 100%M FMWC2 (189,8 mg) CC, silica gel H/E-5/1 FM1 (90,4 mg) FMWC6 (5,0 g) FMWC5 (1,1 g) CC,YMC-RP18 A/W-1/1,5 FMWC4 (1,2 g) CC, silica gel D/M-6/1 FMW5.1 CC, silica gel D/M-7/1 FMW4.2.1 A: acetone D: dichloromethane E: ethyl acetate H: hexane M: methanol W: nước CC: column chromatography CC, LH-20 M/W-1/1,2 FM2 (370 mg) FMW7.1 CC,YMC-RP18 A/W-1/2 FMW4.2 CC,YMC-RP18 A/W-1/1,5 CC, silica gel D/M-6/1 FMW6.2 CC, LH-20 M/W-1/1 FMW4.1 (1,4 mg) FMWC7 (8,0 g) CC,YMC-RP18 A/W-1/3 FM3 (8 mg) FM4 (4,5 mg) FMW6.2.A CC, LH-20 M/W-1/1 CC, LH-20 M/W-1/1,2 FM5 (12,8 mg) FMW7.1.A FM6 (5,4 mg) FMW7.1.A.1 CC, silica gel D/M/W-5/1/0,01 FM7 (6,0 mg) Hình 2.3 Sơ đồ phân lập hợp chất từ phân đoạn FMWC mẫu củ hà thủ ô đỏ FMW7.1.B CC, silica gel D/M-6/1 FM8 (6,8 mg) FME (214,5 g) CC, silica gel Gradient, 100%H → 100%A FME1 FME2÷FME7 FME8 CC, silica gel H/A-4/1 FME8A FME8B CC, silica gel D/M-16/1 CC, silica gel D/M-16/1 FME8B1 FM9 (3,4 mg) CC: Column chromatography A: acetone D: dichloromethane H: hexane M: methanol W: nước CC, LH-20 M/W-1/1 FM10 (28,1 mg) FME8B1A CC, silica gel H/A-1/1 FM11 (90,8 mg) Hình 2.4 Sơ đồ phân lập chất từ cặn ethyl acetate mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ Như vậy, tiến hành phân lập mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ Hà Giang thu tổng số 11 hợp chất Các hợp chất kí hiệu từ FM1 đến FM11 2.4 Hằng số vật lí kiện phổ hợp chất 2.4.1 Hợp chất FM3: 6-methoxy-3-methyl-1,8-đihydroxy-2-naphthoic acid 8-O-β-D- glucopyranoside (chất mới) o Chất dạng bột màu vàng nhạt Độ quay cực riêng [a]24 𝐷 = +23,4 (c = 0,05, CH3OH) HR-ESI-MS m/z 433,1110 [M+Na]+ Tính tốn lí thuyết cho công thức C19H22NaO10, 433,1111 Công thức phân tử: C19H22O10 1H-NMR (500 MHz, CD3OD), H (ppm): 2,30 (3H, s, 3-CH3), 3,45 (1H, m, H-4′), 3,56 (1H, m, H-5′), 3,54 (1H, m, H-3′), 3,58 (1H, m, H-2′), 3,77 (1H, dd, J = 12,5, 5,5 Hz, Hb-6′), 3,88 (3H, s, OCH3), 3,96 (1H, dd, J = 12,5, 2,5 Hz, Ha-6′), 5,12 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′), 6,84 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-5), 7,03 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-7), 7,05 (1H, m, H-4) 13C-NMR (125 MHz, CD3OD), C (ppm): 153,8 (C-1), 123,9 (C-2), 135,5 (C-3), 120,3 (C-4), 102,5 (C-5), 160,4 (C-6), 104,4 (C-7), 157,2 (C-8), 110,3 (C-9), 139,1 (C10), 171,0 (C-11), 55,9 (6-OCH3), 20,2 (3-CH3), 104,1 (C-1′), 74,9 (C-2′), 78,1 (C-3′), 71,3 (C-4′), 78,8 (C5′), 62,4 (C-6′) 2.4.2 Hợp chất FM4: 6-hydroxymusizin 8-O-α-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside (chất mới) o Chất dạng bột màu vàng cam Độ quay cực riêng [a]24 𝐷 = +12,6 (c = 0,05, CH3OH) HR-ESI-MS m/z 549,1578 [M+Na]+, tính tốn lí thuyết cho cơng thức C24H30NaO13, 549,1584 Công thức phân tử: C24H30O13 1H-NMR (500 MHz, CD3OD), H (ppm): 2,28 (3H, s, 3-CH3), 2,60 (3H, s, CH3CO), 3,36 (2H, m, H-5″), 3,45 (1H, m, H-4′), 3,51 (1H, t, J = 8,5 Hz, H-3′), 3,57 (1H, m, H-2′), 3,68 (1H, m, H-5′), 3,70 (1H, m, Hb-6′), 3,80 (1H, d, J = 9,5 Hz, Hb-4″), 4,01 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-2″), 4,04 (1H, d, J = 9,5 Hz, Ha4″), 4,12 (1H, d, J = 9,5 Hz, Ha-6′), 5,05 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-1″), 5,07 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′), 6,72 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-5), 6,91 (1H, s, H-4), 7,00 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-7) 13C-NMR (125 MHz, CD3OD), C (ppm): 154,0 (C-1), 123,2 (C-2), 135,2 (C-3), 119,6 (C-4), 105,5 (C-5), 158,1 (C-6), 104,9 (C-7), 157,4 (C-8), 109,7 (C-9), 139,3 (C-10), 208,2 (CH3CO), 32,6 (CH3CO), 20,2 (3-CH3), 104,3 (C-1′), 74,9 (C-2′), 78,1 (C-3′), 71,5 (C-4′), 77,6 (C-5′), 68,6 (C-6′), 111,0 (C-1″), 78,1 (C-2″), 80,5 (C-3″), 75,1 (C-4″), 65,7 (C-5″) 2.4.3 Hợp chất FM1: Emodin (1,3,8-trihydroxy-6-methylanthraquinone) Chất dạng kết tinh hình kim màu vàng cam ESI-MS m/z 269,0 [M-H]- Cơng thức phân tử: C15H10O5 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), H (ppm): 2,36 (3H, s, 3-CH3), 6,52 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2), 7,04 (2H, br s, H-4, 7), 7,37 (1H, br s, H-5) 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), C (ppm): 161,2 (C-1), 123,7 (C-2), 147,9 (C-3), 120,1 (C-4), 107,6 (C-5), 165,3 (C-6), 108,5 (C-7), 164,2 (C-8), 189,3 (C-9), 180,9 (C10), 134,8 (C-11), 108,6 (C-12), 113,0 (C-13), 132,5 (C-14), 21,2 (3-CH3) 2.4.4 Hợp chất FM2: 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene 2-O-β-D-gluopyranoside Chất dạng bột vô định hình màu nâu ESI-MS m/z 429,0 [M+Na]+ Cơng thức phân tử: C20H22O9 H-NMR (500 MHz, CD3OD), H (ppm): 3,85-3,44 (6H, m, 6H phân tử đường), 4,53 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1″), 6,28 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-4), 6,79 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3′, 5′), 6,64 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), 7,47 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′, 6′), 6,95 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-β), 7,73 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-α) 13C-NMR (125 MHz, CD3OD), C (ppm): 121,6 (C-1), 137,8 (C-2), 151,9 (C-3), 103,5 (C-4), 155,8 (C-5), 108,1 (C6), 133,6 (C-α), 130,8 (C-β), 130,0 (C-1′), 129,1 (C-2′), 116,4 (C-3′), 158,2 (C-4′), 116,4 (C-5′), 129,1 (C6′), 102,7 (C-1″), 75,4 (C-2″), 77,8 (C-3″), 70,7 (C-4″), 78,1 (C-5″), 62,0 (C-6″) 2.4.5 Hợp chất FM5: Pleuropyrone A Chất dạng bột màu vàng cam ESI-MS m/z 419,1 [M+H]+ Công thức phân tử: C21H22O9 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), H (ppm): 2,14 (3H, s, 2-CH3), 2,73 (3H, s, 5-CH3), 3,26 (1H, m, H-4′), 3,35 (2H, m, H-3′, 5′), 3,50 (1H, m, H-2′), 3,54 (1H, m, Hb-6′), 3,72 (1H, d, J = 11,0 Hz, Ha-6′), 5,05 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1′), 6,18 (1H, s, H-2), 6,76 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-7), 6,79 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-9), 7,26 (1H, s, H-6) C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), C (ppm): 156,0 (C-1b), 164,0 (C-2), 111,7 (C-3), 178,6 (C-4), 116,8 (C- 13 4a), 134,7 (C-5), 124,5 (C-6), 138,1 (C-6a), 102,8 (C-7), 158,9 (C-8), 102,4 (C-9), 156,2 (C-10), 107,8 (C10a), 19,1 (2-CH3), 22,9 (5-CH3), 100,6 (C-1′), 73,6 (C-2′), 77,0 (C-3′), 69,4 (C-4′), 76,9 (C-5′), 60,5 (C6′) 2.4.6 Hợp chất FM6: Physcionin (Physcion 8-β-D-glucopyranoside) Chất dạng bột màu vàng ESI-MS m/z 469,1 [M+Na]+ Công thức phân tử C22H22O10 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), H (ppm): 2,41 (3H, s, 3-CH3), 3,17 (1H, m, H-4′), 3,35 (1H, m, H-3′), 3,46 (2H, m, H-2′, Hb-6′), 3,73 (1H, dd, J = 10,0, 5,5 Hz, Ha-6′), 3,95 (3H, s, 6-OCH3), 5,16 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′), 7,17 (2H, d, J = 2,0 Hz, H-2, 7), 7,35 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-5), 7,47 (1H, br s, H-4) 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), C (ppm): 161,6 (C-1), 124,2 (C-2), 147,1 (C-3), 119,3 (C-4), 106,5 (C-5), 164,7 (C-6), 107,3 (C-7), 160,6 (C-8), 186,4 (C-9), 181,8 (C-10), 136,3 (C-11), 114,4 (C-12), 114,4 (C-13), 132,0 (C-14), 21,4 (3-CH3), 56,0 (6-OCH3), 100,6 (C-1′), 73,2 (C-2′), 76,5 (C-3′), 69,8 (C-4′), 77,4 (C-5′), 60,7 (C-6′) 2.4.7 Hợp chất FM7: Benzyl gentiobioside Chất dạng bột màu trắng ESI-MS m/z 431,2 [M-H]- Công thức phân tử: C19H28O11 1H-NMR (500 MHz, CD3OD), H (ppm): 3,26 (2H, m, H-2′, 2″), 3,29 (1H, m, H-3′), 3,30 (2H, m, H-4″, 5″), 3,38 (1H, m, H-3″), 3,30 (1H, m, H-4′), 3,48 (1H, m, H-5′), 3,68 (1H, m, Hb-6″), 3,83 (1H, m, Hb-6′), 3,89 (1H, m, Ha6″), 4,19 (1H, dd, J = 11,5, 1,5 Hz, Ha-6′), 4,39 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1′), 4,44 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1″), 4,68 (1H, d, J = 12,0 Hz, Hb-7), 4,94 (1H, d, J = 12,0 Hz, Ha-7), 7,28 (1H, br d, H-4), 7,34 (2H, br d, H-3, 5), 7,44 (2H, br d, H-2, 6) 13C-NMR (125 MHz, CD3OD), C (ppm): 138,9 (C-1), 129,3 (C-2, 6), 129,2 (C- 3, 5), 128,7 (C-4), 72,0 (C-7), 103,3 (C-1′), 75,0 (C-2′, 2″), 77,9 (C-3′, 3″, 5″), 71,4 (C-4′), 77,0 (C-5′), 69,7 (C-6′), 104,8 (C-1″), 71,5 (C-4″), 62,6 (C-6″) 2.4.8 Hợp chất FM8: emodin-8-β-D-glucopyranoside Chất dạng bột màu vàng cam ESI-MS m/z 455,0 [M+Na]+ Công thức phân tử C21H20O10 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), H (ppm): 2,40 (3H, s, 3-CH3), 3,16 - 3,44 (4H, m, H đơn vị đường), 3,52 (1H, dd, J = 11,5, 5,0 Hz, Hb-6′), 3,73 (1H, dd, J = 5,0 Hz, Ha-6′), 5,04 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′), 7,00 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2), 7,14 (1H, br s, H-7), 7,27 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-5), 7,45 (1H, br s, H-4) 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), C (ppm): 161,6 (C-1), 124,1 (C-2), 146,7 (C-3), 119,1 (C-4), 108,4 (C-5), 164,1 (C-6), 100,8 (C-7), 161,1 (C-8), 186,3 (C-9), 182,1 (C-10), 136,4 (C-11), 113,0 (C-12), 114,4 (C-13), 132,0 (C14), 21,3 (3-CH3), 100,8 (C-1′), 73,2 (C-2′), 76,3 (C-3′), 69,4 (C-4′), 77,2 (C-5′), 60,5 (C-6′) 2.4.9 Hợp chất FM9: Resveratrol Chất dạng bột vơ định hình màu vàng cam ESI-MS m/z 229,1 [M+H]+ Công thức phân tử: C14H12O3 1H-NMR (500 MHz, CD3OD), H (ppm): 6,18 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-4), 6,47 (2H, d, J = 2,0 Hz, H-2, 6), 6,77 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-3′, 5′), 6,83 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-β), 6,99 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-α), 7,37 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′, 6′) 13C-NMR (125 MHz, CD3OD), C (ppm): 141,2 (C-1), 105,7 (C-2, 6), 159,6 (C-3, 5), 102,6 (C-4), 129,4 (C-α), 127,0 (C-β), 130,4 (C-1′), 128,7 (C-2′, 6′), 116,4 (C-3′, 5′), 158,3 (C-4′) 2.4.10 Hợp chất FM10: Torachrysone 8-O-β-D-glucopyranoside Chất dạng kết tinh hình kim màu vàng chanh ESI-MS m/z 431,1 [M+Na]+ Công thức phân tử: C20H24O9 1H-NMR (500 MHz, CD3OD), H (ppm): 2,29 (3H, s, 3-CH3), 2,59 (3H, s, CH3CO), 3,46 (1H, t, J = 9,0 Hz, H-4′), 3,52 (1H, m, H-5′), 3,56 (1H, m, H-2′), 3,58 (1H, m, H-3′), 3,77 (1H, dd, J = 1,0, 12,5 Hz, Hb-6′), 3,86 (3H, s, OCH3), 3,95 (1H, d, J = 1,0 Hz, Ha-6′), 5,10 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′), 6,81 (1H, br s, H-5), 7,00 (1H, s, H-4), 7,00 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-7), 13C-NMR (125 MHz, CD3OD), C (ppm): 153,6 (C-1), 123,9 (C-2), 135,4 (C-3), 120,3 (C-4), 102,4 (C-5), 160,3 (C-6), 104,3 (C-7), 157,1 (C-8), 110,2 (C9), 139,0 (C-10), 208,2 (CH3CO), 32,5 (CH3CO), 55,9 (6-OCH3), 20,2 (3-CH3), 104,2 (C-1′), 74,8 (C-2′), 78,0 (C-3′), 71,2 (C-4′), 78,7 (C-5′), 62,3 (C-6′) 2.4.11 Hợp chất FM11: (+)-Catechin Chất dạng tinh thể màu trắng ESI-MS m/z 289,1 [M-H]- Công thức phân tử: C15H14O6 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz), H (ppm): 4,60 (1H, d, J = 6,5 Hz, H-2), 4,00 (1H, m, H-3), 2,53 (1H, dd, J = 8,5, 16,5 Hz, Ha-4), 2,87 (1H, dd, J = 5,5, 16,0 Hz, Hb-4), 5,70 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), 5,96 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-8), 6,86 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2'), 6,79 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5'), 6,74 (1H, dd, J = 2,0, 8,5 Hz, H-6') 13CNMR (CD3OD, 125 MHz), C (ppm): 82,8 (C-2), 68,8 (C-3), 28,4 (C-4), 156,9 (C-5), 95,5 (C-6), 157,5 (C7), 96,3 (C-8), 157,8 (C-9), 100,8 (C-10), 132,2 (C-1'), 115,2 (C-2'), 146,2 (C-3'), 146,1 (C-4'), 116,1 (C5'), 120,0 (C-6') 2.5 Kết thiết lập điều kiện phân tích cho hệ thống HPLC Trong số 11 hợp chất phân lập từ mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ Hà Giang, chất đảm bảo độ cung cấp đủ lượng chất cho trình định lượng lựa chọn nhằm thiết lập quy trình định lượng thiết bị HPLC Kết lựa chọn chất bao gồm FM1, FM2, FM3, FM4, FM5, FM6 FM8 Các chất sử dụng chất tham chiếu cho trình định lượng Các điều kiện HPLC nghiên cứu bao gồm: thể tích bơm mẫu, cột sắc ký, bước sóng detector, pha động thành phần pha động, thời gian lưu độ tinh khiết chất phân tích khảo sát hệ thống LC/MS 10 Sau trình khảo sát thu kết sau: Kết bước sóng hấp thụ cực đại chất tham chiếu trình bày bảng 2.2: Bảng 2.2 Bước sóng hấp thụ cực đại chất tham chiếu Kí hiệu chất FM1 FM2 FM3 FM4 FM5 FM6 FM8 Bước sóng (nm) 280 320 320 320 280 280 280 Các chất FM2, FM3 FM4 hấp thụ cực đại bước sóng 320 nm; FM1, FM5, FM6 FM8 hấp thụ cực đại bước sóng 280 nm Để đảm bảo độ nhạy cho phép phân tích, lựa chọn hai bước sóng 280 nm 320 nm để định lượng đồng thời bảy hợp chất mẫu rễ củ hà thủ đỏ Điều kiện chạy sắc kí: Cột tách sắc ký: cột XDB C18 (150 x 4,6 mm, µm) Tốc độ dịng: 0,5 mL/phút Thể tích bơm mẫu: µL Thành phần pha động: MeOH - nước (0,1% axit acetic), chạy hệ gradient sau: Thời gian (phút) % MeOH % H2O (0,1% axit acetic) 30 70 35 100 40 100 Kết thời gian lưu độ tinh khiết chất tham chiếu trình bày bảng 2.3: Bảng 2.3 Kết thời gian lưu độ tinh khiết chất tham chiếu Kí hiệu chất Thời gian lưu (phút) Độ tinh khiết (%) FM2 12,7 ÷ 12,8 97,9 FM4 15,7 ÷ 15,8 96,8 FM5 16,4 ÷ 16,5 95,5 FM3 21,0 ÷ 21,1 95,2 FM8 24,3 ÷ 24,4 98,4 FM6 26,5 ÷ 26,6 96,2 FM1 35,3 ÷ 35,4 97,1 Độ chất tham chiếu đạt ≥ 95% Vì vậy, chất có độ phù hợp làm chất chuẩn phép phân tích định lượng thiết bị HPLC Pic ion giả phân tử lựa chọn hệ LC/MS trình bày bảng 2.4: Bảng 2.4 Pic ion giả phân tử chất tham chiếu hệ thống LC/MS STT Chất phân tích Pic ion giả phân tử FM1 269,0 [M-H]- FM2 429,0 [M+Na]+ FM3 433,1 [M+Na]+ FM4 549,1 [M+Na]+ FM5 419,0 [M+H]+ FM6 469,1 [M+Na]+ FM8 455,0 [M+Na]+ Trong trình phân tích mẫu, hệ thống MS phát chất nhờ pic ion giả phân tử tương ứng Qua khẳng định tính chọn lọc phương pháp phân tích 11 2.6 Kết xây dựng đường chuẩn định lượng Sử dụng chất tham chiếu kiểm tra đạt độ tinh khiết cần thiết pha dung dịch chuẩn Chạy HPLC theo quy trình thiết lập thu phương trình đường chuẩn định lượng cho chất tham chiếu, trình bày bảng 2.6: Bảng 2.6 Kết phương trình đường chuẩn định lượng hợp chất TT Ký hiệu chất Phương trình đường chuẩn R2 FM1 y = 6,62295x - 35,495370 0,99990 FM2 y = 6,13790x + 3,965890 0,99995 FM3 y = 0,92796x + 2,408150 0,99991 FM4 y = 1,02181x + 0,786697 0,99994 FM5 y = 2,33173x + 6,822620 0,99995 FM6 y = 2,06170x + 9,318620 0,99976 FM8 y = 4,08608x + 21,567050 0,99991 2.7 Quy trình xử lí mẫu phân tích Mẫu dược liệu phân tích dạng khác cắt nhỏ đến kích thước ≤ mm phơi khơ tự nhiên Cân xác gam mẫu, chiết với 25 mL MeOH ống falcon 50 mL, đặt máy siêu âm 20 phút, lọc dịch chiết giấy lọc thường chuyển vào bình định mức 100 mL Chiết lặp lại lần, thu tất dịch lọc chuyển vào bình định mức 100 mL, định mức MeOH đến vạch Dùng xilanh hút dịch chiết từ bình định mức 100 mL bơm qua màng lọc mẫu kích thước 0,45 µm Dịch lọc chuyển vào lọ chứa mẫu đưa vào hệ thống HPLC 2.8 Kết thẩm định phương pháp định tính, định lượng 2.8.1 Kết xác định tính chọn lọc phương pháp Trong sắc ký lỏng sử dụng detector DAD, xác định tính chọn lọc thơng qua xác định độ tinh khiết pic sắc kí Độ tinh khiết pic xác định cách so sánh phổ UV pic phát sắc ký đồ với pic chất tham chiếu Mặt khác, hệ thống HPLC thực nghiệm kết nối với hệ thống MS Do độ chọn lọc phương pháp cịn xác định thơng qua việc so sánh phổ MS chất phân tích với phổ MS chất tham chiếu tương ứng 2.8.2 Kết xác định LOD, LOQ Tiến hành phân tích mẫu chuẩn chất tham chiếu nồng độ thấp gần giá trị nồng độ nhỏ đường chuẩn Tiến hành thí nghiệm lặp lại 10 lần, tính độ lệch chuẩn SD Khi giá trị LOD LOQ xác định dựa vào độ dốc đường chuẩn độ lệch chuẩn SD Tiến hành thí nghiệm phân tích với mẫu chuẩn chất có nồng độ 10 µg/mL, kết xác định LOD LOQ trình bày bảng 2.7: Bảng 2.7 Kết xác định LOD LOQ Ký hiệu Nồng độ chất (µg/mL) FM2 10 FM4 TT LOD LOQ (µg/mL) (µg/mL) 0,9498 0,5106 1,5474 10 0,4211 1,3600 4,1212 FM5 10 1,0128 1,4333 4,3435 FM3 10 0,4424 1,5736 4,7684 SD 12 FM8 10 0,6187 0,4997 1,5143 FM6 10 0,4591 0,7349 2,2269 FM1 10 1,0240 6,6000 19,8000 Kết thực nghiệm cho thấy LOD LOQ có giá trị nhỏ, giá trị LOD cht t khong 0,4997 ữ 6,6000 àg/mL, giỏ tr LOQ khong 1,51143 ữ 19,8000 àg/mL Cỏc giỏ tr LOQ nhỏ giá trị nồng độ nhỏ đường chuẩn chứng tỏ phương pháp định tính định lượng thiết lập có độ nhạy cao 2.8.3 Kết xác định độ chụm Độ chụm bao gồm độ lặp độ tái lặp Sử dụng chất tham chiếu, pha dung dịch chuẩn hỗn hợp chất với nồng độ khác khoảng làm việc đường chuẩn: 500 µg/ml; 125 µg/ml; 25 µg/ml Tiến hành thí nghiệm lặp lại lần mẫu (mỗi lần cân mẫu chuẩn) Độ tái lặp thực ngày thực nghiệm, ngày cách ngày Tính độ lệch chuẩn (SD) độ lệch chuẩn tương đối (RSD) Kết thực nghiệm cho thấy: dung dịch thử chất với nồng độ 25 µg/mL có giá trị RSD nằm khoảng 0,5160 ÷ 3,4721%, nhỏ 7,3%; phép đo có nồng độ 125 µg/mL 500 àg/mL cú RSD khong 0,1215 ữ 1,4881%, nh 5,3% Điều cho phép kết luận phương pháp định tính định lượng đồng thời hợp chất mẫu rễ củ hà thủ đỏ có độ tái lặp tốt, phù hợp yêu cầu AOAC 2.8.4 Kết xác định độ Để đánh giá độ phương pháp phân tích thiết lập, tiến hành thực nghiệm xác định độ thu hồi Thí nghiệm xác định độ thu hồi tiến hành mẫu thực, ký hiệu mẫu TT6 Cân xác 5,0 gam mẫu, Thêm chất chuẩn ba mức nồng độ thấp, trung bình cao khoảng nồng độ làm việc Nồng độ chuẩn thêm vào mẫu 25 µg/mL; 125 µg/mL 500 µg/mL Kết tính độ thu hồi mẫu R(%) dao động khoảng 90,3% đến 101,6% Theo tiêu chuẩn AOAC, nồng độ chất đạt khoảng 100 µg/mL, độ thu hồi yêu cầu khoảng 90% ÷ 107%; khoảng 80% ÷ 110% nồng độ chất thử đạt cỡ 10 µg/mL Đối chiếu tiêu chuẩn AOAC, độ thu hồi chất nằm khoảng cho phép 2.9 Kết phân tích mẫu Mẫu sau xử lí đưa vào hệ thống HPLC-DAD-MS Chạy HPLC mẫu theo quy trình thiết lập thu giá trị diện tích pic ứng với mẫu tương ứng Nồng độ hoạt chất mẫu phân tích tính dựa vào phương trình đường chuẩn diện tích pic ứng với chất sắc ký đồ mẫu Nồng độ chất tham chiếu mẫu tính theo cơng thức: C (mg⁄g) = Trong đó: C1 V.10−3 100 Q G (2.7) C1 nồng độ chất tham chiếu tính theo đường chuẩn (µg/mL) G khối lượng mẫu (g); V thể tích mẫu, V = 100 mL; Q độ chất tham chiếu (Bảng 2.3) Các mẫu tiến hành phân tích lặp lại lần Tiến hành đo mẫu bước sóng hấp thụ cực đại thu giá trị diện tích pic tương ứng với hợp chất định lượng Từ phương trình đường chuẩn, tính giá trị nồng độ chất tham chiếu Kết hàm lượng hợp chất có khác biệt mẫu mẫu thu hái tự nhiên thường cao nhóm mẫu cịn lại 13 CHƯƠNG THẢO LUẬN KẾT QUẢ 3.1 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập từ hà thủ ô đỏ Từ rễ hà thủ ô đỏ Hà Giang phân lập xác định cấu trúc 11 hợp chất bao gồm hợp chất anthraquinone (FM1, FM6, FM8); hợp chất phenolic (FM2, FM7, FM9, FM11) hợp chất glycoside (FM3, FM4, FM5, FM10) Hợp chất FM3: 6-methoxy-3-methyl-1,8-đihydroxy-2-naphthoic acid 8-O-β-D- glucopyranoside (chất mới) Hợp chất FM3 thu dạng chất bột màu vàng nhạt Dựa phổ HR-ESI-MS với xuất pic ion giả phân tử m/z 433,1110 [M+Na]+ (tính tốn lí thuyết cho công thức C19H22NaO10: 433,1111) Kết hợp với phổ 13C-NMR xác định công thức phân tử hợp chất FM3 C19H22O10, khối lượng phân tử M = 410 Phổ 1H-NMR FM3 xuất tín hiệu proton vịng thơm có proton [H 7,05 (1H, s, H-4)], hai proton ghép cặp meta [δH 6,84 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-5) 7,03 (2H, d, J = 2,0 Hz, H7)] Cũng phổ 1H-NMR, vùng trường mạnh xuất tín hiệu nhóm methyl [δH 2,28 (3H, s, 3-CH3)], tín hiệu cao nhóm methyl thơng thường nên dự đốn nhóm methyl gắn trực tiếp với vịng thơm Tín hiệu phổ proton nhóm methoxy [δH 3,88 (3H, s, 6-OCH3)], tín hiệu cao nhóm methoxy thơng thường nên dự đốn nhóm methyl gắn trực tiếp với vịng thơm Ngồi ra, phổ 1H-NMR cịn quan sát thấy tín hiệu proton thuộc vùng đường δH 3,44 ÷ 4,85 tín hiệu proton anome [δH 5,12 (1H, d, H-1′] Đơn vị đường glucose có cấu trúc β giá trị số tương tác lớn (J1,2 = 7,5 Hz) Phổ 13C-NMR phổ DEPT FM3 cho thấy có mặt 19 nguyên tử carbon, bao gồm nhóm methoxy C 55,2; nhóm methyl C 19,4; nhóm methylene C 62,4; nhóm methine C 71,3 74,9, 78,1, 78,8; nhóm carbon không chứa hydro C 110,3, 123,9, 135,5, 139,1, 153,8, 157,2, 160,4, 171,0 Phân tích liệu phổ 1H- 13 C-NMR hợp chất FM3, đồng thời so sánh liệu phổ với torachrysone 8-O-β-D-glucopyranoside cho thấy so với hợp chất tham khảo torachrysone 8-O-β-Dglucopyranoside có tương đồng cấu trúc ngoại trừ thay nhóm acetyl nhóm cacboxylic (δC 171,0) Giá trị phổ 13C-NMR C-11 C 171,0, C 204,3 giá trị phổ hợp chất torachrysone 8-O-β-D-glucopyranoside Phân tích tương tác phổ HSQC cho phép ta gán tín hiệu proton liên kết trực tiếp với carbon Cấu tạo FM3 làm sáng tỏ thêm phân tích phổ COSY Trên phổ COSY, khung naphtalene khẳng định tương tác proton H-4 (δH 7,05) H-7 (δH 7,03) với H-5 (δH 6,84) Các tương tác phổ COSY proton H-1′ (δH 5,12) với H-2′ (δH 3,58); H-2′ (δH 3,58) với H-3′ (δH 3,54); H-3′ (δH 3,54) với H-4′ (δH 3,45); H-4′ (δH 3,45) với H-5′ (δH 3,56); H-5′ (δH 3,56) với H-6′ (δH 3,77; 3,96) khẳng định có mặt đơn vị đường β-D-glucopyranoside Tương tác HMBC proton thuộc nhóm methyl (δH 2,30) C-2 (δC 123,9)/C-3 (δC 135,5)/C-4 (δC 120,3) chứng minh vị trí nhóm methyl C-3 Tương tự, tương tác HMBC nguyên tử H 14 nhóm methoxy (δH 3,88) với C-6 (δC 160,4) khẳng định vị trí nhóm methoxy C-6 Mặt khác, tương tác HMBC H-1′ (δH 5,12) với C-8 (δC 157,2) khẳng định vị trí đơn vị đường glucose C-8 Hình 3.7 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC hợp chất FM3 Hình 3.8 Phổ HMBC hợp chất FM3 Bảng 3.1 Số liệu phổ NMR hợp chất FM3 hợp chất tham khảo C * δCd,b δCa,b δHa,c (độ bội, J, Hz) 150,9 153,8 - 123,0 123,9 - 136,8 135,5 - 118,8 120,3 7,05 s 102,7 102,5 6,84 d (2,0) 158,2 160,4 - 103,0 104,4 7,03 d (2,0) 155,3 157,2 - 108,5 110,3 - 10 133,6 139,1 - 11 204,3 171,0 - 6-OCH3 55,2 55,9 3,88 s 3-CH3 19,4 20,2 2,30 s 1′ 101,1 104,1 5,12 d (7,5) 2′ 73,3 74,9 3,58 m 3′ 76,1 78,1 3,54 m 4′ 69,8 71,3 3,45 m 5′ 77,7 78,8 3,56 m 6′ 60,5 62,4 3,77 dd (12,5, 5,5) 15 3,96 dd (12,5, 2,5) a đo CD3OD, b 125MHz, c 500MHz, d đo DMSO-d6, *δ liệu phổ 13C-NMR hợp chất torachrysone 8-O-β-D-glucopyranoside Mặt khác, để khẳng định cấu hình tuyệt đối hợp chất FM3, sử dụng phương pháp thủy phân axit Hợp chất FM3 lấy mg, hòa tan ml dioxan / HCl N (1: v/v) đun nóng 80°C Dung dịch axit trung hòa bạc cacbonat chiết CH2Cl2, tách loại dung môi Lớp nước đặc đến khơ khí nitơ Sau đó, hịa tan 0,1 mL pyridin, thêm 0,1 mL L-cystein metyl este hydroclorid 0,06 M pyridin Sau đun nóng 60°C giờ, thêm vào dung dịch 0,1 mL trimethylsilylimidazole, đun nóng 60°C 1,5 Sản phẩm khơ hịa tan đồng thời n-hexan nước (mỗi loại 0,1 mL) Sử dụng lớp hữu phân tích GC hệ thống GC Agilent 7890B sử dụng cột SPB-1 (0,25 mm × 30 m), máy dò FID, nhiệt độ cột 210°C, nhiệt độ kim phun 270°C, nhiệt độ detector 300°C, sử dụng khí mang He D-glucose phát 14,15 phút Từ phân tích kết luận hợp chất FM3 6-methoxy-3-methyl-1,8-đihydroxy-2naphthoic acid 8-O-β-D-glucopyranoside, chất lần công bố Hợp chất FM4: 6-hydroxymusizin 8-O-α-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside (chất mới) Hợp chất FM4 thu dạng chất bột màu vàng cam Trên phổ khối phân giải cao HR-ESIMS xuất pic ion giả phân tử m/z 549,1578 [M+Na]+ (tính tốn lí thuyết cho cơng thức C24H30NaO13: 549,1584) Kết hợp với phổ 13C-NMR, công thức phân tử hợp chất FM4 xác định C24H30O13, khối lượng phân tử M = 526 Dữ liệu phổ 1H- 13C-NMR hợp chất FM4 gợi ý phenolic glycoside, bao gồm hai proton ghép cặp meta, nhóm methyl nhóm acetyl Dữ liệu phổ 1H- 13C-NMR FM4 6hydroxymusizin 8-O-β-D-glucoside, cho thấy chúng tương tự Sự khác hai chất FM4 có thêm đơn vị đường apiose Ngồi phổ 1H-NMR hợp chất FM4 cịn xuất tín hiệu hai proton anome δH 5,05 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-1″) 5,07 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′) gợi ý cho hai đơn vị đường apiosyl glucosyl tương ứng Đơn vị đường glucose có cấu hình β giá trị số tương tác lớn (J1,2 = 7,5 Hz), đơn vị đường apiose xác định cấu hình α (J1,2 = 2,5 Hz) Phổ 13C-NMR DEPT FM4 cho thấy có mặt 24 carbon, bao gồm nhóm methyl C 20,2; nhóm methyl nhóm acetyl C 32,6; nhóm methylene C 65,7, 68,6, 75,1; 10 nhóm methine C 71,5, 74,9, 77,6, 78,1, 78,1, 104,3, 104,9, 105,5, 119,6, 111,0; nguyên tử carbon không liên kết với hyđro C 80,5, 109,7, 123,2, 135,2, 139,3, 154,0, 157,4, 158,1, 208,2 Phân tích tương tác phổ HSQC cho phép ta gán tín hiệu proton liên kết trực tiếp với carbon Các tương tác HMBC H-1″ (δH 5,05) C-6′ (δC 68,6), H-1′ (δH 5,07) C-8 (δC 157,4) khẳng định đơn vị đường apiose gắn vào vị trí C-6′ đơn vị đường glucose C-1′ đơn vị đường gắn vị trí C-8 khung naphtalene Ngồi ra, tương tác HMBC proton nhóm acetyl (δH 2,60) C-2 (δC 123,2) chứng minh vị trí nhóm acetyl C-2 Tương tác HMBC proton nhóm methyl (δH 2,28) C-3 (δC 135,2)/C-2 (δC 123,2)/C-4 (δC 119,6) chứng minh vị trí nhóm methyl C3 16 Hình 3.14 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC hợp chất FM4 Hình 3.15 Phổ HMBC hợp chất FM4 Bảng 3.2 Số liệu phổ NMR hợp chất FM4 hợp chất tham khảo C * δCd,b δCa,b δHa,c (độ bội, J, Hz) 151,1 154,0 - 123,2 123,2 - 136,9 135,2 - 118,6 119,6 6,91 s 102,4 105,5 6,72 d (2,0) 158,2 158,1 - 103,3 104,9 7,00 d (2,0) 155,1 157,4 - 108,7 109,7 - 10 133,6 139,3 - CH3CO 204,3 208,2 - CH3CO 32,2 32,6 2,60 s 3-CH3 19,4 20,2 2,28 s 8-O-β-D-glucopyranoside 1′ 101,2 104,3 5,07 d (7,5) 2′ 72,2 74,9 3,57 m 3′ 75,8 78,1 3,51 t (8,5) 4′ 69,9 71,5 3,45 m 5′ 74,4 77,6 3,68 m 6′ 63,3 68,6 4,12 d (9,5) 17 3,70 m 6′-O-β-D-apiofuranoside 1″ - 111,0 5,05 d (2,5) 2″ - 78,1 4,01 d (2,5) 3″ - 80,5 - 4″ - 75,1 5″ a - 4,04 d (9,5) 3,80 d (9,5) 65,7 3,36 s đo CD3OD, 125MHz, 500MHz, đo DMSO-d6, δ liệu phổ 13C-NMR hợp chất 6b c d * hydroxymusizin 8-O-β-D-glucoside Mặt khác, để khẳng định cấu hình tuyệt đối hợp chất FM4, sử dụng phương pháp thủy phân axit tương tự FM3 Kết quả, pic tín hiệu D-glucose D-apiose phát 14,15 phút 4,61 phút Từ phân tích kết luận hợp chất FM4 6-hydroxymusizin 8-O-α-D-apiofuranosyl(1→6)-β-D-glucopyranoside, hợp chất lần công bố 3.2 Thiết lập quy trình định tính, định lượng hoạt chất hà thủ ô đỏ Các hợp chất thành phần hóa học dược liệu hà thủ đỏ phân tích định tính định lượng đồng thời hệ thống HPLC-MS Bảy hợp chất mẫu lựa chọn phân tích bao gồm: emodin (FM1), 2,3,4′,5-tetrahydroxystilbene 2-O-β-D-gluopyranoside (FM2), 6-methoxy-3-methyl-1,6,8trihydroxy-2-naphthoic acid 8-O-β-D-glucopyranoside (FM3), 6-hydroxymusizin 8-O-α-D-apiofuranosyl(1→6)-β-D-glucopyranoside (FM4), pleuropyrone A (FM5), physcionin (FM6) emodin 8-O-β-Dglucopyranoside (FM8) Hoạt chất THSG (FM2) hoạt chất có nhiều hoạt tính có giá trị hà thủ ô đỏ Theo kết nghiên cứu, hợp chất khác phân lập từ hà thủ ô đỏ có hoạt tính có giá trị Kết đánh giá hoạt tính cho thấy hợp chất FM1 FM6 có tác dụng gây độc tế bào ung thư mạnh dòng ung thư phổi người (H1299) ung thư gan người (Hep3B) Hợp chất FM1 có tác dụng mạnh dịng tế bào ung thư phổi (A549) Như vậy, đánh giá đồng thời nhiều hợp chất thành phần hóa học hà thủ đỏ cần thiết Phân tích đồng thời nhiều hoạt chất góp phần đánh giá tồn diện thành phần chất lượng dược liệu quy trình định lượng Đồng thời tiết kiệm chi phí thời gian phân tích Vì vậy, xây dựng quy trình định lượng đồng thời tiêu chuẩn dược liệu Dược điển hoạt chất cần thiết Qua đó, vào tiêu chuẩn phương pháp Dược điển, mẫu dược liệu kiểm soát đánh giá chất lượng Căn lượng chất phân lập từ mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ Hà Giang phù hợp điều kiện phân tích HPLC hợp chất lựa chọn phân tích định tính định lượng đồng thời Các hợp chất định lượng bao gồm: FM2, FM4, FM5, FM3, FM8, FM6 FM1 Các hợp chất mẫu phân tích định tính dựa thông số: thời gian lưu, phổ DAD giá trị phổ MS hệ thống kết nối LC-MS Đồng thời bảy hoạt chất định lượng đồng thời dựa mối quan hệ tuyến tính nồng độ diện tích pic thu Kết phương pháp định tính định lượng đồng thời hoạt chất mẫu dược liệu hà thủ ô đỏ thiết lập Các chất tham chiếu sử dụng làm chất chuẩn phân lập từ mẫu rễ củ hà thủ đỏ Hà Giang Do đó, chủ động nguồn chất chuẩn sử dụng phân tích, khắc phục hạn chế việc tìm chất chuẩn sử dụng phân tích định lượng hợp chất hữu Chất chuẩn sau 18 phân lập xác định độ phân tích HPLC Độ tinh khiết chất tham chiếu sử dụng q trình tính hàm lượng hoạt chất mẫu nhằm đảm bảo tính xác kết phân tích Thời gian phân tích mẫu tiến hành 40 phút, khoảng thời gian phù hợp, tiết kiệm chi phí so với số cơng bố trước So sánh với phương pháp định lượng công bố Y Tao (thời gian phân tích 55 phút) hay D.Q Han (thời gian phân tích 45 phút), thời gian phân tích mẫu rút ngắn Do thực quy trình phân tích thiết lập giúp tiết kiệm thời gian dung môi Mặt khác, quy trình phân tích thực cột sắc ký pha đảo XDB C18 kích thước 150 x 4,6 mm, kích thước hạt µm loại cột phổ biến cho trình thực nghiệm Hệ dung mơi lựa chọn dễ tìm MeOH nước (0,1% axit acetic), chạy hệ gradient đảm bảo trình phân tách chất Tín hiệu chất q trình định tính định lượng đo detector DAD bước sóng hấp thụ cực đại chất, đảm bảo độ nhạy cho phép phân tích Phương pháp định lượng sắc ký lỏng hiệu cao nhằm kiểm sốt chất lượng dược liệu hà thủ đỏ nêu Dược điển Trung Quốc, Dược điển Hồng Kông Dược điển Mỹ Trong Dược điển Trung Quốc hàm lượng hoạt chất dược liệu hà thủ ô đỏ định lượng phương pháp sắc ký lỏng liệu cao Trong đó, tiêu chuẩn dược liệu đưa hàm lượng anthraquinone kết hợp không 0,1% hàm lượng THSG khơng 1% tính theo dược liệu khơ Dược điển Hồng Kông đề cập đến tiêu chuẩn THSG (FM2), dược liệu đạt tiêu chuẩn hàm lượng hoạt chất ≥ 2,2% tính theo dược liệu khơ Trong Dược điển Mỹ, dược liệu đạt tiêu chuẩn xác định hàm lượng anthraquinone kết hợp hoạt chất THSG (FM2) Hai thành phần định lượng riêng phương pháp HPLC với hệ dung môi: nước 0,1% axit formic acetonitrile Theo tiêu chuẩn này, hàm lượng hoạt chất THSG khơng nhỏ 1,5% tính dược liệu khô Như chuyên luận Dược điển đề cập quan tâm đến hàm lượng hoạt chất THSG dược liêu hà thủ ô đỏ Trong chuyên luận Dược điển Việt Nam IV chưa có quy trình định lượng hoạt chất Quy trình định lượng hoạt chất dược liệu hà thủ ô đỏ lần đưa vào Dược điển Việt Nam V Trong đó, hoạt chất định lượng anthraquinone kết hợp gồm emodin physcion với hệ dung môi methanol - dung dịch axit phosphoric 0,1% (80:20), khơng có quy trình phân tích THSG Theo chuẩn Dược điển Việt Nam V, hàm lượng anthraquinone kết hợp không 0,1% tính theo dược liệu khơ 3.3 Thẩm định phương pháp định tính, định lượng Thẩm định phương pháp phân tích phần khơng thể thiếu để kết phân tích đáng tin cậy Thẩm định phương pháp khẳng định việc kiểm tra cung cấp chứng khách quan chứng minh phương pháp đáp ứng yêu cầu đặt Kết thẩm định phương pháp sử dụng để đánh giá chất lượng, độ tin cậy kết phân tích Phương pháp phân tích định tính định lượng đồng thời bảy hoạt chất loài hà thủ đỏ thiết lập thuộc nhóm phương pháp khơng tiêu chuẩn Vì vậy, thẩm định phương pháp xây dựng cần thiết Các tiêu chí thẩm định bao gồm: tính chọn lọc; LOD LOQ; độ chụm (độ lặp độ tái lặp) độ Các kết thẩm định tin cậy thuộc giới hạn cho phép theo tiêu chuẩn AOAC Trong trình phân tích, chất định tính phổ UV, thời gian lưu phổ khối lượng MS Phổ UV chất mẫu có độ trùng khít cao so với chất chuẩn tham chiếu Trên hệ thống LC, pic sắc ký chất phát cách ổn định thời gian lưu: FM2 (12,7 - 12,8) phút; FM4 (15,7 - 15,8) phút; FM5 (16,4 - 16,5) phút; FM3 (21,0 - 21,1) phút; FM8 (24,3 - 24,4) phút; FM6 19 (26,5 - 26,6) phút; FM1 (35,3 - 35,4) phút Mặt khác, trình phân tích mẫu, có mặt chất cịn khẳng định qua thông tin phổ MS Hệ thống MS phát pic ion giả phân tử chất thời điểm tương ứng Điều khẳng định phương pháp phân tích thiết lập có độ chọn lọc cao Bảy hợp chất định tính định lượng hà thủ đỏ có giá trị LOD LOQ nhỏ: giá trị LOD dao động khong 0,4997 ữ 6,6000 àg/mL; giỏ tr LOQ dao ng t 1,5143 ữ 19,8000 àg/mL c xỏc nh bng thớ nghiệm mẫu chuẩn có nồng độ nhỏ lặp lại 10 lần, giá trị LOQ nhỏ giá trị nhỏ đường chuẩn Do khẳng định thêm độ tin cậy đường chuẩn xây dựng Sử dụng phương pháp phân tích thiết lập giúp định tính định lượng đồng thời bảy hoạt chất đạt độ nhạy cao Độ chụm phương pháp bao gồm độ lặp độ tái lặp thẩm định Kết thẩm định dựa phép xác định chất tham chiếu với lần lặp Qua xử lí số liệu, tính độ lệch chuẩn tương đối (RSD), từ đối chiếu với tiêu chuẩn AOAC nhằm đánh giá độ chụm phương pháp Kết thực nghiệm cho thấy, xác định độ lặp, giá trị RSD chất đạt 0,0671 ÷ 3,4528 % Khi xác định độ tái lặp, giá trị RSD chất đạt 0,1215 ÷ 3,4721 % So sánh với tiêu chuẩn AOAC, giá trị RSD chất thuộc giới hạn cho phép Do phương pháp định tính, định lượng thiết lập có độ chụm cao Mặt khác phương pháp thẩm định độ thông qua độ thu hồi Độ thu hồi xác định mẫu thực thêm chuẩn tiến hành lặp lần Kết thực nghiệm cho thấy giá trị thu hồi chất đạt khoảng 90,3% đến 101,6% So sánh với tiêu chuẩn AOAC mức nồng độ tương ứng, giá trị độ thu hồi xác định nằm giới hạn cho phép Do khẳng định phương pháp định tính định lượng bảy hoạt chất dược liệu hà thủ ô đỏ đạt yêu cầu độ Như vậy, phương pháp định tính, định lượng đồng thời bảy hoạt chất dược liệu hà thủ ô đỏ thẩm định thơng số: tính chọn lọc; LOD LOQ; độ chụm (độ lặp độ tái lặp) độ Các thông số thẩm định đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn AOAC Qua khẳng định phương pháp xây dựng có độ tin cậy, áp dụng phân tích mẫu nhằm định lượng hoạt chất dược liệu hà thủ ô đỏ 3.4 Hàm lượng hoạt chất mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ Các mẫu phân tích tiến hành xử lí mẫu tương tự bao gồm gia công, chiết siêu âm, thời gian số lần chiết methanol định mức thành 100 mL thu dung dịch mẫu phân tích Phân tích mẫu thiết bị HPLC theo quy trình xây dựng thu sắc ký đồ giá trị diện tích pic tương ứng Dựa vào đường chuẩn lập công thức tính, từ tính hàm lượng (mg/g) hợp chất mẫu Kết hàm lượng hoạt chất mẫu trình bày bảng 3.12: Bảng 3.12 Hàm lượng hoạt chất mẫu rễ củ hà thủ đỏ (mg/g) Hàm lượng chất phân tích (mg/g) Chất phân tích HG CU CE TT1 TT2 TT3 TT4 TT5 FM2 55,010±0,505 1,170±0,025 2,160±0,058 0,507±0,038 2,285±0,024 3,285±0,020 1,698±0,021 2,418±0,029 FM4 0,173±0,014 0,020±0,001 0,025±0,001 + 0,043±0,003 0,038±0,001 0,035±0,001 0,039±0,001 FM5 0,117±0,004 + + - - + + - FM3 0,398±0,006 + + - - - - - FM8 3,183±0,020 - + + + + + + FM6 1,404±0,028 + - + + + + + FM1 0,438±0,027 + + - + + 0,547±0,031 + (+): Có phát khơng định lượng (-): Không phát 20 Kết phân tích cho thấy hàm lượng hoạt chất có chênh lệch mẫu thu hái tự nhiên nhóm mẫu lưu hành thị trường Hầu hết hợp chất mẫu thu hái tự nhiên cao mẫu lại kể mẫu hà thủ ô đỏ dạng củ bán thị trường Điển hình với FM2, hoạt chất quan trọng với nhiều hoạt tính có giá trị hà thủ đỏ, độ chênh lệch lên tới 110 lần Một số thành phần khác FM3, FM5, FM6 FM8 định lượng mẫu Hà Giang, không định lượng với nhóm mẫu cịn lại FM3 chất lần phân lập từ hà thủ ô đỏ Điều gợi ý sử dụng FM3 làm chất thị đặc trưng cho loại dược liệu Căn vào tiêu chuẩn dược liệu chuyên luận dược điển, mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ đánh sau (Bảng 3.13): Bảng 3.13 Hàm lượng (%) THSG anthraquinone kết hợp mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ Hàm lượng (%) Chất THSG Đánh giá Anthraquinone Dược điển Dược điển kết hợp (FM1 + Trung Hồng FM6 + FM8) Quốc Kông Mẫu Dược điển Mỹ Dược điển Việt Nam V HG 5,50 0,50 Đạt Đạt Đạt Đạt CU 0,12 - KĐ KĐ KĐ KĐ CE 0,22 - KĐ KĐ KĐ KĐ TT1 0,05 - KĐ KĐ KĐ KĐ TT2 0,23 - KĐ KĐ KĐ KĐ TT3 0,33 - KĐ KĐ KĐ KĐ TT4 0,17 0,05 KĐ KĐ KĐ KĐ TT5 0,24 - KĐ KĐ KĐ KĐ (-): Không xác định KĐ: Không đạt Đánh giá chất lượng dược liệu hà thủ ô đỏ theo chuẩn Dược điển cho thấy hầu hết mẫu dược liệu không đạt tiêu chuẩn theo chuẩn Dược điển Việt Nam chuẩn dược điển Trung Quốc, Hồng Kông dược điển Mỹ Chỉ mẫu HG, hàm lượng hợp chất dược liệu đảm bảo đạt chuẩn theo chuẩn dược điển Như vậy, nhận định mẫu rễ củ hà thủ đỏ tự nhiên có chất lượng tốt mẫu dược liệu khác thị trường Việt Nam Điều vùng đất Hà giang có đặc điểm địa hình, địa chất khí hậu phù hợp với loại Nằm vùng khí hậu cận nhiệt đới ẩm địa hình cao nên khí hậu Hà Giang mang nhiều sắc thái ơn đới Địa hình khí hậu vùng thích hợp cho trồng loại dược liệu có hà thủ ô đỏ Theo kết nghiên cứu nhóm tác giả Nguyễn Thị Hà Ly, hàm lượng hợp chất THSG, emodin physcion số mẫu thuộc tỉnh Lào Cai, Hà Giang, Hà Nội Hưng Yên khác Qua khẳng định vùng trồng khác có hàm lượng hợp chất khác nhau, đặc biệt mẫu trồng vùng núi cao có hàm lượng THSG cao vùng đồng Mặt khác, theo kết phân tích, mẫu rễ củ hà thủ đỏ chế có hàm lượng hoạt chất thấp mẫu Hà Giang chí thấp mẫu thị trường Hoạt chất FM2 FM4 định lượng mẫu có hàm lượng thấp, cịn lại hoạt chất khác phát không định lượng 21 Điều cho phép nhận định mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ chế có chất lượng thấp Nguyên nhân quy trình chế biến mẫu chưa hợp lí, hàm lượng hoạt chất bị bị biến đổi q trình chế biến Ngồi thời gian trồng dược liệu chưa đủ, thời điểm thu hái chưa phù hợp trồng vùng đất khí hậu khơng thích hợp Về mặt này, nhóm tác giả Nguyễn Thị Hà Ly cho nên thu hoạch dược liệu sau trồng năm Ở thời điểm này, rễ củ hà thủ ô đỏ đảm bảo hàm lượng hợp chất đạt chuẩn dược điển Việt Nam Nhóm nghiên cứu cịn khẳng định số sản phẩm chế biến từ hà thủ ô đỏ thuốc hay trà không chứa emodin physcion chí khơng chứa THSG có hàm lượng thấp mẫu dược liệu Qua nhận định số loại dược liệu có hàm lượng hoạt chất thấp chí dược liệu giả dược liệu bị chiết rút lấy hoạt chất có giá trị trước bán thị trường KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đây công trình nghiên cứu xây dựng liệu phân tích định tính, định lượng hoạt chất dược liệu hà thủ ô đỏ Fallopia multiflora sắc ký lỏng hiệu cao Bộ liệu bao gồm: xác định thành phần hố học thiết lập quy trình phân tích định tính, định lượng đồng thời số hoạt chất dược liệu hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora) 1.1 Nghiên cứu hóa học Bằng phương pháp sắc ký kết hợp, phân lập 11 hợp chất từ lồi hà thủ đỏ Trong số 11 hợp chất có hợp chất naphtolic glycoside (FM3, FM4, FM5, FM10); hợp chất anthraquinone (FM1, FM6, FM8); hợp chất stilbene (FM2, FM9); hợp chất benzyl glycoside (FM7) hợp chất flavonoid (FM11), bao gồm: - hợp chất mới: 6-methoxy-3-methyl-1,8-đihydroxy-2-naphthoic acid 8-O-β-D-glucopyranoside (FM3), 6-hydroxymusizin 8-O-α-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside (FM4) - hợp chất biết: emodin (FM1), 2,3,4′,5-tetrahydroxystilbene 2-O-β-D-glucopyranoside (FM2), pleuropyrone A (FM5), physcionin (FM6), benzyl gentiobioside (FM7), emodin 8-β-Dglucopyranoside (FM8), resveratrol (FM9), glycoside A (FM10) (+)-catechin (FM11) 1.2 Nghiên cứu phương pháp phân tích định tính, định lượng Phân lập sử dụng chất phân lập từ mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ thu hái Hà Giang làm chất chuẩn thiết lập quy trình phân tích định tính định lượng Đã tiến hành thiết lập quy trình định tính định lượng đồng thời hợp chất mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ, bao gồm FM1, FM2, FM3, FM4, FM5, FM6, FM8 có hai chất lần phân lập FM3 FM4 Đã tiến hành xây dựng đường chuẩn định lượng hợp chất với độ tuyến tính cao, hệ số tương quan R ≥ 0,995, thỏa mãn tiêu chuẩn hiệp hội nhà hóa học phân tích thức AOAC Đã tiến hành thực nghiệm thẩm định phương pháp phân tích Kết cho thấy, phương pháp phân tích thiết lập có độ chọn lọc cao; giá trị LOD, LOQ nhỏ phù hợp với đường chuẩn; độ chụm độ thu hồi nằm tiêu chuẩn cho phép AOAC Đã tiến hành thực nghiệm phân tích hàm lượng hoạt chất mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ bao gồm: mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ Hà Giang số mẫu lưu hành thị trường Kết cho thấy mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ thu hái tự nhiên Hà Giang có hàm lượng hợp chất cao mẫu thị trường mẫu 22 thỏa mãn tiêu chuẩn số chuẩn dược điển hà thủ đỏ Phương pháp phân tích có khả áp dụng nhằm đánh giá chất lượng dược liệu hà thủ ô đỏ thị trường Việt Nam Kiến nghị Đây cơng trình nghiên cứu thành phần hóa học, thiết lập quy trình định tính định lượng đồng thời hợp chất hà thủ ô đỏ Việt Nam Các hoạt chất phân lập đa dạng sử dụng làm chất chuẩn phương pháp phân tích định tính định lượng đồng thời bảy hoạt chất mẫu rễ củ hà thủ đỏ Phương pháp phân tích thiết lập đảm bảo độ tin cậy độ xác cao Vì vậy, từ cơng trình nghiên cứu tác giả có đề xuất kiến nghị sau: Cần có nghiên cứu hoạt tính sinh học hợp chất phân lập loài hà thủ ô đỏ Hà Giang Nghiên cứu mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ từ vùng miền khí hậu Việt Nam, tìm đặc điểm vùng miền thích hợp cho lồi Đặc biệt cần nghiên cứu hoạt tính sinh học hai hợp chất lần công bố gồm FM3 FM4 nhằm phát thêm tác dụng tích cực hà thủ đỏ Việt Nam Quy trình phân tích định tính định lượng thiết lập cần tổ chức thẩm định có thẩm quyền thẩm định khách quan Nghĩa cần có thêm đơn vị phân tích đối chứng nhằm khẳng định độ tin cậy tính xác phương pháp phân tích thiết lập Từ kết đó, đề xuất đưa phương pháp định lượng thiết lập vào Dược điển Việt Nam góp phần kiểm sốt chất lượng dược liệu hà thủ đỏ Việt Nam NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Từ rễ củ hà thủ ô đỏ Hà Giang phân lập xác định cấu trúc hóa học 11 hợp chất khác Kết nghiên cứu thành phần hóa học cho thấy: 11 hợp chất phân lập xác định cấu trúc hóa học có hợp chất mới, bao gồm: 6-methoxy-3-methyl-1,8-đihydroxy-2-naphthoic acid 8O-β-D-glucopyranoside (FM3) 6-hydroxymusizin 8-O-α-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside (FM4) Kết nghiên cứu phương pháp phân tích định tính, định lượng Lần quy trình định tính định lượng đồng thời hợp chất mẫu hà thủ ô đỏ xây dựng, bao gồm FM1, FM2, FM3, FM4, FM5, FM6, FM8 có hai chất lần phân lập FM3 FM4 Các đường chuẩn định lượng đồng thời hợp chất xây dựng với độ tuyến tính cao, hệ số tương quan R2 ≥ 0,99, thỏa mãn tiêu chuẩn hiệp hội nhà hóa học phân tích thức AOAC Phương pháp phân tích thiết lập thẩm định tính chọn lọc; giá trị LOD, LOQ; xác định độ chụm; độ thu hồi Kết cho thấy, phương pháp phân tích thiết lập có tính chọn lọc cao; giá trị LOD, LOQ nhỏ phù hợp với đường chuẩn; độ chụm độ thu hồi nằm tiêu chuẩn cho phép AOAC Áp dụng quy trình phân tích nhằm định lượng đồng thời hợp chất mẫu thực bao gồm: mẫu hà thủ ô đỏ Hà Giang số mẫu lưu hành thị trường Kết cho thấy mẫu hà thủ ô đỏ thu hái tự nhiên có hàm lượng hợp chất cao mẫu thị trường Phương pháp phân tích có khả áp dụng nhằm đánh giá chất lượng dược liệu hà thủ ô đỏ thị trường Việt Nam DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ 23 Nguyen Thi Thoa, Pham Thanh Binh, Nguyen Phuong Thao, Nguyen Hai Đang, Nguyen Van Hung, Phạm Van Cuong, Chau Van Minh, Tran Quang Hai, Nguyen Tien Đat, Phenolic Constituents from Fallopia multiflora (Thunberg) Haraldson, 2018, Journal of Chemistry, Volume 2018, Article ID 4851439, pages https://www.hindawi.com/journals/jchem/2018/4851439 (SCIE) Nguyen Thi Thoa, Nguyen Hai Dang, Do Hoang Giang, Nguyen Thi Thu Minh, Nguyen Tien Dat, Metabolomics approach for discrimination and quality control of natural and commercial Fallopia multiflora products in Vietnam, 2020, International Journal of Analytical Chemistry, Volume 2020, Article ID 8873614, pages https://www.hindawi.com/journals/ijac/2020/8873614 (SCIE) Nguyễn Thị Thoa, Phạm Thanh Bình, Nguyễn Văn Hùng, Phạm Văn Cường, Nguyễn Hải Đăng, Nguyễn Tiến Đạt, Phân lập, xác định cấu trúc hoạt tính gây độc tế bào số hợp chất anthraquinone từ rễ hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora), 2018, Tạp chí hóa học 56(6E1) 239-242 Nguyễn Thị Thoa, Nguyễn Hải Đăng, Nguyễn Tiến Đạt, Phân lập xác định cấu trúc thành phần hóa học lồi hà thủ đỏ (Polygonum multiflorum), 2019, Tạp chí Khoa học Công nghệ (Trường Đại học Công nghiệp Hà Nội), số 52, 101-103  ... tài ? ?Nghiên cứu xây dựng liệu phân tích định tính, định lượng hoạt chất dược liệu hà thủ ô đỏ Fallopia multiflora (Thunberg) Haraldson sắc ký lỏng hiệu cao? ?? Mục tiêu nghiên cứu luận án Nghiên cứu. .. sốt chất lượng dược liệu hà thủ đỏ nêu Dược điển Trung Quốc, Dược điển Hồng Kông Dược điển Mỹ Trong Dược điển Trung Quốc hàm lượng hoạt chất dược liệu hà thủ ô đỏ định lượng phương pháp sắc ký lỏng. .. gây độc gan hà thủ ô đỏ 1.3.4 Các nghiên cứu phân tích định tính, định lượng hoạt chất hà thủ đỏ 1.4 Tình hình nghiên cứu hà thủ ô đỏ Việt Nam 1.5 Tổng quan thẩm định phương pháp phân tích CHƯƠNG