Vai trò của nấm 2
Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN- Thời gian thực hiện: từ tháng 2 đến tháng 7 năm 2005.- Địa điểm: phòng thí nghiệm Bộ môn Vi sinh - Khoa Sinh học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh. 3.2 VẬT LIỆU3.2.1 Nguồn gốc mẫu thí nghiệmChủng giống nấm hầu thủ Hericium erinaceum nhận từ phòng thí nghiệm Vi Sinh - Khoa Sinh học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh.3.2.2 Hóa chất3.2.2.1 Môi trường nhân giống cấp 1Sử dụng môi trường Mizuno cải tiến:Nước chiết (∗ ): 1 lítCao nấm men: 1gPepton : 1gAgar : 20 gGlucose : 20 gpH : 6 – 6,5(∗) gồm: Khoai tây : 300 g Cà rốt : 100 g Giá đậu : 70 g25 Đun sôi (∗ ) 15 - 20 phút để lấy nước chiết sau đó bổ sung nước cất đủ 1lítMôi trường nấu xong cho vào ống nghiệm và khử trùng ở 121 0C/45 phút.3.2.2.2 Môi trường nhân giống cấp 2 (môi trường hạt)Sử dụng môi trường lúa + cám gạo.3.2.2.3 Môi trường khảo sátKhảo sát trên cơ chất:+ Mạt cưa+ Bã mía + Rơm Có bổ sung thêm: + Cám gạo+ Urê ((NH2)2CO)Hấp khử trùng môi trường 121 0C/90 phút3.2.2.4 Hóa chất phân tíchNa2SO4 khan nước, ete etyl, aceton, Na2SO4 khan nước, hỗn hợp xúc tác K2SO4/CuSO4 (9:1), H2SO4 đặc, H2SO4 N/100, H3BO3 2 %, NaOH N/100, acid tricloacetic (TCA), thuốc thử đỏ metyl, phenol 5 %.3.2.3 Thiết bịMáy đo độ ẩm (Denver Instrument)Máy đo pH (Accumet)AutoclaveMáy ly tâmTủ cấy vô trùngTủ ấm (Prolabo)Tủ sấy26 Cân phân tíchKính hiển viKính lúp Bộ dụng cụ thủy tinh ClevengerMáy cất đạm Parnas WargnerMáy SoxhletMáy so màu quang điệnQue cấy, dao cắt và các thiết bị khác của phòng thí nghiệm3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU3.3.1 Phân lập giống thuần khiếtThực chất phương pháp này là kĩ thuật tách đoạn vô tính hệ sợi song hạch của mô nấm. Đây là kĩ thuật thông dụng, đơn giản mà vẫn đảm bảo chất lượng giống.3.3.1.1 Từ quả thể nuôi trồng (sử dụng phương pháp nuôi cấy mô)Chọn những quả thể trưởng thành và không bị úng, mốc, tiến hành phân lập. Dùng dao mổ vô trùng tách lấy phần mô nấm bên trong, kích thước khoảng 4 - 10 mm2, cấy vào ống nghiệm thạch nghiêng. Các thao tác tiến hành trong điều kiện vô trùng. Nuôi ủ ở điều kiện nhiệt độ phòng (30 ± 2 oC).3.3.1.2 Từ môi trường hạt có hệ sợi tơDùng que cấy móc lấy hạt thóc có tơ cấy sang ống thạch nghiêng. Nuôi ủ ở điều kiện nhiệt độ phòng (30 ± 2 oC).3.3.2 Phương pháp nhân giống và cấy chuyền Lúa đem nấu vừa nở, trộn cám gạo làm lớp áo bên ngoài, cho vào chai (sử dụng chai nước ngọt) 250 ml. Khử trùng ở 121 0C/90 phút. Sau đó để nguội và cấy giống từ môi trường thạch sang . Ủ tối ở nhiệt độ phòng (30 ± 2 oC). Khi tơ lan đầy chai thì chuyển sang môi trường khảo sát.27 3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng các nguồn cơ chất thí nghiệmTheo dõi hai chỉ tiêu là tốc độ lan tơ và năng suất trên các loại cơ chất ở các tỉ lệ phối trộn dinh dưỡng khác nhau. Các thí nghiệm trên ba loại cơ chất được tiến hành cùng thời điểm, cùng điều kiện nuôi trồng (nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng). Sau đó rút ra kết luận cho mỗi loại cơ chất và so sánh giữa các loại cơ chất với nhau.Khảo sát trên các cơ chất sau đây:• Mạt cưa bổ sung: Cám gạo: 4 %, 6 %, 8 %, 10 % Urê: 0,5 ‰, 1 ‰• Rơm bổ sung: Cám gạo: 4 %, 6 %, 8 %, 10 % Urê: 0,5 ‰, 1 ‰• Bã mía bổ sung: Cám gạo: 4 %, 6 %, 8 %, 10 % Urê: 0,5 ‰, 1 ‰Các cơ chất đã được phối trộn theo tỉ lệ như trên, trộn đều đạt độ ẩm 60 – 65 %. Cho vào ống nghiệm Ф25 rồi hấp khử trùng 121 0C/90 phút. Để nguội, cấy giống từ môi trường hạt, ủ tối. Sau 3 ngày bắt đầu đo tốc độ lan tơ. Sau đó cứ 3 ngày đo một lần, ghi nhận kết quả. Dùng thống kê sinh học tính tốc độ ăn sâu mỗi ngày. 3.3.4 Trồng thu quả thể, tính năng suất Phối trộn cơ chất theo tỉ lệ trên, sau đó dồn vào bịch nilon PP kích thước 14 × 24 cm với khối lượng cơ chất như sau:+ Bịch mạt cưa : 300 g/bịch.+ Bịch bã mía : 150 g/bịch + Rơm : 200 g/bịch.28 Hấp khử trùng ở 121 0C/90 phút. Sau đó để nguội và cấy giống từ môi trường hạt, ủ tối ở nhiệt độ phòng (30 ± 2 0C) . Khi tơ lan đầy bịch, mang vào phòng tưới, mở miệng và tưới đón nấm. Nhiệt độ phòng tưới 23 – 25 0C, độ ẩm 85 - 90 %, ánh sáng 500 - 1000 lux.Khi quả thể có tua bào tầng dài khoảng 2 – 3 cm thì thu hoạch và tính năng suất trên từng loại cơ chất ở từng tỉ lệ phối trộn. Năng suất tính bằng trọng lượng quả thể nấm tươi thu được trên khối lượng cơ chất đã phối trộn.3.3.5 Quan sát hình thái giải phẫu+ Hình thái cấu tạo quả thể: quan sát hình dạng quả thể qua các giai đoạn phát triển. Cấu tạo quả thể hoàn chỉnh (thân nấm và tua bào tầng). Xem xét cấu trúc cắt ngang. Chụp hình.+ Đảm và đảm bào tử: cắt một sợi của tua bào tầng, đặt lên một tấm lame, dùng lamelle đè bẹp xuống. Quan sát dưới kính hiển vi ×40, xem cấu trúc đảm và đảm bào tử. Chụp hình.3.3.6 Phân tích một vài chỉ tiêu dinh dưỡng của nấm nuôi trồngSau khi khảo sát tốc độ lan tơ và năng suất, chọn trong mỗi loại cơ chất một công thức phối trộn cho năng suất tốt nhất có khả năng nuôi trồng. Quả thể của những công thức phối trộn này được phân tích về tỷ lệ đạm (protein), đường, béo (lipid), khoáng (tro).3.3.6.1. Khảo sát hàm lượng protein tổng sốDùng phương pháp Kjeldahl để xác định hàm lượng nitơ tổng số ở các mẫu nấm thu được trên các nghiệm thức như trên. Sau đó quy đổi ra lượng protein tổng số có trong mẫu nấm bằng cách nhân với 4,32.29 Nguyên lí: dưới tác dụng của H2SO4 đậm đặc ở nhiệt độ cao, các hợp chất có chứa nitơ trong nấm bị phân hủy và bị oxi hóa đến CO2 và H2O, còn nitơ chuyển thành amoniac (NH3) và tiếp tục kết hợp với H2SO4 tạo thành muối amoni sulfat ((NH4)2SO4). 3.3.6.2 Khảo sát hàm lượng lipid tổng sốDùng phương pháp Soxhlet để xác định hàm lượng lipid tổng số trên các nghiệm thức khác nhau.Nguyên lí: dùng ete nóng để hòa tan tất cả chất béo tự do trong nấm. Sau đó để bay hơi hết ete, cân chất béo còn lại và tính ra hàm lượng lipid trong nấm.3.3.6.3 Khảo sát đường tổng sốĐịnh lượng đường tổng số trong mẫu nấm bằng phản ứng màu.Nguyên lí: dựa trên phản ứng màu đặc trưng của đường với phenol với sự hiện diện của H2SO4 đặc. So màu các dung dịch đã được tạo màu ở bước sóng 490 nm. Đối chiếu với đường chuẩn đã được dựng sẵn từ những dung dịch chuẩn biết trước nồng độ để tính ra nồng độ đường trong dung dịch. Từ đó tính ra hàm lượng đường trong nấm.3.3.6.4 Khảo sát hàm lượng tro tổng sốDùng phương pháp nung ở nhiệt độ cao để tính hàm lượng tro (khoáng) tổng số trong các mẫu nấm.Nguyên lí: sử dụng nhiệt độ cao để phân hủy hoàn toàn các hợp chất hữu cơ có trong mẫu. Mẫu chỉ còn lại các chất khoáng. Từ đó tính được hàm lượng tro tổng số của mẫu nấm.3.3.7 Phân tích tinh dầu nấm hầu thủ+ Tách tinh dầu bằng phương pháp chưng cất hơi nước.Là phương pháp dùng hơi nước bão hòa để lôi cuốn tinh dầu ra khỏi nấm, sau đó cho ngưng tụ. Trong đó có hai pha: tinh dầu và nước. Dùng dung môi ete etyl để tách tinh dầu ra khỏi nước (tinh dầu và ete etyl cùng một pha). Sau đó cho dung môi bay hơi (dùng máy cô quay) để thu nhận tinh dầu.+ Xác định thành phần tinh dầu 30 Sử dụng phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ (GC-MS). Được thực hiện bằng máy sắc kí khí ghép khối phổ của hãng HEWLETT PACKARD 4P 6890 Series tại phòng Phân tích trung tâm Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.Hồ Chí Minh. GC-MS dùng để xác định các thành phần có trong mẫu. Trong nghiên cứu tinh dầu phương pháp này rất có hiệu quả vì có khả năng xác định tất cả các chất trong mẫu với hàm lượng rất nhỏ (vài µg).Nguyên lí cơ bản của phương pháp sắc kí khí dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất tan giữa hai pha lỏng và khí.Tinh dầu được đánh giá về màu sắc, mùi, vị. Kết quả phân tích sắc kí khí ghép khối phổ cho biết thành phần hóa học của tinh dầu.3.3.8 Phương pháp xử lí số liệu Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi nghiệm thức lặp lại 4 lần, lấy giá trị trung bình. Số liệu được xử lí bằng bảng tính ExcelGiá trị trung bình của mẫuX = Sai sốS = 31 Σ Xii=1 N N(N-1)∑ (Xi-X)2Ni=1 . Cám gạo+ Urê ((NH2)2CO)Hấp khử trùng môi trường 121 0C/90 phút3 .2. 2.4 Hóa chất phân tíchNa2SO4 khan nước, ete etyl, aceton, Na2SO4 khan nước,. và khử trùng ở 121 0C/45 phút.3 .2. 2 .2 Môi trường nhân giống cấp 2 (môi trường hạt)Sử dụng môi trường lúa + cám gạo.3 .2. 2.3 Môi trường khảo sátKhảo sát trên