Nghiên cứu phát triển que thử xác định aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi

NGUYỄN THỊ NGỌC ÁNH BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - NGUYỄN THỊ NGỌC ÁNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN QUE THỬ XÁC ĐỊNH AFLATOXIN TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHỐ 2016B Hà Nội – Năm 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN THỊ NGỌC ÁNH NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN QUE THỬ XÁC ĐỊNH AFLATOXIN TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS TS TRƯƠNG QUỐC PHONG Hà Nội – Năm 2018 ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cộng khác Các kết nghiên cứu luận văn hoàn tồn trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu nào, phần kết cơng bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả Mọi liệu, hình ảnh trích dẫn tham khảo luận văn thu thập sử dụng nguồn liệu mở trích dẫn rõ nguồn gốc Tơi xin chịu hồn toàn trách nhiệm với cam đoan Học viên Nguyễn Thị Ngọc Ánh i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS TS Trương Quốc Phong – Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Bách khoa Hà Nội người trực tiếp hướng dẫn định hướng phương pháp nghiên cứu, tạo điều kiện thuận lợi truyền cho niềm đam mê nghiên cứu suốt thời gian thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, anh chị, bạn học viên, sinh viên công tác học tập Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học trường Đại học Bách khoa Hà Nội góp ý kiến q báu cho tơi, giúp đỡ tơi q trình thực luận văn Với tất kính u biết ơn chân thành, tơi xin cảm ơn gia đình người thân yêu động viên, khuyến khích giúp tơi vượt qua khó khăn suốt q trình học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 09 tháng 09 năm 2018 Nguyễn Thị Ngọc Ánh ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN .ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC HÌNH viii DANH MỤC CÁC BẢNG x ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ AFLATOXIN 1.1 Lịch sử phát Aflatoxin 1.2 Điều kiện sản sinh Aflatoxin 1.3 Đặc điểm Aflatoxin 1.3.1.Cấu trúc hóa học phân loại .5 1.3.2.Tính chất hóa học tính chất vật lý 1.3.3.Sự chuyển hóa tiết aflatoxin 1.3.4.Độc tính aflatoxin 10 1.4 Tình hình nhiễm độc aflatoxin giới Việt Nam 12 1.4.1.Trên giới 12 1.4.2.Tại Việt Nam 13 1.5 Các phương pháp phát Aflatoxin 14 1.5.1.Phương pháp sắc kí 14 1.5.2.Phương pháp quang phổ .17 1.5.3.Phương pháp miễn dịch 18 1.5.4.Phương pháp que thử sắc ký miễn dịch 21 1.6 Đặc tính que thử 23 1.6.1.Hạt nano vàng (GNPs) 23 1.6.2.Cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng 23 1.6.3.Miếng thấm mẫu 24 1.6.4.Miếng cộng hợp 24 iii 1.6.5.Màng .25 1.6.6.Miếng thấm hút .25 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Sơ đồ tổng thể nghiên cứu 26 2.2 Vật liệu 26 2.1.1.Hóa chất 26 2.1.2.Các kháng thể sử dụng 27 2.1.3.Thiết bị 27 2.2 Phương pháp nghiên cứu 28 2.2.1.Phương pháp sản xuất kháng thể 28 2.2.2.Phương pháp tinh kháng thể kháng AFB1 protein A 28 2.2.3.Phương pháp điện di SDS – PAGE 29 2.2.4.Phương pháp ELISA gián tiếp 30 2.2.5.Phương pháp Dot – blot .30 2.2.6.Phương pháp tạo cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng 31 2.2.7.Phương pháp chuẩn bị miếng cộng hợp .32 2.2.8.Phương pháp phân tích mẫu que thử 32 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Nghiên cứu tạo kháng thể kháng AFB1 33 3.1.1.Nghiên cứu sản xuất kháng huyết kháng AFB1 33 3.1.2.Nghiên cứu tinh chế kháng thể đa dòng kháng AFB1 34 3.1.3.Đánh giá đặc tính kháng thể kháng AFB1 tinh 37 3.2.Nghiên cứu chế tạo que thử 38 3.2.1.Thiết lập điều kiện ban đầu tạo que thử .38 3.2.2.Nghiên cứu điều kiện chế tạo miếng cộng hợp .39 3.2.3.Nghiên cứu cố định kháng thể lên màng lai 48 3.3.Đánh giá que thử 53 3.3.1.Độ lặp lại que thử 54 3.3.2.Ngưỡng phát 55 iv 3.3.3.Thử nghiệm mẫu nguyên liệu thức ăn chăn nuôi 56 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 PHỤ LỤC 65 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AF : Aflatoxin AFB1 : Aflatoxin B1 AFB2 : Aflatoxin B2 AFG1 : Aflatoxin G1 AFG2 : Aflatoxin G2 AFM1 : Aflatoxin M1 AFM2 : Aflatoxin M2 AP : Alkaline phosphatase BICP : –Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt BSA : Bovine Serum Albumine EDC : 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide ELISA : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay FCA : Freund’s Complete Adjuvant FIA : Freund’s Incomplete Adjuvant FPLC : Fast protein liquid chromatography GNP : Gold Nanoparticles (hạt nano vàng) GST : Glutathione S-transferase HPLC : High – performance liquid chromatography HPTLC : High – performance thin layer chromatography HRP : Horseradish peroxidase Ig : Immunoglobulin KLH : Keyhole Limpet Hemocyanin LFA : Lateral Flow Immunoassay MS Mass spectrometry NHS N-hydroxysuccinimide PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis PBS Phosphate Buffered Saline vi PEG Polyethylene glycol PrA Protein A TLC Thin Layer Chromatography UV-VIS Ultraviolet–visible spectroscopy WHO World Healthy Organization vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1 Nấm Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus bào tử nấm nhìn kính hiển vi, độ phóng đại 600 lần Hình Cấu trúc nhóm Aflatoxin điển hình B G Hình Các nhóm Aflatoxin khác Hình Quá trình chuyển hóa aflatoxin B1 thể Hình Nguyên lý que thử hoạt động dựa kỹ thuật sắc ký miễn dịch cạnh tranh 22 Hình Sơ đồ tổng thể nghiên cứu 26 Hình 2 Quy trình gắn kháng thể với hạt nano vàng 31 Hình 3.1 Biểu đồ ELISA trình gây đáp ứng miễn dịch thỏ AFB1KLH 34 Hình Sắc ký đồ tinh IgG từ huyết thỏ sử dụng cột Protein ASepharosevới thể tích gel ml, tốc độ ml/phút 35 Hình 3 Phổ điện di protein tinh kháng thể kháng AFB1 36 Hình Đánh giá tính đặc hiệu kháng thể kháng AFB1 tinh 37 Hình Kiểm tra hoạt động que thử với điều kiện thiết lập ban đầu 39 Hình Xác định hàm lượng kháng thể kháng AFB1 cộng hợp với GNPs thích hợp 40 Hình Xác định pH thích hợp tạo cộng hợp kháng thể với hạt nano vàng 42 Hình Phản ứng tạo cộng hợp kháng thể hạt nano vàng điều kiện nhiệt độ khác 43 Hình 3.9 Xác định thời gian phản ứng cộng hợp kháng thể hạt nano vàng 44 Hình 10 Ảnh hưởng cơng thức đệm cộng hợp đến tín hiệu que thử 45 Hình 11 Kết thử nghiệm loại vật liệu khác làm miếng cộng hợp 46 Hình 12 Nhiệt độ cố định cộng hợp 47 Hình 13 Thời gian sấy miếng cộng hợp 48 Hình 14 Ảnh hưởng vật liệu màng đến kết nghiên cứu 49 Hình 15 Tối ưu hóa hàm lượng kháng thể cố định lên vạch kiểm tra (vạch T) 50 viii Hình 18 Xác định thời gian sấy màng nitrocellulose 37oC 3.2.3.6.Xác định hàm lượng kháng thể cố định vạch kiểm chứng lên màng lai Kháng thể thỏ vạch kiểm chứng có vai trò bắt giữ kháng thể kháng AFB1 cộng hợp nano vàng có vai trị quan trọng việc đánh giá hoạt động bình thường que thử Hàm lượng kháng thể thỏ phải đảm bảo bắt cặp với lượng kháng thể đủ lớn cho cường độ vạch tín hiệu vạch C tương đương vạch tín hiệu vạch T trường hợp mẫu âm tính, có vạch tín hiệu ổn định trường hợp mẫu dương tính (kháng thể cộng hợp với vàng phải dư so với kháng thể kháng thỏ vạch C) Hơn nữa, hàm lượng kháng thể ảnh hưởng lớn đến giá thành que thử thành phẩm sau nên cần tối ưu nồng độ kháng thể để đảm bảo với lượng kháng thể sử dụng đảm bảo tín hiệu rõ ràng Chúng tơi tiến hành thử nghiệm với hàm lượng kháng thể thỏ cố định lên vạch kiểm chứng: 0,05 μg; 0,08 μg; 0,1 μg; 0,15 μg; 0,2 μg /que thử 0,05 µg 0,08 µg 0,1 µg 0,15 µg 0,2 µg Hình 19 Xác định hàm lượng kháng thể cố định vạch kiểm chứng Kết cho thấy hàm lượng kháng thể tăng cường độ tín hiệu tăng lên rõ rệt (Hình 3.19) Với hàm lượng kháng thể sử dụng 0,1 μg xuất vạch tín hiệu rõ nét có tượng độ ổn định mẫu âm tính mẫu dương tính, đồng thời tín hiệu tương đương vạch T mẫu âm tính 53 dự định nhóm nghiên cứu Vì vậy, hàm lượng kháng thể 0,1 μg sử dụng để tạo cộng hợp cho nghiên cứu 3.3 Đánh giá que thử 3.3.1 Độ lặp lại que thử Để đánh giá độ lặp lại que thử, tiến hành kiểm tra 10 que thử mẫu âm tính 10 mẫu thử dương tính với AFB1 điều kiện người thao tác, thiết bị sử dụng, việc hiệu chuẩn thiết bị, môi trường (nhiệt độ, độ ẩm, ô nhiễm khơng khí…) phép đo tiến hành khoảng thời gian ngắn Hình 3.20 Kết độ lặp lại que thử mẫu âm tính với AFB1 (Mũi tên đỏ: vạch phun kháng thể kháng kháng thể thỏ, mũi tên đen: vạch phun kháng nguyên AFB1BSA) 54 Hình 21 Kết độ lặp lại que thử mẫu dương tính với AFB1 Kết Hình 3.20 cho thấy 10 que thử với mẫu âm tính với AFB cho kết xuất vạch màu hồng tía có cường độ tương đương vạch T vạch C Kết Hình 3.21 cho thấy 10 que thử với mẫu dương tính với AFB1 cho kết xuất vạch màu hồng tía vạch C điều khẳng định độ lặp lại que thử 100% 3.3.2 Ngưỡng phát Để đánh giá ngưỡng phát que thử, tiến hành kiểm tra que thử với hàm lượng AFB1 chuẩn khác nhau: 0,5 ng; 1,0 ng; 2,0 ng; 5,0 ng; 10,0 ng; 15,0 ng Có thể thấy kết kiểm tra với mẫu âm tính, que thử xuất vạch tín hiệu hồng tía có cường độ tương đương vạch T C Khi kiểm tra với mẫu dương tính, tín hiệu vạch C khơng thay đổi, tín hiệu vạch T giảm dần biến hàm lượng AFB1 tăng lên Ở hàm lượng AFB1 0,5 ng khó nhận thay đổi vạch T, nhiên nhận thấy hàm lượng AFB1 1,0 ng, vạch T mờ hẳn hàm lượng AFB1 10 ng, tín hiệu vạch T biến hồn tồn Như xác lập ngưỡng phát que thử 10,0ng 55 Hình 22 Đánh giá ngưỡng phát que thử Đối với que thử thương mại có thị trường, xét nghiệm que thử coi dương tính với aflatoxin kết vạch T biến mờ tín hiệu vạch C Như que thử mà chúng tơi chế tạo hồn tồn nhận biết có mặt aflatoxin hàm lượng thấp Độ nhạy que thử thiết kế cao so sánh với que thử thương mại Reveal Mỹ có độ nhạy 20 ppb 3.3.3 Thử nghiệm mẫu nguyên liệu thức ăn chăn nuôi Chúng tiến hành kiểm tra que thử với mẫu thực tế gồm mẫu thức ăn chăn nuôi tổng hợp (gồm: cám chim cút, cám gà thịt cám heo cai sữa) mẫu nguyên liệu sản xuất thức ăn chăn nuôi (gồm: cám mỳ, ngô đùn, khô đậu, DDGS) cung cấp Công ty Cổ phần dinh dưỡng Hồng Hà Các mẫu khẳng định âm tính với aflatoxin B1 kỹ thuật HPLC Để chuẩn bị mẫu dương tính, chúng tơi tiến hành trộn mẫu với aflatoxin B1 chuẩn tiến hành chiết mẫu Methanol 70% theo phương pháp Poh HongGoh cộng (2014) Với mẫu âm mẫu dương này, tiến hành kiểm tra dịch chiết que thử chế tạo, đọc kết sau 10-15 phút 56 Hình 23 Các mẫu nguyên liệu thức ăn chăn nuôi (DDGS: bã rượu khô, 6410: cám chim cút, 2100: cám gà thịt, 1100: cám lợn cai sữa) Kết que thử với mẫu âm tính xuất vạch màu hồng tía vạch T vạch C (Hình 3.24) mẫu dương tính xuất vạch màu hồng tía vạch C chứng tỏ que hoạt động tốt mẫu thực tế Hình 24 Kết kiểm tra que thử với mẫu âm tính AFB1 Hình 25 Kết que thử que thử với mẫu dương tính AFB1 57 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: Từ kết thu được, chúng tơi có số kết luận sau: Đã tinh chế kháng thể đa dòng kháng AFB1 hiệu suất thu 3,29 mg/ml huyết Kháng thể thu đáp ứng yêu cầu để ứng dụng phát triển kít chẩn đốn ứng dụng khác Xác định điều kiện thích hợp để tạo cộng hợp kháng thể kháng AFB1 với hạt nano vàng: hàm lượng kháng thể ng; pH 7,0; phản ứng cộng hợp 25oC thời gian 30 phút; sấy 37oC 30 phút Xác định điều kiện thích hợp cố định kháng thể lên màng lai: Hàm lượng AFB1-BSA 0,1 µg; phun thể tích 1,5µl/cm, sấy 37oC 30 phút Đã tạo que thử phát AFB1 bước đầu đánh giá số đặc tính que thử: độ lặp lại 100%, ngưỡng phát hiện: 10 ppb thử nghiệm với mẫu nguyên liệu sản xuất thức ăn chăn nuôi Kiến nghị: Đề tài thành công bước đầu quan trọng để phát triển sản xuất thương mại hóa sản phẩm nghiên cứu, giúp cho Việt Nam có sinh phẩm chẩn đốn nhanh có mặt độc tố aflatoxin Để hoàn thiện sản phẩm, đề tài cần phải tiếp tục số nghiên cứu: - Đánh giá thử nghiệm que thử với cỡ mẫu lớn trường - Xác định điều kiện bảo quản que thử 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đậu Ngọc Hào, Lê Thị Ngọc Diệp (2003), Nấm mốc độc tố aflatoxin thức ăn chăn nuôi, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr 53 – 198 Lê Thị Mai Hương, Trần Văn Hùng (2015), “Ngành chăn nuôi trước thách thức Việt Nam gia nhập Cộng đồng Kinh tế ASEAN (AEC)”, Phát triển Hội nhập, số 23(33), tr 13-18 Lê Văn Giang, Phan Thị Kim (2011), “Đánh giá ô nhiễm Aflatoxin lạc, ngô thử nghiệm áp dụng biện pháp phòng trừ cho sản phẩm chế biến xã huyện Tân Kỳ tỉnh Nghệ An”, Y học thực hành 2011, số 6, tr 79-81 Nguyễn Thùy Châu, Đào Thị Hương, Vũ Thị Hương (2011), “Đánh giá mức độ nhiễm nấm mốc độc tố aflatoxin B1 số nông sản giai đoạn bảo quản Việt Nam”, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nông thôn, số 21, tr 13 - 21 Tiếng Anh Allcroft R., Lewis G (1963), “Groundnut toxicity in catlle”, Vet Rec, 75, pp 487-493 Amaike.S, Keller N.P (2011), “Aspergillus flavus”, Annu Rev Phytopathol, 49, pp 107-133 Asao T., Büchi G., Abdel-Kader M M., Chang S B., Wick E L., Wo-gan G N., (1965), “The structure of aflatoxin B1 and G1”, Chem Soc, 87:882 Asao T., Büchi G., Abdel-Kader M.M., Chang S.B., Wick E.L., Wo-gan G.N., (1963), “Aflatoxin B and G”, Chem Soc, 85:1706 Ayub M., Sachan D (1997), “Dietary factors affecting aflatoxin bi carcinogenicity,” Malaysian Journal of Nutrition, (3), pp 161–197 10 Azziz-Baumgartner E., Lindblade K., Gieseker K., Rogers H.S., Kieszak S., Njapau H (2005), “Aflatoxin Investigative Group Case-control study of an acute aflatoxicosis outbreak, Kenya, 2004” Environ Health Perspect, 113(12), pp 1779–1783 59 11 Babu D (2010), Rapid and Sensitive Detection of Aflatoxin in Animal Feeds and Food Grains Using Immunomagnetic Bead Based Recovery and RealTime Immuno Quantitative PCR (RT-iqPCR) Assay, Oklahoma State University 12 Bbosa G.S., Kitya D., Odda J., and Ogwal-Okeng J (2013), “Aflatoxins metabolism, effects on epigenetic mechanisms and their role in carcinogenesis”, Health, 5(10), pp 14–34 13 Bhat R.V., Krishnamachari K.A (1977), Follow-up study of aflatoxic hepatitis in parts of western India Indian J Med Res 66(1) pp 55–58 14 Boutrif E (1995), “FAO programmes for prevention, regulation, and control of mycotoxins in food”, Nat Toxins, 3, pp 322–326 15 Boyer R.F (1993), Modern Experimental Biochemistry, Benjamin/Cummings Publishing Company 16 Braăse S (2013), The Chemistry of Mycotoxins, Progress in the Chemistry of Organic Natural Products”, Springer-Verlag Wien, 97(2), pp 3-21 17 Braithwaite A., Smith F.J., and Stock R (1985), Chromatographic Method, Chapman and Hall 18 Codner R.C., Sargeant K., Yeo R (1963), “Production of aflatoxin by the culture of strains of Aspergillus flavus-oryzae on sterilized peanuts”, Biotech Bioeng, 5, pp 185-192 19 Cullen J.M., Newberne P.M., Eaton D., and Groopman J (1993), “Acute hepatotoxicity of aflatoxins”, in The Toxicology of Aflatoxins: Human Health, Veterinary and Agricultural Significance, pp 3–26 20 Iongh H., Vles R., and De Vogel P (1964), “The occurrence and detection of aflatoxin in food”, in Proceedings of the Symposium on Mycotoxins in Foodstuffs, G H Wogan, Ed., p 235, MIT Press, Cambridge, Mass, USA 21 Delmulle B.S., De Saeger S.M.D.G., Sibanda L., Barna-Vetro I., and van Peteghem C.H (2005), “Development of an immunoassay-based lateral flow 60 dipstick for the rapid detection of aflatoxin B1 in pig feed”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53(9), pp 3364–3368 22 Dors G.C.; Bierhals V.S., Badiale-Furlong E (2011) “Parboiled rice: chemical composition and the occurrence of mycotoxins” Ciência e Tecnologia de Alimentos, 31(1), pp 172-177 23 Gallagher E.P., Kunze K.L., Stapleton P.L., and Eaton D.L (1996), “The kinetics of aflatoxin B1 oxidation by human cDNA-expressed and human liver microsomal cytochromes P450 1A2 and 3A4”, Toxicology and Applied Pharmacology, 141(2), pp 595–606 24 Gournama H., Bullerman L.B (1995), “Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus: aflatoxigenic fungi of concern in foods and feeds: a review”, J Food Protect, 58, pp 1395–1404 25 Giray B., Girgin G., Engin A.B., Aydın S., Sahin G (2007) “Aflatoxin levels in wheat samples consumed in some regions of Turkey”, Food Control,18, pp 23–29 26 Hussain I., Anwar J (2008), “A study on contamination of aflatoxin M1 in raw milk in the Punjab province of Pakistan”, Food Control, 19, pp 393– 395 27 Hussein H.S., Brasel J.M (2011), “Toxicity, metabolism, and impact of mycotoxins on humans and animals”, Toxicology, 167(2), pp 101–134 28 Huybrechts B (2011), Evaluation of Immunoassay Kits for Aflatoxin Determination in Corn & Rice, CODA-CERVA, National Reference Laboratory on Mycotoxins 29 IARC (1993), Some naturally occurring substances - food items and constituents, heterocyclic aromatic amines and mycotoxins IARC Monogr Eval Carcinog Risks Hum Lyon, France: World Health Organization, International Agency for Research on Cancer, pp 245–391 61 30 Jelinek C.F., Pohland A.E., Wood G.E (1989), “Worldwide occurrence of mycotoxins in foods and feeds - an update”, Assoc Off Anal Chem, 72(2), pp 223-230 31 Jin X., Liu X., Chen L., Jiang J., Shen G., and Yu R., “Biocatalyzed deposition amplification for detection of aflatoxin B1 based on quartz crystal microbalance”, Analytica Chimica Acta, 645(1-2), pp 92–97 32 Johnson W.W., Yamazaki H., Shimada T., Ueng Y.F., Guengerich F.P (1997), “Aflatoxin B1 8,9-epoxide hydrolysis in the presence of rat and human epoxide hydrolase”, Chemical Research in Toxicology, 10(6), pp 672–676 33 K Spinella, L Mosiello, G Palleschi, and F Vitali, “Development of a qcm (quartz crystal microbalance) biosensor to the detection of aflatoxin b1,” Open Journal of Applied Biosensor, vol 2, no 4, pp 112–119 34 Kensler T.W., Roebuck B.D., Wogan G.N., Groopman J.D (2011), “Aflatoxin: a 50-year odyssey of mechanistic and translational toxicology”, Toxicol Sci, 120 (1), pp 28-48 35 Krishnamachari K.A., Bhat R.V., Nagarajan V., Tilak T.B (1975), “Hepatitis due to aflatoxicosis An outbreak in Western India”, Lancet, 1(7915), pp 1061-1063 36 Laemmli U K (1970), “Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4” Nature 227(5259), pp 680-685 37 Langone J.J and van Vunakis H (1976), “Aflatoxin B1: specific antibodies and their use in radioimmunoassay”, Journal of the National Cancer Institute, 56(3), pp 591–595 38 Lequin R.M (2005), “Enzyme immunoassay (eia)/enzyme-linked immunosorbent assay (elisa)”, Clinical Chemistry, 51, pp 2415–2418 39 Lewis L., Onsongo M., Njapau H., Schurz-Rogers H., Luber G., Kieszak S (2005), “Kenya Aflatoxicosis Investigation Group Aflatoxin contamination of commercial maize products during an outbreak of acute aflatoxicosis in 62 eastern and central Kenya”, Environ Health Perspect, 113(12), pp 1763– 1767 40 Li P., Zhang Q., Zhang D (2011), “Aflatoxin measurement and analysis,” in Aflatoxins—Detection, Measurement and Control, I Torres-Pacheco, Ed., pp 183–208, Intech, Shanghai, China 41 McLean M., Dutton M.F (1995), “Cellular interactions and metabolism of aflatoxin: an update”, Pharmacol Ther, 65, pp 163–192 42 Newberne P.M., Butler W.H (1969), “Acute and chronic effects of aflatoxin on the liver of domestic and laboratory animals: A review”, Cancer Res, 29, pp 236-250 43 Newberne P.M., Harrington D.H., Wogan G N (1966), “Effects of cirrhosis and other liver insults on induction of liver by aflatoxin in rat” Lab Invest, 13: pp 1962-1969 44 Ngindu A., Johnson B.K., Kenya P.R., Ngira J.A., Ocheng D.M., Nandwa H (1982), “Outbreak of acute hepatitis caused by aflatoxin poisoning in Kenya”, Lancet, 1(8285), pp 1346–1348 45 Payne G.A., Brown M.P (1998), “Genetics and physiology of aflatoxin biosynthesis”, Annu Rev Phytopathol, 36, pp 329-362 46 Pearson T., Wicklow D., Maghirang E., Xie F., and Dowell F (2001), “Detecting aflatoxin in single corn kernels by transmittance and reflectance spectroscopy”, Transactions of the American Society of Agricultural Engineers, 44(5), pp 1247–1254 47 Petterson H and Langseth W (2002), “Intercomparison of trichothecenes analysis and feasibility to produce certified calibrants”, EU Reports EUR 20285, European Commission BCR Information Project 48 Ramesh J., Sarathchandra G., and Sureshkumar V (2013), “Analysis of feed samples for aflatoxin b1 contamination by hptlc-a validated method”, International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, 2, pp 373–377 63 49 Rauch P., Fukal L., Prošek J., Březina P., and Káš J (1987), “Radioimmunoassay of aflatoxin M1”, Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry, 117(3), pp 163–169 50 Romani L (2004), “Immunity to fungal infections”, Nat Rev Immunol, 4(1), pp 1-23 51 Severns D.E., Clements M.J., Lambert R.J., White D.G.J (2003), “Comparison of Aspergillus ear rot and aflatoxin contamination in grain of high-oil and normal-oil corn hybrids”, Food Prot, 66(4), pp 637-643 52 Stroka J., Anklam E (2002), “New strategies for the screening and determination of aflatoxins and the detection of aflatoxin-producing moulds in food and feed”, TrAC—Trends in Analytical Chemistry, 21(2), pp 90–95 53 Vondracek M., Xi Z., Larsson P (2001), “Cytochrome P450 expression and related metabolism in human buccal mucosa”, Carcinogenesis, 22(3), pp 481–488 54 Voller A., Bartlett A., and Bidwell D E (1978), “Enzyme immunoassays with special reference to ELISA techniques”, Journal of Clinical Pathology 31(6), p 507-522 55 Wild C P and Turner P C (2002), “The toxicology of aflatoxins as a basis for public health decisions,” Mutagenesis, 17(6), pp 471–481 56 Wild C.P., Turner P.C (2002), “The toxicology of aflatoxins as a basis for public health decisions”, Mutagenesis, 17(6), pp 471–481 57 Williams J.H., Phillips T.D., Jolly P.E., Stiles J.K., Jolly C.M (2004), “Human aflatoxicosis in developing countries: a review of toxicology, exposure, potential health consequences, and interventions”, Am J Clin Nutr, 80, pp 1106–1122 Trang Web 58 http://fungi.myspecies.info/all-fungi/aspergillus-flavus 59 https://en.wikipedia.org/wiki/Aspergillus_parasiticus 64 PHỤ LỤC Kết phân tích mẫu thức ăn chăn ni phương pháp HPLC Mẫu 1: Dịch chiết cám mỳ Mẫu 2: Dịch chiết ngô đùn Mẫu 3: Dịch chiết DDGS Mẫu 4: Dịch chiết khô đậu 65 Mẫu 5: Dịch chiết cám chim cút 6410 Mẫu 6: Dịch chiết cám gà thịt 2100 Mẫu 7: Dịch chiết cám heo cai sữa Mẫu AFB1 chuẩn: ... tài ? ?Nghiên cứu phát triển que thử xác định aflatoxin thức ăn chăn nuôi? ?? với mục tiêu tạo kháng thể đặc hiệu kháng AFB1 nghiên cứu điều kiện tối ưu để phát triển que thử phát có mặt aflatoxin thức. .. BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN THỊ NGỌC ÁNH NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN QUE THỬ XÁC ĐỊNH AFLATOXIN TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA... 20 ppb Các que thử thị trường Việt Nam gồm có que thử định lượng que thử định tính aflatoxin Reveal for Aflatoxin (Mĩ) que thử định tính với độ nhạy 20 ppb sử dụng để xác định có mặt aflatoxin