Nghiên cứu chế tạo bộ xét nghiệm sắc ký miễn dịch sử dụng hạt nano vàng để phát hiện nhanh vi khuẩn escherichia coli gây bệnh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - ĐÀO THỊ THANH HUYỀN NGHIÊN CỨU TẠO BỘ XÉT NGHIỆM SẮC KÝ MIỄN DỊCH SỬ DỤNG HẠT NANO VÀNG ĐỂ PHÁT HIỆN NHANH VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI GÂY BỆNH LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – Năm 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - ĐÀO THỊ THANH HUYỀN NGHIÊN CỨU TẠO BỘ XÉT NGHIỆM SẮC KÝ MIỄN DỊCH SỬ DỤNG HẠT NANO VÀNG ĐỂ PHÁT HIỆN NHANH VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI GÂY BỆNH Chuyên ngành : Công nghệ sinh học LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS TS TRƢƠNG QUỐC PHONG TS TRẦN QUANG HUY Hà Nội – Năm 2018 Luận văn thạc sĩ khoa học LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn nghiên cứu dƣới đạo khoa học Thầy hƣớng dẫn hỗ trợ Phịng thí nghiệm kỹ thuật Protein Trung tâm nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học, Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội Phịng thí nghiệm Siêu cấu trúc - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng Các kết luận văn hồn tồn trung thực, số liệu tính tốn chƣa đƣợc cơng bố cơng trình nghiên cứu trƣớc Mọi liệu, hình ảnh trích dẫn tham khảo luận văn đƣợc thu thập sử dụng nguồn liệu tin cậy đƣợc trích dẫn rõ nguồn gốc Tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm với cam đoan Hà Nội, ngày 28 tháng năm 2018 Học viên Đào Thị Thanh Huyền Luận văn thạc sĩ khoa học LỜI CẢM ƠN Tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Trƣơng Quốc Phong TS Trần Quang Huy – ngƣời thầy ln tận tình giúp đỡ, định hƣớng, góp ý cho tơi suốt q trình thực đề tài nghiên cứu Tôi xin trân trọng cảm ơn Ths Nguyễn Thanh Thủy đồng nghiệp khác hết lòng chia sẻ kiến thức, kinh nghiệm q báu để tơi thực hồn thiện luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, anh chị, bạn học viên, sinh viên công tác Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội Phịng thí nghiệm siêu cấu trúc - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng góp ý kiến quý báu cho tơi, giúp đỡ tơi q trình thực luận văn Và tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đồng hành, động viên tơi mặt để tơi hồn thành luận văn Với điều kiện, khả thời gian thực có giới hạn nên đề tài khơng thể tránh thiếu sót Tơi mong muốn nhận đƣợc góp ý thầy cô bạn để đề tài đƣợc hoàn thiện Hà Nội, ngày 28 tháng năm 2018 Học viên Đào Thị Thanh Huyền Luận văn thạc sĩ khoa học MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT LỜI MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 11 1.1 TÌNH HÌNH CHUNG 11 1.1.1 Tình hình nhiễm Escherichia coli Thế giới .11 1.1.2 Tình hình nhiễm E coli Việt Nam .11 1.2 ESCHERICHIA COLI 12 1.2.1 Đặc điểm chung 12 1.2.2 Hình thể tính chất bắt màu 13 1.2.3 Đặc điểm sinh hóa học 13 1.2.4 Cấu trúc kháng nguyên 14 1.2.5 Phân loại E.coli .15 1.2.6 Cơ chế sinh bệnh bệnh cảnh lâm sàng 16 1.3 Các phƣơng pháp chẩn đoán E coli 18 1.3.1 Phƣơng pháp định danh kinh điển 18 1.3.2 Phƣơng pháp thử nghiệm tạo váng gây ngƣng kết hồng cầu 18 1.3.3 Phƣơng pháp thử nghiệm động vật thực nghiệm 18 1.3.4 Phƣơng pháp miễn dịch gắn men .19 1.3.5 Kỹ thuật sinh học phân tử 19 1.3.6 Kỹ thuật sắc ký miễn dịch 20 CHƢƠNG II PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Vật liệu .25 2.1.1 Hóa chất kháng thể 25 2.1.2 Thiết bị 26 2.2.3 Nguyên lý que thử sắc kĩ miễn dịch .27 Luận văn thạc sĩ khoa học 2.2 Quy trình thực nghiệm 29 2.2.1 Xác định hình thái, kích thƣớc hạt nano vàng 29 2.2.2 Quy trình xác lập điều kiện tạo cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng 29 2.3 Nghiên cứu điều kiện chế tạo miếng cộng hợp kháng thể - nano vàng 31 2.3.1 Xác định hàm lƣợng kháng thể 31 2.3.2 Xác định độ pH thích hợp 31 2.3.3 Xác định nhiệt độ cộng hợp 32 2.3.4 Xác định thời gian cộng hợp 32 2.3.5 Xác định điều kiện cố định cộng hợp lên miếng cộng hợp 32 2.3.6 Xác định thời gian sấy miếng cộng hợp 33 2.4 Nghiên cứu cố định kháng thể lên màng lai 33 2.4.1 Xác định nồng độ kháng thể cố định phù hợp 33 2.4.2 Xác định nhiệt độ cố định phù hợp 34 2.4.3 Lựa chọn đệm cố định kháng thể 34 2.5 Tạo que thử đánh giá đặc tính que thử .34 2.5.1 Lựa chọn vật liệu miếng thấm mẫu 34 2.5.2 Kiểm tra hoạt động que thử 35 2.5.3 Xác định hệ đệm mẫu phù hợp .36 2.5.4 Khảo sát đặc tính que thử .36 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 3.1 Điều chế hạt nano vàng 41 3.2 Nghiên cứu điều kiện chế tạo miếng cộng hợp kháng thể - nano vàng .41 3.2.1 Xác định nồng độ kháng thể phù hợp 41 3.2.2 Xác định PH phù hợp tạo cộng hợp 43 3.2.3 Xác định nhiệt độ tạo cộng hợp 44 3.2.4 Xác định thời gian tạo cộng hợp .45 3.2.5 Xác định thời gian sấy cộng hợp 45 3.3 Nghiên cứu điều kiện cố định kháng thể lên màng lai 46 3.3.1 Xác định hàm lƣợng kháng thể cố định phù hợp: 46 Luận văn thạc sĩ khoa học 3.3.2 Xác định nhiệt độ cố định phù hợp 47 3.3.3 Xác định đệm cố định kháng thể lên màng nitrocellulose .47 3.4 Tạo que thử đánh giá đặc tính que thử .48 3.4.1 Kiểm tra hoạt động que thử 48 3.4.2 Xác định hệ đệm mẫu phù hợp .49 3.4.3 Khảo sát độ lặp lại 50 3.4.4 Khảo sát ngƣỡng phát .51 3.4.5 Khảo sát phản ứng chéo 51 3.4.6 Khảo sát thời gian bảo quản que thử 52 3.4.7 Khảo sát độ nhạy, độ đặc hiệu .53 CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 4.1 Kết luận 55 4.2 Kiến nghị 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC 63 Luận văn thạc sĩ khoa học DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hình ảnh E.coli quan sát kính hiển vi điện tử 13 Hình 2.2 Các thị đƣợc sử dụng kỹ thuật sắc kí miễn dịch 24 Hình 2.1 Mơ hình que thử nhanh theo nguyên lý kẹp sandwich 27 Hình 2.2 quy trình gắn kháng thể với hạt nano vàng 29 Hình 2.2 Hình ảnh E.Coli đƣợc xác định dƣới kính hiển vi điện tử 36 Hình 2.3 Hình ảnh mẫu ngƣng kết với kháng thể kháng E.coli 37 Hình 2.4 Hình ảnh định lƣợng vi khuẩn E.coli mẫu gốc 37 Hình 3.1 Hình thái, kích thƣớc hạt nano vàng dƣới kính hiển vi điện tử truyền qua 41 Hình 3.2 Xác định hàm lƣợng kháng thể gắn với hạt nano vàng 43 Hình 3.3 Xác định ph để tạo cộng hợp kháng thể với hạt nano vàng 44 Hình 3.4 Tối ƣu nhiệt độ tạo cộng hợp (4c, 25c 37c) 44 Hình 3.5 Tối ƣu thời gian tạo cộng hợp (30 phút, 60 phút, 90 phút 120 phút) 45 Hình 3.6 Tối ƣu thời gian sấy cộng hợp 46 Hình 3.7 Xác định hàm lƣợng kháng thể cố định 46 Hình 3.8 Xác định nhiệt độ cố định kháng thể lên màng lai 47 Hình 3.9 Kết thử nghiệm loại đệm khác cố định kháng thể lên màng 48 Hình 3.10 Kiểm tra hoạt động que thử với điều kiện thiết lập ban đầu 48 Hình 3.11 Kết thử nghiệm dung dịch ly giải mẫu khác 49 Hình 3.12 Kết xét nghiệm với 10 mẫu âm tính (n=10) 50 Hình 3.13 Kết xét nghiệm với 10 mẫu dƣơng tính (n=10) 50 Hình 3.14 Ngƣỡng phát 51 Hình 3.15 Kiểm tra phản ứng chéo que thử 52 Hình 3.16 Kiểm tra thời gian bảo quản que thử 53 Luận văn thạc sĩ khoa học DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT E coli Escherichia coli AuNPs Gold nanoparticle (hạt nano vàng) BSA Bovine Serum Albumin cDNA Complementary DNA CRS Congenital Rubella Syndrome ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay FP Fusion Peptide Ig Immunoglobulin mRNA Messenger RNA NSP Non-Structural Protein PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis Pr A Protein A PBS Phosphate Buffered Saline PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic Acid WHO World Health Organization TCMR Tiêm chủng mở rộng EDC 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide NHS N-hydroxysuccinimide PEG Polyethylene glycol Luận văn thạc sĩ khoa học LỜI MỞ ĐẦU Vi khuẩn tồn khắp nơi giữ vai trò quan trọng hệ sinh thái Đa số loài vi khuẩn có lợi, nhƣng có số loại gây nên bệnh nghiêm trọng [1] Nhiễm bệnh vi khuẩn không ảnh hƣởng lớn tới sức khỏe ngƣời dân mà gây thiệt hại nặng nề đến kinh tế xã hội Vi khuẩn gây bệnh tồn lâu dài mơi trƣờng gây bệnh có tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp với ngƣời hay động vật Ngƣời hay động vật bị nhiễm bệnh từ mơi trƣờng nƣớc, khơng khí, thực phẩm, dụng cụ cá nhân hay bị trùng đốt [1] Khơng khí mơi trƣờng truyền bệnh 20 loại vi khuẩn gây viêm não, viêm đƣờng hô hấp, lao tiêu chảy [2] Nƣớc môi trƣờng truyền bệnh nhiều mầm bệnh liên quan đến đƣờng tiêu hóa, có phẩy khuẩn tả, loại vi khuẩn nhƣ Campylobacter spp., Escherichia coli (E.coli), Legionella pneumophila, Salmonella spp… [3] Một số mầm bệnh lây truyền qua thực phẩm nhƣ vi khuẩn Campylobacter, E coli, Salmonella hay Shigella [4] Hiện nay, an toàn thực phẩm thách thức, quan tâm hàng đầu giới, đặc biệt nƣớc phát triển có Việt Nam Trong gần 325.000 ca nhập viện năm thực phẩm Mỹ, vi khuẩn đƣợc xác định nguyên nhân chính, chiếm tới 60% [5] Theo thống kê Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng, tính tháng đầu năm 2016, tiêu chảy bệnh truyền nhiễm có số ngƣời mắc cao khu vực miền Nam với tổng số 55.528 ca mắc bệnh Bên cạnh đó, gần 1.500 ca mắc bệnh khác vi khuẩn gây nên [6] Trong đƣờng tiêu hóa, E coli cộng sinh với thể góp phần tiêu hóa thức ăn, sản xuất số Vitamin giữ cân sinh thái vi khuẩn Nhƣng E coli vi khuẩn gây bệnh hội quan trọng vi khuẩn gây tiêu chảy, viêm đƣờng tiết niệu, viêm đƣờng mật; đứng hàng đầu nguyên gây nhiễm khuẩn huyết [11] E coli gây nhiều bệnh khác nhƣ viêm phổi, viêm màng não, nhiễm khuẩn vết thƣơng Việc chẩn đoán gặp khó khăn triệu chứng lâm sàng khơng đặc hiệu Phần lớn vi khuẩn E.coli khơng có ảnh hƣởng đáng kể đến sức khỏe số gây tiêu chảy tùy vào địa phƣơng, độ tuổi ngƣời bệnh mà vi khuẩn Luận văn thạc sĩ khoa học khơng có vi khuẩn dƣơng tính với que thử phát E coli gây bệnh Khi thiết lập que thử phát E coli gây bệnh sử dụng kháng thể thứ hai kháng thể đa dòng IgG thỏ kháng E coli serotype K12, 0111, 055, 0125, 020 O157 đặc hiệu với serotype E coli gây bệnh Vì vậy, có khả xảy tƣợng trao đổi chéo với kháng nguyên nhóm Vi sinh sinh vật khác Salmonella Klebsiella pneumoniae Tụ cầu vàng Mycobacterium tuberculosis Hình 3.15 Kiểm tra phản ứng chéo que thử 3.4.6 Khảo sát thời gian bảo quản que thử Trong nghiên cứu này, que thử phát E coli gây bệnh đƣợc bảo quản túi có khóa bọc giấy bạc phía ngồi điều kiện nhiệt độ khác nhau: điều kiện nhiệt độ phịng thí nghiệm ngăn mắt tủ lạnh (4-8C) nhằm xác định tính ổn định que thử đƣa điều kiện bảo quản thực tế Kết cho thấy que thử sau tháng tháng hai điều kiện bảo quản cho tín hiệu vạch thí nghiệm kiểm chứng rõ nét, tạm thời kết luận: với điều kiện bảo quản tốt, que thử trì đƣợc chất lƣợng tối thiểu sau tháng 52 Luận văn thạc sĩ khoa học Sau tháng Sau tháng Hình 3.16 Kiểm tra thời gian bảo quản que thử 3.4.7 Khảo sát độ nhạy, độ đặc hiệu Độ nhạy độ đặc hiệu phản ánh mức độ xác que thử Độ nhạy tiến tới 100 % độ âm tính giả tiến tới Độ đặc hiệu 100% Ngƣời khơng bị bệnh cho kết có kết dƣơng tính Âm tính giả thấp độ nhạy cao Và ngƣợc lại dƣơng tính giả thấp độ đặc hiệu cao Để khảo sát độ nhạy, độ đặc hiệu que thử chúng tơi sử dụng 30 mẫu âm tính 30 mẫu dƣơng tính với E coli O157 Kết khảo sát (Phụ lục 2) cho thấy 100% mẫu âm tính đƣợc thử nghiệm có kết âm tính, 100% mẫu dƣơng tính đƣợc thử nghiệm có kết dƣơng tính - Kết Mẫu chứng (+) Mẫu chứng (-) Mẫu có kết dƣơng tính (+) 30 Mẫu có kết âm tính (-) 30 Đánh giá kết quả: + Độ xác (AC): (30+30)/60 x 100 = 100% + Độ đặc hiệu (SP): 30/(30+0) x 100 = 100% + Độ nhạy (SE): 30/(30+0) x 100 = 100% 53 Luận văn thạc sĩ khoa học Đây kết khảo sát độ nhạy độ đặc hiệu điều kiện phịng thí nghiệm Tuy nhiên, để kết luận độ nhạy độ đặc hiệu que thử cần đánh giá với cỡ mẫu thực địa lớn 54 Luận văn thạc sĩ khoa học CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 4.1 Từ kết thu đƣợc đƣa kết luận: Đã tạo đƣợc cộng hợp kháng thể hạt nano vàng nồng độ kháng thể 0,5 μg/µL, dung dịch nano vàng có độ pH 7.0, ủ thời gian 90 phút, nhiệt độ tạo cộng hợp 37C, thời gian sấy miếng cộng hợp 30 phút Xác định đƣợc điều kiện cố định kháng thể lên màng lai với hàm lƣợng kháng thể cố định 0,5 µg, nhiệt độ cố định 37C, sử dụng hệ đệm SPS1 (20 mM SB, 100 mM NaCl, 0,2% Tween) Tạo đƣợc que thử phát nhanh vi khuẩn E.coli gây bệnh serotypes O157 Kiến nghị 4.2 - Đánh giá que thử phát nhanh vi khuẩn E.coli gây bệnh serotypes O157 với cỡ mẫu lớn - Nghiên cứu thử nghiệm que thử phát nhanh vi khuẩn E.coli gây bệnh serotypes O157 thực địa 55 Luận văn thạc sĩ khoa học TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT: Lê Huy Chính Vi sinh vật y học Nxb Y học, 2007 [1] PGS TS Lê Hồng Hinh, Trƣờng Đại học Y Hà nội Vi sinh Y học 2008 [11] PGS.TS Lê Thị Oanh ,Vi sinh Y học [17] Bộ môn vi sinh, Khoa Y, Đại học Y Dƣợc Tp Hồ Chí Minh, 1996 [19] Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng (1998), Phƣơng pháp PCR, Sinh học phân tử, Nhà xuất Giáo dục, 190-199 [29] Khổng Thị Điệp, Nguyễn Nam Thắng, Phạm Ngọc Khái, Hoàng Thị Thu Hà Một số đặc điểm kháng kháng sinh vi khuẩn E coli sinh men Betalactamase phổ rộng từ ngƣời khỏe mạnh Thái bình 2013 Tạp chí Y học dự phịng, Tập 27, số – 2017 [50] Đinh Thị Bích Hằng (2002), Tìm hiểu tình trạng nhiễm vi khuẩn số loại thức ăn đƣờng phố phƣờng Thắng Lợi, thành phố Buôn Ma Thuột, Luận văn Thạc sỹ Y học, Trƣờng Đại học Y Hà Nội, 10-12 [51] Trần Huy Hoàng, Trần Vân Khánh, Nguyễn Hữu Thọ, Tạ Thành Văn (2011), “Biểu Tinh protein tái tổ hợp tiểu đơn vị B độc tố không chịu nhiệt LT E coli”, Tạp chí Nghiên cứu Y học, 74 (3), tr 29-32 [18] Trần Quang Huy, Phạm Thị Minh Huyền, Nguyễn Thanh Thủy, Phạm Văn Chung, Nguyễn Thị Hồng Hạnh Sự phát triển kỹ thuật sắc ký miễn dịch phát vi khuẩn gây bệnh Tạp chí Y học dự phòng 2016; 15: 9-20 [10] 10 Trần Quang Huy, Phạm Thị Minh Huyền, Nguyễn Thanh Thủy, Phạm Văn Chung, Nguyễn Thị Hồng Hạnh Sự phát triển kỹ thuật sắc ký miễn dịch 56 Luận văn thạc sĩ khoa học phát vi khuẩn gây bệnh Tạp chí Y học dự phịng 2016; 15: 9-20 [12] 11 Phạm Đức Minh, Lê Quốc Tuấn, Nguyễn Hùng Long; Hoàng Văn Lƣơng (2012) Nghiên cứu chế tạo test thử nhanh phát trực khuẩn listeria monocytogenes Tạp chí Y Dược học quân số [31] 12 Đỗ Huy Nhật Minh, Nguyễn Thị Nguyệt, Nguyễn Văn Trí, Vƣơng Xuân Vân, Trần Thị Thúy Hằng, Nguyễn Thị Lệ Hồ, Cao Hữu Nghĩa Khảo sát tỉ lệ nhiễm E coli thịt thủy sản tƣơi sống số chợ khu vực phía nam năm 2017 Tạp chí Y học dự phòng, Tập 27, số 11 – 2017 [47] 13 Hồng Thị Bích Ngọc, Nguyễn Thùy Trâm, Phùng Đắc Cam, Hồng Thị Thu Hà Xác định nhóm E coli gây tiêu chảy trẻ em dƣới tuổi bệnh viện Nhi Trung ƣơng kỹ thuật PCR Tạp chí Y học dự phịng, Tập XXIV, Số (157) [46] 14 Nguyễn Thị Thu Thái (2006), Xác định gen aap, agg R, astA EAEC số chủng E coli khác kỹ thuật PCR, Luận văn thạc sỹ, Trƣờng Đại học Y Hà Nội [26] 15 Bùi Quang Tiến (2011), Tìm hiểu hạt nano vàng hƣớng ứng dụng nay, Luận văn tốt nghiệp cử nhân Vật lý kĩ thuật, Trƣờng đại học công nghệ, Đại học Quốc gia Hà Nội [32] 16 Nguyễn Hữu Thọ, Trần Huy Hoàng, Trịnh Thị Quế, Trần Vân Khánh, Tạ Thành Văn (2011), “Thiết kế vector biểu Protein tái tổ hợp tiểu đơn vị B độc tố khơng chịu nhiệt LT E coli”, Tạp chí Y học Việt Nam, 6(2), tr.94-97 [39] 17 Tạp chí Y học dự phòng, Tập XXVI, Số 15 (188) 2016 [36] 57 Luận văn thạc sĩ khoa học TÀI LIỆU TIẾNG ANH : 18 Aliabadi AA, Rogak SN, Barlett KH, Green SI Preventing airborne disease transmission: review of methods for ventilation design in health care facilities Adv Prev Med 2011; article ID 124064 [2] 19 Bitzan M et al (1998), The rol of E Blount ZD Elife 2015 Mar 25;4 doi: 10.7554/eLife.05826 Review PMID: 25807083 [15] 20 Colonization factors of diarrheagenic E coli and their intestinal receptors Cassels FJ, Wolf MK J Ind Microbiol 1995 Sep;15(3):214-26 Review PMID: 8519480 Similar articles Select item 18790864 [45] 21 CDC, Preliminary FoodNet Data on the incidence of infection with pathogens transmitted commonly through food-10 states, 2008 MMWR Morb Mortal Wkly Rep 58:333-337 [4] 22 Comparisons of infant Escherichia coli isolates link genomic profiles with adaptation to the ecological niche de Muinck EJ, Lagesen K, Afset JE, Didelot X, Rønningen KS, Rudi K, Stenseth NC, Trosvik P BMC Genomics 2013 Feb 5; 14: 81 doi: 10.1186/1471-2164-14-81 PMID: 23384204 Free PMC Article Similar articles Select item 21676223 [41] 23 Comparative genomics of Escherichia coli isolated from patients with inflammatory bowel disease Vejborg RM, Hancock V, Petersen AM, Krogfelt KA, Klemm P BMC Genomics 2011 Jun 15; 12: 316 doi: 10.1186/1471-2164-12-316 PMID: 21676223 Free PMC Article Similar articles Select item 23340801 [42] 24 E coli as an all-rounder: the thin line between commensalism and pathogenicity Leimbach A, Hacker J, Dobrindt U Curr Top Microbiol Immunol 2013; 358: 3-32 doi: 10.1007/82_2012_303 Review.PMID: 23340801 Similar articles Select item 8519480 58 [43] Luận văn thạc sĩ khoa học 25 Escherichia coli harboring a natural IncF conjugative F plasmid develops complex mature biofilms by stimulating synthesis of colanic acid and Curli May T, Okabe S.J Bacteriol 2008 Nov;190(22):7479-90 doi: 10.1128/JB.00823-08 Epub 2008 Sep 12 PMID: 18790864 Free PMC Article Similar articles Select item 20574458 [46] 26 Fadi E.R., Elias A.R., Fawwak T.S and Alexander M.A (2012) Identification of Virulence Genes among Antibacterial-Resistant Escherichia coli Isolated from Poultry Advanced Studies in Biology, (8): 385 – 396 [27] 27 James B Kaper (1998), ”Enterohemorrhagic Escherichia coli”, Current opinion in microbiology, Vol 1, p.103-108 [25] 28 Gubala V, Harris LF, Ricco AJ, Tan MX, Williams DE Point of care diagnostics: Status and future Anal Chem 2012; 84: 487–515 [37] 29 Goossens J, Sein H, Lu S, et al Functionalization of gold nanoparticles with nanobodies through physical adsorption Anal Methods, 2017: 9: 3430-3440 30 Kavosi B, Hallaj R, Teymourian H, Salimi A Au nanoparticles/PAMAM dendrimer functionalized wired ethyleneamine – viologen as highly efficient interface for ultra-sensitive α - fetoprotein electrochemical immunosensor Biosens Bioelectron 2014; 59: 389–96 [38] 31 Khanfar HS, Bindayna KM, et al Extended spectrum beta-lactamases (ESBL) in Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae: trends in the hospital and community settings J Infect Developing Countries, 2009; 3(4): 295-299 [49] 32 Kieninger AN, Lipsett PA Hospital acquired pneumonia: Pathophysiology, Diagnosis, and Treatment Surg Clin N Am, 2009; 89: 439–461 [7] 33 Lazcka O, Campo FJ Del, Muñoz FX Pathogen detection: A perspective of traditional methods and biosensors Biosensors and Bioelectronics 2007; 22: 1205–17 [8] 59 Luận văn thạc sĩ khoa học 34 Lou S, Ye J, Li K, Wu A A gold nanoparticle-based assay: The influence of nanoparticulate size Analyst, 2012;137: 1174 35 Mead PS, Slutsker L, Dietz V, Mccaig LF, Bresee JS, Shapiro C, et al FoodRelated Illness and Death in the United States 1999;5:607–25 [5] 36 Niemirowicz K, Markiewicz KH, Wilczewska AZ, Car H Magnetic nanoparticles as new diagnostic tools in medicine Adv Med Sci 2012;57(2):196-207 [13] 37 Nguyen VT, Le Van P, Le Huy C, Gia KN, Weintraub A Detection and characterization of Diarrheagenic Escherichia coli from young children in Hanoi Vietnam J Clin Microbiol 2005; 43(2): 755 – 760 [21] 38 Nguyen T.V., Le P.V., Le C.H., Weintraub A (2005) Antibiotic resistance in diarrheagenic Escherichia coli and Shigella strains isolated from children in Hanoi, Vietnam Antimicrob Agents Chemother 49: 816-819 [28] 39 Orlandi PP, Magalhães GF, Matos NB, Silva T, Penatti M, Nogueira PA, L.H.Pereira da Silva Etiology of diarrheal infections in children of Porto Velho (Rondonia, Western Amazon region, Brazil) Braz J Med Biol Res, 2006; 39(4): 507-517 [24] 40 P J Quinn cs, 1994 Clirical Verteriaary Microbiology [16] 41 Pengsuk C, Chaivisuthangkura P, Longyant S, Sithigorngul P Development and evaluation of a highly sensitive immunochromatographic strip test using gold nanoparticle for direct detection of Vibrio cholerae O139 in seafood samples Biosens Bioelectron 2013; 42: 229–35 [34] 42 Sajid M, Daud M.Designs , formats and applications of lateral flow assay : A literature review Journal of Saudi Chemical Society 2015; 19: 689–705[9] 43 Sehand K Arif and layla I.F.Salih Identification of different categories of diarrheagenic Escherichia coli in Stool samples by using multiplex PCR technique Asian J Med Sci, 2010; 2(5): 237 – 243 [23] 60 Luận văn thạc sĩ khoa học 44 Sivaram AJ, Wardiana A, Howard CB Recent Advances in the Generation of Antibody– Nanomaterial Conjugates Adv Healthcare Mater, 2018; 7: 1700607 45 Sajid M, Daud M Designs, formats and applications of lateral flow assay : A literature review J Saudi Chem Soc 2015; 19: 689–705 [33] 46 Tran Quang Huy, Pham Van Chung, Nguyen Thanh Thuy, Cristina Blanco Andujar, Nguyen Thi Kim Thanh, 2014 Protein A conjugated iron oxide nanoparticles for separation of Vibrio cholerae from water samples, Faraday Discussions, 175: 73–82 [14] 47 Truong Quoc Phong, Pham Thi Thao Phuong Covalent conjugation of antibody and gold nanoparticle for development of lateral flow immunoassay test strip J Sci Technol, 2016; 54 (4A): 323-330 48 The unexhausted potential of E coli.Blount ZD Elife 2015 Mar 25;4 doi: 10.7554/eLife.05826 Review PMID: 25807083 Free PMC Article Similar articles Select item 23384204 [40] 49 Vagas M, Gascón J, Gallardo F, de Anta MTJ, vila J Prevalence of diarrheagenic Escherichia coli strains detected by PCR in patient with travelers, diarrhea Clin Microbiol Infect 1998; 4: 682-688 [22] 50 Zhu J, Chen W, Lu Y, Cheng G Development of an immunochromatographic assay for the rapid detection of bromoxynil in water Environmental Pollution 2008;156: 136–42 [35] 51.Zhang W, Bielaszewska M, Bauwens A, et al Real-time Multiplex PCR for Detecting Shiga Toxin 2-producing Escherichia coli O104: H4 in Human Stools J Clin Microbiol, 2012; 50(5): 1752-1754 [48] TÀI LIỆU WEB: 52 CDC,Waterborneillnesses,www.cdc.gov/nceh/vsp/training/videos/transcripts /water.pdf [3] 61 Luận văn thạc sĩ khoa học 53 CDC,Waterborneillnesses,www.cdc.gov/nceh/vsp/training/videos/transcripts /water.pdf 54 http://www.tapchiyhocduphong.vn/tin-tuc/thong-bao dich/2016/10/81E21083/tinh-hinh-27-benh-truyen-nhiem-6-thang-dau-nam2016-khu-vuc-phia-nam/ 2010 55 http://www.tapchiyhocduphong.vn/tin-tuc/thong-baodich/2016/10/81E21083/tinh-hinh-27-benh-truyen-nhiem-6-thang-dau-nam2016-khu-vuc-phia-nam/ 2010 [6] 62 Luận văn thạc sĩ khoa học PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: TĨM TẮT QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM I Thành phần xét nghiệm - Kit thử bao nhôm - Týp chứa mẫu - Dung môi - Tăm lấy mẫu - Ống đựng dung môi - Hƣớng dẫn sử dụng II Bảo quản - Bảo quản kit thử nhiệt độ phịng (1-30oC) - Khơng bảo quản nhiệt độ âm - Không sử dụng kit thử túi nhôm bị rách hỏng - Không sử dụng kit hết hạn sử dụng III Thu mẫu bệnh phẩm, bảo quản thận trọng Lấy mẫu chuẩn bị - Dùng tăm lấy khoảng 50 mg mẫu phân - Đặt tăm vào ống nghiệm có dung mơi - Xoay tăm bơng 10 lần mẫu đƣợc hòa tan dung mơi Loại bỏ tăm bơng Hút 100 µl vào thử Vận chuyển mẫu bảo quản - Mẫu nên sử dụng sau lấy Không đƣợc dùng loại môi trƣờng để bảo quản hay vận chuyển mẫu - Mẫu đƣợc bảo quản nhiệt độ 2-8oC 72 Trong trƣờng hợp lƣu mẫu lâu phải bảo quản nhiệt độ âm sâu: -20oC Thận trọng - Nên lấy mẫu triệu chứng bệnh xuất 63 Luận văn thạc sĩ khoa học - Mẫu phân trực tiếp xét nghiệm nên đƣợc đựng ống nghiệm không chứa môi trƣờng, chất bảo quản hay phụ gia gây phản ứng với kit thử IV.Quy trình xét nghiệm Chuẩn bị mẫu chiết - Thanh thử mẫu đƣa nhiệt độ phòng để tiến hành xét nghiệm - Cho dung môi vào ống nghiệm - Lấy khoảng 50 mg phân tăm bơng vơ trùng có sẵn - Nhúng tăm vào ống nghiệm chứa dung môi - Lắc 10 lần mẫu hịa tan dung mơi - Bỏ tăm bơng khỏi ống nghiệm Quy trình xét nghiệm - Lấy thử khỏi túi đặt bề mặt phẳng, khơ - Hút 100 µl vào giếng mẫu thử Khi test thử bắt đầu hoạt động, màu đỏ tía chạy dọc cửa sổ đọc kết - Đọc kết vòng 15 – 20 phút V Nhận định kết  Test thử hoạt động tốt xuất vạch đỏ tía phía trái cửa sổ đọc kết - vạch chứng C  Vị trí bên phải vùng đọc kết thử vị trí thử T Nếu thử xuất vạch màu đỏ tía vạch thử T - Âm tính: xuất vạch màu đỏ tía vị trí C - Dƣơng tính: xuất vạch màu đỏ tía vạch chứng C vạch thử T - Khơng có giá trị: Khơng có vạch màu thử sau nhỏ mẫu bệnh phẩm xuất vạch T Dƣơng tính Âm tính 64 Luận văn thạc sĩ khoa học PHỤ LỤC 2: KHẢO SÁT ĐỘ NHẠY VÀ ĐỘ ĐẶC HIỆU Kết thử nghiệm que thử với 30 mẫu Âm tính với E coli gây bệnh 65 Luận văn thạc sĩ khoa học PHỤ LỤC 2: KHẢO SÁT ĐỘ NHẠY VÀ ĐỘ ĐẶC HIỆU Kết thử nghiệm que thử với 30 mẫu Dƣơng tính với E coli O157 66 ... phát nhanh vi khuẩn Escherichia coli gây bệnh? ?? Mục tiêu đề tài nhằm tạo xét nghiệm sắc ký miễn dịch sở hạt nano vàng để phát nhanh vi khuẩn E .coli gây bệnh Nội dung nghiên cứu đề tài: - Tạo cộng... muốn tạo xét nghiệm sắc ký miễn dịch có độ nhạy độ đặc hiệu cao, đề tài đƣợc đề xuất cho luận văn thạc sỹ với tiêu đề: ? ?Nghiên cứu tạo xét nghiệm sắc ký miễn dịch sử dụng hạt nano vàng để phát nhanh. ..BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - ĐÀO THỊ THANH HUYỀN NGHIÊN CỨU TẠO BỘ XÉT NGHIỆM SẮC KÝ MIỄN DỊCH SỬ DỤNG HẠT NANO VÀNG ĐỂ PHÁT HIỆN NHANH VI KHUẨN