Nghiên cứu và thử nghiệm hạt từ nano được chức năng hóa bề mặt trong chẩn đoán Virus Epstein Barr

Nghiên cứu và thử nghiệm hạt từ nano được chức năng hóa bề mặt trong chẩn đoán Virus Epstein Barr Nghiên cứu và thử nghiệm hạt từ nano được chức năng hóa bề mặt trong chẩn đoán Virus Epstein Barr Nghiên cứu và thử nghiệm hạt từ nano được chức năng hóa bề mặt trong chẩn đoán Virus Epstein Barr luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHẠM THỊ TRÀ NGHIÊN CỨU VÀ THỬ NGHIỆM HẠT TỪ NANO ĐƢỢC CHỨC NĂNG HĨA BỀ MẶT TRONG CHẨN ĐỐN VIRUS EPSTEIN BARR Chun ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN TS Nguyễn Thị Vân Anh Hà Nội – 2011 Khoa Sinh häc Khãa 2009 2011 Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà MC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ EPSTEIN BARR VIRUS (EBV) 1.1.1 Giới thiệu chung EBV 1.1.2 Vai trò gây ung thƣ vòm mũi họng EBV 10 1.1.3 Quá trình nhân lên, tàng nhiễm khả gây ung thƣ EBV 11 1.1.4 Các phƣơng pháp phát EBV 12 1.2 NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ HẠT NANO TỪ VÀ ỨNG DỤNG 13 1.2.1 Hạt nano từ 13 1.2.2 Các phƣơng pháp chế tạo hạt nano từ [3] 14 1.2.2.1 Phương pháp nghiền 15 1.2.2.2 Phương pháp đồng kết tủa 15 1.2.2.3 Phương pháp vi nhũ tương 16 1.2.3 Ứng dụng hạt nano từ lĩnh vực y sinh 17 1.2.3.1 Phân tách chọn lọc tế bào 18 1.2.3.2 Dẫn truyền thuốc 20 1.2.3.3 Tăng thân nhiệt cục 23 1.2.3.4 Tăng độ tương phản cho ảnh cộng hưởng từ 23 1.3 VAI TRÕ CỦA VIỆC TINH SẠCH AXIT NUCLEIC 23 1.4 MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP TINH SẠCH VÀ LÀM GIÀU AXIT NUCLEIC CỦA SINH VẬT 24 1.4.1 Nguyên lý chung 24 1.4.2 Phƣơng pháp tinh axít nucleic dung mơi hữu 25 1.4.3 Phƣơng pháp tinh axít nucleic màng xốp silica 27 1.4.4 Phƣơng pháp tinh axít nucleic hạt từ nano bọc silica 28 1.4.5 Điều kiện chế phân tử ADN hấp thụ lên bề mặt hạt nano từ bọc silica 29 1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG HẠT NANO TỪ BỌC SILICA TINH SẠCH AXÍT NUCLEIC 32 Khoa Sinh häc Khãa 2009 - 2011 Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà Chƣơng 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1 NGUYÊN LIỆU 34 2.1.1 Mẫu máu 34 2.1.2 Mồi 34 2.1.3 Các hóa chất, nguyên liệu khác 35 2.1.4 Máy móc thiết bị 36 2.2 PHƢƠNG PHÁP 36 2.2.1 Tách chiết axit nucleic 36 2.2.1.1 Tách chiết ADN MinElute Virus Spin Kit 36 2.2.1.2 Tách chiết ADN kít Dynabead Myone SILANE® 37 2.2.1.3 Tách chiết ADN kít Virus Magnet Nano Kit 37 2.2.2 Nhân đoạn gen đích đặc hiệu kỹ thuật PCR 39 2.2.3 Nhân dòng sản phẩm PCR vào vector pGEM-T easy 43 2.2.4 Tinh plasmid theo kít Qiagen 44 2.2.5 Giải trình trình tự gen đƣợc nhân dịng 45 2.2.6 Định lƣợng gen đích kỹ thuật PCR thời điểm (Real-time PCR) 46 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 48 3.1 NHÂN DÕNG ĐOẠN GEN EBNA-2 KÍCH THƢỚC 250 BP ĐẶC HIỆU CHO EBV 48 3.1.1 Nhân đoạn gen đặc hiệu EBV nested PCR với hai lần phản ứng PCR độc lập 48 3.1.2 Nhân đoạn gen đặc hiệu EBV nested PCR với lần PCR chu trình nhiệt 49 3.1.3 Kết nhân dòng đoạn gen EBNA-2/250 53 3.2 KẾT QUẢ NHÂN DÕNG ĐOẠN GEN MÃ HÓA PROTEIN MÀNG BNRF1 p143 KHƠNG CHỨA NHĨM GLYCOSYL KÍCH THƢỚC 74 bp (EBV- 74) 57 3.2.1 Nhân đoạn gen EBV-74 58 3.2.2 Kết nhân dòng đoạn gen EBV-74 59 3.3 KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT ADN EBV BẰNG BỘ KÍT VIRUS MAGNET NANO KIT 60 Khoa Sinh häc Khãa 2009 - 2011 Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà 3.4 ĐÁNH GIÁ ĐỘ CHÍNH XÁC CỦA BỘ KÍT VIRUS MAGNET NANO KIT VỚI HAI BỘ KÍT THƢƠNG MẠI BẰNG PCR 62 3.5 SO SÁNH KHẢ NĂNG TÁCH CHIẾT ADN EBV CỦA VIRUS MAGNET NANO KIT VỚI HAI BỘ KÍT THƢƠNG MẠI BẰNG REAL-TIME PCR 64 KẾT LUẬN VÀ HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 BẢNG KÝ HIỆU VIẾT TẮT Amp Ampicillin BL Burkit’s Lymphoma (U lympho xƣơng hàm trên) bp base pair (cặp bazơ) Ct Cycle of Threshold (Chu kỳ ngƣỡng) EA Early Antigen (Kháng nguyên sớm) EBNA EBV EDTA ELISA Epstein Barr Virus nuclear (Kháng nguyên nhân EBV) Epstein Barr Virus Ethylene Diamine Tetra acetic acid Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (Xét nghiệm miễn dịch liên kết Enzyme) Gp GuSCN IPTG Glycoprotein Guanidine thiocyanate Isopropyl β-D-Thiogalactopyranoside kb kilobase LB Luria Bertani Khoa Sinh häc Khãa 2009 - 2011 LuËn văn thạc sĩ Phạm Thị Trà LMP Latent Membral Protein (Protein màng tiềm tàng) PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) Virus capsid antigen (Kháng nguyên vỏ capsid) VCA MỞ ĐẦU Cơng nghệ nano ngày có bƣớc tiến quan trọng, đặc biệt vật liệu nano ngày đƣợc ứng dụng rộng rãi lĩnh vực Một hƣớng quan trọng cơng nghệ nano ứng dụng Y – sinh bao gồm sử dụng vật liệu nano vào nghiên cứu, công cụ dẫn thuốc, liệu pháp điều trị, chẩn đoán hỗ trợ điều trị bệnh [6, 14, 29, 33] nhằm mục đích cải thiện nâng cao sức khỏe ngƣời Trong số đó, hạt nano từ tính đƣợc chức hóa bề mặt đƣợc nghiên cứu ứng dụng rộng rãi năm gần đây, ví dụ nhƣ tách chiết axít nucleic (ADN, ARN), phân tách tế bào, vận chuyển thuốc, liệu pháp trị nhiệt từ nhiều ứng dụng khác [3, 21, 26, 33] Việc tinh axít nucleic vi sinh vật mẫu bệnh phẩm bƣớc quan trọng nghiên cứu, xét nghiệm sinh học phân tử PCR, Real-time PCR cần đến nguồn axit nucleic tinh Vì vậy, nhiều phƣơng pháp tách chiết tinh axít nucleic đƣợc nghiên cứu, phát triển ứng dụng rộng rãi, phƣơng pháp René Boom cộng phát minh vào năm 1990 phƣơng pháp đƣợc sử dụng nhiều Nguyên lý phƣơng pháp dựa khả hình thành liên kết bền vững hạt silica với axít nucleic thơng qua cầu nối cation mơi trƣờng có nồng độ muối cao [8, 9] Một cải tiến mang tính đột phá phƣơng pháp Boom đƣợc nhiều công ty công nghệ sinh học hàng đầu giới nhƣ Roche, Invitrogen, Promega, phát triển sử dụng hạt nano từ tính bọc Khoa Sinh häc Khãa 2009 - 2011 Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà silica tinh axít nucleic, giúp nâng cao hiệu tách chiết tiết kiệm thời gian thao tác Đặc biệt, cải tiến giúp chế tạo đƣợc máy tự động tách chiết tinh axít nucleic [27, 39] Tuy nhiên, giá thành kít tinh axít nucleic hạt nano từ bọc silica cao Do đó, việc nghiên cứu phát triển kít tách chiết axit dựa nguyên lý hạt từ bọc silica có ý nghĩa khoa học ứng dụng thực tiễn cao giúp cho việc giảm chi phí khâu tách chiết, chủ động cung cấp kít tách chiết axit nucleic cần Trong nghiên cứu này, xử lý hạt từ nano đƣợc chức hóa bề mặt silica (Silica-coated magnetic nano-particles) hay gọi hạt Magsi nano nhóm nghiên cứu thuộc Trung tâm Khoa học Vật liệu Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên chế tạo đệm thích hợp (kế thừa kết nhóm nghiên cứu phịng Sinh học nano Ứng dụng) để thử nghiệm khả tách chiết axit nucleic virus Epstein Barr bệnh phẩm bệnh nhân ghi nhiễm EBV EBV virus truyền nhiễm ngƣời, lây truyền qua đƣờng ăn uống, tiếp xúc EBV liên quan đến nhiều bệnh lý nghiêm trọng nhƣ: ung thƣ vòm họng, Burkitt lymphoma, ung thƣ lymphoma trạng thái biến đổi tế bào lympho [1] ADN tách chiết kít Virus Magnet Nano Kit bao gồm hạt Magsi nano đệm thích hợp đƣợc sử dụng phản ứng PCR Real-time PCR để phát định lƣợng nồng độ EBV máu hay mẫu bệnh phẩm nghi nhiễm, hỗ trợ cơng tác chẩn đốn, điều trị, tiên lƣợng bệnh liên quan đến EBV Xuất phát từ thực tế tiến hành: “Nghiên cứu thử nghiệm hạt từ nano chức hóa bề mặt chẩn đoán Virus Epstein Barr’’ với mục tiêu sau: Xây dựng phƣơng pháp phát định tính định lƣợng EBV PCR Real-time PCR Khoa Sinh học Khóa 2009 - 2011 Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà Nghiờn cu th nghim khả tách chiết ADN EBV mẫu máu kít tự chế tạo (Virus Magnet Nano Kit) gồm hạt từ nano đƣợc chức hóa bề mặt (cụ thể hạt từ nano đƣợc bọc silica hay ký hiệu MagSi nano) đệm kèm theo (kế thừa kết nhóm nghiên cứu thuộc phịng Sinh học Nano Ứng dụng thử nghiệm đối tƣợng HBV, HCV) So sánh khả tách chiết ADN EBV kỹ thuật PCR, Real-time PCR với nguồn ADN khn tách ba kít: MinElute® Virus Spin Kit hãng Qiagen, Dynabead Myone Silane® Kit hãng Invitrogen, Virus Magnet Nano Kit điều kiện thí nghiệm Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ EPSTEIN BARR VIRUS (EBV) 1.1.1 Giới thiệu chung EBV Hình 1.1: Hình ảnh Epstein Barr Virus dƣới kính hiển vi điện tử [47] Khoa Sinh häc Khãa 2009 - 2011 Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà Năm 1958, Burkitt phát khối u lympho xƣơng hàm trẻ em Châu Phi, từ bệnh đƣợc mang tên ông: Burkitt’s Lymphoma (BL) Vào năm 1964 nhóm tác giả Epstein, Barr Pulvertaft phân lập đƣợc loại virus dòng lymphoblastes khối u LB (Lympho’s Burkitt) kính hiển vi điện tử [15] Từ virus đƣợc mang tên Epstein Barr Virus Năm 1975, tác giả Nadol cs phân lập đƣợc hạt (virion) EBV tế bào biểu mô ung thƣ vịm kính hiển vi điện tử Đây lần đầu ngƣời ta quan sát đƣợc thể virus thuộc họ Herpesviridae tế bào ung thƣ ngƣời, EBV bị nghi ngờ nguyên nhân gây ung thƣ ngƣời [1] EBV thuộc họ virus Herpesviridae, có hệ gen thuộc loại ADN sợi đơi xoắn kép mạch hở, kích thƣớc hệ gen khoảng 184 kb tính phần lặp lại hai đầu Hệ gen EBV có tổ hợp gen mã hóa cho loại protein kháng nguyên nhân (Epstein Barr Virus nuclear antigen), đƣợc ký hiệu là: EBNA-1, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C, EBNA-LB gen mã hóa cho protein màng tiềm tàng (latent membral protein), đƣợc ký hiệu là: LMP-1, LMP-2A, LMP-2B [13] Vai trị sáu protein EBNA có liên quan đến trình nhân lên EBV tế bào lympho B giai đoạn đầu xâm nhiễm loại protein LMP có liên quan đến chu kỳ nhân lên EBV tế bào lympho B Gen mã hóa cho protein EBNA-2 phân đoạn gen EBNA hệ gen EBV EBNA -2 có vai trị biệt hóa tế bào lympho B thành tế bào mầm non hóa để EBV thực trình gây ung thƣ Hơn gen EBNA-2 gen đƣợc chép sớm vai trị trình điều tiết nhân lên tế bào bị nhiễm EBNA-2 điều hịa q trình chép gen tổng hợp protein virus tế bào bị nhiễm EBV, protein EBNA-2 đƣợc coi yếu tố quan trọng cảm ứng tăng sinh dòng tế bào lympho B [25] Khoa Sinh häc Khãa 2009 - 2011 Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà Ton hệ gen EBV đƣợc chứa vỏ capsid Vỏ capsid có hình thái đối xứng hình khối, cấu trúc protein đóng kín bảo vệ nhân ADN virus mang tính kháng nguyên đặc hiệu EBV (kháng nguyên VCA), đƣợc xác định 20 mặt bên, 12 đỉnh trục đồng dạng đối xứng Vỏ capsid lại đƣợc bao bọc vỏ bao khác gọi vỏ (envelope) cấu trúc từ thành phần chủ yếu glycoprotein Vỏ bao đƣợc mã hóa gen virus mang dấu ấn miễn dịch (hình 1.2) Hình 1.2: Cấu trúc EBV [43] Giữa vỏ capsid vỏ khoảng chứa đựng protein đệm cấu trúc enzyme virus (Tegument) Vỏ ngồi EBV có nhạy cảm với tác động axit, ether, dung dịch hịa tan sát khuẩn đơng khơ [13] EBV loại virus truyền nhiễm gây bệnh ngƣời lây truyền qua đƣờng tiêu hóa, tiếp xúc Do đó, virus thƣờng đƣợc phát thấy chất thải tế bào chất tiết phần hệ tiêu hóa hơ hấp nhƣ nƣớc bọt, niêm dịch vùng họng EBV có đặc tính hƣớng bạch huyết hấp phụ lên tế bào lympho B thông qua tƣơng tác glycoprotein gp350/220 có bề mặt virus với thụ thể CR2/CR21 bổ thể CD3 tế bào lympho B ngƣời (hình 1.3) Khoa Sinh häc Khóa 2009 - 2011 Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà Hỡnh 1.3: S hp ph ca EBV lờn tế bào lympho B qua thụ thể CR21 [46] EBV trạng thái tiềm tan, nhiều ADN EBV đƣợc tìm thấy tế bào chất tế bào lympho B bị nhiễm nhƣng có vài gen đƣợc chép EBV gây nhiễm dạng tiềm tan tồn lâu dài thể mà không gây bệnh Nhƣng thể trạng hệ miễn dịch suy yếu EBV nguyên nhân gây bệnh tăng bạch cầu đơn nhân nhiễm khuẩn (IM-infectious mononucleosis), liên quan đến chế tiến triển số loại ung thƣ nhƣ tăng lympho B, UTVMH, Burkitt lymphoma Đặc trƣng khối u bệnh ung thƣ tế bào khối u có chứa lƣợng lớn hệ gen EBV xuất biểu nhiều protein có vai trị chuyển hóa khối u từ lành tính thành khối u ác tính [25] Về mặt sinh bệnh học, nhiễm virus xảy vùng miệng, hầu lan vào máu, tế bào lympho B bị nhiễm Sự đáp ứng miễn dịch nhiễm EBV thể sinh kháng thể IgM chống lại kháng nguyên VCA EBV, đáp ứng kháng thể IgM xuất vài tuần đầu sau nhiễm, kháng thể IgG kháng thể IgG tồn suối đời ngƣời nhiễm [19] EBV thƣờng gây nhiễm trùng cấp vùng miệng họng, khơng biểu triệu chứng Sau q trình nhiễm EBV tồn tiềm tàng tế bào biểu Khoa Sinh häc Khãa 2009 - 2011 LuËn văn thạc sĩ Phạm Thị Trà ng chy (-): chng âm Đƣờng chạy (+): µl ADN EBV Đƣờng chạy 1-2: ADN plasmid tách từ khuẩn lạc trắng Kết điện di thể hình 3.10 cho thấy đƣờng chạy xuất băng ADN sản phẩm PCR kích thƣớc khoảng 74 bp, trùng với kết điện di sản phẩm PCR đối chứng dƣơng ADN EBV đƣờng chạy đối chứng âm không xuất băng ADN Điều cho thấy chúng tơi nhân dịng đƣợc đoạn gen EBV-74 vào vector pGEM-T, plasmid tái tổ hợp tách chiết từ dòng khuẩn lạc trắng mang đoạn gen EBV-74 Plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen EBV-74 đƣợc dùng làm đối chứng dƣơng chất chuẩn cho phản ứng định lƣợng ADN EBV Real- time PCR phần so sánh khả tách chiết axit nucleic kít Virus Magnet Nano Kit 3.3 KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT ADN EBV BẰNG BỘ KÍT TỰ CHẾ TẠO VIRUS MAGNET NANO KIT Chúng tơi nghiên cứu thử nghiệm khả tách chiết ADN EBV mẫu máu bệnh nhân nhiễm EBV kít tự chế tạo Virus Magnet Nano Kit bao gồm hạt từ nano bọc silica (MagSi nano) đệm kèm theo Trong nghiên cứu này, chúng tơi tìm đƣợc điều kiện, quy trình thích hợp cho sử dụng hạt MagSi nano để tinh ADN EBV Khoa Sinh học 60 Khóa 2009 - 2011 Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà Hỡnh 3.11: Hỡnh nh b kít Virus Magnet Nano Kit thao tác tách chiết axit nucleic sử dụng kít Quy trình tách chiết ADN EBV bao gồm bƣớc từ xử lý hạt MagSi nano bƣớc ly giải virus, gắn kết ADN/ARN với hạt MagSi nano, rửa để loại bỏ tạp chất khỏi phức hệ ADN-MagSi nano cuối tách thu đƣợc ADN tinh Đặc biệt qui trình chúng tơi khơng sử dụng máy ly tâm dùng nam châm để thao tác, điều giảm thời gian chi phí cho tách chiết ADN Muối GuCNS đệm ly giải có vai trò quan trọng trong: phá màng tế bào, virus, ức chế nuclease, cầu nối liên kết hạt silica với axit nucleic Chi tiết khâu tinh đƣợc tối ƣu hóa quy trình đƣợc trình bày mục 2.2.1.3 Sử dụng µl ADN EBV tách chiết theo kít Virus Magnet Nano Kit với mẫu bệnh phẩm huyết bệnh nhân đƣợc chẩn đoán nhiễm EBV đƣợc kiểm tra PCR với cặp mồi đặc hiệu cho EBV bp (-) M (+) 300 250 200 100 Khoa Sinh häc 61 Khóa 2009 - 2011 Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà Hỡnh 3.12: Kt qu in di sn phm PCR nhân đặc hiệu đoạn gen EBNA-2/250 với nguồn ADN EBV tách Virus Magnet Nano Kit Đƣờng chạy (-): chứng âm Đƣờng chạy (+): chứng dƣơng với khuôn ADN plasmid EBNA-2/250 Đƣờng chạy 1: khuôn ADN tách từ mẫu bệnh phẩm nhiễm EBV kít Virus Magnet Nano Kit Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen EBNA-2/250 thể hình 3.12 cho thấy đƣờng chạy số với khn ADN EBV tách kít Virus Magnet Nano Kit cho kết băng ADN có kích thƣớc khoảng 250 bp, trùng với băng ADN đƣờng chạy đối chứng dƣơng khn ADN plasmid EBNA-2/250, cịn đƣờng chạy đối chứng âm khơng có băng ADN Từ kết cho phép kết luận tách chiết đƣợc ADN EBV kít Virus Magnet Nano Kit 3.4 ĐÁNH GIÁ ĐỘ CHÍNH XÁC CỦA BỘ KÍT VIRUS MAGNET NANO KIT VỚI HAI BỘ KÍT THƢƠNG MẠI BẰNG PCR Chúng tơi tiến hành tách chiết đồng thời ADN 40 mẫu huyết (30 mẫu bệnh nhân có xét nghiệm kháng thể IgG kháng VCA EBV dƣơng tính 10 mẫu bệnh nhân đƣợc chuẩn đoán ung thƣ vịm họng) kít tự chế tạo Virus Magnet Nano Kit hai kít thƣơng mại chuyên dùng cho tách ADN/ARN virus MinElute® Virus Spin Kit hãng Qiagen, Dynabeads Myone SILANE® Invitrogen điều kiện thí nghiệm ADN mẫu bệnh phẩm thu đƣợc sau tách chiết ba kít đƣợc dùng làm khn cho phản ứng PCR để bƣớc đầu so sánh định tính khả tách chiết ADN EBV ba kít độ đậm nhạt sản phẩm PCR đoạn gen EBNA-2/250 Kết thực tế có mẫu ADN tách chiết từ mẫu máu nghi nhiễm EBV cho băng điện di sản phẩm PCR với kích thƣớc 250 nên lấy kết điện di làm đại diện Khoa Sinh häc 62 Khãa 2009 - 2011 Luận văn thạc sĩ bp Phạm Thị Trà (+) M (-) 10 A 500 250 250 B 500 250 250 C 500 250 250 Hình 3.13: Kết điện di sản phẩm PCR đặc hiệu cho EBNA-2/250 dùng khuôn ADN EBV từ mẫu bệnh phẩm tách Virus Magnet Nano kit (A), MinElute® Spin Virus Kit (B), Dynabead myone Silane® Kit (C) Đƣờng chạy (+): khuôn ADN plasmid EBNA-2/250 M: Thang chuẩn ADN kb Đƣờng chạy (-): chứng âm Đƣờng chạy 1-10: khn µl ADN tách từ mẫu bệnh phẩm 1-10 Trên hình 3.13 thể kết điện di sản phẩm PCR cho thấy, đƣờng Khoa Sinh häc 63 Khãa 2009 - 2011 Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà chy ca i chứng âm khơng có khn nên khơng cho băng sản phẩm PCR, cịn đƣờng chạy chứng dƣơng với khn ADN plasmid chứa đoạn gen EBNA-2/250 có băng ADN kích thƣớc 250 bp, đƣờng chạy 7, 10 tƣơng ứng với khuôn ADN tách chiết từ mẫu số bệnh nhân Nguyễn Ngọc D (bệnh nhân đƣợc chẩn đốn ung thƣ vịm họng) bệnh viện qn y 103 cung cấp Nguyễn Văn Đ (bệnh nhân có kết IgG-VCA EBV dƣơng tính) khoa vi sinh bệnh viện Bạch Mai cung cấp xuất băng ADN có kích thƣớc 250 bp trùng với kích thƣớc băng ADN đối chứng dƣơng ba điện di ứng với ba kít, khác độ đậm nhạt băng điện di Điều cho thấy với nguồn ADN 40 mẫu bệnh phẩm bệnh nhân xét nghiệm EBV với ba kit cần so sánh phát đƣợc tỷ lệ mẫu dƣơng tính tổng 40 mẫu phƣơng pháp PCR độ đậm băng ADN đƣờng chạy 7, 10 từ sản phẩm PCR với nguồn ADN EBV tách kít MinElute® Virus Spin kit sáng sau đến Virus Magnet Nano Kit cuối Dynabeads Myone SILANE® Với kết cho phép chúng tơi kết luận ba kít: Virus Magnet Nano Kit, MinElute® Virus Spin kit, Dynabeads Myone SILANE® có độ xác nhƣ phát EBV định tính phƣơng pháp PCR 3.5 SO SÁNH KHẢ NĂNG TÁCH CHIẾT ADN EBV CỦA VIRUS MAGNET NANO KIT VỚI HAI BỘ KÍT THƢƠNG MẠI BẰNG REAL-TIME PCR Nhƣợc điểm phản ứng PCR đánh giá đƣợc định tính (độ xác) khả tách chiết ADN EBV tức xác định đƣợc mẫu dƣơng tính tổng số mẫu xét nghiệm phƣơng pháp khơng cụ thể hóa đƣợc số EBV mẫu bệnh phẩm Phƣơng pháp real - time PCR với ƣu điểm nhanh, độ nhạy độ xác cao, đƣợc sử dụng để định lƣợng so sánh khả tách chiết ADN EBV Virus Magnet Nano Kit (hạt nano từ bọc Khoa Sinh học 64 Khóa 2009 - 2011 Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà silica v b m kốm theo) với hai kít thƣơng mại thể số ADN EBV mà kít tách đƣợc Trong thí nghiệm chúng tơi sử dụng plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen EBV-74 nhân dòng đƣợc mục 3.2.2 làm chứng dƣơng chất chuẩn (standard) cho phản ứng Real-time PCR định lƣợng Số lƣợng ADN EBV mẫu tách chiết kít đƣợc định lƣợng theo khn chuẩn (standard) Mỗi phản ứng chúng tơi sử dụng 5µl ADN EBV khn Với thành phần phản ứng chu trình nhiệt cho phản ứng Real-time PCR trình bày mục 2.2.6 thu đƣợc kết chạy Real-time PCR nhƣ sau: PC 107 108 106 104 105 103 A B Hình 3.14: Kết Real-time PCR với nguồn ADN EBV hai mẫu bệnh phẩm số 7, 10 tách ba kít Virus Magnet Nano Kit, MinElute Virus Spin Kit, Dynabead myone Silane® Kit chất chuẩn Khoa Sinh häc 65 Khóa 2009 - 2011 Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà A: th biu din quỏ trỡnh nhõn đoạn gen EBV-74 đặc hiệu cho EBV B: Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng dựa pha loãng nồng độ plasmid EBV-74 ban đầu, nồng độ mẫu ADN cần so sánh, trục x biểu thị giá trị logarit số lƣợng copies ban đầu mẫu ADN, trục y biểu diễn giá trị chu kỳ ngƣỡng (CT) Kết Real-time PCR định lƣợng thể hình 3.14 có hệ số tƣơng quan R2= 0.996 cho thấy đƣờng chuẩn xây dựng đƣợc từ chất chuẩn ADN plasmid mang đoạn gen EBV-74 với dải nồng 103 đến 108 copies/ml thí nghiệm có độ tin cậy cao đủ tiêu chuẩn cho việc định lƣợng số copies ADN EBV tách ba kít cần so sánh Kết định lƣợng nồng độ ADN EBV tách đƣợc ba kít đƣợc cụ thể bảng 3.2 Bảng 3.2: Kết real–time PCR định lƣợng ADN EBV tách ba kít Mẫu CT (chu kỳ ngƣỡng) Số copies/ml M7 Q 35.6 9,64x103 M7 Mgsi 36.2 7,17x103 M7 I 40.62 6,53x102 M10 Q 25,96 1.84x106 M10 Mgsi 26,78 1.18x106 M10 I 27,73 7.04x105 Kết Real-time PCR định lƣợng mẫu ADN EBV tách từ mẫu bệnh phẩm số (kí hiệu: M7 Q, M7 Mgsi, M7 I) số 10 (kí hiệu: M10 Q, M10 Mgsi, M10 I) lần lƣợt ký hiệu Q, Mgsi, I tƣơng ứng với kít MinElute® Virus Spin Kit, Virus Magnet Nano Kit, Dynabead myone Silane® kit Từ kết real-time PCR ta thấy số ADN EBV tách theo kít Khoa Sinh häc 66 Khóa 2009 - 2011 Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trµ Virus Magnet Nano Kit hai mẫu 10 tƣơng ứng M7 Mgsi =7.17x103, M10 Mgsi = 1.18x106 copies/ml cao lƣợng ADN EBV hai mẫu tách kít Dynabead Myone Silane® Invitrogen (M7I = 6,53x102, M10I = 7.04x105) thấp lƣợng ADN EBV tách MinElute® Virus Spin Kit Qiagen (M7Q = 9.64x103, M10Q = 1.84x106) Kết hoàn toàn phù hợp với độ đậm băng điện di sản phẩm PCR đƣợc phân tích mục kết 3.4 Với kết thu đƣợc cho phép khẳng định tách chiết đƣợc ADN EBV kít Virus Magnet Nano Kit (bao gồm hạt từ bọc silica với đệm kèm theo) với chất lƣợng đủ tiêu chuẩn dùng chẩn đoán EBV Vấn đề đặt cần tiếp tục nghiên cứu nâng cao chất lƣơng, độ ổn định hạt từ bọc silica (hạt từ nano đƣợc chức hóa bề mặt) đệm kèm theo để đƣa vào ứng dụng chẩn đoán phát nhiễm EBV hỗ trợ cho cơng tác chẩn đốn, điều trị tiên lƣợng bệnh liên quan đến EBV KẾT LUẬN VÀ HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu trên, rút đƣợc kết luận nhƣ sau: Xây dựng phƣơng pháp phát định tính định lƣợng EBV PCR Real-time PCR i) Nhân thành công đoạn gen EBNA-2 kích thƣớc 250 bp đặc hiệu dùng cho chẩn đốn EBV nested PCR Thiết kế thành cơng cặp mồi EBVex2 Fw/Rv tối ƣu điều kiện phản ứng nested PCR lần phản ứng với chu trình nhiệt Chế độ nhiệt cho phản ứng PCR này: Vòng với chu kỳ 940C phút, 600C phút, 720C phút; vòng với 30 chu kỳ 940C - 30 giây, Khoa Sinh học 67 Khóa 2009 - 2011 Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà 540C - phỳt, 720C - phút Nhân dòng đƣợc đoạn gen EBNA-2/250 tạo chứng dƣơng cho phản ứng phát EBV PCR ii) Đã nhân dịng thành cơng đoạn gen mã hóa cho protein màng BRNF1 p143 khơng chứa nhóm glycosyl đặc hiệu cho EBV kích thƣớc 74 bp (EBV-74) dùng cho chẩn đoán EBV Real-time PCR Đã tách chiết đƣợc ADN EBV hạt từ nano đƣợc chức hóa bề mặt (hay cịn gọi hạt Magsi nano) sử dụng phát EBV phản ứng PCR, Real-time PCR Bộ kít Virus Magnet Nano Kit cho phép tinh ADN EBV (M7Mgsi = 7.17x103 copies/ml) gần tƣơng đƣơng với kít MinElute® Virus Spin Kit hãng Qiagen (M7Q = 9.64x103 copies/ml) Dynabead myone Silane® hãng Invitrogen (M7I = 6.53x102 copies/ml) HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO Tiếp tục thử nghiệm khả tách chiết ADN EBV hạt từ nano đƣợc chức hóa bề mặt (hạt từ bọc silica-Magsi nano) mẫu bệnh phẩm nhiễm EBV Nghiên cứu độ bền hạt từ bọc silica đệm kèm theo Phối hợp với phòng xét nghiệm bệnh viện để thử nghiệm ứng dụng hạt từ nano bọc silica đệm kèm chẩn đoán bệnh liên quan đến EBV Khoa Sinh học 68 Khóa 2009 - 2011 Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà TI LIU THAM KHO TI LIU TIẾNG VIỆT Đái Duy Ban (2002), Sinh học phân tử ung thư vòm họng, NXB Khoa học kỹ thuật Hồ Quỳnh Thùy Dƣơng (2000), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục, Hà Nội Nguyễn Hữu Đức, Nguyễn Hoàng Hải, Trần Mậu Danh, “Chế tạo ứng dụng hạt nano từ bọc silica Y – Sinh học”, Báo cáo Hội nghị Vật lý toàn quốc lần thứ VI, Hà Nội ngày 23-25 tháng 11 năm 2005 Phạm Hùng Vân (2009), PCR real-time PCR Các vấn đề áp dụng thường gặp, NXB Y học TÀI LIỆU TIẾNG ANH Bajij BG., Murakami M., Robertson ES (2007) “Molecular biology of EBV on the lationship to AIDS-assosiated oncogenesis”, Cancer Treat Res 133: 141-62 Bhushan B (2004), HADNbook of Nanotechnology, Spinger – Verlag, Berlin, Germany, 279-371 Boom R., Sol C J A., Salimans M M M., Jansen C L., Wertheim P M E (1990), “Rapid ADN simple method for purification of nucleic acids”, J Clinic Microbiol 28: 495-503 8.Boom R., Sol C J A., Salimans M M M., Jansen C L., Wertheim P M E (1990), “Rapid ADN simple method for purification of nucleic acids”, J Clinic Microbiol 28: 495-503 Boom R., Sol C., Beld M., Weel J., Goudsmit J ADN Dillen P W V (1999), “Improved Silica-Guanidiniumthiocyanate ADN Isolation Procedure Based Khoa Sinh häc 69 Khãa 2009 - 2011 Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà on Selective Binding of Bovine Alpha-Casein to Silica Particles”, J Clinic Microbiol 37: 615-619 10 Chang ET., Adami HO (2006), “The enigmatic epidemiology of nasopharylgeal carcinoma”, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 15: 1765-77 11 Chou J., Lin YC., Kim J., You L., Xu Z., He B., Jablons DM (2008), “Nasopharyngeal carcinoma- Review of the molecular mechanisms of tumorigenesis” 12 Clark D (2005), Molecular Biology: UnderstADNing Genetic Revolution, Elsevier Academic Press, California, USA, 567-599 13 Cohen JI (2006), “Virology ADN molecular biology of Epstein barr virus”, 21-37 14 Elisabeth S., Aravind P (2007), BioNanotechnology 1st edit., Morgan & Claypool , Conecticut, USA, 31-79 15 Epstein MA., Barr YM ADN Achong BG (1964), “Virus particles in cultured lymphoblasts from Burkitt's lymphoma’’, The Lancet 1: 702-703 16 Gerstein S A (2001), Molecular Biology Problem Solver, Wiley- Liss Inc, New York, USA, 167-197 17 Guo XC., Scott K., Liu Y., Dean M., David V., Nelson GW., Johnson RC., Dilks HH., Lautenberger J., Kessing B., Martenson J., Guan L., Sun S., Deng H., Zheng Y., The G., Liao J., Zeng Y., O’Brien SJ., Winkler CA (2006), “Genetic factors leading to chronic Epstein-Barr virus infection ADN nasopharyngeal carcinoma in South East China: study design, methods ADN feasibility”, Huma Geno 2: 365-75 18 Hecht JL., ADN Aster JC (2000), “Molecular biology of Burkitt’s lymphoma”, J Clin Oncol 18: 3707-21 Khoa Sinh học 70 Khóa 2009 - 2011 Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà 19 Henle G., Henle W., ADN Horowitz C A (1997), "Epstein-Barr Virus Specific Diagnosis: Tests in Infectious Mononucleosis", Huma Patholo 5: 551-558 20 Huijun T., ADNreas F R., ADN LADNers J P (2000), “Evaluation of Silica Resins for Direct ADN Efficient Extraction of ADN from Complex Biological Matrices in a Miniaturized Format”, Analyt Biochem 283: 175-191 21 Laura L.V., SADNerson R D ADN Koch K R (2006), “Magnetic nanoparticles: Properties ADN potential applications”, Pure Appl Chem 78: 1793-1801 22 Lee YC., Hwang YC., Chen KC., Lin YS., Huang DY., Huang TW., Kao CY., Wu HC., Lin CT., Huang CY (2007), “Effect of Epstein-Barr virus infection on global gene expression in nasopharyngeal carcinoma” Funct Integr Geno 7:79-93 23 Liu JP., Cassar L., Pinto A., Li H (2006), “Mechanisms of cell immortalization mediated by EB viral activation of telomerase in nasopharyngeal carcinoma”, Cell Res 16 :809-17 24 Dermott AL., Dutt SN., Watkinson JC (2001), “The aetiology of nasopharyngenl carcinoma’’, Clin Otolaryngol Appllie Sci 26: 82-92 25 Middeldrorp JM., Brink AA., Van den Brule AJ., Meijer CJ (2003), “Phathogenic role for Epstein Barr virus (EBV) gene products in EBVassociated proliferactive disorders”, Crit Rev Oncol Hematol 4: 1-36 26 Niesters HG., Van Esser J., Fries E., Wolthers KC., Cornelissen J., Osterhaus AD (2000), “Development of a real-time quantitative assay for detection of Epstein-Barr virus”, J Clin Microbiol 38: 712-715 27 Obata K., Segawa O., Yakabe M., Ishiada Y., Kuroita, Ikeda K., Kawakami B., Kawamura Y., Yohda M., Matsunaga T., ADN Tajama H (2001), “Development of a Novel Method for Operating Magnetic Particles, Magtration Technology, Khoa Sinh häc 71 Khãa 2009 - 2011 Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà ADN Its Use for Automating Nucleic Acids Purification”, J Biosci & Bioenginer 91: 500-503 28 Pankhurst Q.A., Connolly J., Jones S.K., ADN Dobson J (2003), “Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine”, J Physic D: Appl Physic 36: 167-181 29 Rajshri M., Tarala D (2007), “Application of nanotechnology in biomedicine”, Indi J Exper Bio 45: 160-165 30 Sambrook J., Russel D (2003), Molecular Cloning 3rd edit., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA 31 Spano JP., Busson P., Atlan D., Bourhis J., Pignon JP., Esteban C., AramADN JP (2003), “Nasopharyngeal carcinoma: an update”, Eur J Cancer 39: 2121-2135 32 Van Baarle D., Hovenkamp E., Kersten MJ., Klein MR., Miedema F., Van Oers MH (1999), “Direct Epstein-Barr virus (EBV) typing on peripheral blood mononuclear cells: no association between EBV type infection or superinfection ADN the development of acquired immunodeficiency syndrome-related lymphoma’’, non-Hodgkin's J Clini Microbiol 93 :3949-55’’ 33 Vinod Lab., DiADNra L (2007), Biomedical Applications of Nanotechnology, John Wiley & Sons Inc, New Jersey, USA 34 Zhong BL., Zong YS., Lin SX., Zhang M., Liang YJ., (2006), “Epstein Barr virus infection in precursor lesions of nasopharyngeal carcinoma”, Ai Zheng, 25: 136-142 TÀI LIỆU INTERNET 35 http://agencourt.com/technical Khoa Sinh häc 72 Khãa 2009 - 2011 Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà 36 http://www.roche-diagnostics.us/press_room/2001/100501.htm 37 http://www.dost.danang.gov.vn/index.php?option=com_content&view=article& id=3206&catid=34:tin-khoa-hc-va-cong-ngh&Itemid=27 38 http://www.bio101.com/cat/4142/802/geneclean-protocols/ 39 http://www1.qiagen.com/Products/Automation/BioSprint96.aspx 40 http://www.promega.com/catalog/catalogproducts.aspx?categoryname productleaf,1506 41 http://products.invitrogen.com/ivgn/product/37002D?CID=Search-Product 42 http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd =IVGNcatDisplayCategory&catKey=92801 43 http://cullenlab.duhs.duke.edu/research/ebv/ 44 http://www.jle.com/fr/revues/bio_rech/vir/e-docs/00/04/26/E0/article.phtml 45 http://complementaryoncology.com/reports/breast-cancer/detection-of-epstein-b arr-virus-in-invasive-breast-cancers 46 http://textbookofbacteriology.net/themicrobialworld/Herpes.htm 47 http://www.celebrities-with-diseases.com/health-conditions/what-is-epstein-barr -virus-6795.html Khoa Sinh học 73 Khóa 2009 - 2011 Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học Phạm Thị Trà Khóa 2009 2011 ... trị, tiên lƣợng bệnh liên quan đến EBV Xuất phát từ thực tế tiến hành: ? ?Nghiên cứu thử nghiệm hạt từ nano chức hóa bề mặt chẩn đoán Virus Epstein Barr? ??’ với mục tiêu sau: Xây dựng phƣơng pháp phát... tách chiết axit nucleic cần Trong nghiên cứu này, xử lý hạt từ nano đƣợc chức hóa bề mặt silica (Silica-coated magnetic nano- particles) hay gọi hạt Magsi nano nhóm nghiên cứu thuộc Trung tâm Khoa... kích thƣớc nano, chất chức hóa bề mặt (chất hoạt hóa bề mặt) dung mơi Trong đó: i) lõi Fe3O4 có kích thƣớc nano thành phần định đến tính chất từ dung dịch từ; ii) chất hoạt hóa bề mặt có tác