Nghiên cứu công nghệ thu nhận peptit kìm hãm enzym chuyển hoá angiotensin từ vi sinh vật lên men truyền thống với cơ chất là đậu tương

bộ giáo dục đào tạo trường đại học bách khoa hµ néi - NGUYễN THị PHƯƠNG THảO NGHIấN CU CễNG NGHỆ THU NHẬN PEPTIT KÌM HÃM ENZYM CHUYỂN HỐ ANGIOTENSIN TỪ VI SINH VẬT LÊN MEN TRUYỀN THỐNG VỚI CƠ CHT L U TNG 23.04.3898 luận văn thạc sĩ khoa học ngành : công nghệ sinh học NGI HNG DN KHOA HỌC: TS Trần Liên Hà Hµ Néi - 2008 MỤC LỤC Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình PHẦN I: MỞ ĐẦU PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đặc tính enzym chuyển Angiotensin 2.1.1 Giới thiệu enzym chuyển Angiotensin (ACE) thể người .3 2.1.2 Cấu trúc hóa học ACE 2.1.3 Đặc tính enzym ACE 2.2 Giới thiệu peptit ức chế enzym chuyển Angiotensin (ACEIP) 2.2.1 Lịch sử nghiên cứu ACEI 2.2.2 Cơ chế hoạt động ACEI .8 2.2.3 Phân loại ACEIP .10 2.2.3.1 ACEIP tổng hợp hóa học 10 2.2.3.2 ACEIP tổng hợp tự nhiên 13 2.3 Công nghệ sản xuất ACEIPs 14 2.3.1 Sản xuất ACEIP theo đường hóa học 14 2.3.2 Sản xuất ACEIP từ nguồn tự nhiên 14 2.3.2.1 Sản xuất ACEIP từ protein động vật 15 2.3.2.2 Sản xuất ACEIP từ nguồn protein thực vật 19 2.3.2.3 Sản xuất ACEIP từ vi khuẩn lactic 23 2.3.2.4 Tình hình sử dụng peptit ức chế ACE giới 28 2.4 Lên men tổng hợp ACEIP từ protein đậu tương sử dụng chủng Bacillus subtilis TH2 30 2.4.1 Protein đậu tương .30 2.4.2 Các hợp phần protein đậu tương 30 2.4.3 Giới thiệu vi khuẩn Bacillus subtilis 32 Phần III: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 33 3.1 Nguyên liệu .33 3.1.1 Chủng giống vi sinh vật 33 3.1.2 Hóa chất 33 3.1.3 Thiết bị 33 3.1.4 Môi trường nuôi cấy 34 3.2 Phương pháp nghiên cứu 36 3.2.1 Phương pháp phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn Lactic 36 3.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính ức chế ACE .36 3.2.3 Phương pháp so sánh khả tạo ACEIP chủng lactic với chủng Bacillus subtilis 38 3.2.4 Phương pháp xác định protein tổng (BSA) 38 3.2.5 Phương pháp xác định peptit tổng .38 3.2.6 Tối ưu điều kiện lên men theo phương pháp cổ điển 39 3.2.6.1 Tối ưu nhiệt độ .39 3.2.6.2 Tối ưu hàm lượng đường .39 3.2.6.3 Tối ưu hàm lượng protein 39 3.2.6.4 Tối ưu pH .40 3.2.7 Tối ưu điều kiện lên men theo thuật toán sử dụng ma trận DOEHLERT 40 3.2.8 Tinh enzyme 42 3.2.8.1 Phương pháp lọc dòng ngang 42 3.2.8.2 Phương pháp lọc qua màng cut off 42 3.2.8.3 Phương pháp điện di protein 43 3.2.9 Phương pháp sấy phun sản phẩm 44 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 4.1 Phân lập chủng vi khuẩn lactic có khả sinh tổng hợp ACEIP .45 4.2 Lựa chọn chủng vi khuẩn lactic có khả sinh ACEIP cao 45 4.3 Định tên sơ chủng vi khuẩn lactic lựa chọn 46 4.4 So sánh khả tạo ACEIP chủng vi khuẩn lactic với chủng Bacillus subtilis 52 4.5 Lên men kết hợp chủng vi khuẩn Bacillus subtilis TH2 với chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae 53 4.6 Tối ưu điều kiện lên men theo phương pháp cổ điển 55 4.6.1 Tối ưu hàm lượng đường 55 4.6.2 Tối ưu nhiệt độ 58 4.6.3 Tối ưu hàm lượng protein 61 4.6.4 Tối ưu pH 64 4.7 Tối ưu điều kiện lên men theo thuật toán sử dụng ma trận DOEHLERT 65 4.8 So sánh khả kìm hãm ACE trước sau tối ưu 71 4.9 Tinh enzym 72 4.9.1 Loại phân tử kích thước lớn 73 4.9.2 Kết điện di Protein 74 4.10 Sản phẩm dạng sấy phun 76 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 78 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Study on producing angiotensin converting enzyme inhibitory peptides using traditional fermented microorganisms from soybean Abstract Nowadays, hypertention is a significant health problem in the world It is one of the major controllable factors, which associated with cardiovasscular disease event such as myocardial infarction, heart failture, and end- stage diabetes and is the main cause of many death in the western countries In this study, we isolated and screened microorganisms from traditional fermented food such as lactic acid bacteria, from fermented vegestable and yoghourt, and Bacillus subtilis from fish sauce and Natto Among 13 strains lactic acid bacteria, DC2 were selected Comparison angiotensin converting enzyme inhibitory activity between DC2 lactic acid bacteria and strains Bacillus subtilis, Bacillus subtilis TH2 was selected with ACEI (%) = 50,00% Combination using Bacillus subtilis TH2 and the yeast Saccharomyces cerevisiae 28 showed higher ACEI (%) =58.33% The study also showed that the potential using soy bean is a good source for producing ACEIP The optimum incubation condition for producing were investigated with traditional method and algorithm The optimum condition for ACEIP were pH of 6.5, incubation time of 48h, at 30oC, protein 10 mg/ml and glucose 20 g/l The purified peptide showed inhibitory activity of 95% The molecular weight of ACEIP is less than 3000 Da NguyÔn Thị Phương Thảo Công nghệ sinh học Nghiờn cu cơng nghệ thu nhận peptit kìm hãm enzym chuyển hố angiotensin từ vi sinh vật lên men truyền thống với chất protein đậu tương Tóm tắt Ngày bệnh cao huyết áp vấn đề sức khỏe mang tính tồn cầu Nó nhân tố gây nên bệnh tim mạch, chí dẫn tới nhồi máu tim, tai biến mạch máu não nguyên nhân gây tử vong cao nước phương tây Trong nghiên cứu này, phân lập lựa chọn nhiều loại vi sinh vật từ thực phẩm lên men truyền thống Như vi khuẩn lactic từ dưa chua sữa chua Bacillus subtilis từ nước mắm natto Trong số 13 loại vi khuẩn lactic, DC2 lựa chọn So sánh hoạt tính ức chế enzym chuyển hóa angiotensin vi khuẩn lactic DC2 loại Bacillus subtilis, Bacillus subtilis TH2 chọn cho hoạt tính ức chế ACE 50,00% Kết hợp sử dụng Bacillus subtilis TH2 nấm men Saccharomycs cerevisiae 28 cho hoạt tính ức chế ACE cao đạt 58.33% Nghiên cứu cho thấy đậu tương lên men nguồn có tiềm tốt cho hoạt tính ức chế ACE Chúng tơi tối ưu điều kiện nuôi cấy theo phương pháp cổ điển thuật tốn Điều kiện ni cấy tối ưu để tạo peptit có khả kháng huyết áp từ TH2 là: pH 6.5 48 giờ, 30oC Với hàm lượng protein 10 mg/ml Hàm lượng đường glucoza 20 mg/ml Tinh peptit cho tỷ lệ ức chế ACE 95% Peptit có hoạt tính ức chế ACE xác định có kích thước nhỏ hn KDa Luận văn thạc sỹ khoa học 2006 - 2008 Nguyễn Thị Phương Thảo Công nghệ sinh häc Lời cảm ơn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới cô giáo PGS.TS Trần Liên HàGiảng viên phòng vi sinh kỹ thuật di truyền Viện Công Nghệ Sinh Học Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, người tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn giảng viên, cán phòng, bạn sinh viên phòng vi sinh kỹ thuật di truyền, phịng hóa sinh tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành luận văn Cuối cùng, xin bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình, bạn bè ln động viên, ủng hộ giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài Hà nội, ngày 24 tháng 11 năm 2008 Học viên Nguyễn Thị Phương Thảo Luận văn thạc sỹ khoa học 2006 - 2008 Nguyễn Thị Phương Thảo Công nghệ sinh học Li cam đoan Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu luận văn khoa học Các kết nghiên cứu luận văn hoàn toàn trung thực, thơng số kết tính tốn hồn tồn xác chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Hà nội, ngày 24 tháng 11 năm 2008 Học viên Nguyễn Thị Phương Thảo Luận văn thạc sỹ khoa học 2006 - 2008 Nguyễn Thị Phương Thảo Công nghệ sinh học DANH MC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Giải thích RAAS Renin- Angiotensin- Aldosterol system (hệ thống Renin-Angiotensin Aldosterol) ACEI Angiotensin I converting enzyme inhibitor (chất ức chế enzym chuyển angiotensin I) ACEIP Angiotensin I converting enzyme inhibitor peptides (peptit ức chế enzym chuyển angiotensin I ACE Angiotensin I converting enzyme (enzym chuyển hóa angiotensin I) BSA Bovine serum albumin (albumin huyết bò) Da Dalton BW Body weight (trọng lượng thể) IC50 50% inhibitory concentration (mg/ml) (nồng độ ức chế 50% hoạt tính ACE) f Fracment (đoạn) Km Michaelis Menten constant (hằng số Michaelis Menten) MWCO Molecular weight cut off (cut off trọng lượng phân tử) SDS- sodium dodecyl sulphate - polyacrylamide gel electrophoresis (điện PAGE di gel acrylamid) SHR FAPGG Spontaneously hypertensive rat(s) (tiến hành huyết áp chuột) Furanacryloy- L- phenylalaninylglycylglycine MRS De Man, Rogosa, Sharpe (môi trường MRS) SBP Systolic blood pressure (áp suất máu tâm thu Luận văn thạc sỹ khoa học 2006 - 2008 Nguyễn Thị Phương Thảo Công nghệ sinh học DANH MC CÁC BẢNG Bảng Tên bàng Trang Bảng 2.1 Một số ACEI tổng hợp hóa học dùng 132 điều trị bệnh cao huyết áp thị trường giá trị IC50 chúng Bảng 2.2 Một số enzym thương phẩm dùng để thủy phân 15 whey protein Bảng 2.3 Những peptit cho hoạt tính ức chế ACE từ nước sốt 18 cá lên men Bảng 2.4 Một số ACEIP thu từ nguồn protein động vật 19 Bảng 2.5 Khả ức chế ACE số loại protein thực 22 vật Bảng 2.6 Giá trị IC50 số sản phẩm lên men từ đậu 23 tương Bảng 2.7 ACEIP từ protein sữa vi khuẩn lactic 24 Bảng 2.8 Casein sữa chuyển peptit kháng huyết áp chuột 26 Bảng 2.9 Ảnh hưởng sữa lên men peptit sữa đến 28 huyết áp người Bảng 2.10 Giá trị sinh học protein đậu tương Bảng 2.11 Tỷ lệ đặc trưng đoạn protein hòa tan 30 31 nước đậu tương Bảng 3.1 Phương pháp đo hoạt tính kìm hãm ACE theo Otte, 37 Zakora, Shalaby Bng 3.2 Ma trn DOEHLERT Luận văn thạc sỹ khoa học 41 2006 - 2008 Nguyễn Thị Phương Thảo 92 C«ng nghƯ sinh häc KIẾN NGHỊ Do điều kiện thời gian nghiên cứu có hạn, chúng tơi chưa thể nghiên cứu sâu vào xác định đặc tính thử nghiệm lâm sàng chế phẩm chứa peptit kìm hãm enzym ACE Chúng tơi có số kiến nghị sau: • Tiến hành nghiên cứu xác định trình tự axit amin peptit có hoạt tính ACE thu • Thử nghiệm lâm sàng để tiến tới sản xuất sản phẩm chứa peptit sinh học có hoạt tính ức chế ACE, có tác dụng điều trị bnh cao huyt ỏp nc Luận văn thạc sỹ khoa học 2006 - 2008 Nguyễn Thị Phương Thảo 93 C«ng nghƯ sinh häc TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt: Trần thị thúy Hằng (2006), Phân lập Bacillus subtilis TH2 từ Natto, tạo chế phẩm lên men Natto thử nghiệm sản xuất Natto từ đậu tương Lê Thanh Hà, Quản Lê Hà, Nguyễn Thị Hoài Trâm, (2008), “Nghiên cứu điều kiện thủy phân Casein enzym để thu peptit kìm hãm ACE”, Hội nghị khoa học tồn quốc lần thứ IV, Hóa sinh Sinh học phân tử, phục vụ nông, sinh, y học công nghiệp thực phẩm Lê Thị Thanh Ngân (2007), Nghiên cứu lựa chọn chủng giống vi sinh vật điều kiện lên men tổng hợp peptit chức kìm hãm enzym chuyển ACE từ nguồn protein sữa bị Luận văn thạc sĩ khoa học Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, Ngành công nghệ thực phẩm Lê Văn Nhân (2007), “Lịch Sử Khám Phá Nhóm Thuốc Ức Chế Men Chuyển Angiotensin” Y Dược Ngày Nay Lương Đức Phẩm (1998), Công nghệ vi sinh vật Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội PGS.TS Đặng Thị Thu, Nguyễn Thị Xuân Sâm, Tô Kim Anh (1997), Thí nghiệm Hóa sinh học cơng nghiệp Trường ĐH Bách khoa Hà Nội, Trung tâm công nghệ sinh học-Bộ môn Hóa sinh PGS.TS Lê Ngọc Tú (chủ biên) (2000), Biến hình sinh học sản phẩm từ hạt Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội PGS.TS Lê Ngọc Tú (chủ biên) (2000), Biến hình sinh học sản phẩm từ hạt Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Nguyễn Minh Tuyển, (2002), “Quy hoạch thực nghiệm” Nhà xuất Khoa học v K thut Luận văn thạc sỹ khoa học 2006 - 2008 Nguyễn Thị Phương Thảo 94 Công nghệ sinh häc Tài liệu nước ngoài: 10 Abubakar, A., Saito, T., Kitazawa, H., Kawai, Y and Itoh, T (1998) Structural analysis of new antihypertensive peptides derived from cheese whey protein by proteinase K digestion Journal of Dairy Science, 81:3131-3138 11 Anne Pihlanto-Leppolo, Timo Rokka and Hannu Korhonen, (1998), “Angiotensin I converting enzyme inhibitory peptides derived from bovine milk proteins”, International Dairy Journal, Vol.8, Issue 4, p325-331 12 Belem MAF, Gibbs BF Lee BH (1999), “Proposing sequences for peptides derived from whey fermentation with potential bioactive sites”, J Dairy Sci 82:486–93 13 Bunning, P., Holmquist, B and Riordan, J F (1983), “Substrate specificity and kinetic characteristics of angiotensin converting enzyme”, Biochemistry, 22:103-110 14 Chen JR, Yang SC, Suetsuna K, Chao JCJ (2004), “Soybean proteinderived hydrolysate affects blood pressure in spontaneously hypertensive rats”, J Food Biochem 28:61–73 15 Cheung HS, Wang FL, Ondetti MA, Sabo EF, Cushman DW (1980), “Binding of peptide substrates and inhibitors of angiotensin-converting enzyme”, J Biol Chem 255:401–7 16 Cheung, H S., Wang, F L., Ondetti, M A., Sabo, E F and Cushman, D W (1980), “Binding of peptide substrates and inhibitors of the angiotensin-converting enzyme”, Journal of Biological Chemistry, 255:401-407 Luận văn thạc sỹ khoa học 2006 - 2008 Nguyễn Thị Phương Thảo 95 Công nghệ sinh học 17 Cho YJ, Cha WS, Bok SK, Kim MU, Chun SS, Choi UK (2000), “Production and separation of anti-hypertensive peptide during Chunggugjang fermentation with bacillus subtilis CH-1023”, J Korean Soc Agric Chem Biotechnol 43:247–52 18 Corvol, P., Michaud, A., Soubrier, F and Williams, T A (1995), “Recent advantages in knowledge of the structure and function of the angiotensin I converting enzyme”, Journal of Hypertension, 13:S3-S10 19 Cuhman DW, Ondetti MA, (1980), “Inhibitors of angiotensinconverting enzyme”, Elsevier/ North- Holland Biomedical Press, New York, Amsterdam, pp41-104 20 Cushman, D W and Cheung, H S (1971), “Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin converting enzyme of rabbit lung”, Biochemical Pharmacology, 20:1637-1648 21 Cushman, D W., Ondetti, M A., Gordon, E M., Natarajan, S., Karanewsky, D S., Krapcho, J and Petrillo JR., E W (1987), “Rational design and biochemical utility of specific inhibitors of angiotensin converting enzyme”, Journal of Cardiovascular Pharmacology, 10:S17S30 22 Cushman, D W., Wang, F L., Fung, W C., Grover, G J., Harvey, C M., Scalese, R J., Mitch, S L and Deforrest, J M (1989), “Comparisons in vitro, ex vivo, and in vivo of the actions of seven structurally diverse inhibitors of the angiotensin converting enzyme (ACE)”, British Journal of Clinical Pharmacology, 28:115S-131S 23 Dr J Tuomilehto, (2004), “Journal of human hypertension, life sciences, vol.75 issue 14, p1727-1734 Luận văn thạc sỹ khoa học 2006 - 2008 Nguyễn Thị Phương Thảo 96 Công nghệ sinh học 24 Dziuba J, Iwaniak A Minkiewicz, P (2003), “Computer-aided characteristics of proteins as potential precursors of bioactive peptides” Polimery 48(1):50–3 25 Floris R, Recio I, Berkhout B, Visser S (2003), “Antibacterial and antiviral effects of milk proteins and derivatives thereof”, Curr Pharm Des 9(16):1257–75 26 Fuglsang A, Rattray FP, Nilsson D, Nyborg NC, (2003), “Lactic acid bacteria: inhibition of angiotensin converting enzyme in vitro and in vivo”, Antonie van Leeuwenhoek 83, p27-34 27 Fujita H, Usui H, Kurahashi K, Yoshikawa M (1995), “Isolation and characterization of ovokinin, a bradykinin B1 agonist peptide derived from ovalbumin”, Peptides 16:785–90 28 Fujita H, Yoshikawa M (1999), “LKPNM: a prodrug-type ACEinhibitory peptide derived from fish protein”, Immunopharmacology 44(1/2):123–7 29 Gibbs BF, Zougman A, Masse R, Mulligan C (2004), “Production and characterization of bioactive peptides from soy hydrolysate and soyfermented foods”, Food Res Int 37(2):123–31 30 Gobbetti, M., Ferranti, P., Smacchi, E., Goffredi, F and Addeo, F (2000) Production of angiotensin-I-converting-enzyme inhibitory peptides in fermented milks started by Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus SS1 and Lactococcus lactis subsp cremoris FT4 Applied andEnvironmental Microbiology, 66:3898-3904 31 Hata, Y., Yamamoto, M., Ohni, M., Nakajima, K., Nakamura, Y and Takano, T (1996), “A placebo controlled study of the effect of sour milk on blood pressure in hypertensive subjects”, American Journal of Clinical Nutrition, 64:767-771 Luận văn thạc sỹ khoa học 2006 - 2008 Nguyễn Thị Phương Thảo 97 Công nghệ sinh học 32 Holmquist, B., Bunning, P and Riordan, J F (1979), “A continuous spectrophotometric assay for the angiotensin converting enzyme”, Analytical Biochemistry, 95:540-548 33 Itakura, H., Ikemoto, S., Terada, S and Kondo, K (2001), “The effect of sour milk on blood pressure in untreated hypertensive and normotensive subjects”, Journal of Japanese Society of Clinical Nutrition, 23:26-31 34 James F Riordan (2003), “Angiotensin-I- converting enzyme and its relatives”, center for biochemical and Biophysical Sciences and Medicine, Harvard Medical School 35 Jeong HJ Lam Y, de Lumen BO (2002), “Barley lunasin suppresses ras-induced colony formation and inhibits core histone acetylation in mammalian cells”, J Agric Food Chem 50(21):5903–8 36 Jeong HJ, Park JH, Lam Y, de Lumen BO (2003) “Characterization of lunasin isolated from soybean”, J Agric Food Chem 51(27):7901–6 37 Jeanette Otte, Samah M.Shalaby, Mila Zakora (2007), “Angiotensinconverting enzyme inhibitory activity of milk protein hydrolysates: Effect of substrate, enzyme and time of hydrolysis”, International Dairy Journal Vol.17, p488-503 38 Kim SE, Kim HH, Kim JY, Kang YI, Woo HJ, Lee HJ (2000), “Anticancer activity of hydrophobic peptides from soy proteins”, BioFactors 12(1–4):151–5 39 Kimura A, Takada A, Okada T, Yamada H, (2000), “Microbial manufacture of angiotensin I-converting enzyme inhibiting peptides”, Japan: Toyo Hatsuko K.K.: Jpn Kokai Tokkyo Koho JP 2000229996 A2 22; Aug 2000 11 p 40 Kitts DD, Weiler K (2003), “Bioactive proteins and peptides from food sources Applications of bioprocesses used in isolation and recovery, Curr Pharm Des 9(16):130923 Luận văn thạc sỹ khoa học 2006 - 2008 Nguyễn Thị Phương Thảo 98 Công nghệ sinh học 41 Kodera T, Nio N (2002), “Angiotensin converting enzyme inhibitors”, PCT Int Appl WO 2002055546 A1 18 43 p.Kokai Tokkyo Koho 42 Korhonen H, Pihlanto A (2003),” Food-derived bioactive peptides— opportunities for designing future foods”, Curr Pharm Des 9(16):1297– 308 43 Korhonen H, Pihlanto-Leppälä A, Rantamäki P, Tupasela T (1998), “Impact of processing on bioactive proteins and peptides”, Trends Food Sci Technol 9:307–19 44 Law, J and Haandrikman, A (1997), “Proteolytic enzymes of lactic acid bacteria”, International Dairy Jour 45 Le Hoang Lam, Tomoko Shimamura, Hiroyuki, Ken Sakaguchi, “Antihypertensive activity of some potential food samples”, Kochi university, faculty of agriculture, p783-789 46 LeBlanc JG, Matar C, Valdez JC, LeBlanc J, Perdigon G (2002), Immunomodulating effects of peptidic fractions issued from milk fermented with Lactobacillus helveticus”, J Dairy Sci 85:2733–42 47 Li C, Matsui T, Matsumoto K., Yamasaki R, Kawasaki T (2002), “Latent production of angiotensin I-converting enzyme inhibitors from buckwheat protein”, J Pept Sci 8(6):267–274 48 M Gobbetti, P Ferranti, E Smacchi, and F Addeo (2000), “Production of angiotensin I converting enzyme inhibitory peptides in fermentated milks started by Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus SS1 and Lactococcus lactis subsp cremoris FT4”, applied and environmental microbiology, p3898-3904 49 Matsui T, Li C, Osajima Y (1999), “Preparation and characterization of novel bioactive peptides responsible for angiotensin I-converting enzyme inhibition from wheat germ”, J Pept Sci 5(7):289–97 LuËn văn thạc sỹ khoa học 2006 - 2008 Nguyễn Thị Phương Thảo 99 Công nghệ sinh học 50 Matsui T, Yukiyoshi A, Doi S, Sugimoto H, Yamada H, Matsumoto K (2002), “Gastrointestinal enzyme production of bioactive peptides from royal jelly protein and their antihypertensive ability in SHR”, Nutr Biochem 13(2):80–6 51 Meisel H, FitzGerald RJ (2003), “Biofunctional peptides from milk proteins: mineral binding and cytomodulatory effects” Curr Pharm Des 9(16):1289–95 52 Mirkka Narva, Jussi Halleen and Riitta Korpela, (2004), “Effects of Lactobacillus helveticus fermented milk on bone cells in vitro”, Institute of biomedicine 53 Natesh R, Schwager SL, Sturrock ED, Acharya KR (2003), “Crystal structure of the human angiotensin-converting enzyme-lisinopril complex Nature 421(6922):551–4 54 Okamoto A, Hanagata H, Matsumoto E, Kawamura Y, Koizumi Y Yanadiga F (1995), “Angiotensin I converting enzyme inhibitory activities of various fermented foods”, Biosci Biotechnol Biochem 59:1147–9 55 Pena-Ramos EA, Xiong YL (2002), “Antioxidant activity of soy protein hydrolysates in a liposomal system” J Food Sci 67(8):2952–6 56 Richard J FitzGerald, Brian A Murray, and Daniel J Walsh (2004), “The Emerging role of dairy proteins and bioactive peptides in nutrition and health”, American society for Nutritional Scienses,Vol.13, p 980S– 985S 57 Shin ZI, Yu R, Park SA, Chung DK, Ahn CW Nam HS, Kim KS, Lee HJ (2001), “His-His-Leu, an angiotensin I converting enzyme inhibitory peptide derived from Korean soybean paste, exerts antihypertensive activity in vivo”, J Agric Food Chem 49:30049 Luận văn thạc sỹ khoa học 2006 - 2008 Nguyễn Thị Phương Thảo 100 Công nghÖ sinh häc 58 Takano, T (2002), “Antihypertensive activity of fermented dairy products containing biogenic peptides”, Antonie van Leeuwenhoek, 82:333340, 7:1-11 59 Tran Lien Ha, Nguyen Van Cach, Nguyen Thi Hang, Nguyen Thanh Hoa (2006) Isolation and characterization of Lactobacillus plantarum NC13 producing angiotensin-converting enzyme inhibiting peptides Proceeding of the second international conference on the development of biomedical engineering in Vietnam, 236-241 60 Toshiaki Ichimura, Jianen Hu, Duong Qua Aita, and Susumu Maruyama, (2003), “Angiotensin I – Converting Enzyme Inhibitory Activity and Insulin Secretion Stimulative Activity of Fermented Fish Sauce”, Journal of biosciene and bioengineering Vol 96, No.5, 496-499 61 Vanesa Vermeirssen, John Van Camp, Willy Verstraete, (2001), “Optimisation and validation of an angiotensin-converting enzyme inhibition assay for the screening of bioactive peptides”, Journal of biochemical and biophysical methods 51 (2002), p75-87 62 Vanessa Vermeirssen (2003), “Release and activity of ACE inhibitory peptites from pea and whey protein: fermentation, in vitro digestion and transport”, Universiteit gent, p 17-38 63 Wenyi Wang and Elvira Gonzalez de Mejia (2005), “A New Frontier in Soy Bioactive Peptids that May Prevent Age-related Chronic Diseases”, Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, p.63-78 64 Wu J Ding X (2001), “Hypotensive and physiological effect of angiotensin converting enzyme inhibitory peptides derived from soy protein on spontaneously hypertensive rats J Agric Food Chem 49(1):5016 Luận văn thạc sỹ khoa học 2006 - 2008 Nguyễn Thị Phương Thảo 101 Công nghệ sinh học 65 Wolf WJ (1970), “Soybean proteins: their functional, chemical and physical properties”, J Agric Food Chem 18: 969–76 66 Yamamoto, N., Akino, A and Takano, T (1993), “Purification and specificity of a cell-wall-associated proteinase from Lactobacillus helveticus CP790”, Journal of Biochemistry (Tokyo), 114:740-745 67 Yamamoto, N., Akino, A and Takano, T (1994a), “Antihypertensive effects of different kinds of fermented milk in spontaneously hypertensive rats”, Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 58:776-778 68 Yamamoto, N., Akino, A and Takano, T (1994b), “Antihypertensive effect of the peptides derived from casein by an extracellular proteinase from Lactobacillus helveticus CP790”, Journal of Dairy Science, 77:917922 69 Yamamoto N, Ejiri M, Mizuno S (2003), “Biogenic peptides and their potential use” Curr Pharm Des 9(16):1345–55 70 Yasunori Nakamura, Naoyuki Yamamoto, Kumi Sakai, Akira Okubo and Toshiaki Takano, (1994), “Purification and characterization of angiotensin I converting enzyme inhibitors from sour milk”, the calpis food industry co., Japan 71 Yoshikawa M, Fujita H, Matoba N, Takenaka Y, Yamamoto T, Yamauchi R, Tsuruki H, Takahata K (2000), “Bioactive peptides derived from food proteins preventing lifestyle- related diseases”, BioFactors 12(1– 4):143–6 72 Yoshikawa M, Yamada Y, Matoba N, Utsumi S, Maruyama N, Onishi K 2002 Study on introducing new physiological function into soy protein by genetic engineering Daizu Tanpakushitsu Kenkyu 5:26–30 73 http://en.wikipedia.org/wiki/Renin-angiotensin_system 74 http://en.wikipedia.org/wiki/ACE_inhibitor LuËn văn thạc sỹ khoa học 2006 - 2008 Nguyễn Thị Phương Thảo 102 Công nghệ sinh học 75.http://www.esrf.eu/UsersAndScience/Publications/Highlights/2003/MX/ MX10 76.http://genomebiology.com/2003/4/8/225 Luận văn thạc sỹ khoa học 2006 - 2008 Nguyễn Thị Phương Thảo 103 Công nghệ sinh học PH LC Bảng 1: Kết đo đường chuẩn BSA [BSA] 250 500 1.000 1.500 2.000 2,131 2,216 2,428 2,591 2,728 µg/ml OD595 2,000 nm DUONG CHUAN BSA 3,000 y = 0.3635x + 2031 R2 = 0.9917 OD595nm 2,500 2,000 Series1 1,500 Linear (Series1) 1,000 500 0 500 1000 1500 2000 2500 [BSA] Hình 1: Đường chuẩn BSA Kết đo đường chuẩn xác định hàm lượng peptit theo phương phỏp OPA c th hin hỡnh Luận văn thạc sỹ khoa học 2006 - 2008 Nguyễn Thị Phương Thảo 104 Công nghệ sinh học Bng 2: Kt qu đo OD340nm để xây dựng đường chuẩn peptone theo phương pháp OPA Nồng 0.5 0.027 0.093 0.188 0.246 0.354 0.433 0.58 độ pepton (mg/ml) OD340nm 0.7 y = 0.0953x - 0.0171 OD 340nm 0.6 R2 = 0.9879 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 Nồng độ peptone (mg/ml) Hình 2: Đường chuẩn xác định hàm lượng peptt theo phng phỏp OPA Luận văn thạc sỹ khoa học 2006 - 2008 Nguyễn Thị Phương Thảo Luận văn thạc sỹ khoa học 105 Công nghệ sinh học 2006 - 2008 ... activity of 95% The molecular weight of ACEIP is less than 3000 Da Ngun ThÞ Phương Thảo Công nghệ sinh học Nghiờn cu cụng nghệ thu nhận peptit kìm hãm enzym chuyển hố angiotensin từ vi sinh vật. .. sinh vật lên men truyền thống với chất protein đậu tương? ?? Mục tiêu đề tài: • Tìm chủng giống vi sinh vật có khả tạo ACEIP cao • Lựa chọn điều kiện lên men thích hợp để thu nhận ACEIP nhiều Từ tiến... vi? ??c tạo ACEIP để sử dụng cho bệnh nhân bị cao huyết áp Do tính cấp bách trên, tiến hành thực đề tài: ? ?Nghiên cứu cơng nghệ thu nhận peptit có khả kìm hãm enzym chuyển hóa angiotensin từ vi sinh