Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro lan hoàng thảo thạch hộc tía dendrobium nobile lindl

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN NGỌC NAM NGHIÊN CỨU HỒN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN HỒNG THẢO THẠCH HỘC TÍA (DEDROBIUM NOBILE LINDL) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Thái Nguyên - 2018 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN NGỌC NAM NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN HỒNG THẢO THẠCH HỘC TÍA (DEDROBIUM NOBILE LINDL) Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS NGUYỄN THỊ HẢI YẾN Thái Nguyên - 2018 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Hải Yến giảng viên Khoa Công nghệ sinh học nhiệt tình hướng dẫn giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tơi xin cảm ơn thầy, giáo cán Phịng thí nghiệm sinh học Khoa Cơng nghệ sinh học tạo điều kiện thời gian sở vật chất cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu để hoàn thành đề tài Cuối tơi xin cảm ơn gia đình, bạn bè tất thầy cô luôn động viên, khuyến khích giúp đỡ tơi tiến trình tơi học tập làm đề tài Thái Nguyên, ngày … tháng …năm 2018 Học Viên Trần Ngọc Nam i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC .ii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU vi MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ PHONG LAN 1.1.1 Phân loại nguồn gốc 1.1.2 Chi lan Hoàng thảo (Dendrobium) 1.2 MỘT SỐ LOÀI LAN DENDROBIUM DÙNG LÀM THUỐC 1.2.1 Lan Thạch hộc 1.2.2 Hoàng thảo ngọc trúc - Dendrobium moniliforme 1.2.3 Dendrobium officinale 1.2.4 Các Dendrobium khác 10 1.3 GIÁ TRỊ DƯỢC LIỆU CỦA LAN THẠCH HỘC 10 1.3.1 Đặc điểm thực vật học 10 1.3.2 Thu hái chế biến 11 1.3.3 Cơng dụng thành phần hóa học 12 1.3.4 Các vị thuốc chứa thạch hộc 13 1.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN DENDROBIUM 16 1.4.1 Một số nghiên cứu giới 16 1.4.2 Một số nghiên cứu Việt Nam 17 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 VẬT LIỆU 19 2.1.1 Vật liệu thực vật 19 2.1.2 Dụng cụ hóa chất 19 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.2.1 Thu xử lý mẫu 20 2.2.2 Khử trùng mẫu hạt đưa vào nuôi cấy 20 2.2.3 Môi trường nuôi cấy 20 ii 2.2.4 Bố trí thí nghiệm 21 2.2.5 Điều kiện nuôi cấy 22 2.2.6 Các tiêu đánh giá 22 2.2.7 Xử lý số liệu 22 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 3.1 KẾT QUẢ KHỬ TRÙNG MẪU 23 3.2 KẾT QUẢ TÁI SINH TẠO PROTOCORM 25 3.2.1 Ảnh hưởng nồng độ BAP đến khả tăng sinh protocorm 25 3.2.2 Ảnh hưởng hàm lượng saccharose đến trình nhân nhanh protocorm 26 3.2.3 Ảnh hưởng nước dừa đến trình phát sinh chồi protocorm 28 3.2.4 Ảnh hưởng than hoạt tính đến khả phát sinh chồi từ protocorm 29 3.3 KẾT QUẢ NHÂN NHANH VÀ TẠO CÂY HOÀN CHỈNH IN VITRO 31 3.3.1 Ảnh hưởng BAP đến nhân nhanh chồi lan Thạch hộc 31 3.3.2 Ảnh hưởng hàm lượng khoai tây chuối xanh nghiền đến phát triển chồi lan Thạch hộc 33 3.3.3 Ảnh hưởng α – NAA đến khả rễ lan Thạch hộc 35 3.4 ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ LOẠI GIÁ THỂ ĐẾN SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN LAN THẠCH HỘC SAU KHI RA CÂY 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 PHỤ LỤC 42 iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Kết khử trùng đoạn thân lan Thạch hộc 23 Bảng 3.2 Kết khử trùng hạt lan Thạch hộc 24 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nồng độ BAP đến khả phát sinh Protocorm 26 Bảng 3.4 Ảnh hưởng hàm lượng saccharose đến khả nhân nhanh protocorm 27 Bảng 3.5 Ảnh hưởng hàm lượng nước dừa đến khả phát sinh chồi từ cụm protocorm 28 Bảng 3.6 Ảnh hưởng than hoạt tính đến khả phát sinh chồi từ cụm protocorm 30 Bảng 3.7 Ảnh hưởng BAP đến phát triển cụm chồi lan Thạch hộc 31 Bảng 3.8 Ảnh hưởng hàm lượng chuối xanh khoai tây nghiền đến phát triển lan Thạch hộc 33 Bảng 3.9 Ảnh hưởng α - NAA đến khả tạo rễ lan Thạch hộc 35 Bảng 3.10 Ảnh hưởng số loại giá thể đến phát triển lan Thạch hộc 37 iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cây hoa lan Thạch hộc 11 Hình 3.1 Hình ảnh mẫu thân lan thạch hộc sinh trưởng môi trường bổ sung BAP 1mg/l 23 Hình 3.2 Hình ảnh protocorm phát sinh từ hạt Thạch hộc môi trường nuôi cấy sau 40 60 ngày 25 Hình 3.2 Hình ảnh protocorm sinh trưởng mơi trường có nồng độ BAP khác 26 Hình 3.3 Hình ảnh protocorm sinh trưởng mơi trường có bổ sung saccharose sau tuần nuôi cấy 28 Hình 3.4 Chồi phát sinh từ cụm protocorm môi trường chứa 100ml/l nước dừa 29 Hình 3.5 Ảnh hưởng than hoạt tính đến khả phát sinh chồi từ cụm protocorm 30 Hình 3.6 Ảnh hưởng BAP tới nhân nhanh chồi lan Thạch hộc 32 Hình 3.7 Ảnh hưởng chuối xanh khoai tây lên phát triển lan Thạch hộc 34 Hình 3.8 Ảnh hưởng α - NAA đến khả tạo rễ lan Thạch hộc 35 Hình 3.9 Hình ảnh lan thạch hộc sinh trưởng loại giá thể khác sau chai huấn luyện vườn ươm 37 v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU Tên đầy đủ Chữ viết tắt (ký hiệu) ABA Abscisic acid ADN Acid deoxyribonucleic APG III Angiosperm Phylogeny Group III B1 Thiamine B2 Riboflavin BAP - Benzyl adenin purine EAC Ehrlich ascites cells GA3 Gibberellic acid IAA Indol - - acetic acid IBA Indol - - butyric acid Kinetin - furfurryl - aminopurin MS Murashige and Skoog PM Phytamax RE Robert Ernst VW Vacin Went USA United States of America 2,4 - D 2,4 - Dichlorophenoxy acetic acid α - NAA α - Naphthalene acetic acid vi MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ Bảo tồn phát triển loài dược liệu dân gian trở thành vấn đề cấp thiết, tình trạng khai thác bừa bãi, thiếu khoa học giảm nhanh diện tích rừng tự nhiên, điều làm giảm trầm trọng nguồn thuốc tự nhiên bao gồm lồi lan làm thuốc, đại diện điển hình dược liệu lan Thạch hộc thuộc chi lan Hoàng thảo Trên giới, chi lan Hồng thảo (Dendrobium) có khoảng 1400 lồi, chủ yếu phân bố Đơng Nam Á đảo thuộc Philippine, Malaysia, Indonesia, Papua New Guinea, Đông Bắc Australia Ở Việt Nam có 107 lồi thứ, phân bố vùng núi từ Bắc vào Nam số đảo ven biển Tuy nhiên, nhiều nguyên nhân khác nhau, đến nhiều loài bị tuyệt chủng bị đe dọa Tình trạng khai thác đến cạn kiệt hầu hết loài phong lan rừng nước ta xảy mạnh, điển vùng Tây Ngun tỉnh phía Bắc Hà Giang, Yên Bái, Thái Nguyên gây nguy tuyệt chủng cao số loài phong lan quý Hoa Phong Lan khơng có tác dụng làm đẹp cho khơng gian sống mà cịn thuốc có tác dụng chữa bệnh thần kỳ Trong kể đến lan Kim tuyến dùng điều trị bệnh trị đau bụng, sốt cao, rắn cắn, bệnh tiểu đường, bệnh viêm thận, huyết áp cao, yếu sinh lý, phòng ngừa u bướu chữa bệnh tim mạch; Lan Phi Điệp, Hoàng thảo đùi gà trị chứng suy nhược thể, thần kinh suy nhược, đau họng yếu sinh lý nam giới Lan Thạch hộc dùng chữa ho lao, sốt nóng, khô cổ, ho, đau họng, khát nước thuộc chứng âm hư, nóng trong, đau lưng, chân tay nhức mỏi, mồ hôi trộm, thiểu sinh dục nam giới, di tinh, đau dày, viêm ruột… Hiện nay, lan rừng bị khai thác cạn kiện nhu cầu chơi hoa nhu cầu thu hái làm thuốc Các thương lái Trung Quốc tràn sang tỉnh phía bắc Việt Nam săn lùng, thu mua số lượng lớn loại lan có tác dụng làm thuốc Vì việc bảo tồn nguồn dược liệu tự nhiên cần thiết Thông qua phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật với hệ số nhân giống cao tạo nhiều in vitro đồng mang đặc điểm ưu việt mong muốn mà không phụ thuộc vào mùa vụ, thời tiết… góp phần thực cơng tác bảo tồn nguồn gen phong lan tốt Thêm vào đó, phương pháp ni cấy mơ đỉnh sinh trưởng thực vật tạo virus từ mẹ bị nhiễm bệnh (phục tráng giống trồng) Hơn nữa, ni cấy mơ, tế bào cịn cung cấp ngun liệu cho việc tạo giống công nghệ gen, lai soma, chọn dòng tế bào… mang đặc điểm tốt có hoạt tính sinh học cao, có khả kháng bệnh virus, chịu hạn, chịu yếu tố bất lợi từ môi trường Từ lý trên, tiến hành đề tài "Nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hoàng thảo Thạch hộc (Dendrobium nobile Lindl.)" MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro lan rừng Dendrobium nobile Lindl, góp phần cho cơng tác bảo tồn cung cấp giống lan Thạch hộc NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Nghiên cứu điều kiện khử trùng mẫu lan Thạch hộc Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố mơi trường lên q trình tái sinh chồi, phát triển chồi rễ lan Thạch hộc in vitro Nghiên cứu giá thể phù hợp để lan Thạch hộc CT2 CT3 Hình 3.3 Hình ảnh protocorm sinh trưởng mơi trường có bổ sung saccharose sau tuần nuôi cấy 3.2.3 Ảnh hưởng nước dừa đến trình phát sinh chồi protocorm Để tìm hiểu ảnh hưởng nước dừa lên trình phát sinh chồi từ cụm protocorm, tiến hành cấy cụm protocorm mơi trường MS có chứa: agal 6g/l; saccharose 10g/l; than hoạt tính 1g/l; BAP 0,5mg/l nước dừa với hàm lượng thay đổi theo công thức (CT) sau: CT1- không bổ sung; CT2- 50ml/l; CT3- 100ml/l; CT4- 150 ml/l Sau 40 ngày nuôi cấy thu kết tạo chồi từ protocorm công thức môi trường sau: với CT1cho hệ số phát sinh chồi 75%, CT2 88,6%, CT3 97,4% CT4 87,9%, qua thấy với môi trường CT3 khả phát sinh chồi từ protocorm cao so với cơng thức mơi trường thí nghiệm khác (Bảng 3.5) Bảng 3.5 Ảnh hưởng hàm lượng nước dừa đến khả phát sinh chồi từ cụm protocorm Công thức nhân chồi CT1 CT2 CT3 CT4 Hàm lượng nước dừa (ml/l) 50 100 150 Số cụm protocorm đưa vào Số cụm protocorm phát sinh chồi Tỷ lệ phát sinh chồi (%) 40 35 38 33 30 31 37 29 75 88,6 97,4 87,9 28 Tuy tỷ lệ phát sinh chồi cụm protocorm cao (trên 70%) số lượng chồi cụm protocorm cịn thấp (trung bình 3-5 chồi cụm) Chất lượng hình thái chồi thay đổi theo tùng cơng thức mơi trường, chúng tơi nhận thấy với cơng thức mơi trường CT3 chồi cho chất lượng tốt nhất, kích thước chồi trung bình, chồi xanh đều, chồi mang từ 3-4 cao từ 0,5- 1cm (Hình 3.5) Hình 3.4 Chồi phát sinh từ cụm 3.2.4 Ảnh hưởng than hoạt protocorm mơi trường chứa tính đến khả phát sinh chồi từ 100ml/l nước dừa protocorm Để kiểm tra mức độ ảnh hưởng than hoạt tính đến q trình phát sinh chồi protocorm tách cụm protocorm cấy chuyển vào môi trường MS chứa: 10g đường saccharose; BAP 0,5 ml/l; nước dừa 100ml/l; agar 6g/l than hoạt tính với hàm lượng thay đổi theo công thức sau: CT1không bổ sung; CT2- 0,5g/l; CT3- 1g/l CT4- 1,5 g/l Sau 40 ngày nuôi cấy, CT3 cho tỷ lệ phát sinh chồi cao (đạt tỷ lệ 94,3%), chồi mập phát triển tốt so với cơng thức thí nghiệm khác (Bảng 3.6; Hình 3.6) Tuy nhiên trình theo dõi thấy bổ sung tăng dần lượng than hoạt tính chiều cao lại có xu hướng giảm dần 29 Bảng 3.6 Ảnh hưởng than hoạt tính đến khả phát sinh chồi từ cụm protocorm Công Hàm lượng Số cụm Số cụm Tỷ lệ phát Hình thái thức than hoạt tính protocorm phát sinh sinh chồi chồi (g/l) đưa vào chồi (%) CT1 35 26 74 CT2 0,5 35 30 85,7 Chồi gầy, xanh đậm Chồi vừa, xanh nhạt Chồi mọc CT3 35 33 94,3 vừa, xanh Chồi thấp, CT4 1,5 35 28 80 bé xanh nhạt CT3 CT4 Hình 3.5 Ảnh hưởng than hoạt tính đến khả phát sinh chồi từ cụm protocorm 30 3.3 KẾT QUẢ NHÂN NHANH VÀ TẠO CÂY HOÀN CHỈNH IN VITRO 3.3.1 Ảnh hưởng BAP đến nhân nhanh chồi lan Thạch hộc BAP (6 - benzyl amino purin) hormone sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin có vai trị chủ yếu kích thích phân chia tế bào BAP ảnh hưởng rõ rệt lên hình thành phân hóa quan thực vật, đặc biệt phân hóa chồi Thơng qua chế di truyền BAP tác động lên trình sinh tổng hợp protein, từ ảnh hưởng đến tổng hợp protein, enzyme cần thiết cho phân chia sinh trưởng tế bào Ngồi ra, BAP cịn có tác dụng ngăn chặn già hóa tế bào thực vật, ngăn chặn phân hủy protein, axit nucleic chlorophyll Để nghiên cứu ảnh hưởng BAP đến phát triển chồi lan Thạch hộc, tách cụm chồi nhỏ phát sinh từ protocorm cấy chuyển vào môi trường MS bổ sung đường saccharose 30 g/l; agar 7g/l; nước dừa 50ml/l; than hoạt tính 1g/l BAP với nồng độ thay đổi bốn cơng thức (CT) thí nghiệm: CT1 không bổ sung BAP; CT2 - 0,5mg/l BAP; CT3 - 1mg/l BAP; CT4 - 1,5mg/l BAP Bảng 3.7 Ảnh hưởng BAP đến phát triển cụm chồi lan Thạch hộc Môi trường Nồng độ Số Chiều cao BAP chồi/cụm chồi (mm) Số lá/chồi Hình thái chồi (mg/l) CT1 7,22 ± 0,07 11,5 ± 0,08 2,9 ± 0,05 CT2 0,5 7,85 ± 0,12 14,7 ± 0,1 3,82 ± 0,2 CT3 8,32 ± 0,09 16,5 ± 0,12 3,7 ± 0,16 CT4 1,5 9,75 ± 0,23 17,25 ± 0,2 4,1 ± 0,15 Chồi nhỏ, xanh nhạt Chồi nhỏ, xanh Chồi BT, xanh đậm Chồi to, xanh đậm Kết bảng 3.7 cho thấy tất mơi trường có nhân chồi Tuy nhiên, chúng tơi nhận thấy có chênh lệch lớn hệ số nhân chồi 31 khả phát triển chồi thay đổi nồng độ BAP Trong đó, mơi trường CT1 chúng tơi khơng bổ sung BAP, mẫu thu cho hệ số nhân chồi thấp đạt 7,72 chồi/cụm Chiều cao chồi trung bình chồi 11,5 mm số chồi 2,9, chồi nhỏ, xanh nhạt, cho thấy khả nhân nhanh phát triển chồi chưa thực tốt Sau chúng tơi bổ sung BAP vào môi trường, tiêu theo dõi có thay đổi rõ rệt theo công thức, với môi trường CT2 bổ sung 0,5mg/l BAP số chồi/ cụm 7,85 số tăng dần với môi trường CT3 CT4 Qua q trình theo dõi, chúng tơi nhận thấy môi trường CT4 cho hệ số nhân chồi cao với hệ số nhân chồi đạt 9,75 chồi/cụm, chiều cao chồi đạt 17,25 mm số 4,1 lá/chồi, chồi phát triển khỏe mạnh, đồng có màu xanh đậm CT2 - BAP mg/l CT4 - BAP 1,5mg/l Hình 3.6 Ảnh hưởng BAP tới nhân nhanh chồi lan Thạch hộc Như vậy, kết luận khả nhân chồi giống lan Thạch hộc cao môi trường MS bổ sung 30g/l đường saccharose; 6g/l agar; 50ml/l nước dừa; 1g/l than hoạt tính; 1,5mg/l BAP Tuy nhiên, chúng tơi nhận thấy khơng bổ sung chất kích thích cho kết tạo chồi, điều có khả lồi lan có chứa lượng cytokinin nội sinh cao nên tự tạo lượng chồi tương đối dù khơng có bổ sung cytokinin vào môi trường Đây ưu giống lan Dendrobium nhân giống đối tượng ta không cần phải tiêu tốn 32 lượng chất điều hòa sinh trưởng nhiều, điều vừa kinh tế lại vừa hạn chế tượng đột biến cho mẫu cấy 3.3.2 Ảnh hưởng hàm lượng khoai tây chuối xanh nghiền đến phát triển chồi lan Thạch hộc Ngoài chất điều tiết sinh trưởng để thúc đẩy q trình ni cấy giúp sinh trưởng nhanh có chất lượng tốt người ta thường bổ sung khoai tây, chuối xanh thành phần khơng xác định có tác dụng kích thích sinh trưởng mơ tế bào Do thí nghiệm chúng tơi sử dụng dịch khoai tây nghiền chuối xanh nghiền để theo dõi sinh trưởng lan thạch hộc Các chồi lan tách thành chồi/ cụm chuyển sang môi trường MS bổ sung 30 g/l đường saccharose; g/l agar; g/l than hoạt tính; g/l BAP bổ sung chuối xanh nghiền, khoai tây nghiền với hàm lượng cơng thức thí nghiệm sau: CT1- không bổ sung, CT2- bổ sung 30g/l khoai tây, CT3- bổ sung 50g/l khoai tây, CT4- bổ sung 30g/l chuối xanh, CT5- bổ sung 50g/l chuối xanh Kết theo dõi sau 90 ngày trình bày bảng 3.8 Bảng 3.8 Ảnh hưởng hàm lượng chuối xanh khoai tây nghiền đến phát triển lan Thạch hộc CT thí nghiệm CT1- khơng bổ sung CT2 - 30 g/l khoai tây CT3 - 50 g/l khoai tây CT4 - 30 g/l chuối xanh CT5 - 50 g/l chuối xanh Số chồi/cụm Chiều cao tb (mm) Số lá/cây 4,6 ± 0,06 47,1 ± 2,26 3,37 ± 0,07 5,8 ± 0,12 59,5 ± 2,2 4,5 ± 0,11 6,3 ± 0,01 63,6 ±1,82 5,1 ±0,08 6,2 ± 0,04 54,2 ± 3,04 4,1 ±0,13 6,8 ± 0,06 57,2 ± 3,32 4,7 ±0,09 Hình thái Cây nhỏ, nhỏ xanh Cây vừa, trung bình xanh Cây mập, to xanh đậm Cây nhỏ, nhỏ xanh Cây nhỏ, nhỏ, dài xanh đậm Qua bảng 3.8 cho thấy, môi trường CT1 khơng bổ sung khoai tây chuối xanh nghiền nhân lên thấp so với môi trường khác bổ sung khoai tây nghiền chuối xanh nghiền Với mơi trường bổ sung 33 chất kích thích tăng trưởng nên chồi tiếp tục phát triển nhiên số theo dõi thấp hệ số nhân chồi đạt 4,6 chồi/cụm, chiều cao trung bình đạt 47,1 mm số lá/chồi 3,37 Chồi nhỏ xanh nhạt so với chồi môi trường bổ sung khoai tây nghiền chuối xanh nghiền Với hàm lượng khoai tây 30 g/l, hệ số nhân chồi đạt 5,8 chồi/cụm, chiều cao trung bình đạt 59,5 mm số lá/chồi 4,5 sau chúng tơi tăng hàm lượng khoai tây mơi trường CT3 lên 50 g/l sinh trưởng phát triển chồi tăng lên rõ rệt hệ số nhân chồi đạt 6,3 chồi/cụm, chiều cao trung bình đạt 63,6 mm số lá/chồi 5,1 CT1- không bổ sung CT3- 50g/l khoai tây CT5- 50g/l chuối xanh Hình 3.7 Ảnh hưởng chuối xanh khoai tây lên phát triển lan Thạch hộc Với hàm lượng chuối xanh 30g/l mơi trường CT4, hệ số nhân chồi đạt 6,2 chồi/cụm, chiều cao trung bình đạt 54,2 mm số lá/chồi 4,1 cịn với hàm lượng chuối xanh lên 50g/l môi trường CT5 hệ số nhân chồi đạt 6,8 chồi/cụm, chiều cao trung bình đạt 57,2 mm số lá/chồi 4,7 So sánh sinh trưởng lan Thạch hộc mơi trường có chứa dịch chuối xanh khoai tây nghiền, nhận thấy với môi trường bổ sung 50g/l khoai tây phát triển lan Thạch hộc đạt kết tốt Từ đó, chúng tơi rút kết luận mơi trường thích hợp cho lan Thạch hộc phát triển môi trường MS bổ sung đường saccharose 25g/l; agar 6g/l; than hoạt tính 1g/l; BAP 1g/l khoai tây 50g/l 34 3.3.3 Ảnh hưởng α – NAA đến khả rễ lan Thạch hộc α - NAA hormone sinh trưởng thuộc nhóm auxin Nó sinh mơ phân sinh vận chuyển xuống phận khác Vai trò α - NAA thúc đẩy sinh trưởng dãn nở tế bào thực vật, tăng cường trình tổng hợp trao đổi chất ADN, protein… Ngồi cịn kích thích rễ, kéo dài rễ tham gia vào cảm ứng tạo chồi vơ tính ống nghiệm Để nghiên cứu ảnh hưởng α - NAA đến khả tạo rễ lan sử dụng môi trường: MS bổ sung đường saccharose 30 g/l; agar 6g/l; than hoạt tính 1g/l; khoai tây 50g/l bổ sung NAA (nồng độ từ 0mg/l đến 0,75mg/l ) Kết theo dõi sau 80 ngày trình bày bảng 3.9 Bảng 3.9 Ảnh hưởng α - NAA đến khả tạo rễ lan Thạch hộc CT Nồng độ α – NAA Số rễ tb/cây Độ dài tb rễ (mm) CT1 5,7 ± 0,01 11 ± 0,22 CT2 0,25 6,5 ± 0,05 15,9 ± 0,31 CT3 0,5 7,32 ± 0,11 20,5 ± 0,25 CT4 0,75 6,78 ± 0,03 18,2 ± 0,38 CT1- NAA CT2- 0,25mg/l NAA Đặc điểm rễ Rễ nhỏ, ngắn, màu xanh Rễ nhỏ,màu xanh, Rễ mập, dài, màu trắng đục, chóp rễ xanh Rễ dài, nhỏ, màu trắng đục, chóp rễ có màu xanh CT3- 0,5mg/l NAA Hình 3.8 Ảnh hưởng α - NAA đến khả tạo rễ lan Thạch hộc 35 Qua bảng 3.9, nhận thấy môi trường bổ sung α - NAA hàm lượng khác thu kết khác Ở mơi trường CT1 chồi lan có tăng trưởng chiều cao số tỷ lệ rễ/cây chưa cao 5,7; độ dài rễ 11 mm Rễ nhỏ, ngắn, màu xanh nhạt Khi mơi trường có bổ sung α - NAA, lan Thạch hộc rễ với tỉ lệ cao Ở nồng độ NAA 0,25mg/l số rễ/cây 6,5; độ dài rễ 15,9 mm; rễ nhỏ, màu xanh Khi tăng nồng độ NAA lên 0,5 mg/l độ dài rễ lên đến 20,5 mm,và số rễ trung bình đạt 7,32, rễ mập, dài, màu trắng đục, chóp rễ màu xanh Chúng tơi tiếp tục tăng nồng độ NAA lên 0,75mg/l số rễ cây, chiều dài rễ tương ứng 6,78 18,2 mm Rễ dài, nhỏ, màu trắng chóp rễ xanh Từ thí nghiệm, chúng tơi đánh giá nồng độ α - NAA thích hợp cho rễ lan Thạch hộc 0,5 mg/l 3.4 ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ LOẠI GIÁ THỂ ĐẾN SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN LAN THẠCH HỘC SAU KHI RA CÂY Đưa vườn ươm giai đoạn quan trọng bao gồm việc tạo rễ, huấn luyện thích nghi với thay đổi nhiệt độ, độ ẩm, nước, sâu bệnh chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng hoàn toàn Đây giai đoạn định khả ứng dụng quy trình nhân giống in vitro Khi nuôi cấy mô đạt đủ tiêu chuẩn, chúng tơi tiến hành dùng panh gắp khỏi bình ni cấy sau rửa nhẹ nhàng vịi nước cho thật môi trường thạch tránh để bị nát, để nước, trồng vào cốc nhựa đựng giá thể, nguyên liệu mà sử dụng để làm giá thể mùn cưa ủ hoai mục vụn dớn, để nghiên cứu chia làm ba loại giá thể sau: loại thứ chứa mùn cưa; loại hai chứa mùn cưa với vụn dớn trộn vói tỷ lệ 1:1 loại chứa vụn dớn Mỗi loại giá thể chúng tơi tiến hành thí nghiện trồng 50 Sau trồng vào giá thể chúng tơi đưa vào túi bóng nilon ghim lại Tiến hành chăm sóc cách tưới nước lã tưới dung dịch ½ MS (Kết theo dõi sau 60 ngày trình bày bảng 3.10) Chúng tơi nhận thấy loại giá thể có khả trồng lan Thạch hộc sau với tỷ lệ cấy sống đạt 80% nhiên so với hai loại 36 giá thể giá thể mùn cưa gia thể vụn dớn giá thể chứa hỗn hợp hai loại vụn dớn + mùn cưa cho tỷ lệ sống đạt chất lượng tốt hơn, tỷ lệ sống đạt 92% to khỏe rễ nhiều, số chồi hình thành đạt 2,86 chồi Như vậy, kết luận giá thể chứa hai mùn cưa vụn dớn với tỷ lệ 1:1 thích hợp cho sinh trưởng phát triển lan Thạch hộc Bảng 3.10 Ảnh hưởng số loại giá thể đến phát triển lan Thạch hộc Giá thể Số Số chồi cịn sống hình thành Số lá/ Đặc điểm Cây khỏe, xanh nhạt Mùn cưa 42 1,54 ± 0,12 7,45 ± 0,12 nhỏ, rễ hình thành khơng nhiều, chồi Mùn cưa vụn Cây to khỏe, xanh, rễ 46 2,86 ± 0,15 8,5 ± 0,03 dớn nhiều, rễ xanh, nảy chồi nhiều Cây khỏe, xanh nhạt, Vụn Dớn 45 1,7 ± 0,1 6,8 ± 0,04 rễ nảy chồi chưa nhiều VỤN DỚN MÙN CƯA + VỤN DỚN MÙN CƯA Hình 3.9 Hình ảnh lan thạch hộc sinh trưởng loại giá thể khác sau chai huấn luyện vườn ươm 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Mẫu phù hợp để khử trùng tạo vật liệu đưa vào nuôi cấy lan thạch hộc sử dụng lan hóa chất khử trùng thích hợp HgCl 0,1% Ảnh hưởng số yếu tố đến tái sinh protocorm môi trường phù hợp - Môi trường MS bổ sung đường saccharose 10g/l + aga 6g/l r + than hoạt tính 1g/l; nước dừa 50ml/l BAP 1,0 mg/l phù hợp để phát sinh protocrom từ hạt Thạch hộc - Mơi trường tốt để hình thành chồi lan Thạch hộc từ protocorm MS bổ sung 10g đường saccharose; 6g/l agar; 1g/l than hoạt tính; 0,5ml/l BAP 100ml/l nước dừa Kết nhân nhanh tạo hồn chỉnh - Mơi trường phù hợp nhân nhanh chồi lan Thạch hộc môi trường MS bổ sung 30 g/l đường saccharose; 6g/l agar; 1g/l than hoạt tính; 50 ml/l nước dừa 1mg/l BAP - Lan Thạch hộc phát triển hình thành rễ tốt môi trường MS bổ sung 30 g/l đường sacch arose; g/l agar; g/l than hoạt tính; 50g/l khoai tây 0,5mg/l NAA - Giá thể thích hợp để trồng lan Thạch hộc mùn cưa hoai mục trộn với vụn dớn với tỷ lệ 1:1 KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu để hồn thiện quy trình nhân giống in vitro lồi lan Thạch hộc nhằm góp phần bảo tồn lan rừng cung cấp nguồn dược liệu quý Thạch hộc cho thị trường, phục tráng giống giữ gìn chất có hoạt tính sinh học cây, phục vụ nghiên cứu di truyền tạo giống 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lê Trần Đức (1997), Cây thuốc Việt Nam – Trồng hái chế biến, trị bệnh ban đầu Nhà xuất Nơng nghiệp Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhi, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến trồng Nhà xuất Nông nghiệp Dương Mậu Hùng, Lê Đình Khả (2003), Giáo trình giống rừng Nhà xuất nông nghiệp Nguyễn Hồng Nghĩa (2001), Nhân giống vơ tính trồng rừng vơ tính Nhà xuất nơng nghiệp Hà Nội Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn (2005), Sinh lý học thực vật Nhà xuất Giáo Dục Trần Hợp (1998), Phong lan Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mậu Hùng, Lê Hồng Điệp (2005), Sinh lý học thực vật (tập 2) Nhà xuất giáo Dục Trần Việt Hưng (2014), Lan Hoàng thảo Dendrobium hoa, vị thuốc Vũ Ngọc Lan, Nguyễn Thị Lý Anh (2013), Nhân giống In vitro loài lan địa dendrobium Nobile Lindl Tạp chí Khoa học Phát triển, tập 11 (7): 917-925 10 Nguyễn Thanh Tùng, Lê Văn Điệp, Nguyễn Minh Trung, Trương Thị Bích Phượng (2010), “Áp dụng phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào nhân giống in vitro Hồng lan thân gãy (Dendrobium aduncum), Tạp chí Công nghệ Sinh học (3): 361 - 367 11 Nguyễn Văn Song (2011), “Nhân nhanh in vitro lan Kim Điệp (Dendrobium chrysotoxum) - lồi lan rừng có nguy tuyệt chủng”, Tạp chí khoa học Đại học Huế, số 64, tr.127 – 136 12 Nguyễn Thị Sơn, Nguyễn Thị Lý Anh, Vũ Ngọc Lan, Trần Thế Mai (2011), “Nhân giống in vitro giống lan Dendrobium fimbriatum (Lan Hoàng Thảo Long nhãn)”, Tạp chí Khoa học Phát triển, Trường Đại học Nông nghiệp, tập 10, số 2, tr.263 – 271 39 13 Bùi Thị Tường Thu, Trần Văn Minh (2007), “Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến q trình ni cấy phát sinh tế bào soma phơi vơ tính lan (Dendrobium, Phalaenopsis, Cybidium)”, Hội nghị Khoa học Công nghệ 2007, trang 503 – 508 Tài liệu tiếng Anh 14 Kusumoto and Furukawa (1977), Effect of Oganic Matter on the Growth of Cymbidium Protocrom Cultured in vitro Japan Soc Hort Sci 45 (4): 421-426 15 Tawaro Supavadee, Suraninpong Potjamarn and Chanprame Sontichai (2008), Germination Regenaration of Cymbidium findlaysonyanum Lindl on a Medium Supplemented with Some organic Sourcer Walailak J Sci & Tech (2): 125-135 16 Chang C, Chen YC, Hsu YH, Wu JT, Hu CC, Chang WC, Lin NS (2005), Transgenic resistance to Cymbidium mosaic virus in Dendrobium expressing the viral capsid protein gene Transgenic Res, 14(1), pp: 41–46 17 Narayanaswamy S (1994) Plant Cell and Tissue Culture Tata Mcgraw Hill Publishing Company Limited, New Delhi 18 Kauth P (2005) In vitro seed germination and seedling development of Calopogon tuberosus and Sacoila Lanceolata var lanceolata: Two Florida native terrestrial orchids Master thesis, University of Florida 19 Bijaya Pant and Deepa Thapa (2012), “In vitro mass propagation of an epiphytic orchid, Dendrobium primulinum Lindl through shoot tip culture” African Journal of Biotechnology Vol 11(42), pp 9970-9974 20 Sana Asghar, Touqeer Ahmad, Ishfaq Ahmad Hafiz and Mehwish Yaseen (2011 ), “In vitro propagation of orchid (Dendrobium nobile) var Emma white” African Journal of Biotechnology Vol 10(16), pp 3097 – 3103 21 M Maridass, R Mahesh , G.Raju A.Benniamin and K.Muthuchelian (2010) “In Vitro propagation of Dendrobium nanum through rhizome bud culture” International Journal of Biological Technology, 1(2), 50 – 54 40 Tài liệu trang web 22 http://nongnghiep.vn/than-duoc-thach-hoc-tia-post119811.html 23 http://thachhoc.net/ 24 http://www.thaythuoccuaban.com/vithuoc/thonhilan.htm 25 http://bioplants.com.vn/ky-thuat-trong-cay-thach-hoc-tia 26 http://www.vuonhoalan.net/?tab=detailnews&tin=68&title=lan-dahac-phi-diep-dendrobium-anosmum 27 http://www.vnorchids.net/index.php?/topic/11-lan-hoang-thao% 28 http://blogcaycanh.vn/cay_canh/d/cay-thach-hoc-tia 41 PHỤ LỤC Môi trường nuôi cấy môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) Khoáng đa lượng Khoáng vi lượng Sắt EDTA Vitamin Thành phần Nồng độ (mg/l) NH NO 1650 KNO 1900 CaCl 2H O 440 MgSO 7H O 370 KH PO 170 MnSO 4H2O 23,3 ZnSO 7H2O 8,6 H BO 6,2 KI 0,83 Na MoO4 2H O 0,25 CuSO 5H O 0,025 CoCl 6H O 0,025 Na EDTA 37,3 FeSO 7H O 27,8 myo-Inositol 100 Thiamin (B ) 0,1 Nicotinic acid 0,5 Pyridoxine HCl 0,5 42 ... TIÊU NGHIÊN CỨU Nghiên cứu hồn thiện quy trình nhân giống in vitro lan rừng Dendrobium nobile Lindl, góp phần cho công tác bảo tồn cung cấp giống lan Thạch hộc NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Nghiên cứu điều... NGỌC NAM NGHIÊN CỨU HỒN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN HỒNG THẢO THẠCH HỘC TÍA (DEDROBIUM NOBILE LINDL) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG... [23] 1.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN DENDROBIUM 1.4.1 Một số nghiên cứu giới Bijaya Pant and Deepa Thapa (5/2012) nghiên cứu nhân nhanh giống Dendrobium primulinum Lindl có nguy tuyệt