Đa phần các công trình nghiên cứu này cho rằng chất lượng tinh trùng bảo quản trong tủ lạnh chịu sự ảnh hưởng của tỉ lệ pha loãng, chất bảo quản và nhiệt độ [3].. Một vài nghiên cứu [r]
(1)ẢNH HƯỞNG CỦA TỈ LỆ PHA LOÃNG, CHẤT BẢO QUẢN VÀ NHIỆT ĐỘ ĐẾN CHẤT LƯỢNG TINH TRÙNG CÁ MÚ CỌP
BẢO QUẢN TRONG TỦ LẠNH
EFFECTS OF DILUTION RATIO, EXTENDER AND TEMPERATURE ON SPERM QUALITY OF TIGER GOUPER SPERM STORED IN REFRIGERATOR
Lê Minh Hoàng1, Phạm Quốc Hùng1
Ngày nhận bài: 21/10/2015; Ngày phản biện thông qua: 22/12/2015; Ngày duyệt đăng: 15/12/2016 TĨM TẮT
Mục đích nghiên cứu tìm tỉ lệ pha lỗng, chất bảo quản nhiệt độ thích hợp cho chất lượng tinh trùng cá mú cọp tối ưu bảo quản tủ lạnh Tinh trùng cá mú cọp pha loãng chất bảo quản BSA, 0,3 M Glucose, MPRS ASP, với tỷ lệ 1:1, 1:3, 1:5, 1:10 (tinh dịch:chất bảo quản) và bảo quản thang nhiệt độ 0oC, 2oC, 4oC Kết thu từ thí nghiệm cho thấy: Tinh trùng cá
mú cọp bảo quản tủ lạnh chất bảo quản ASP với tỷ lệ 1:3 nhiệt độ 4oC cho chất lượng tốt
hoạt lực trì đến ngày thứ 24 Kết cho thấy tinh trùng cá mú cọp bảo quản ở nhiệt độ thấp tủ lạnh.
Từ khóa: Cá mú cọp, tinh trùng, bảo quản tủ lạnh, chất bảo quản ABSTRACT
The objectives of this study were to fi nd the optimal dilution ratio, extender and temperature for sperm quality of tiger grouper stored in refrigerator Sperm of tiger grouper was diluted in different extender (BSA, 0,3 M Glucose, MPRS or ASP), at dilution ratios of 1:1, 1: 3, 1: 5, or 1:10 (sperm:extender) and stored at 0oC,
2oC, 4oC The results from these experiments showed that sperm quality of tiger grouper was the best if they
stored in ASP at ratio of 1:3 at a temperature of 4oC and sperm maintained motility for 24 days These results
demonstrate that sperm of tiger grouper can be chilled-stored in refrigerator. Keywords: Tiger grouper, sperm, chilled storage in refrigerator, extender
1 Viện Nuôi trồng thủy sản - Trường Đại học Nha Trang
THÔNG BÁO KHOA HỌC
I ĐẶT VẤN ĐỀ
Bảo quản lạnh tinh trùng động vật thủy sản nhiệt độ cận 0oC yêu cầu số tình Việc làm giúp khơng phải ni giữ động vật thủy sản đực thụ tinh nhân tạo Trong trình sản xuất giống nhân tạo, việc bảo quản lạnh tinh giúp cho trình thụ tinh chủ động hơn, đơn giản việc vận chuyển cá bố mẹ từ nơi đến nơi khác, phục vụ lai tạo
giống mới, khắc phục khó khăn sản xuất nhân tạo số loài cá lệch pha cá đực cá đồng thời bảo vệ nguồn gen Ngoài ra, bảo quản lạnh tinh trùng cịn có vai trị quan trọng việc hạn chế tối đa việc lưu giữ cá đực, bảo tồn dòng thuần, hạn chế suy giảm cận huyết quần đàn [3]
(2)cá lồi cá biển có giá trị kinh tế [6, 7] Đặc biệt, cá mú cọp lồi có đặc tính biến đổi giới tính từ lúc nhỏ lúc thành thục sau chuyển thành đực Ngồi ra, lồi cá khơng đồng pha sinh sản nhân tạo thu tinh trùng trứng lại chưa đạt mức độ thành thục Đây trở ngại lớn công tác sinh sản nhân tạo không chủ động đồng pha đực Chính vậy, việc nghiên cứu bảo quản lưu trữ tế bào sinh dục thành thục nói chung tinh trùng cá nói riêng tủ lạnh giải pháp tốt cho việc chủ động sinh sản nhân tạo
Trên giới Việt Nam, có nhiều cơng trình nghiên cứu bảo quản lạnh tinh trùng số lồi cá cơng bố tinh trùng cá hồi bảo quản điều kiện có kháng sinh 0oC trì thời gian sống lên tới 34 ngày [18], tinh trùng cá tra trì hoạt lực lên đến 21 ngày bảo quản 4oC tương tự hoạt lực tinh trùng cá tầm kéo dài đến 28 ngày [12, 17], tinh trùng cá đù vàng bảo quản dịch tương nhân tạo có bổ sung kháng sinh trì hoạt lực lên tới 26 ngày [15], tinh trùng cá chẽm mõm nhọn bảo quản dịch tương nhân tạo trì hoạt lực đến ngày thứ 24 nhiệt độ 2oC [4] Đa phần cơng trình nghiên cứu cho chất lượng tinh trùng bảo quản tủ lạnh chịu ảnh hưởng tỉ lệ pha loãng, chất bảo quản nhiệt độ [3] Một vài nghiên cứu công bố cá mú cọp nghiên cứu đặc tính tinh dịch ảnh hưởng cation lên hoạt lực tinh trùng [2] nghiên cứu ảnh hưởng tỉ lệ pha loãng, nhiệt độ, pH áp suất thẩm thấu lên hoạt lực tinh trùng [5] Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu lĩnh vực lên bảo quản tinh trùng cá mú cọp Chính thế, nghiên cứu “Ảnh hưởng
tỉ lệ pha loãng, chất bảo quản nhiệt độ lên chất lượng tinh trùng cá mú cọp Epinephelus fuscoguttatus bảo quản tủ lạnh” việc làm có ý nghĩa nhằm xác định tỉ lệ pha loãng, chất bảo quản nhiệt độ tối ưu cho chất lượng tinh trùng cá mú cọp bảo quản tủ lạnh đạt chất lượng tốt
II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1 Quản lý cá đực vuốt tinh
(3)2 Đánh giá chất lượng tinh
Tinh dịch pha loãng nước biển nhân tạo với tỷ lệ 1:100 (1 µL tinh dịch 99 µL nước biển nhân tạo), sau dó dùng micropipette hút 1µL hổn hợp đặt lam kính quan sát kính hiển vi (Olympus BX41, Japan) có kết nối với camera (Olympus C-7070, Japan) Những mẫu có 85% tinh trùng vận động đưa vào nghiên cứu
3 Ảnh hưởng chất bảo quản, tỉ lệ pha loãng nhiệt độ đến chất lượng tinh trùng bảo quản tủ lạnh
Để xác định chất bảo quản, tỉ lệ pha loãng nhiệt độ tốt cho bảo quản tinh trùng cá,
ta tiến hành bảo quản tinh trùng chất bảo quản sau: BSA, 0,3 M Glucose, MPRS, ASP tỷ lệ pha loãng 1:1, 1:3, 1:5, 1:10 (tinh dịch: chất bảo quản) Thành phần chất bảo quản sử dụng để bảo quản tinh trùng tủ lạnh thể Bảng Tinh trùng sau pha loãng chất bảo quản cho vào eppendorf tube 1,5 mL bảo quản 03 tủ lạnh (Sanyo SR-125RN, Việt Nam) khác nhiệt độ đặt 0oC, 2oC, 4oC Hoạt lực tinh trùng tiến hành đánh giá sau ngày lần, chẳng hạn như: ngày 3, 6, 9… tinh trùng ngừng hoạt động
Bảng Thành phần chất bảo quản 100ml nước cất
Thành phần Chất bảo quản
BSA 0,3 M Glucose MPRS ASP
NaCl (mg) 1,0 0,675 0,353 0,5
NaH2PO4 (mg) - - 0,0216 0,02
NaH CO3 (mg) - - 0,0432 0,01
KCl (mg) - - 0,0298 0,04
CaCl2.2H2O (mg) - - 0,0166 0,01
BSA (mg) 1,0 - -
-Glucose (mg) - 5,945 0,98
-MgCl2.6H2O (mg) - - 0,0229 0,02
pH 7,8 7,5 7,7 8,1
ASTT (mOsm/kg) 342 335 327 32
ASTT: áp suất thẩm thấu, BSA: bovine serum albumin, ASP: artifi cial seminal plasma (dịch tương nhân tạo), MPRS: modifi ed plaice ringer solution
4 Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu trình bày dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn Số liệu xử lý phần mềm Microsoft Excel Tác động chất bảo quản, tỷ lệ pha loãng kháng sinh đến hoạt lực tinh trùng phân tích phương sai yếu tố (One-way ANOVA) phần mềm SPSS 18.0
III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 1 Ảnh hưởng chất bảo quản lên chất lượng tinh trùng cá mú cọp bảo quản tủ lạnh
(4)Tinh trùng bảo quản ASP có hoạt lực tốt so với MPRS, BSA 0,3 M Glucose Tinh trùng bảo quản ASP có hoạt lực 4,00%, với vận tốc đạt 33,00mm/s sống đến ngày thứ 24, khi bảo quản 0,3 M Glucose, MPRS, BSA có hoạt lực vận tốc 9,00% 41,00mm/s sống đến 21 ngày; 8% 27,00mm/s sống đến 15 ngày; 4,00% 28,00mm/s sống đến 15 ngày Qua Hình 1, ta thấy hoạt lực tinh trùng có sai khác không đáng kể chất bảo quản sau ngày thứ nhất, cụ thể: chất bảo quản ASP, MPRS BSA hoạt lực khơng có sai khác lại sai khác vận tốc so với lô tinh trùng bảo quản 0,3 M Glucose nhóm có sai khác so với lơ đối chứng Sau ngày bảo quản, hoạt lực vận tốc tinh trùng chất bảo quản gần có sai khác rõ rệt có nhóm ASP lơ đối chứng khơng có sai khác đến ngày thứ có sai khác hoàn toàn chất bảo quản so với lô đối chứng Tuy nhiên, tinh trùng bảo quản chất bảo quản ASP có hoạt lực, vận tốc thời gian sống lớn nhất, kéo dài đến 24 ngày
Muchlisin [16] cho chất bảo quản mơi trường đệm giúp pha lỗng tinh dịch
để có lượng tinh trùng pha lỗng lớn sinh sản nhân tạo Do đó, việc sử dụng chất bảo quản trình bảo quản lạnh tinh trùng cần thiết BSA chất bảo quản tối ưu cho số loài cá biển cá bơn (Scophthalmus maximus) [11], cá chẽm châu Âu (Dicentrarchus labrax) [16] Tuy nhiên, nghiên cứu kết cho thấy khơng tốt cho với ASP Ngồi ra, MPRS chất bảo quản tốt cho cá chẽm châu Á (Lates calcarifer) Khi áp dụng chất cho bảo quản tinh cá mú cọp mang lại kết so với ASP Bên cạnh đó, 0,3 M Glucose chất bảo quản tốt cho số loài cá mú cá mú đen (Epinephelus malabaricus) [10, 14] áp dụng vào nghiên cứu khơng mang lại hiệu so với ASP Việc lựa chọn chất bảo quản thích hợp quan trọng, thành phần chất bảo quản yếu tố định lên kết bảo quản Việc áp dụng kết số nghiên cứu trước cho cá mú cọp không mang lại kết tốt Một nghiên cứu gần người ta phân tích thành phần tinh dịch cá tạo môi trường bảo quản dựa vào thành phần Trong nghiên cứu dịch tương nhân tạo (ASP)
Hình Hoạt lực (%) vận tốc tinh trùng (mm/s) cá mú cọp bảo quản BSA, 0,3 M Glucose, MPRS, ASP tỉ lệ 1:3 tủ lạnh 4oC
(5)Qua đồ thị ta thấy tinh trùng bảo quản tỷ lệ 1:3 cho hoạt lực tốt 4,56%, vận tốc 12,33mm/s kéo dài thời gian sống đến 21 ngày ngắn tỷ lệ 1:10 hoạt lực 25,22%, với vận tốc 71,11mm/s sống đến ngày
Như vậy, thấy rằng: sau ngày bảo quản hoạt lực tinh trùng ASP tỷ lệ 1:1, 1:3 lô đối chứng khơng có sai khác, lại sai khác vận tốc so với tỷ lệ 1:10 Đến ngày thứ hoạt lực vận tốc tinh ASP tỷ lệ có sai khác hồn tồn với so với lơ đối chứng Tuy nhiên, hoạt lực tinh trùng bảo quản
ở tỷ lệ 1:3 có hoạt lực, vận tốc thời gian sống tốt nhất, kéo dài đến ngày thứ 21
Theo nghiên cứu Le ctv [15] tinh trùng cá đù vàng (Larimichthys polyactis) bảo quản tỷ lệ 1:3 cho thời gian sống lâu (14 ngày), tỷ lệ 1:1 (10 ngày) tỷ lệ 1:5 (12 ngày) Đối với tinh trùng cá tuyết Đại T ây Dương (Gadus morhua), cá tuyết chấm đen (Melanogrammus aeglefi nus) cá mướp vân (Osmerus mordax) tỷ lệ pha loãng 1:3 tốt so với tỷ lệ 1:1, 1:2, 1:5 1:10 [13] Ở tinh trùng cá trê Phi (Clarias gariepinus) tỷ lệ 1:5 tốt so với tỷ lệ 1:3 hay 1:10 [3] Ở tinh trùng cá chẽm mõm nhọn
Hình Hoạt lực (%) vận tốc tinh trùng (mm/s) với tỷ lệ pha loãng khác bằng chất bảo quản ASP tủ lạnh 4oC
AS: Sau pha lỗng Control: khơng pha lỗng Số liệu trình bày dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn Đồ thị cột biểu thị hoạt lực tinh trùng, đồ thị đường biểu thị vận tốc tinh trùng
chính dựa thành phần có tinh dịch cá mú cọp Đối với tinh trùng cá đù vàng
(Larimichthys polyactis) khi bảo quản ASP (Artifi cial Seminal Plasma) sống 14 ngày marine fi sh Ringer’s solution 10 ngày [15] Tinh trùng cá bơn (Scophthalmus maximus) bảo quản Ringer 200 artifi cial seminal liquid cho thời gian hoạt lực kéo dài tới 6-7 ngày [11] Tinh trùng cá chẽm mõm nhọn (Psammoperca waigiensis)bảo quản ASP cho thời gian hoạt lực kéo dài đến ngày thứ 24 [4] Dựa
kết nghiên cứu việc bảo quản tinh trùng cá mú cọp ASP mang lại hiệu tốt so với bảo quản chất bảo quản khác Như vậy, loài cá khác chất bảo quản khác
2 Ảnh hưởng tỷ lệ pha loãng đến chất lượng tinh trùng cá mú cọp bảo quản tủ lạnh
Hoạt lực (%) tinh trùng cá mú cọp bảo quản ASP tỷ lệ pha lỗng 1:1,1:3, 1:5, 1:10 thể thơng qua
(6)(Psammoperca waigiensis) tỷ lệ pha loãng 1:3 tốt so với tỷ lệ 1:1, 1:5 hay 1:10 [4] Như vậy, loài cá khác tỷ lệ pha lỗng bảo quản khác
3 Ảnh hưởng nhiệt độ lên chất lượng tinh trùng cá mú cọp bảo quản tủ lạnh
Hoạt lực (%) tinh trùng cá mú cọp bảo quản ASP với tỷ lệ pha loãng 1:3 thang nhiệt độ 0ºC, 2ºC, 4ºC thể thơng qua Hình
Hình Hoạt lực (%) vận tốc tinh trùng (mm/s) với tỷ lệ pha loãng 1:3, ở thang nhiệt độ 0ºC, 2ºC, 4ºC ASP
AS: Sau pha lỗng Số liệu trình bày dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn Đồ thị cột biểu thị hoạt lực tinh trùng, đồ thị đường biểu thị vận tốc tinh trùng
Qua đồ thị ta thấy tinh trùng bảo quản thang nhiệt độ 4°C cho hoạt lực 10,00% vận tốc 54,00mm/s tốt nhất, kéo dài thời gian sống đến 24 ngày ngắn nhiệt độ 0°C 2°C với hoạt lực 8,11%, 8,00% vận tốc lần lược 55,78mm/s; 55,00mm/s sống đến 21 ngày
Nhiệt độ thấp giảm phát triển vi khuẩn Điều giải thích bảo quản tinh trùng nhiệt độ thấp khoảng dao động từ 0-4oC kéo dài thời gian tồn tinh trùng Sự tồn tinh trùng bảo quản lạnh nhiệt độ 0-4oC giảm tỉ lệ trao đổi chất [9] Ngoài ra, cịn phụ thuộc vào lồi cá đặc biệt loài cá nhiệt đới Ở cá hồi, tinh trùng tồn vài ngày bảo quản chúng nhiệt độ 1-4oC [8] Ở cá bơn, tinh trùng tồn 30 ngày bảo quản chúng nhiệt độ 0oC Ngồi lồi cá song tinh trùng tồn ngày bảo quản chúng nhiệt độ 4oC Một nghiên cứu gần Le ctv [15] cho nhiệt độ 0oC nhiệt độ tối ưu cho bảo quản tinh trùng cá đù vàng Bên cạnh đó,
Lê Minh Hoàng ctv [4] cho nhiệt độ 2oC nhiệt độ tối ưu cho bảo quản tinh trùng cá chẽm mõm nhọn Trong nghiên cứu thấy nhiệt độ 0oC 2oC lại cho kết thấp so với nhiệt độ 4oC Như vậy, hoạt lực, vận tốc tinh trùng cá mú cọp bảo quản 4°C tốt nghiên cứu thời gian kéo dài đến ngày thứ 24
IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1 Kết luận
Tinh trùng dược bảo quản ASP cho thời gian hoạt lực vận tốc tốt trì đến ngày thứ 24 ngắn bảo quản BSA trì đến ngày thứ 15
Thời gian hoạt lực vận tốc tinh trùng trì lâu bảo quản ASP tỷ lệ pha loãng 1:3 lên đến 24 ngày ngắn tỷ lệ 1:10 sống đến ngày thứ
(7)2 Kiến nghị
Qua thí nghiệm cho thấy tỷ lệ sống thời gian hoạt lực tinh trùng cá mú cọp thay đổi theo thời gian bảo quản, chất lượng tinh trùng thay đổi Do đó, nghiên cứu sau nên tiến hành cho thụ tinh nhằm đánh giá chất lượng tinh trùng
một cách xác
Do thời gian nghiên cứu ngắn nên chưa đánh giá tác động kháng sinh lên thời gian bảo quản tinh trùng tủ lạnh Chính thế, nghiên cứu sau nên tiến hành thí nghiệm để đánh giá vai trò kháng sinh lên thời gian bảo quản lạnh tinh trùng
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1 Đồn Khắc Bộ, 2008 Kỹ thuật ni cá mú NXB Đà Nẵng
2 Hoàng Thị Hiền, Lê Minh Hồng, 2014 Một số đặc tính tinh trùng ảnh hưởng cation lên hoạt lực tinh trùng cá mú cọp (Epinephelus fuscoguttatus Forsskal, 1775) Tạp chí nghề cá sơng Cửu Long, 3:23-32 Lê Minh Hoàng, 2015 Bảo quản lạnh tinh trùng số đối tượng thủy sản NXB Nơng nghiệp, TP Hồ Chí
Minh: 156 p
4 Lê Minh Hồng, Bơng Minh Đương, Mai Như Thủy, Phạm Quốc Hùng, 2013 Nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá chẽm mõm nhọn Psammoperca waigiensis trong tủ lạnh Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản
5 Lê Minh Hoàng, Hoàng Thị Hiền, Phạm Phương Linh, Phạm Quốc Hùng, 2014 Ảnh hưởng tỷ lệ pha loãng, nhiệt độ, pH áp suất thẩm thấu lên hoạt lực tinh trùng cá mú cọp Epinephelus fuscoguttatus Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản
6 Vũ Văn Toàn, 2002 Danh mục lồi ni biển ni nước lợ Việt Nam - Hợp phần hỗ trợ nuôi trồng thủy sản biển nước lợ (SUMA), Danida Bộ Thủy sản, Hà Nội: 118 p
7 Lê Anh Tuấn, 2004 Tình hình nuôi cá mú Việt Nam: Hiện trạng trở ngại mặt kỹ thuật Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản, Số đặc biệt:174-179
Tiếng Anh
8 Basavaraja N, Hegde SN., 2005 Some characteristics and short-term preservation of spermatozoa of Deccan mahseer, Tor khudree (Sykes) Aquaculture Research, 36(5):422-430
9 Bobe J, Labbe C., 2009 Chilled storage of sperm and eggs In: E Cabrita V Robles, P Herráez, editor Methods in reproductive aquaculture: Marine and Freshwater Species: CRC Press, Taylor Francis Group: 219-235 10 Chao NH, Tsai HP, Liao IC., 1992 Short- and long-term cryopreservation of sperm and sperm suspension of the
grouper Epinephelus malabaricus Asian Fish Sci., 5:103-116
11 Chereguini O, Cal RM, Dreanno C, Ogier de Baulny B, Suquet M, Maisse G Short-term storage and cryopreservation of turbot (Scophthalmus maximus) sperm Aquat Living Resour 1997;10:251-255
12 Christensen JM, Tiersch TR Refrigerated storage of channel catfi sh sperm Journal of the World Aquaculture Society 1996;27(3):340-346
13 DeGraaf JD, Berlinsky DL Cryogenic and refrigerated storage of Atlantic cod (Gadus mor hua) and haddock (Melanogrammus aeglefi nus) spermatozoa Aquaculture 2004;234(1-4):527-540
14 Gwo JC Cryopreservation of black grouper (Epinephelus malabaricus) spermatozoa Theriogenolgy 1993;39(6):1331 - 1342
15 Le MH, Lim HK, Min BH, Park MS, Chang YJ Stor age of yellow croaker Larimichthys polyactis semen The Israeli Journal of Aquaculture - Bamidgeh 2011;63
16 Muchlisin ZA Review: Current stat us of extenders and cryoprotectants on fi sh spermatozoa cryopreservation Biodiversitas 2005;6(1):66-69
17 Park C, Chapman FA An Extender solution for the short-term storage of sturgeon Semen North American Journal of Aquacultu re 2005;67:52-57