Nghiên cứu tăng cường tác dụng ức chế escherichia coli của nisin bằng cách kết hợp với hoá chất và các biện pháp xử lý nhiệt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGÀNH: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NGHIÊN CỨU TĂNG CƯỜNG TÁC DỤNG ỨC CHẾ E.COLI CỦA NISIN BẰNG CÁCH KẾT HỢP VỚI HÓA CHẤT VÀ CÁC BIỆN PHÁP XỬ LÝ NHIỆT NGUYỄN TIẾN THÀNH HÀ NỘI 2006 MỞ ĐẦU Thực phẩm, xét phương diện vi sinh, môi trường giàu chất dinh dưỡng thích hợp cho phát triển vi sinh vật Sự nhiễm tạp vi sinh vật lại vô dễ dàng thực phẩm không bảo quản tốt Nhiều biện pháp bảo quản thực phẩm sử dụng như: ướp muối, bảo quản lạnh, lạnh đông, sấy, gia nhiệt, lên men, bổ sung chất bảo quản hoá học kháng sinh… Tuy nhiên phương pháp làm thay đổi giá trị dinh dưỡng giá trị cảm quản thực phẩm để lại dư lượng có nguy gây tác động phụ có hại cho người sử dụng Vì vậy, chất bảo quản có nguồn gốc sinh học không ảnh hưởng tới chất lượng thực an toàn với người cần thiết Một chất có hoạt tính kháng khuẩn, an toàn hữu hiệu bảo quản thực phẩm nisin Nisin có phổ tác dụng rộng với nhiều loại vi khuẩn Gram dương như: Staphylococcus, Bacillus, Lactobacillus đặc biệt số vi khuẩn gây bệnh gây hư hỏng thực phẩm: Clostridium, Bacillus Nisin có chất protein nên dễ dàng bị phân huỷ enzim hệ tiêu hóa, khơng để lại dư lượng gây tượng nhờn thuốc chất kháng sinh y học Ngoài ra, sử dụng nisin bảo quản thực phẩm (đặc biệt sản phẩm đồ hộp) có tính kinh tế tiết kiệm lượng (giảm nhiệt độ và rút ngắn thời gian trùng) cho trình xử lý nhiệt, đảm bảo hiệu kháng khuẩn mà không làm giảm giá trị dinh dưỡng sản phẩm Bên cạnh ưu điểm, nisin có nhược điểm khơng có khả tác dụng tới nấm men, nấm mốc, đặc biệt nhóm vi khuẩn Gram âm E coli, Salmonella…vốn nguyên nhân gây bệnh qua thực phẩm chủ yếu để lại hậu nghiêm trọng cho người Một chất bảo quản thực phẩm đảm bảo phải có khả tiêu diệt ức chế hầu hết vi sinh vật có hại, nhằm tạo sản phẩm an tồn Vì vậy, với nhược điểm chưa khắc phục vậy, việc ứng dụng nisin bảo quản thực phẩm nhiều hạn chế Khả kháng nisin vi khuẩn Gram âm có nhờ cấu tạo thành tế bào Do tác động số yếu tố môi trường pH, hoá chất, áp suất thẩm thấu đặc biệt nhiệt độ, lớp màng tế bào bị suy yếu hư hỏng, vi khuẩn Gram âm trở nên nhạy cảm với nisin Xuất phát từ vấn đề nêu trên, đề tài: “Nghiên cứu tăng cường tác dụng ức chế E coli nisin cách kết hợp với biện pháp xử lý nhiệt” tiến hành nhằm góp phần tăng cường khả ứng dụng nisin bảo quản thực phẩm CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nisin 1.1.1 Bacterioxin Vi sinh vật ngun nhân gây bệnh có liên quan tới thực phẩm Ngay ngày đầu tiên, kể từ người ta phát vi sinh vật ảnh hưởng chúng người, người ta tìm cách để kiểm sốt sinh trưởng phát triển vi sinh vật thực phẩm Ngoài biện pháp truyền thống sấy, bảo quản lạnh, trùng, ướp muối… biện pháp khác phổ biến sử dụng chất phụ gia bảo quản thực phẩm Trong chất phụ gia bảo quản thực phẩm, phải kể đến nhóm chất bảo quản có tên gọi bacterioxin Bacterioxin tạo vi khuẩn, chất thường oligo polypeptit có đặc tính tiêu diệt vi khuẩn có quan hệ họ hàng với chủng sản [16] Bacterioxin biết đến colicin - tạo chủng vi khuẩn Gram âm E coli Được phát lần Gratia vào năm 1925, “principe V” sản phẩm chủng E coli để chống lại chủng E coli khác Gratia Fredericq (1946) gọi chất thuật ngữ “colicin”, sau đến năm 1953, Jacob số cộng gọi thuật ngữ “bacterioxin” để protein khả kháng khuẩn Thuật ngữ colicin dùng để nhấn mạnh protein kháng khuẩn tạo vi khuẩn E coli chủng thuộc Enterobacteriaceae [44] Ban đầu, bacterioxin (cũng colicin) định nghĩa protein kháng khuẩn có phổ tác dụng hẹp, hấp phụ lên vị trí đặc biệt bề mặt tế bào Khi phát kháng sinh mới, để dự đoán chất có phải bacterixin hay khơng, người ta thường xác định chất protein chúng thông qua việc sử dụng enzym proteaza Người ta xác định chất bacterioxin thông qua tiêu chuẩn sau [1] [20]: − Phổ tác dụng hẹp, có tác dụng ức chế với lồi vi khuẩn có quan hệ họ hàng với vi khuẩn sinh − Trong phân tử có phần protein cần thiết cho tác dụng ức chế − Chúng chất gây độc vi khuẩn đối kháng − Để ức chế vi khuẩn nhạy cảm, bacterioxin phải gắn vào chất mang đặc hiệu tế bào nhạy cảm − Vi khuẩn sinh bacterioxin phải tự sinh chất kháng bacterioxin hai phân tử nằm plasmit − Được tổng hợp có tác động qua lại với vi khuẩn đối kháng Bacterioxin gồm nhiều loại khác nhau, bacterioxin vi khuẩn lactic quan tâm hiệu mức độ an toàn chúng Mỗi bacterioxin chọn lọc dùng để chống lại chủng vi khuẩn cụ thể Tuy nhiên, hiệu thực phẩm cịn bị ảnh hưởng nhiều yếu tố khác Bacterioxin vi khuẩn lactic chia thành nhóm (bảng 1.1), nhóm I (lantibiotic) nhóm ý nghiên cứu Bảng 1.1: Bacterioxin vi khuẩn lactic [51] Chủng sản Bacterioxin Phổ tác dụng Kích thước (aaa) Nhóm I: Lantibiotic Nisin (A Z) Lactococcus lactis Rộng 34 Lacticin 481 Lactococcus lactis Rộng 27 Lactocin S Lactococcus sake Rộng 37 Carnocin U149 Carnobacterium pisicola Rộng 35-37 Variacin Micrococcus varians Rộng 25 Nhóm II: Phi - lantibiotic, kích thước nhỏ, bền nhiệt Lactococcin A Lactococcus lactis Hẹp 54 Lactococcin B Lactococcus lactis Hẹp 47 Lactococcin M Lactococcus lactis Hẹp 48 Mesenterocin 52B Leuconostoc mesenteroides Hẹp 32 Curvaticin FS47 Lactobacillus curvatus TB 31 Sakacin A Lactobacillus sake TBb 41 Sakacin P Lactobacillus sake TB 41 Carnobacterioxin A, B Carnobacterium piscicola TB 53, 48 Pediocin AcH/PA-1 Pediococcus acidilactici TB 44 Leucocin A-UAL-187 Leuconostoc gelidum TB 37 Enterocin 1146/A Enterococcus faecium TB 47 Piscicolin 126 Carnobacterium piscicola TB 44 Mesenterocin Y105 Leuconostoc mesenteroides TB 37 Hẹp 333 Bacterioxin giống Pediocin: Nhóm III: Kích thước lớn, bền nhiệt Helveticin J Lactobacillus helveticus Chú thích: a: aa: axit amin; TBb: Trung bình Nhóm lantibotic bao gồm peptit kích thước nhỏ (65 kDa) chứa axit amin bất thường (các axit amin thioete) lanthionin (Lan) L- metyllanthionin (MeLan) số axit amin dehydrat (dehydrated amino acids) 2,3-didehydroalanin (Dha) (do serin khử nước) 2,3didehydrobutyrin (Dhb) (do threonin khử nước) [58] 1.1.2 Lịch sử nghiên cứu nisin Nisin bacterioxin tạo số chủng vi khuẩn Lactococcus lactis Cho đến này, nisin nghiên cứu nhiều tính chất ứng dụng bảo quản thực phẩm Lịch sử nghiên cứu nisin kéo dài gần thể kỷ qua, kể từ năm 1925, người ta lần phát nisin [20] Khi xem xét bất thường trình xuất phomat tượng lên men diễn chậm hỏng, người ta phát nguyên nhân tượng thực khuẩn thể số chủng vi khuẩn hình cầu có sữa có khả ức chế chủng vi sinh vật khác trình lên men Năm 1928, Rogers Whittier người công bố tác động ức chế nisin sinh Streptococcus lactis (hiện Lactococcus lactis subsp lactis) Lactobacillus bulgaricus [20] Tên nisin Mattick Hirsch (1947) gọi xuất phát từ ý nghĩa “ chất ức chế N” (N inhibitory substance), Lactococcus lactis ban đầu phân vào nhóm N Streptococcus Ban đầu người ta nghiên cứu ứng dụng nisin y học nisin chủ yếu nghiên cứu để ứng dụng vào chống bệnh viêm vú bị sữa [37] Tuy nhiên nhiều nghiên cứu sau nisin khơng thích hợp cho mục đích độ hồ tan thấp pH sinh lý, bị thuỷ phân proteaza hệ tiêu hóa Ngược lại, xuất phát từ ưu điểm: khơng độc, khơng kích thích tăng trưởng, có hoạt tính chống Clostridium, nisin trở thành chất bảo quản thực phẩm có hiệu Năm 1951, Hirsch số tác giả khác bắt đầu kiểm tra khả ứng dụng vào thực phẩm nisin Hirch chứng minh: sử dụng chủng vi khuẩn lactic sinh nisin làm giống lên men ban đầu (starter culture) ngăn chặn hư hỏng phomat gây Clostridium botulium [36] Cùng lúc đó, nhiều nhà nghiên cứu khác sử dụng chủng vi khuẩn sinh nisin vào trình lên men phomat để ức chế lên men butyric vi khuẩn gây hư hỏng gây thối phomat [20] Cho tới năm 1957, nisin bắt đầu xuất phân xưởng sản xuất mát quy mô nông trại để bảo quản sản phẩm làm Cũng năm này, hãng Aplin and Barrett đưa chế phẩm thương mại nisin để sử dụng thực phẩm [20] Dạng chế phẩm nisin sẵn có thị trường Nisaplin TM, với thành phần 2,5 % nisin, 77,5 % NaCl sữa gầy [16, 51, 75] Gross Morrell người làm sáng tỏ cấu trúc nisin vào năm 1971 [31] Sau đó, có loại nisin phát thấy xác định tính chất (các loại ký hiệu ký tự từ A đến E Z), loại nisin A dạng hoạt động Mức độ an toàn nisin Người ta thử nghiệm mức độ an toàn nisin loại động vật chuột lợn khẳng định nisin khơng có hại gây ảnh hưởng động vật thí nghiệm [27, 70] Giá trị LD50 động vật thí nghiệm g/kg trọng lượng thể [38] Tổ chức nông lương thực thực phẩm quốc tế, tổ chức y tế giới (FAO/WHO) đồng ý cho phép sử dụng nisin bảo quản thực phẩm từ năm 1969 [15, 16, 20] Hiện nay, nisin nằm danh mục chất phụ gia phép sử dụng với ký hiệu quốc tế E234 Tổ chức FAO/WHO khuyến cáo mức hấp phụ tối đa hàng ngày nisin vào thể cho người nặng 70 kg 60 mg nisin tinh khiết, tương đương với 33000 đơn vị hoạt tính quốc tế [15, 16, 20] Tuy nhiên, Australia, Pháp, Anh, người ta cho phép sử dụng nisin không hạn chế công nghiệp chế biến phomat Ở Mỹ, lượng nisin sử dụng tối đa thực phẩm 10000 đơn vị hoạt tính gam thực phẩm; Nga 8000 đơn vị hoạt tính gam sản phẩm [15] Trong Argentina, Italy Mexico, giới hạn lại thấp, khoảng 500 đơn vị hoạt tính quốc tế gam sản phẩm format chế biến sản phẩm khác [15] Ở Mỹ, quản quản lý thuốc thực phẩm (FDA) cho phép sử dụng bacterioxin nisin phụ gia thực phẩm an toàn (GRAS - generally recognized as safe) Khi chất kháng sinh tự nhiên sử dụng chất bảo quản thực phẩm chủng vi sinh vật sinh chất kháng sinh coi vi sinh vật an tồn (GRAS - generally recognized as safe microorganism) Do vậy, việc sử dụng chủng vi khuẩn sinh nisin lactococci không bị hạn chế [15, 16] Hướng nghiên cứu nisin Hiện nay, nisin sử dụng chất phụ gia thực phẩm an toàn 50 quốc gia giới [20] Tuy nhiên, nghiên cứu nisin diễn liên tục theo số hướng chính: − Nghiên cứu mở rộng tác động nisin với chủng vi sinh vật thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, nấm men nấm mốc - vốn có tính kháng nisin điều kiện thông thường − Nghiên cứu sử dụng nisin để chế tạo màng bao gói thực phẩm, thay phương pháp bổ sung trực tiếp nisin vào thực phẩm 1.1.3 Tính chất nisin 1.1.3.1 Cấu trúc nisin Cấu trúc hoàn thiện nisin làm sáng tỏ Gross Morell vào đầu năm 70 Nisin xếp vào nhóm 1: lantibiotics chứa axit amin dị thường [40, 51, 75] Phân tử nisin bao gồm 34 axit amin có số axit amin cải biến Những cải biến khử nước xerin threonin, tạo axit amin dehydroalanin axit amin dehydrobutyrin Các axít amin liên kết với axit amin khác thơng qua cầu lưu huỳnh, tạo thành vịng đặc trưng (hình 1.1) [12, 77] Hình 1.1: Cấu trúc phân tử nisin [30, 32] Năm nội vòng phân tử tạo liên kết thioete Trong vịng A 3-7, Ala-S-Ala lanthionine, vòng B, C, D, E tương ứng 8-11, 1319, 23-26, 25-28 β-metyl lanthionine Các vòng A, B, C hợp lại thành nhóm ngăn cách với nhóm cịn lại gồm vịng D E thơng qua axit amin thứ 21 đóng vai trị “bản lề” (hình 1.4) Phân tử nisin không chứa axit amin thơm nên không hấp thụ bước sóng 280 nm [6] Các axit amin dị thường đóng vai trị nhóm nhân (nucleophile) xác định thông qua khả phản ứng với mercaptan 78 KIẾN NGHỊ VỀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO Các kết thu nghiên cứu cho thấy nisin có tác dụng với vi khuẩn Gram âm kết hợp với biện pháp xử lý nhiệt Tuy nhiên đê rõ chế tác dụng cần có nghiên cứu sâu biến đổi màng tế bào E coli LCB sau trình xử lý nhiệt Đồng thời, nghiên cứu ứng dụng kết thu vào bảo quản sản phẩm thực phẩm 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lê Thanh Bình, (1997), "Vi khuẩn Lactic - Kỹ thuật gen, vấn đề triển vọng sản xuất thực phẩm", Unesco National Workshop on application of microbiology on food processing and beverage, Hanoi 20 - 25th Oct., 1997 Nguyễn Lân Dũng , Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Tuy, (2002) Vi sinh vật học, Nhà xuất giáo dục, Hà nội Phan Thị Khánh Hoa, (2003), Nghiên cứu sinh tổng hợp nisin từ vi khuẩn Lactococcus lactis subsp lactics 11, Luận văn tiến sỹ kỹ thuật Lê Thanh Mai, (2005) Các phương pháp phân tích ngành cơng nghệ lên men, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Đình Phong Phạm, Nguyễn Tiến Thành, Lê Thanh Mai, Lê Thanh Bình (2006), "Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình hấp phụ nisin lên bề mặt tế bào vi khuẩn lactic sinh nisin", Hội nghị khoa học lần thứ 20, Đại học Bách Khoa Hà nội, 195 - 198 Tài liệu Tiếng Anh Bailey, F J., and A Hurst (1971), "Preparation of a highly active form of nisin from Streptococcus lactis, Can J Microbiol., 17, 61-7." Can J Microbiol , 17, 61 - 67 Boziaris, I S., and M R Adams (1999), "Effect of chelators and nisin produced in situ on inhibition and inactivation of gram negatives", Int J Food Microbiol., 53, 105-13 Boziaris, I S., and M R Adams (2001), "Temperature shock, injury and transient sensitivity to nisin in Gram negatives", J Appl Microbiol., 91, 715-24 Boziaris, I S., and M R Adams (2000), "Transient sensitivity to nisin in cold-shocked Gram negatives", Lett Appl Microbiol., 31 (3), 233-7 10 Boziaris, I S., L Humpheson, and M R Adams (1998), "Effect of nisin on heat injury and inactivation of Salmonella enteritidis PT4", Int J Food Microbiol., 43, 7-13 11 Breukink, E., H E van Heusden, P J Vollmerhaus, E Swiezewska, L Brunner, S Walker, A J Heck, and B de Kruijff (2003), "Lipid II is an intrinsic component of the pore induced by nisin in bacterial membranes", J Biol Chem., 278, 19898-903 80 12 Breukink, E., C van Kraaij, A van Dalen, R A Demel, R J Siezen, B de Kruijff, and O P Kuipers (1998), "The orientation of nisin in membranes", Biochemistry, 37, 8153-62 13 Breukink, E., I Wiedemann, C van Kraaij, O P Kuipers, H Sahl, and B de Kruijff (1999), "Use of the cell wall precursor lipid II by a poreforming peptide antibiotic", Science, 286, 2361-4 14 Campbell, L L., Jr., and E E Sniff (1959), "Effect of subtilin and nisin on the spores of Bacillus coagulans", J Bacteriol, 77, 766-70 15 Chen, H., and D Hoover (2003), "Bacteriocins and their Food Applications", Comprehensive reviews in food science and food safety, 2, 82 - 100 16 Cleveland, J., T J Montville, I F Nes, and M L Chikindas (2001), "Bacteriocins: safe, natural antimicrobials for food preservation", Int J Food Microbiol., 71, 1-20 17 Cutter, C., and G Siragusa (1994), "Decontamination of beef carcass tissue with nisin using a pilot scale model carcass washer", Food Microbiology 11, 481-9 18 Cutter, C N., and G R Siragusa (1996), "Reduction of Brochothrix thermosphacta on beef surfaces following immobilization of nisin in calcium alginate gels", Lett Appl Microbiol., 23, 9-12 19 Cutter, C N., and G R Siragusa (1995), "Treatments with nisin and chelators to reduce Salmonella and Escherichia coli on Beef", Journal of Food protection, 57 (9), 1028 - 1030 20 Delves-Broughton, J., P Blackburn, R J Evans, and J Hugenholtz (1996), "Applications of the bacteriocin, nisin", Antonie Van Leeuwenhoek, 69, 193-202 21 Driessen, A J., H W van den Hooven, W Kuiper, M van de Kamp, H G Sahl, R N Konings, and W N Konings (1995), "Mechanistic studies of lantibiotic-induced permeabilization of phospholipid vesicles", Biochemistry, 34, 1606-14 22 E.A Davies, H E B., R Potter, J Harris, G.C Williams and J DelvesBroughton (1998), "The effect of pH on the stability of nisin solution during autoclaving", Letters in Applied Microbiology, 27, 186-187 23 Elliason, D J., and S R Tatini (1999), "Enhanced inactivation of Salmonella typhimurium and verotoxigenic Escherichia coli by nisin at 6,5oC", Food Microbiology, 16, 257 - 267 81 24 Fang, T., and L LW (1994), "Growth of Listeria monocytogenes and Pseudomonas fragi on cooked pork in a modified atmosphere packaging/nisin combination", J Food Prot., 57, 479-85 25 Fang, T J., and Y.-T Hsueh (2000), "Effect of chelators, organic acid and storage temperature on growth of Escherichia coli O157:H7 in ground beef treated with nisin using response surface Methodology", Journal of food and Drug Analysis, (3), 187-194 26 Ferreira, M A., and B M Lund (1996), "The effect of nisin on Listeria monocytogenes in culture medium and long-life cottage cheese", Lett Appl Microbiol., 22, 433-8 27 Frazer, A C (1962), "Additives and food safety: the medical risk and the safeguard", R Soc Health J., 82, 229-32 28 Garcera, M J., M G Elferink, A J Driessen, and W N Konings (1993), "In vitro pore-forming activity of the lantibiotic nisin Role of protonmotive force and lipid composition", Eur J Biochem., 212, 417-22 29 Gert N Moll, J C., Weng C Chan, BarrieI W Bycroft, Gordon C K Roberts, Wil N Konings and Arnold J M Driessen (1997), "Role of Transmembrane pH Gradient and Membrane Binding in Nisin Pore Formation", Jounal of bacteriology, 179 (1), 135–140 30 Gross, E., and J L Morell (1970), "Nisin The assignment of sulfide bridges of beta-methyllanthionine to a novel bicyclic structure of identical ring size", J Am Chem Soc, 92, 2919-20 31 Gross, E., and J L Morell (1967), "The presence of dehydroalanine in the antibiotic nisin and its relationship to activity", J Am Chem Soc, 89, 2791-2 32 Gross, E., and J L Morell (1971), "The structure of nisin", J Am Chem Soc, 93, 4634-5 33 H.-L Alakomi, E S., M Saarela, T Mattila-Sandholm, K Latva-Kala, And I M Helander (2000), "Lactic Acid Permeabilizes GramNegative Bacteria by Disrupting the Outer Membrane", Appl Environ Microbiol., 66, 2001–2005 34 Hancock, R E W (1984), "Alterations in outer membrane permeability", Annu Rev Microbiol., 38, 237-264 82 35 Helander, M I., H L Alakomi, K S L Kala, and P Koski (1997), "Polyethyleneimine is an effective permeabilizer of Gram-negative bacteria", Microbiology 143, 3193–3199 36 Hirsch, A (1951), "Various antibiotics from one strain of Streptococcus lactis", Nature, 167, 1031-2 37 Hulse, E C., and J E Lancaster (1951), "The treatment with nisin of chronic bovine mastitis caused by Str uberis and staphylococci", Vet Rec, 63, 477-80 38 Hurst, A (1981), "Nisin", Adv Appl Microbiol., 27, 85-123 39 Imke Wiedemann, E B., Cindy van Kraaij, Oscar P Kuipers, Gabriele Bierbaum, Ben de Kruijff, and Hans-Georg Sahl (2001), "Specific Binding of Nisin to the Peptidoglycan Precursor Lipid II Combines Pore Formation and Inhibition of Cell Wall Biosynthesis for Potent Antibiotic Activity", The Journal of biological chemistry, 276 (1), 1772 - 1779 40 Israil, A (1992), "Lantibiotics", Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol, 37, 1-8 41 Jay, J., (1996) Modern food microbiology 5th ed, Chapman and Hall, New York 42 Kalchayanand, N., M B Hanlin, and B Ray (1992), "Sublethal injury makes Gram negative and resistant Gram positive bacteria sensitive to the bacteriocins, pediocin AcH and nisin ", Lett Appl Microbiol., 15, 239 - 243 43 Katsui, N., T Tsuchido, R Hiramatsu, S Fujikawa, M Takano, and I Shibasaki (1982), "Heat-Induced Blebbing and Vesiculation of the Outer Membrane of Escherichia coli", Journal of Bacteriology, 151(3), 1523-1531 44 Konisky, J (1982), "Colicins and other bacteriocins with established modes of action", Annual Rev Microbiol 36, 125-44 45 Kordel, M., and H G Sahl (1986), "Susceptibility of bacterial, eucaryotic and artifacial membranes to the disruptive action of the cationic peptides Pep and nisin", FEMS Microbiol lett., 34, 139 -144 46 Kuipers, O P., G Bierbaum, B Ottenwalder, H M Dodd, N Horn, J Metzger, T Kupke, V Gnau, R Bongers, P van den Bogaard, H Kosters, H S Rollema, W M de Vos, R J Siezen, G Jung, F 83 Gotz, H G Sahl, and M J Gasson (1996), "Protein engineering of lantibiotics", Antonie Van Leeuwenhoek, 69, 161-69 47 Lee, J.-I., H.-J Lee, and M.-H Lee (2002), "Synergistic effect of nisin and heat treatment on the Growth of Escherichia coli O157:H7", Journal of Food protection, 65 (2), 408-410 48 Leive, L (1965), "Release of lipopolysaccharide by EDTA treatment of E coli", Biochem Biophys Res Commun , 21, 290 - 296 49 Liu, W., and J N Hansen (1990), "Some chemical and physical properties of nisin, a small-protein antibiotic produced by Lactococcus lactis", Appl Environ Microbiol., 56, 2551-8 50 Madigan, M T., J M Martinko, and J Packer, (2000) Brock biology of microorganism - 9th ed., Prentice - hall, Inc., New Jersey, USA 51 McAuliffe, O., R P Ross, and C Hill (2001), "Lantibiotics: structure, biosynthesis and mode of action", FEMS Microbiol Rev, 25, 285308 52 Montville, T J., and Y Chen (1998), "Mechanistic action of pediocin and nisin: recent progress and unresolved questions", Appl Microbiol Biotechnol., 50, 511-9 53 Montville, T J., H J Chung, M L Chikindas, and Y Chen (1999), "Nisin A depletes intracellular ATP and acts in bactericidal manner against Mycobacterium smegmatis", Lett Appl Microbiol., 28, 18993 54 Morris, S L., R C Walsh, and J N Hansen (1984), "Identification and characterization of some bacterial membrane sulfhydryl groups which are targets of bacteriostatic and antibiotic action", J Biol Chem, 259, 13590-4 55 Nguyen, T T., N A Tuan, T T M Huong, L T Mai, and L T Binh (2005), "Synergistic effect of nisin and cold shock, heat treatment and chelators on E coli K12TG1", Proceedings of Regional Symposium on Chemical Engineering 2005, 1, 267 - 271 56 Nikaido, H., and T Nakae (1979), "The outer membrane of gram-negative bacteria", Adv Microb Physiol., 20, 163-250 57 Nikaido, H., and M Vaara (1985), "Molecular basis of bacterial outer membrane permeability", Microbiological Review, 49, 1-32 84 58 Olivia McAulie, R P R., Colin Hill (2001), "Lantibiotics: structure, biosynthesis and mode of action", FEMS Microbiology Reviews 25, 285 - 308 59 Osmanagaoglu, O (2005), "Sensitivity of sublethally injured gram negative bacteria to pediocin P", Journal of food safety, 25, 266 275 60 Panoff, J.-M., B Thammavongs, M Gueguen, and P Boutibonnes (1998), "Cold Stress Responses in Mesophilic Bacteria", Crybiology, 36, 75– 83 61 Rayman, M K., B Aris, and A Hurst (1981), "Nisin: a possible alternative or adjunct to nitrite in the preservation of meats", Appl Environ Microbiol., 41, 375-80 62 Rongguang Yang, M C J., and Bibek Ray (1992), "Novel Method To Extract Large Amounts of Bacteriocins from Lactic Acid Bacteria", Applied and Environmental Microbiology, 58(10), p 3355-3359 63 Russell, N (1984), "Mechanisms of thermal adaption in bacteria: blueprints for survival." Trends Biochem Sci., (March), 108 - 12 64 Russell, N., and t P Evans RI, Hellemons J, Verheul A, Abee T (1995), "Membranes as a target for stress adaption", Int J Food Microbiol., 28, 255–61 65 Russell, N J (2002), "Bacterial membranes: the effects of chill storage and food processing An overview", International Journal of Food Microbiology 79 27– 34 66 Ryser, E., and E Marth, (1999) Listeria, listeriosis and food Safety 2nd ed, Marcel Dekker, Inc., New York 67 Sahl, H.-G., (1991) Pore formation in bacterial membranes by cationic lantibiotics In: Nisin and novel lantibiotics eds Jung, G and Sahl, H.-G, ESCOM Science Publishers, Leiden, the Netherlands 68 Scheie, P., and S Ehrenspeck (1973), "Large surface blebs on Escherichia coli heated to inactivating temperatures", J Bacteriol., 114, 814-818 69 Schillinger, U., and W H Holzapfel (1996), "Guidelines for manuscripts on bacteriocins of lactic acid bacteria", Int J Food Microbiol., 33, iii-v 70 Shtenberg, A J., and A D Ignat'ev (1970), "Toxicological evaluation of some combination of food preservatives", Food Cosmet Toxicol., 8, 369-80 85 71 Stevens, K A., N A Klapes, B W Sheldon, and T R Klaenhammer (1992), "Antimicrobial action of nisin against Salmonella typhimurium lipopolysaccharide mutants", Appl Environ Microbiol., 58, 1786-8 72 Stevens, K A., B W Sheldon, N A Klapes, and T R Klaenhammer (1991), "Nisin treatment for inactivation of Salmonella species and other gram-negative bacteria", Appl Environ Microbiol., 57, 3613-5 73 Thongbai, B., P Gasaluck, and W M Waites (2005), "Morphological changes of temperature- and pH-stressed Salmonella following exposure to cetylpyridinium chloride and nisin." Swiss Society of Food Science and Technology., Article in press 74 Tsuchido, T., N Katsui, A Takeuchi, M Takano, and I Shibasaki (1985), "Destruction of the outer membrane permeability barrier of Escherichia coli by heat treatment", Appl Environ Microbiol., 50 (2), 298 - 303 75 Twomey, D., R P Ross, M Ryan, B Meaney, and C Hill (2002), "Lantibiotics produced by lactic acid bacteria: structure, function and applications", Antonie Van Leeuwenhoek, 82, 165-85 76 Vaara, M (1992), "Agents that increase the permeability of the outer membrane", Microbiological Review, 56, p 395 - 411 77 van Kraaij, C., E Breukink, M A Noordermeer, R A Demel, R J Siezen, O P Kuipers, and B de Kruijff (1998), "Pore formation by nisin involves translocation of its C-terminal part across the membrane", Biochemistry, 37, 16033-40 78 Wiedemann, I., E Breukink, C van Kraaij, O P Kuipers, G Bierbaum, B de Kruijff, and H G Sahl (2001), "Specific binding of nisin to the peptidoglycan precursor lipid II combines pore formation and inhibition of cell wall biosynthesis for potent antibiotic activity", J Biol Chem., 276, 1772-9 86 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Hình ảnh minh họa cho phương pháp khuếch tán đĩa thạch Chủng kiểm định sử dụng Lactobacillus palntarium JCM 149 Ở mức nồng độ nisin lớn, đường kính vịng vơ khuẩn có kích thước lớn Hoạt tính IU/ml Phụ lục 2: Đường chuẩn xác định hoạt tính chế phẩm nisin 2500 y = 23.105e0.3253x 2000 R2 = 0.9899 1500 1000 500 0 10 15 Đường kính vịng vơ khuẩn (D-d) (mm) 87 MỤC LỤC MỞ ĐẦU -1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU -3 1.1 Nisin 1.1.1 Bacterioxin -3 1.1.2 Lịch sử nghiên cứu nisin -6 1.1.3 Tính chất nisin 1.1.3.1 Cấu trúc nisin -9 1.1.3.2 Một số tính chất hố lý nisin - 10 1.1.3.3 Tính chất kháng khuẩn nisin 12 1.1.4 Ứng dụng bacterioxin nisin bảo quản thực phẩm - 18 1.1.4.1 Bảo quản thịt sản phẩm từ thịt - 18 1.1.4.2 Bảo quản sản phẩm sữa 20 1.1.4.3 Bảo quản sản phẩm đồ hộp 21 1.1.4.4 Bảo quản sản phẩm đồ uống lên men 21 1.2 Tác động nisin vi khuẩn Gram âm - 22 1.2.1 Cấu tạo thành tế bào vi khuẩn Gram âm - 22 1.2.1.1 Peptidoglycan 22 1.2.1.2 Lớp màng vi khuẩn Gram âm - 24 1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới cấu trúc chức thông thường màng tế bào vi khuẩn - 27 1.2.2.1 Tác nhân hóa học 27 1.2.2.2 Nhiệt độ - 30 I.2.3 Tác động kết hợp nisin với số nhân tố khác vi khuẩn Gram âm - 34 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 38 2.1 Vật liệu 38 2.1.1 Chủng vi sinh vật - 38 2.1.2 Chế phẩm Nisin - 38 2.1.3 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật - 38 2.1.3.1 Môi trường MRS 38 2.1.3.2 Môi trường LB - 39 2.1.4 Thiết bị - 39 2.2 Phương pháp nghiên cứu 39 2.2.1 Phương pháp vi sinh 39 2.2.1.1 Phương pháp xác định hoạt tính nisin 39 88 2.2.1.2 Xác định số tế bào vi sinh vật phương pháp nuôi cấy mặt thạch - 42 2.2.2 Các phương pháp vật lý- hóa lý - 44 2.2.2.1 Đo pH - 44 2.2.2.2 Đo mật độ quang OD (optical density) - 44 2.2.3 Phương pháp gây sốc - 44 2.2.3.1 Chuẩn bị huyền phù sinh khối vi khuẩn để xử lý - 44 2.2.3.2 Chuẩn bị dung dịch nisin - 44 2.2.3.3 Tiến hành thí nghiệm sốc - 45 2.2.4 Phương pháp xử lý thông kê số liệu 45 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46 3.1 Khảo sát sinh trưởng phát triển chủng E coli LCB 46 3.2 Tác động nisin tới E coli LCB nhiệt độ 37oC 48 3.3 Kết hợp tác động nisin nhiệt độ thấp E coli LCB - 49 3.4 Nghiên cứu kết hợp tác động nisin xử lý nhiệt độ cao E coli LCB. - 53 3.4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ xử lý - 53 3.4.2 Ảnh hưởng thời gian giữ nhiệt 59 3.4.3 Ảnh hưởng tốc độ sốc - 61 3.5 Nghiên cứu tác động đồng thời sốc lạnh nisin E coli LCB 65 3.5.1 Ảnh hưởng tốc độ sốc - 66 3.5.2 Ảnh hưởng thời gian giữ nhiệt độ 4oC 69 3.5.3 Ảnh hưởng nồng độ nisin - 72 3.6 Tác động kết hợp nisin sốc lạnh đông E coli LCB 73 KẾT LUẬN 77 KIẾN NGHỊ VỀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 78 TÀI LIỆU THAM KHẢO 79 PHỤ LỤC 86 89 TÓM TẮT LUẬN VĂN Nisin bacterioxin dược sinh tổng hợp số chủng vi khuẩn Lactococcus lactis Với khả ức chế tiêu diệt nhiều vi khuẩn đặc biệt nhóm vi khuẩn Gram dương gây hư hỏng thực phẩm Staphylococcus, Bacillus, Lactobacillus vi khuẩn có khả sinh bào từ Clostridium Bacillus, với mức độ an toàn, nisin chấp nhận chất phụ gia bảo quản thực phẩm 50 nước Vi khuẩn Gram âm, nhờ có cấu tạo lớp màng tế bào phức tạp, ngăn chặn tác động nisin, làm hạn chế khả ứng dụng nisin bảo quản thực phẩm Nghiên cứu tập trung xem xét tác động kết hợp nisin với biện pháp xử lý nhiệt vi khuẩn Gram âm E coli LCB, vốn có khả kháng nisin điều kiện phát triển thông thường Kết hợp nisin với biện pháp xử lý sốc nhiệt, sốc lạnh, sốc lạnh đông nhiệt độ nuôi cấy thấp để tác dụng tới E coli LCB tăng cường khả tác động nisin tới vi khuẩn Gram âm Cụ thể kết cho thấy, bị sốc nhiệt 45 - 55oC, sốc lạnh 4oC, sốc lạnh đông 20oC phát triển điều kiện nhiệt độ thấp 8oC, chủng vi khuẩn E coli LCB trở nên nhạy cảm với nisin Từ khoá: nisin, vi khuẩn Gram âm, sốc nhiệt, sốc lạnh, nhiệt độ thấp 90 ABSTRACTS Nisin is a small antimicrobial protein produced by Lactococcus lactis Nisin is active against Gram - positve bacteria including Staphylococcus, Bacillus, Lactobacillus and bacterial spores of Clostridium as well as Bacillus Because of its safety, nisin is accepted as food preservative in more than 50 countries around the world However, the outer membrane of Gram negative bacteria does not allow molecules like nisin to reach its site of action, which is the cell cytoplasmic membrane, therefore nisin is not generally active against Gram negative bacteria This study focus on the synergistic effects of nisin and some others factor such as cold shock, heat shock, reduced temperature and frezzing stress on E coli LCB The obtained results indicated that, treated cells of E coli heat shock at 45 - 55oC, cold shock at 4oC, frezzing shocks at - 20oC or growth at low temperature - 10 oC become more sensitive with nisin Key word: nisin, Gram - negative bacteria, cold shock, heat shock, ređuce temperature 91 LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Lê Thanh Bình, PGS TS Lê Thanh Mai đà tận tình hướng dẫn, bảo cho em st thêi gian häc tËp cịng nh­ thùc hiƯn ln văn Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô, anh chị đồng nghiệp Bộ môn Công nghệ Sản phẩm Lên men đà động viên, giúp đỡ tạo điều kiện cho em thêi gian lµm viƯc, häc tËp vµ thùc hiƯn luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban Giám Hiệu, Trung tâm Đào tạo Sau đại học LÃnh đạo Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm đà tạo điều kiện cho trình học tập Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đà cổ vũ, ủng hộ trình học tập thực luận văn Hà nội, ngày 21 tháng 11 năm 2006 Tác giả Nguyễn Tiến Thành 92 DANH MC VIT TT IU (nternational unit): Đơn vị quốc tế PMF (proton motive force): Lực đẩy proton qua màng nguyên sinh chất Gras (generally reconsidered as safe): Thành phần an toàn MAP (modified atmosphere packaging): Kỹ thuật bao gói hiệu chỉnh khí EDTA: Elilendiamin tetraaxetat LPS: Lipopolisaccarit OM (outer membrane): Lớp màng vi khuẩn gram âm CFU (colony forming unit): Đơn vị hình thành khuẩn lạc ... cảm với nisin Xuất phát từ vấn đề nêu trên, đề tài: ? ?Nghiên cứu tăng cường tác dụng ức chế E coli nisin cách kết hợp với biện pháp xử lý nhiệt? ?? tiến hành nhằm góp phần tăng cường khả ứng dụng nisin. .. R Siragusa nghiên cứu xử lý nisin kết hợp với số hợp chất chelator Các kết cho thấy số lượng tế bào Salmonella E coli thịt bị giảm có tác động kết hợp nisin với chelator [19] Các chủng vi khuẩn... nhiều so với mẫu đối chứng khơng có nisin trình xử lý nhiệt [8] Jeong-in Lee cộng (2002) nghiên cứu tác động đồng thời nisin xử lý nhiệt phát triển E coli O157:H7 Sau bị xử lý nhiệt chế độ 50,