Nghiên cứu tách chiết beta glucan từ thành thế bào nấm men bia

Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ Sinh học BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN NGỌC SƠN NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT BETA-GLUCAN TỪ THÀNH TẾ BÀO NẤM MEN BIA Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS QUẢN LÊ HÀ Hà Nội – 2013 Nguyễn Ngọc Sơn Đại học Bách khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ Sinh học MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU PHẨN I TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan nấm men bia 1.1.1 Đặc điểm hình thái tế bào nấm men 1.1.2 Cấu tạo tế bào nấm men 1.2 Tổng quan betaglucan .7 1.2.1 Tính chất β-glucan thành tế bào nấm men S cerevisiae .7 1.2.2 Nguồn nguyên liệu chứa β-glucan 1.2.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng β-glucan 1.2.4 Các ứng dụng β-glucan 12 1.3 Các phương pháp thu nhận β-glucan từ thành tế bào nấm men bia 22 1.3.1 Phương pháp học để phá vỡ tế bào nấm men 22 1.3.2 Phương pháp sóng siêu âm để phá vỡ tế bào nấm men 23 1.3.3 Phương pháp tự phân để phá vỡ thành tế bào nấm men 23 1.3.4 Phương pháp dùng hóa chất để thu nhận β-glucan từ thành tế bào nấm men 25 1.4 Tổng quan papain (enzyme thủy phân protein nấm men) 29 1.4.1 Papain từ nhựa đu đủ (Carica papaya L) 29 1.4.2 Hoạt tính enzyme nguyên tắc tác dụng papain 30 PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Vật liệu nghiên cứu 32 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 32 2.1.2 Thiết bị sử dụng nghiên cứu 33 2.1.3 Hóa chất sử dụng nghiên cứu 34 2.2 Phương pháp nghiên cứu 34 2.2.1 Các bước nghiên cứu để thu nhận β-glucan từ tế bào nấm men 34 2.2.2 Phương pháp xác định độ ẩm nấm men 38 2.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng Protein theo phương pháp Kjeldahl 38 2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng carbohydrate 39 Nguyễn Ngọc Sơn Đại học Bách khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ Sinh học 2.2.5.Phương pháp xác định hàm lượng β-glucan (bộ kit Megazyme-ireland) 42 PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47 3.1 Khảo sát phương pháp phá vỡ tế bào nấm men để thu nhận thành phần chủ yếu thành tế bào nấm men .47 3.1.1 Tự phân nấm men 47 3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng việc sử dụng sóng siêu âm để phá vỡ thành tế bào nấm men khoảng thời gian khác 55 3.1.3 Ảnh hưởng việc sử dụng dung dịch kiềm nóng để phá vỡ thành tế bào nấm men .56 3.1.4 Kết khảo sát phương án phá vỡ tế bào nấm men khác để thu nhận thành tế bào 57 3.2 Khảo sát phương pháp dùng kiềm để tách protein khỏi thành tế bào nấm men để thu nhận phần lớn β-glucan .59 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ NaOH tới hiệu tách protein 60 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ tới hiệu tách protein 61 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng thời gian tới hiệu tách protein 63 3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung môi tới hiệu tách protein 64 3.3 Nghiên cứu chế độ tạo sản phẩm có hàm lượng β-glucan cao từ thành tế bào nấm men bia 66 3.3.1 Lựa chọn phương án tinh sản phẩm 66 3.3.2 Lựa chọn chế độ sấy tạo sản phẩm 68 3.4 Đề xuất quy trình tách chiết thu nhận β-glucan từ thành tế bào nấm men bia 70 3.4.1 Thuyết minh quy trình 72 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 74 4.1 Kết luận 74 4.2 Kiến nghị .75 TÀI LIỆU THAM KHẢO 76 PHỤ LỤC 82 Phụ lục 82 Nguyễn Ngọc Sơn Đại học Bách khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ Sinh học 1.1 Phương pháp xác định hàm lượng Protein theo phương pháp Kjeldahl 82 Phụ lục 83 2.1 Phương pháp xác định hàm lượng axit amin thuốc thử ninhydrin (dùng để xác định hoạt độ enzyme papain) 83 2.2 Phương pháp xác định hoạt độ protease papain 85 Phụ lục 86 3.1 Kết thí nghiệm xác định hàm lượng β-glucan 86 Phụ lục 88 4.1 Hình ảnh trình tiền xử lý, tự phân, tách protein 88 Nguyễn Ngọc Sơn Đại học Bách khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ Sinh học LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, cố gắng nỗ lực thân, nhận ủng hộ, giúp đỡ tận tình thầy giáo, gia đình bạn bè Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Quản Lê Hà - Viện Công Nghệ Sinh Học & Thực Phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội tận tình bảo tơi suốt q trình hồn thành luận văn này, Tôi xin chân thành cảm ơn tới cô giáo thuộc môn Công nghệ Sinh học (PGS.TS Lê Thanh Hà, PGS TS Nguyễn Lan Hương), PGS.TS Khuất Hữu Thanh– Trường Đại học Bách khoa Hà Nội giảng dạy giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực luận văn Xin cảm ơn đến tồn thể cán bộ, cơng nhân viên Cơng ty cổ phần Bia Hà Nội- Hải Dương giúp đỡ tạo điều kiện cho làm nghiên cứu suốt trình học tập làm luận văn Đồng thời tơi xin chân thành cảm ơn gia đình tơi thầy cô bạn học viên, sinh viên làm việc phịng thí nghiệm thuộc Viện Cơng nghệ Sinh học & Thực Phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội tạo điều kiện, quan tâm, động viên góp ý cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày 25 tháng năm 2013 Học viên Nguyễn Ngọc Sơn Nguyễn Ngọc Sơn Đại học Bách khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ Sinh học LỜI CAM ĐOAN Tôi Nguyễn Ngọc Sơn xin cam đoan nội dung luận văn với đề tài “Nghiên cứu tách chiết Beta-Glucan từ thành tế bào nấm men bia’' cơng trình nghiên cứu sáng tạo tơi thực hướng dẫn PGS.TS Quản Lê Hà - Bộ môn Công nghệ Sinh học Nguyễn Ngọc Sơn Đại học Bách khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ Sinh học DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Ký hiệu Tên đầy đủ Ghi BYC Brewer’s yeast whole cells Nấm men bia sau tiền xử lý MOS Mannan-Oligo-Saccharide v/phút Vòng/phút PA Phương án SP Sản phẩm LDL Low Density Lipoprotein Lipoprotein tỷ trọng thấp DANH MỤC BẢNG, BIỂU STT Tên bảng biểu Trang Bảng 1.1 Cấu trúc β-glucan tách từ số nguồn khác Bảng 1.2 Các β-glucan có hoạt tính sinh học thường sử dụng Bảng 1.3 Một số ứng dụng điển hình β-glucan thực phẩm 11 19 Bảng 2.1 Hoạt lực enzyme papapain 33 Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm sử dụng papain thủy phân nấm men 37 Bảng 2.3 Cách pha nồng độ glucose xây dựng đường chuẩn 40 Bảng 2.4 Giá trị OD dung dịch glucose nồng độ khác 41 10 Bảng 3.1 Ảnh hưởng thời gian đến kết thủy phân nấm men Bảng 3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến kết thủy phân nấm men Bảng 3.3 Ảnh hưởng pH đến kết thủy phân nấm men Nguyễn Ngọc Sơn 48 49 51 Đại học Bách khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Công nghệ Sinh học Bảng 3.4.Ảnh hưởng hàm lượng papain đến hiệu suất thủy phân Bảng 3.5.Ảnh hưởng việc sử dụng enzyme thủy phân sau nấm men tự phân Bảng 3.6 Ảnh hưởng trình xử lý song siêu âm thời gian khác Bảng 3.7 Kết phá vỡ tế sơ thành tế bào nấm men NaOH Bảng 3.8.Tổng hợp kết khảo sát xử lý tế bào nấm men bia Bảng 3.9 khảo sát ảnh hưởng nồng độ NaOH đến hàm lượng protein, carbohydrate hàm lượng chất rắn Bảng 3.10 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến đến hàm lượng protein, carbohydrate hàm lượng chất rắn Bảng 3.11 Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến hàm lượng protein, carbohydrate hàm lượng chất rắn Bảng 3.12 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung môi đến hàm lượng protein, carbohydrate hàm lượng chất rắn Bảng 3.13 Tổng hợp nghiên cứu chế độ xử lý nấm men điều kiện khác để tạo sản phẩm có chứa β-glucan Bảng 3.14 Khảo sát chế độ sấy Nguyễn Ngọc Sơn 54 55 57 58 60 62 63 65 67 69 Bảng 3.15 Thành phần sản phẩm phương pháp sấy khác 53 70 Đại học Bách khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ Sinh học DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ STT Tên hình vẽ, đồ thị Trang Hình 1.1 Cấu tạo tế bào nấm men Hình 1.2 Cấu tạo thành tế bào nấm men Hình 1.3 Cấu trúc β-glucan thành tế bào nấm men 7 Hình 1.4 Dectin-1 trung gian cho hiệu sinh học βglucan Hình 1.5 Sơ đồ phá vỡ thành tế bào nấm men phương pháp học Hình 1.6 Sơ đồ thu nhận β-glucan từ tế bào nấm men S cerevisiae Hình 1.7 Sơ đồ thu nhận phân đoạn β-glucan từ tế bào nấm men S cerevisiae Hình 2.1 Bã thải nấm men bia 10 23 26 28 32 Hình 2.2 Các bước thu nhận β-glucan từ thành tế bào nấm men bia 35 10 Hình 2.3 Phương trình tạo màu glucose Anthrone 40 11 Hình 3.1 Sản phẩm sau sấy thường 69 12 Hình 3.2 Sản phẩm sau sấy đơng khơ 69 13 Hình 3.3 Sản phẩm sau sấy phun 69 14 15 Hình 3.4 Quy trình cơng nghệ thu nhận sản phẩm β-glucan từ thành tế bào nấm men bia Đồ thị 2.2 Phương trình đường chuẩn glucose bước sóng λ=630nm Nguyễn Ngọc Sơn 71 41 Đại học Bách khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ Sinh học LỜI MỞ ĐẦU Trong năm gần Việt Nam giới nhu cầu phát triển, số lượng nhà máy chế biến rượu, bia, ngày gia tăng đem lại giá trị to lớn m t kinh tế cho đất nước Tuy nhiên c ng với phát triển này, lượng bã men thải khổng lồ thải ngồi mơi trường Trung bình sản xuất 1000 lít bia xả 10 kg men thải với độ ẩm trung bình khoảng 85% Lượng nấm men chủ yếu d ng để chế biến thức ăn động vật hay d ng nguồn nguyên liệu rẻ tiền để làm dịch chiết nấm men tự phân, phần lại thải ngồi mơi trường gây nhiễm đến mơi trường sống xung quanh [20,56] Trong tế bào nấm men, thành tế bào chiếm khoảng 10-20% trọng lượng khô tế bào, β glucan chiếm khoảng 50-60% lượng chất khơ thành tế bào nấm men Chính vậy, việc sản xuất sản phẩm phụ, có giá trị kinh tế β-glucan mang lại lợi nhuận cao cho nhà máy xí nghiệp đồng thời cịn có tác động làm giảm thiểu tác động m t môi trường từ nhà máy công nghiệp Nhiều nước giới Hàn Quốc, Mỹ, Nhật tiến hành nghiên cứu tách chiết β-glucan từ thành tế bào nấm men để sử dụng yếu tố kích thích hệ miễn dịch tác động tích cực đến hệ thống bảo vệ vật chủ, tăng tính đề kháng vật chủ đến hầu hết loại bệnh nhiễm khuẩn, nấm, virut c ng nhiều loại sinh vật ký sinh khác Ngoài ra, nhà khoa học Nhật sử dụng β glucan yếu tố miễn dịch hiệu điều trị ung thư [27] Bên cạnh đó, β glucan cịn chất chống oxy hoá, tái tạo da, làm mờ nếp nhăn lên d ng làm chất bổ sung để sản xuất mỹ phẩm [39] Ở Việt Nam, hướng nghiên cứu cịn bước đầu nghiên phương pháp tách chiết β-glucan từ thành tế bào nấm men bia S cerevisiae từ tận thu nguồn bã thải nấm men bia nhằm sử dụng ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm mỹ phẩm Nguyễn Ngọc Sơn Đại học Bách khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ Sinh học cịn có khả tận thu nguồn axit amin từ trình thủy phân nấm men để làm nguyên liệu phụ gia có giá trị cao dinh dưỡng ứng dụng cơng nghệ thực phẩm, sinh học 4.2 Kiến nghị Trong phạm vi đề tài nghiên cứu khuôn khổ nấm men bia thải Công ty cổ phần Bia Hà Nội – Hải Dương nghiên cứu số yếu tố để tách β-glucan từ thành tế bào nấm men - Đề nghị tiếp tục nghiên cứu loại nấm men thải nhiều công ty khác nhằm tận thu nguồn nguyên liệu sẵn có - Tiến hành nghiên cứu invivo người động vật để xem khả tăng cường hệ miễn dịch sử dụng sản phẩm β-glucan từ tế bào nấm men bia thải - Tiến hành sản xuất thử nghiệm quy mô pilot quy mô bán công nghiệp nhằm tận thu toàn nấm men thải để sản xuất β-glucan phục vụ nhu cầu nước khắc phục vấn đề ô nhiễm môi trường phần lớn nhà máy bia Nguyễn Ngọc Sơn 75 Đại học Bách khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ Sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO A TIẾNG VIỆT Lê Ngọc Tú (2002), Hóa Sinh học Công nghiệp, Nhà xuất KHKT, Hà Nội Lương Đức Phẩm (2006), Vi Sinh Vật học Công nghiệp, Nhà xuất KHKT, Hà Nội Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến (1998), Công nghệ enzyme, Nhà xuất nông nghiệp TPHCM Phạm Thị Trân Châu (1983), Những hiểu biết enzyme, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn hữu Chấn (1983), Enzyme xúc tác sinh học, Nhà xuất Y học, Hà nội Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Ánh Tuyết, Lê Thị Thủy Tiên, Tạ Thu Hằng, Huỳnh Ngọc Oanh, Nguyễn Thủy Hường, Phan Thị Huyền (2004) Công nghệ Enzyme, Nhà xuất Đại Học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Văn Đạt, Ngơ Văn Tám (1974), Phân tích lương thực thực phẩm, Bộ lương thực thực phẩm Quản Lê Hà (1990), Nghiên cứu số đặc tính ứng dụng hệ enzyme thuỷ phân tinh bột protein sản xuất đồ uống, Luận văn Tiến sĩ khoa học, Đại học Bách Khoa Hà nội Nguyễn Đức Lương, O Cường, Nguyễn Ánh Tuyết, Lê Thị Thuỷ Tiên, Tạ Thu Hằng, Huỳnh Ngọc Oanh, Nguyễn Thúy Hường, Phan Thị Huyền (2004) Công nghệ enzyme, Nhà xuất Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh 10 Nguyễn Văn M i (2001), Thực hành hóa sinh học, Nhà xuất KHKT 11 TS Nguyễn Hoài Hương (2009), Thực hành hóa sinh, Trường đại học Kỹ thuật Cơng nghệ TP.HCM 12 Đ ng Thị Thu, Nguyễn Thị Xuân Sâm, Tơ Kim Anh (1997), Thí nghiệm hóa sinh cơng nghiệp, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Nguyễn Ngọc Sơn 76 Đại học Bách khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Cơng nghệ Sinh học 13 Trần Đình Toại, Lê Đức Ngọc, Trần Đình Thanh (1991) Quy trình tinh papain từ nhựa đu đủ phương pháp muối tách, Cơng trình nghiên cứu khoa học trung tâm nhiệt đới Việt-Xô, Phần Trang 142 14 Trần Đình Toại (1997), Papain từ nhựa đu đủ xanh, Trung tâm nhiệt đới Việt – Nga 15 Trần Đình Toại, Đỗ Ngọc Lanh, Nguyễn Văn Thiết, Nguyễn Thu Hoài 1994), “Nghiên cứu khả thủy phân số loại protein papain”, Tạp chí hóa học học T.32, số 4, tr 33-36 16 Trần Đình Thanh(1991), bước đầu khai thác chế biến nhựa đu đủ, Luận văn tốt nghiệp đại học, khoa Hóa, Đại học Tổng Hợp Hà Nội 17 Trần Đình Thanh (2009), phân tách papain nghiên cứu sử dụng chế phẩm papain có hoạt tính sinh học cao, Luận án Tiến sĩ Hóa học, Viện hóa học hợp chất thiên nhiên, Hà Nội 18 Trần Xuân Ngạch (2007), Công nghệ enzyme, Trường Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng 19 Trần Đình Toại, Lê Đức Ngọc, Trần Đình Thanh (1993) “Nghiên cứu tách chiết tính chất papain”, Tạp chí Hóa học, T31, No 4, 29-31 20 TS Phạm Việt Cường (2005), Nghiên cứu xây dựng công nghệ sản xuất βglucan từ thành tế bào nấm men dùng công nghiệp thực phẩm, dược phẩm mỹ phẩm, (thuộc đề tài KC 04-28) B TIẾNG ANH 21 A J Willis and E W Yemm (1954), The Estimation of Carbohydrate in Plant Extracts by Anthrone 22 Hyman J V Goldberg and Thomas G Ludwig (1954), The anthrone method for the determination of carbohydrate in food and in oral rising Eastman Dental Dispensary, Rochester, N Y 23 Horst Feldmann (2005), Yeast Molecular biology, University of Munich Nguyễn Ngọc Sơn 77 Đại học Bách khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ Sinh học 24 V Zechner – Krpan et al (2010), “β-Glucans from Brewer’s Yeast” Food Technol Biotechnol” 48 (2) 189–197 (2010), and Dried by Different Methods Characterization of b-Glucans Isolated from Brewer’s Yeast 25 E.R Simard, M Bouksaim, “Process for brewer's yeast debittering” US patent 5716653 (1995) 26 Hunter Jr KW, of microparticulate RA Gault, MD Berner (2002), Preparation β- glucan from S cerevisiae for use in immune potentiation Lett appl microbiol 35: 267-271 27 Roger Manson, (2011), What is beta glucan?, A Concise Guide to the Benefits and Uses of the Most Powerful Natural Immune Enhancer Known to Science 28 Vaibhav Shah, M.Pharm (2009), Molecular and funtional analysis of betaglucan-mediated microglial, Presented in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree Doctor of Philosophy in the Graduate School of The Ohio State University 29 Juny Yan+, Daniel J Allendorf & Brian Brandley Expert Opin Ther (2005), Yeast whole glucan particle (WGP) β-glucan conjuntion with antitumour monocloral antibodies to treat cancer 5(5): 691-702 30 Hasan TANGÜLER, Hüseyin ERTEN (2009), The Effect of Different Temperatures on Autolysis of Baker’s Yeast for the Production of Yeast Extract 31 Gina Marinescu, Antoneta Stoicescu (2009), Researches concerning the preparation of spent brewer’s yeast β-glucans Journal of Agroalimentary Processes and Technologies, 15(4), 547-553 32 R.J Wheatcroft, J Kulandai, R.W Gilbert, K.J Sime, C.G Smith, W.H Langeris (2002), Production of b-glucan-mannan pre parations by autolysis of cells under certain pH, temperature and time conditions, US patent 6444448 Nguyễn Ngọc Sơn 78 Đại học Bách khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ Sinh hc 33 N Dallies, J Franỗois, V Paquet (1998), A new method for quantitive determination of polysaccharides in the yeast cell wall Application to cell wall defective mutants of Saccharomyces cerevisiae, Yeast, 1297– 1306 34 J S D Bacon, V C Farmer, D Jonesand Irene F Taylor, The Glucan Components of the Cell Wall of Baker's Yeast (Saccharomyces cerevisiae) 35 Stefan Kwiatkowski, Ursula Thielen, Phyllis Glenney and Colm Moran (2009), Study of Saccharomyces cerevisiae Cell Wall Glucans, Inst Brew 115(2), 151–158 36 B Waszkiewicz-Robak and E Bartnikowska Warsaw (2009) Effects of spent brewer’s yeast and biological β-glucans on selected parameters of lipid metabolism in blood and liver in rats Journal of Animal and Feed Sciences, 18 699–708 37 Murli Dharmadhikari (2011), Yeast Autolysis, Lowa State University Extension and Outreach 38 Russell L Blaylock, MD, Member (2012), Yeast β-1,3-glucan and Its Use Against Anthrax Infection and in the Treatment of Cancer , University of Mississippi Recent Patents 39 Celine Laroche1,* and Philippe Michaud Laboratoire de Génie Chimique et Biochimique,Université Blaise Pascal (2007) NewDevelopments and Prospective Applications for (1,3) Glucans, Recent Patents on Biotechnology 2007, 1, 59-73 40 Vlatka Petravic-tominac Vesna Zechner-Krpan Slobodan GRBA Siniša Srecec, Ines Panjkota-KrbavČiĆ Lana VidoviĆ, Biological Efects of Yeast β-Glucans review article 41 Gertie J Smits, Johan C Kapteyn,Herman vanden Ende and Frans M Klis (1999) Cell wall dynamics in yeast, Current Opinion in Microbiology, Vol 2: 348-352 Nguyễn Ngọc Sơn 79 Đại học Bách khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ Sinh học 42 Yu et al “Methol and preparing Glucan and mannan, glucan preparation and mannam preparation produced thereby and use therefor” Fe 24 2011 43 Aguilar-Uscanga B, Francois JM (2003), A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation Lett Appl Microbiol 37: 268–274 44 Donald C Vosti and M A Joslyl (1953) Autolysis of Baker's Yeast department of Food Technology, University of California, Berkeley, California Gina Marinescu, Antoneta Stoicescu 45 Dunarea (2009), ‘‘Researches concerning the preparation of spent brewer’s yeast β-glucans’’ Food Science and Engineering Faculty Domneasca Street 111 Journal of Agroalimentary Processes and Technologies, 15(4), 547-553 46 Osumi M(1998), The ultrastructure of yeast cell wall structure and formation, Micron 29: 207–233 47 G L Huang College of Chemistry (2010), Extraction of proteins from yeast cell wall, African Journal of Biotechnology Vol 9(21), pp 3207-3209, 24 May 48 Sara Figueiredo, João Nuno Moreira, Carlos F.G.C Geraldes, Silvio Aime, EnzoTerreno (2011) ‘‘Yeast Cell Wall Particles: a promising class of natureinspired microcarriers for multimodal imaging’’ The Royal Society of Chemistry 2011 49 Z HOLAN, K.BERAN a n d I.MILER (1980), Preparation of Zymosan from Yeast Cell Walls, Institute of Mlicrobiology, 25, 501-504 (1980) 50 David J Manners, Alan J.Masson and James C Patterson (1973) “The Structure of a beta-(1-3)-D-Glucan from Yeast Cell Walls” Department of Brewing and Biological Sciences,) 135, 19-30 in Great Britain 51 Frans M Klis*, Andre Boorsma and Piet W J De Groot Swammerdam (2006), Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae, Institute for Life Sciences, University of Amsterdam, BioCentrum Amsterdam, The Netherlands Yeast 2006; 23: 185–202., Nguyễn Ngọc Sơn 80 Đại học Bách khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ Sinh học 52 Aguilar-Uscanga, B Francois JM (2003) A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation, Lett Appl Microbiol 37: 268–274 53 Klis FM, Mol P, Hellingwerf K, Brul S (2002) Dynamics of cell wall structure in Saccharomyces cerevisiae, FEMS Microbiol Rev 26: 239-256 54 Lipke PN, Ovalle R (1998), Cell wall structure and new challenges, J Bacteriol architecture in yeast new 180:3735–3740 55 Vesna ZECHNER-KRPAN (2009), Potential Application of Yeast β- Glucans in Food Industry, review article 56 M Suphantharika *, P Khunrae, P Thanardkit, C Verduyn (2002) Preparation of spent brewers yeast b-glucans with a potential application as animmunostimulant for black tiger shrimp, Penaeus monodon, Department of Biotechnology, Faculty of Science, Mahidol University, Rama Road, Bangkok 10400, Thailan 57 Celine Laroche and Philippe Michaud (2007) New Developments and Prospective Applications for (1,3) Glucans,Recent Patents on Biotechnology 2007, 1, 59-73 58 Morris GJ, Winters L, Coulson GE, Clarke KJ (1986) Effect of osmotic stres on the ultrastructure and viability of the yeast Saccharomyces cerevisiae J Gen Microbiol 132: 2023–2034 59 Wolfgang Kunze (2009), Technology brewing and malting, international edition C NGUỒN INTERNET 60 http://vi.wikipedia.org/wiki/Beta-glucan 61 http://en.wikipedia.org/wiki/Sonication 62 http://biochemie.web.med.uni-muenchen.de/Yeast_Biol Nguyễn Ngọc Sơn 81 Đại học Bách khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ Sinh học PHỤ LỤC Phụ lục 1.1 Phương pháp xác định hàm lượng Protein theo phương pháp Kjeldahl * Nguyên tắc: Khi đốt nóng ngun liệu đem phân tích với H2SO4 đậm đ c, hợp chất hữu bị oxy hoá Cacbon hydro tạo thành CO2 H2O nitơ sau giải phóng dạng NH3 kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4 tan dung dịch [11] Đuổi amoniac khỏi dung dịch NaOH, đồng thời cất thu lượng dư axit boric H3PO3 (NH4)2SO4 + 2NaOH → 2NH4OH + Na2SO4 2NH4OH + H3BO3 → (NH4)2B4O7 + 7H2O Định phân lượng tetraborat amơn tạo thành dung dịch H2SO4 chuẩn, qua tính lượng nitơ mẫu vật (NH4)2B4O7 + H2SO4 + 5H2O → (NH4)SO4 + H3BO3 * Cách thức thực hiện: - Cân 0,5g mẫu cắt nhỏ chuyển vào bình Kjeldahl - Cho tiếp vào bình Kjeldahl 10ml H2SO4 đậm đ c (d=1,84) Để tăng nhanh trình vơ hố (đốt cháy) cần phải cho thêm hỗn hợp xúc tác CuSO4 K2SO4 ( tỷ lệ 1:3) Sau đun dung dịch hồn tồn màu để nguội - Chuyển toàn dung dịch sau vơ hố xong bình Kjeldahl vào bình định mức “100 ml’’ thêm nước cất đến vạch mức, lắc - Lấy 10 ml dung dịch thí nghiệm sau vơ hóa định mức đến 100ml 10ml dung dịch NaOH 40% cho vào bầu cất Quá trình cất kết thúc sau 15 phút, định phân lượng tetraborat amôn tạo thành dung dịch H2SO4 0,01N Cất mẫu trắng để kiểm chứng với thuốc thử thao tác thay 10 ml dung dịch vơ hố 10 ml nước cất Kết tính theo công thức: Nguyễn Ngọc Sơn 82 Đại học Bách khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ Sinh học Trong : X: Hàm lượng protein (%) 6,25: Hệ số chuyển đổi sang hàm lượng protein a: Số ml H2SO4 0,01N d ng để chuẩn độ mẫu thí nghiệm b: Số ml H2SO4 0,01N d ng để chuẩn độ mẫu kiểm chứng 0,14: mg nitơ ứng với 1ml H2SO4 0,01N V: Dung tích bình định mức V1: ml dung dịch thí nghiệm hút từ bình định mức vào bầu cất m: Lượng mẫu đem cất đạm (mg) Phụ lục 2.1 Phương pháp xác định hàm lượng axit amin thuốc thử ninhydrin (dùng để xác định hoạt độ enzyme papain) Bản chất phương pháp dung ninhydrin phản ứng với axit amin (dạng α-aminoaxit) tạo phức chất màu xanh tím Tiến hành đo màu trực tiếp có sử dụng pyridine chất ổn định màu[10] Axit glutamic α-amin tham gia phản ứng tạo màu với ninhydrin cho màu xanh đo bước sóng 570nm Có thể tóm lược quy trình đường chuẩn axit glutamic theo sơ đồ: Pha dung dịch 0,1% (0,1g/100ml) Dung dịch aa phân tích 100 ml Lấy 10 ml định mức đến 100 ml Pha nồng độ từ 0,01g/l-0,1g/l Pha loãng Lấy 1ml + 1ml ninhydrin 2% + 1ml pyridine 20% Xác định mật độ quang bước sóng 570 nm Đun nóng 750C 10 phút Hình 2.1.1 Các bước tiến hành xác định hàm lượng axit amin xây dựng đường chuẩn axit glutamic Nguyễn Ngọc Sơn 83 Đại học Bách khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ Sinh học Dung dịch sau pha theo nồng độ 0,01g/l đến 0,1g/l tiến hành phản ứng với ninhydrin Lấy 1ml dịch cộng với 1ml pyridine 20% 1ml ninhydrin 2%, đun nóng nhiệt độ 750C 10 phút đo mật độ quang bước sóng 570 nm Dựng đường chuẩn có phương trình chuẩn ứng với R2 Cụ thể sau Giá trị mật độ quang xây dựng đường chuẩn axit glutamic Bảng 2.1.1.Giá trị OD dung dịch axit glutamic nồng độ khác Nồng độ Kết đo OD(570nm) 0,001 0,041 0,002 0,123 0,003 0,232 0,004 0,335 0,05 0,402 0,06 0,497 Đồ thị 2.1.1.Phương trình đường chuẩn axit glutamic Phương trình đường chuẩn axit glutamic có dạng y=9.2x-0.050 Nguyễn Ngọc Sơn 84 Đại học Bách khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ Sinh học 2.2 Phương pháp xác định hoạt độ protease papain Một đơn vị hoạt lực enzyme protease định nghĩa gram axit amin tạo sau phản ứng thủy phân enzyme với chất gelatin kiện nhiệt độ 500C 30 phút Hàm lượng axit amin xác định phản ứng với ninhydrin tính theo axit glutamic Phương pháp xác định hoạt độ enzyme protease tóm lược sơ đồ sau [10] Pha dung dịch enzyme papain (0,1g/100ml) Chuẩn bị dung dịch gelatin nồng độ 2% Lấy 1ml dung dịch E + 4ml gelatin ổn nhiệt 500C 30 phút Lấy 1ml dịch, pha loãng 25 lần Lấy 1ml dịch + 1ml ninhydrin 20% + 1ml pyridine 20% Đun nóng nhiệt độ 750C 10 phút Xác định mật độ quang bước sóng 570 nm hì Hình 2.2.1 Các bước tiến hành xác định hoạt lực protease Kết đo mật độ quang thu được, sử dụng phương trình đường chuẩn glutamic để tính hoạt lực enzyme phụ mục [2.2.5] Hoạt độ enzyme tính theo cơng thức: Trong đó: C: g/l tính từ phương trình đường chuẩn n: hệ số pha lỗng 5: thể tích ống 5ml 10: thời gian phản ứng 1000/147 hệ số quy đổi theo axit glutamic Nguyễn Ngọc Sơn 85 Đại học Bách khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ Sinh học 2.3 Bảng xác định hàm hoạt lực enzyme papain Giá trị mật độ Hệ số pha Lượng aa sau Hoạt lực enzyme quang (570nm) loãng thủy phân (g) (U/g) 0,55 250 16,7935 5545 0,59 250 17,1739 5915 0,565 250 17,1195 5684 Phụ lục 3.1 Kết thí nghiệm xác định hàm lượng β-glucan Bảng 3.1 phân tích hàm lượng α- glucan Giá trị Mẫu Khối lượng Hàm lượng mật độ quang Độ ẩm mẫu phân (510nm) % tích (mg) BYC 0,048±0,004 100 4,04 SP1 0,210± 0,03 100 18,65±0,53 SP4 0,280±0,03 100 23,64±0,64 SP5 0,270±0,04 100 22,35±0,45 SP6 0,280±0,02 100 23,50±0,51 SP7 0,281±0,008 100 23,67±0,36 SP8 0,282±0,008 100 23,87±0,40 SP9 0,282±0,008 100 23,87±0,53 Nguyễn Ngọc Sơn 86 α-glucan 0,68 Đại học Bách khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ Sinh học Bảng 3.2 phân tích hàm lượng glucan tổng số Giá trị Mẫu Khối lượng Hàm lượng mật độ quang Độ ẩm mẫu phân tích Glucan (510nm) % (mg) tổng số BYC 0,038±0,003 100 17,53±0,667 SP1 0,480 ± 0,05 100 42,38±0,53 SP4 0,940±0,03 100 82,66±0,64 SP5 0,980±0,04 100 81,87±0,45 SP6 1,010 ±0,03 100 83,49±0,51 SP7 1,010±0,04 100 83,47±0,40 SP8 1,020±0,02 100 85,23±0,40 SP9 1,020±0,03 100 85,24±0,52 Nguyễn Ngọc Sơn 87 Đại học Bách khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ Sinh học Phụ lục Bảng 4.1 Sự ảnh hưởng thời gian ngâm dung dịch NaOH khoảng thời gian khác đến hàm lượng carbohydrate, protein, chất rắn Thời gian Hàm lượng Hàm lượng (Phút) carbohydrate protein (g) ( g) (N×6,25) 30 2,95±0,04 0,209±0,002 3,62±0,065 60 2,23±0,29 0,088±0,004 2,46±0,046 90 1,95±0,23 0,082±0,015 2,17±0,042 120 1,89±0,19 0,078±0,003 2,10±0,051 SP1 4,85±0,053 5,02±0,016 10 Hàm lượng chất rắn (g) 4.1 Hình ảnh trình tiền xử lý, tự phân, tách protein Nấm men bia thải Nguyễn Ngọc Sơn 88 Đại học Bách khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ Sinh học Nấm men sau tiền xử lý Nấm men sau tự phân Sản phẩm sau xử lý NaOH Nguyễn Ngọc Sơn 89 Đại học Bách khoa Hà Nội ... gồm: Nghiên cứu điều kiện thủy phân nấm men bia: - Thủy phân nấm men tự phân nấm men - Tự phân nấm men kết hợp với sử dụng enzyme Nghiên cứu điều kiện thích hợp để tách β -glucan từ thành tế bào nấm. .. lượng β -glucan (Megazyme-ireland) 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Các bước nghiên cứu để thu nhận β -glucan từ tế bào nấm men Sơ đồ tách β -glucan từ thành tế bào nấm men bia tham khảo từ nhiều... PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1.1 Bã nấm men bia - Bã nấm men bia Saccharomyces cerevisiae sử dụng nghiên cứu bã nấm men thải từ Công ty cổ phần Bia Hà