Mục tiêu của đề tài là giải trình tự và xác định tỷ lệ ADN ty thể và ADN nhân của các mẫu phôi sinh thiết; khảo sát tỷ lệ ADN ty thể và ADN nhân ở các nhóm phôi khác nhau trong xét nghiệm PGT-A. Từ đó, khảo sát sự tương quan giữa chỉ số MA (tỷ số ADN ty thể/ADN nhân) và các tiêu chí chọn phôi hiện tại, tiềm năng của chỉ số MA trong việc đánh giá ưu tiên chuyển phôi ở mức độ di truyền.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Trần Thị Thanh Huyền MỐI LIÊN QUAN GIỮA TỶ LỆ ADN TY THỂ VÀ ADN NHÂN TRONG ĐÁNH GIÁ SÀNG LỌC PHÔI TIỀN LÀM TỔ LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2020 BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Trần Thị Thanh Huyền MỐI LIÊN QUAN GIỮA TỶ LỆ ADN TY THỂ VÀ ADN NHÂN TRONG ĐÁNH GIÁ SÀNG LỌC PHÔI TIỀN LÀM TỔ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC Hướng dẫn 1: TS Nguyễn Thị Trang Huyền Hướng dẫn 2: TS Trần Thị Thanh Huyền Hà Nội - 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn cơng trình nghiên cứu riêng Các kết nêu luận văn chưa cơng bố cơng trình khác Các số liệu, ví dụ trích dẫn luận văn đảm bảo tính xác, tin cậy trung thực Tơi hồn thành tất mơn học toán tất nghĩa vụ tài theo quy định Phịng Đào tạo - Học viện Khoa học Công nghệ Vậy viết Lời cam đoan đề nghị Phòng Đào tạo - Học viện Khoa học Công nghệ xem xét để tơi bảo vệ luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn! NGƯỜI CAM ĐOAN Trần Thị Thanh Huyền LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình thực luận văn tốt nghiệp, bên cạnh cố gắng nỗ lực thân xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới tập thể cá nhân tận tình giúp đỡ tơi Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Trang Huyền- Trường Đại Học Khoa học Công nghệ Hà Nội, TS Trần Thị Thanh Huyền- Trung tâm công nghệ cao Vinmec – Hệ thống y tế Vinmec tận tình hướng dẫn truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho thời gian học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn quan tâm giúp đỡ, bảo tận tình chuyên môn động viên chân thành tập thể nhân viên phịng Xét nghiệm, cơng ty TNHH Công nghệ GenHD Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy, Cơ Phịng Đào tạo - Học viện Khoa học Cơng nghệ tận tình bảo tạo điều kiện tốt cho suốt q trình học tập Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình, bạn bè động viên, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày … tháng … năm 2020 Học viên TRẦN THỊ THANH HUYỀN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt ADN Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic ADP Adenosine diphosphate Phân tử mang lượng ARN Ribonucleic acid Axit ribonucleic ATP Adenosine triphosphate Phân tử mang lượng Base pair Cặp bazơ CCS Comprehensive chromosome screening Sàng lọc nhiễm sắc thể toàn diện CGH Comparative genomic hybridization Phương pháp lai so sánh hệ gen CNV Copy number variation Biến thể số lượng dNTP Deoxynucleotide triphosphates Deoxynucleotit triphotphat Flavin adenine dinucleotide Flavin adenin dinucleotit FISH Fluorescence in situ hybridization Kỹ thuật lai huỳnh quang chỗ ICM Inner cell mass Nguyên bào phôi ICSI Intra- cytoplasmic sperm injection Tiêm trực tiếp tinh trùng vào noãn để tạo phôi IUI Intrauterine insemination Bơm tinh trùng vào buồng tử cung ISH In situ hybridization Lai ghép chỗ bp FADH2 ISP Ion Sphere Particles Hạt ISP IVF In Vitro Fertilization Thụ tinh ống nghiệm Kilobyte Kích thước tập tin kDA Kilodalton Đơn vị khối lượng nguyên tử MA mtDNA/nuDNA Tỷ lệ ADN ty thể/ ADN nhân Mb Megabyte Đơn vị thông tin mRNA Messenger ribonucleic acid ARN thông tin mtDNA Mitochondrial DNA Hệ gen ty thể NADH Nicotinamide adenine dinucleotide Nicotinamit adenin dinucleotit Next generation sequencing Giải trình tự gen hệ kb NGS Nhiễm sắc thể NST nuDNA PGCs PGT-A QC qPCR Nuclear DNA Hệ gen nhân Primordial germ cells Tế bào mầm nguyên thủy Preimplantation genetic testing for - Aneuploidy Sàng lọc di truyền trước chuyển phơi Quality control Kiểm sốt chất lượng Quantitative Polymerase Chain Reaction Định lượng phản ứng chuỗi Reactive oxygen species Các dạng oxy hoạt động Trophectoderm Nguyên bào nuôi tRNA Transfer ribonucleic acid ARN vận chuyển WGA Whole genome amplification Khuếch đại toàn hệ gen WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới µl Microliter Micro lít µm Micrometer Micro mét ROS TE DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1 Ưu- nhược điểm số phương pháp hỗ trợ sinh sản Bảng Hệ thống đánh giá điểm phôi giai đoạn phân chia theo tổ chức Alpha 11 Bảng Hệ thống đánh giá điểm phôi giai đoạn phôi nang theo Gardner’s 12 Bảng Ưu nhược điểm ba giai đoạn thực sinh thiết phôi 14 Bảng Các hóa chất sử dụng nghiên cứu 29 Bảng Số lượng tỷ lệ phần trăm (%) tổng số phôi nghiên cứu 45 Bảng Số lượng tỷ lệ phần trăm (%) tổng số phôi có hình thái tốt 51 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1 Sơ đồ quy trình PGT- A Hình Hình ảnh time- lapse cho thấy phát triển phôi giai đoạn phát triển Hình Bộ gen ty thể động vật có vú mã hóa 13 polypeptit chuỗi truyền điện tử 20 Hình Cơ chế di truyền thắt cổ chai ADN ty thể (mtDNA) 22 Hình Ion Torrent công nghệ bán dẫn 28 Hình Sơ đồ bước tiến hành thí nghiệm 31 Hình 2 Tổng quan bước tạo thư viện 33 Hình Sơ đồ hóa quy trình hoạt động chuẩn bị khn giải trình tự 35 Hình Tinh hạt từ tạo ADN sợi đơn 36 Hình Quy trình xử lý liệu giải trình tự phần mềm Torrent Suite 37 Hình Kết giải trình tự phôi 46, XY 38 Hình Kết giải trình tự phơi 46, XX 38 Hình Kết điện di sản phẩm sau bước khuếch đại 39 Hình Đánh giá tổng quan chất lượng kết giải trình tự chu kì PGT-A 40 Hình 3 Đánh giá chất lượng kết giải trình tự mẫu 41 Hình Đánh giá chất lượng kết xử lý số liệu giải trình tự 42 Hình Hình ảnh phân tích mẫu sinh thiết phơi 43 Hình Sự phân bố đoạn đọc ty thể số mẫu phơi 44 Hình Sự phân bố số MA nhóm phơi có hình thái khơng tốt nhóm phơi có hình thái tốt 45 Hình Phơi có nhiễm sắc thể bất thường (NST số 19) 46 Hình Phơi có nhiễm sắc thể bất thường (NST số 4, 22) 46 Hình 10 Phơi có nhiễm sắc thể bất thường (NST số 4, 13, 14, 15, 21) 47 Hình 11 Phơi có 13 nhiễm sắc thể bất thường (NST số 3, 4, 5, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 21 Y) 47 Hình 12 Sự phân bố số lượng phơi nhóm theo số NST bị bất thường 47 Hình 13 Sự phân bố số MA dựa theo nhóm phơi có số NST bị bất thường 48 Hình 14 Sự phân bố số lượng phôi theo mức độ bất thường số lượng NST 49 Hình 15 Sự phân bố số MA nhóm phơi theo mức độ bất thường NST 50 Hình 16 Sự phân bố số MA nhóm phơi theo trạng thái bất thường số lượng NST 52 68 Median of column A 0.004155, n=32 Median of column B 0.00149, n=326 Difference: Actual -0.002665 Difference: Hodges-Lehmann -0.00245 Bảng Kiểm tra độ phân bố chuẩn nhóm phơi : khơng có bất thường số lượng NST, có NST bất thường, có từ 2-5 NST bất thường, từ NST bất thường (tổng số phôi nghiên cứu) Number of values Binh thuong NST 2-5 NST NST 148 68 106 36 Minimum 0.000406 0.000363 0.000151 0.000267 25% Percentile 0.000982 0.0009255 0.0009918 0.001353 Median 75% Percentile Maximum 0.00145 0.00141 0.001635 0.002025 0.001948 0.001973 0.0111 0.0043 0.00261 0.009543 0.0287 0.0265 Mean 0.001605 0.001577 0.002404 0.005551 Std Deviation 0.001078 0.0008554 0.003302 0.007006 Std Error of Mean 8.861e-005 0.0001037 0.0003208 0.001168 Lower 95% CI of mean 0.00143 0.001369 0.001768 0.003181 Upper 95% CI of mean 0.00178 0.001784 Sum 0.2375 0.1072 0.00304 0.007922 0.2548 0.1998 69 D'Agostino & Pearson normality test K2 P value 194.1 17.99 161.5 17.18