Nghiên cứu đặc điểm thực vật thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây gạo bombax malabaricum DC họ gạo bombacaceae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI HỒ THỊ THANH HUYỀN (Bombax malabaricum DC., LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2014 BỘ Y TẾ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI HỒ THỊ THANH HUYỀN (Bombax malabaricum DC LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: Dƣợc học cổ truyền MÃ SỐ: 62.72.04.06 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thái An PGS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu HÀ NỘI, NĂM 2014 ) LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận án công trình nghiên cứu riêng tơi hướng dẫn PGS TS Nguyễn Thái An PGS TS Thái Nguyễn Hùng Thu Các kết trình bày luận án trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả luận án Hồ Thị Thanh Huyền ii LỜI CẢM ƠN Trong q trình thực luận án, tơi nhận ủng hộ tạo điều kiện Đảng ủy, Ban giám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội Bộ môn Dược liệu nơi học tập, nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thái An PGS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu, người Thầy hướng dẫn truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu nghiên cứu khoa học cho Tôi xin chân thành cảm ơn GS.TS Phạm Thanh Kỳ, PGS TS Nguyễn Trọng Thông, PGS TS Phan Văn Kiệm, PGS TS Trần Huy Thái, PGS TS Nguyễn Khắc Khơi, TS Phạm Thị Vân Anh góp ý cho tơi q trình nghiên cứu hồn thiện luận án Trong q trình thực luận án, tơi nhận hợp tác nghiên cứu quan: Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, Bộ môn Dược lý trường Đại học Y Hà Nội, Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Đồng thời, nhận đóng góp q báu Thầy Cơ giáo, nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực Nhân dịp xin trân trọng cảm ơn giúp đỡ nhiệt tình thầy cơ, anh chị em đồng nghiệp môn Dược liệu, môn Dược học cổ truyền mơn Thực vật, phịng ban trường tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành luận án.Cảm ơn học trị ln sát cánh tơi suốt q trình nghiên cứu vừa qua Lời sau cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới người bạn, người thân gia đình bố, mẹ, kịp thời động viên tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận án Xin cảm ơn người chồng thân yêu giúp đỡ, chia sẻ với năm tháng qua Xin trân trọng cảm ơn tất giúp đỡ quý báu Hồ Thị Thanh Huyền iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ii LỜI CẢM ƠN iii DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT vii x Ẽ xii CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT 1.1.1 Họ Gạo (Bombacaceae L.) 1.1.2 Chi Bombax L 1.1.3 Bombax malabaricum DC (Bombax ceiba L.) 1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI Bombax L 13 1.2.1 Loài Bombax anceps Pierre 13 1.2.2 Loài Bombax costatum Pellegr & Vuillet 16 1.2.3 Loài Bombax malabaricum DC 16 1.3 TÁC DỤNG SINH HỌC VÀ CÔNG DỤNG 28 1.3.1 Độc tính 28 1.3.2 Tác dụng sinh học 29 1.3.3 Công dụng 35 CHƢƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 40 2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 40 2.1.2 Động vật thí nghiệm 41 2.1.3 Hóa chất thiết bị 41 2.1.4 Địa điểm nghiên cứu 43 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 43 iv 2.2.1 Nghiên cứu thực vật 43 2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 43 2.2.3 Phƣơng pháp đánh giá độc tính cấp tác dụng sinh học 44 2.2.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu 51 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 53 3.1 NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT 53 3.1.1 Mơ tả đặc điểm hình thái thực vật giám định tên khoa học Gạo 53 3.1.2 Đặc điểm vi học cấu tạo giải phẫu 55 3.2 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC 58 3.2.1 Định tính nhóm chất thƣờng có dƣợc liệu 58 3.2.2 Chiết xuất phân lập hợp chất từ vỏ thân Gạo 60 3.2.3 Nhận dạng hợp chất phân lập từ phận Gạo 64 3.2.4 Xây dựng phƣơng pháp xác định hàm lƣợng số hợp chất có Gạo 94 3.3 ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CẤP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC 104 3.3.1 Đánh giá độc tính cấp cao nƣớc vỏ thân, hoa Gạo 104 3.3.2 Tác dụng giảm đau 107 3.3.3 Tác dụng chống viêm cấp 109 3.3.4 Tác dụng chống viêm mạn 112 3.3.5 Tác dụng cầm máu qua đánh giá thời gian chảy máu, đông máu 113 3.3.6 Tác dụng bảo vệ gan chống oxy hóa 115 CHƢƠNG BÀN LUẬN 121 4.1 VỀ THỰC VẬT 121 4.2 VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 123 4.2.1 Về kết định tính 124 4.2.2 Về kết phân lập hợp chất 124 4.2.3 Về kết xác định hàm lƣợng số hợp chất 129 v 4.3 VỀ ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC 132 4.3.1 Độc tính 133 4.3.3 Về tác dụng chống viêm 136 4.3.4 Về tác dụng cầm máu 140 4.3.5 Về tác dụng bảo vệ gan chống oxy hóa 142 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 146 CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC CỦA LUẬN ÁN vi DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Độ dịch chuyển hóa học H-NMR 13 C-NMR Proton nuclear magnetic resonance – Phổ cộng hƣởng từ proton Carbon (13) nuclear magnetic resonance – Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C AGC Apigenin 7-O- -D-glucuronopyranosid ALAT Alanin aminotransfera APG Angiosperm Phylogeny Group As Ánh sáng AST Ánh sáng thƣờng ASAT Aspartat aminotransfera BBL Cắn toàn phần chiết xuất từ Gạo BBL-H Cắn phân đoạn n-hexan chiết xuất từ Gạo BBL-C Cắn phân đoạn cloroform chiết xuất từ Gạo BBL-E Cắn phân đoạn ethyl acetat chiết xuất từ Gạo BBL-W Cắn phân đoạn nƣớc chiết xuất từ Gạo BBV Cắn toàn phần chiết xuất từ vỏ thân Gạo BBV-H Cắn phân đoạn n-hexan chiết xuất từ vỏ thân Gạo BBV-C Cắn phân đoạn cloroform chiết xuất từ vỏ thân Gạo BBV-E (VGE) Cắn phân đoạn ethyl acetat chiết xuất từ vỏ thân Gạo BBV-W Cắn phân đoạn nƣớc chiết xuất từ vỏ thân Gạo B Bombax BHA Butyl hydroxylanisol CTCP Cơng ty cổ phần CTHH Cơng thức hóa học CTPT Cơng thức phân tử vii CTSK Chƣơng trình sắc ký d Doublet – đỉnh đôi dd Doublet of doublet dl Dƣợc liệu DĐVN Dƣợc điển Việt Nam DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DMSO Dimethyl sulfosid DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl ESI-MS Electron Spray Ionization Mass Spectrometry EtOAc Ethyl acetat GSH Glutathion Glc Glucose HCNKST Hồng cầu nhiễm kí sinh trùng HG Hoa Gạo HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence IC50 Nồng độ ức chế 50% (Haft maximal inhibitory concentration) IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) LD50 Liều gây chết 50% (Lethal Dose, 50%) LG Lá Gạo LOD: Giới hạn phát (Limit of Detection) LOQ: Giới hạn định lƣợng (Limit of Qualification) m Multiplet m/z Tỷ lệ số khối/điện tích ion MDA Malonyl dialdehyd Mp Điểm nóng chảy MS Mass spectrometry – Phổ khối viii NAPQI N-acetyl parabenzoquinon-imin NMR Nuclear Magnetic Resonance p page PAR Paracetamol PG Prostaglandin s Singlet- đỉnh đơn SKC Sắc ký cột SKC-RP Sắc ký cột pha đảo SKLM Sắc ký lớp mỏng s.c Tiêm dƣới da t Triplet- đỉnh ba TLTK Tài liệu tham khảo TT Thuốc thử TW Trung ƣơng UV254nm Ultra violet– Ánh sáng tử ngoại UV365nm Ultra violet - Ánh sáng tử ngoại (bƣớc 365nm) VG Vỏ thân Gạo WHO World Health Organization -Tổ chức Y tế giới ix cxxx Phổ 13C-NMR cxxxi Phổ DEPT cxxxii PHỤ LỤC 14 cxxxiii PHỤ LỤC 14 SẮC KÝ ĐỒ CỦA DỊCH CHIẾT TOÀN PHẦN VỎ THÂN CÂY GẠO cxxxiv PHỤ LỤC 15 cxxxv PHỤ LỤC 15 SẮC KÝ ĐỒ CỦA DỊCH CHIẾT TOÀN PHẦN LÁ CÂY GẠO cxxxvi PHỤ LỤC 16 cxxxvii PHỤ LỤC 16 KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐỘ ĐÚNG CỦA CÁC HỢP CHẤT CÓ TRONG VỎ THÂN CÂY GẠO Kết khảo sát độ với Epicatechin TT S mẫu S thêm (mAU.s) (mAU.s) 38872 50345 38543 50245 38590 50346 38650 50355 38596 50346 38652 50345 Trung bình C thêm (µg/mL) 7,34 7,34 7,34 7,34 7,34 7,34 C cũ (µg/mL) 24,25 24,04 24,07 24,11 24,07 24,11 24,11 C (µg/mL) 31,40 31,34 31,40 31,41 31,40 31,40 C cũ (µg/mL) 29,36 29,36 29,14 29,36 29,09 29,41 29,29 C (µg/mL) 32,31 32,41 32,18 32,29 32,17 32,45 C cũ (µg/mL) 3,06 3,06 3,05 3,05 3,09 3,06 3,06 C (µg/mL) 4,42 4,43 4,43 4,44 4,48 4,45 % tìm lại 97,44 99,39 99,84 99,41 99,79 99,31 99,20 Kết khảo sát độ với Catechin TT S mẫu S thêm (mAU.s) (mAU.s) 124346 136841 124367 137242 123454 136272 124356 136765 123243 136253 124562 137432 Trung bình C thêm (µg/mL) 3,04 3,04 3,04 3,04 3,04 3,04 % tìm lại 97,25 100,21 99,77 96,58 101,26 100,17 99,21 Kết khảo sát độ với Daucosterol TT S mẫu S thêm (mAU.s) (mAU.s) 6184 9030 6170 9034 6155 9052 6156 9065 6243 9153 6182 9082 Trung bình C thêm (µg/mL) 1,36 1,36 1,36 1,36 1,36 1,36 cxxxviii % tìm lại 99,97 100,58 101,75 102,16 102,19 101,85 101,42 Kết khảo sát độ với Lupeol TT S mẫu S thêm (mAU.s) (mAU.s) 60352 75841 60367 75842 60454 75672 60356 75665 60243 75753 60862 76132 Trung bình C thêm (µg/mL) 7,17 7,17 7,17 7,17 7,17 7,17 C cũ (µg/mL) 28,36 28,37 28,41 28,37 28,31 28,60 28,40 C (µg/mL) 35,65 35,65 35,57 35,56 35,61 35,78 C cũ (µg/mL) 4,36 4,31 4,35 4,37 4,36 4,37 4,35 C (µg/mL) 6,27 6,27 6,30 6,30 6,29 6,27 C cũ (µg/mL) 15,93 15,90 15,89 15,82 15,74 15,75 15,84 C (µg/mL) 20,31 20,12 20,22 20,07 20,06 19,82 % tìm lại 101,60 101,51 99,82 100,42 101,74 100,16 100,88 Kết khảo sát độ với Stigmasterol TT S mẫu S thêm (mAU.s) (mAU.s) 6351 9130 6270 9134 6325 9172 6356 9165 6343 9153 6362 9132 Trung bình C thêm (µg/mL) 1,92 1,92 1,92 1,92 1,92 1,92 % tìm lại 99,41 102,43 101,83 100,46 100,48 99,07 100,61 Kết khảo sát độ với Friedelin TT S mẫu S thêm (mAU.s) (mAU.s) 21501 27500 21470 27242 21454 27372 21356 27165 21243 27153 21262 26832 Trung bình C thêm (µg/mL) 4,27 4,27 4,27 4,27 4,27 4,27 cxxxix % tìm lại 102,68 98,79 101,29 99,42 101,14 95,33 99,77 PHỤ LỤC 17 cxl PHỤ LỤC 17 KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐỘ ĐÚNG CỦA CÁC HỢP CHẤT CÓ TRONG LÁ CÂY GẠO Kết khảo sát độ với mangiferin TT Smẫu (mAU.s) 169480 168431 169540 168650 168896 168565 C thêm (µg/ml) S thêm (mAU.s) 196595 196245 196346 196355 196546 196145 C cũ (µg/ml) 40,00 39,75 40,01 39,80 39,86 39,78 C (µg/ml) 46,39 46,31 46,34 46,34 46,38 46,29 6,43 C tìm lại (µg/ml) 6,39 6,56 6,33 6,54 6,52 6,51 Trung bình % tìm lại 99,48 102,04 98,34 101,64 101,44 101,18 100,69 Kết khảo sát độ với daucosterol TT Smẫu (mAU.s) 6194 6170 6125 6156 6243 6162 C thêm (µg/ml) S thêm (mAU.s) 9070 9034 9012 9045 9153 9062 C cũ (µg/ml) 3,07 3,06 3,04 3,05 3,09 3,05 C (µg/ml) 4,44 4,43 4,42 4,43 4,48 4,44 1,36 C tìm lại (µg/ml) 1,37 1,37 1,38 1,38 1,39 1,39 Trung bình % tìm lại 101,02 100,58 101,40 101,46 102,19 101,85 101,42 Kết khảo sát độ với -hydroxysitosterol TT Smẫu (mAU.s) 3568 3510 3534 3556 3543 3562 C thêm (µg/ml) S thêm (mAU.s) 5871 5850 5872 5865 5853 5862 C cũ (µg/ml) 4,29 4,22 4,25 4,27 4,26 4,28 C (µg/ml) 7,04 7,02 7,04 7,04 7,02 7,03 2,75 cxli C tìm lại (µg/ml) 2,76 2,80 2,80 2,76 2,76 2,75 Trung bình % tìm lại 100,17 101,76 101,68 100,41 100,44 100,02 100,75 Kết khảo sát độ với lupeol TT Smẫu (mAU.s) 50552 50367 50454 50356 50243 50562 C thêm (µg/ml) S thêm (mAU.s) 65841 65542 65672 65665 65453 66032 7,17 C cũ (µg/ml) 23,76 23,67 23,71 23,66 23,61 23,76 C (µg/ml) 30,95 30,80 30,87 30,86 30,76 31,04 C tìm lại (µg/ml) 7,19 7,14 7,16 7,20 7,15 7,27 Trung bình % tìm lại 100,29 99,54 99,82 100,42 99,77 101,48 100,22 Kết khảo sát độ với taraxeryl acetat TT Smẫu (mAU.s) 24501 24470 24454 24356 24243 24562 C thêm (µg/ml) S thêm (mAU.s) 31100 30942 31172 30865 30753 31132 5,09 C cũ (µg/ml) 18,38 18,36 18,35 18,27 18,18 18,43 C (µg/ml) 23,51 23,39 23,57 23,33 23,24 23,54 C tìm lại (µg/ml) 5,13 5,03 5,22 5,06 5,06 5,11 Trung bình % tìm lại 100,80 98,85 102,61 99,42 99,43 100,35 100,25 Kết khảo sát độ với stigmasterol TT Smẫu (mAU.s) 5370 5340 5325 5456 5343 5362 C thêm (µg/ml) S thêm (mAU.s) 8210 8144 8152 8265 8203 8202 1,92 C cũ (µg/ml) 3,69 3,67 3,66 3,75 3,67 3,68 C (µg/ml) 5,64 5,59 5,60 5,68 5,64 5,63 C tìm lại (µg/ml) 1,95 1,93 1,94 1,93 1,96 1,95 Trung bình C (µg/ml) 24,41 24,63 24,59 24,58 24,64 24,81 C tìm lại (µg/ml) 4,39 4,41 4,38 4,37 4,50 4,47 Trung bình % tìm lại 101,59 100,28 101,11 100,46 102,27 101,58 101,22 Kết khảo sát độ với taraxerol TT Smẫu (mAU.s) 32055 32367 32345 32356 32243 32562 C thêm (µg/ml) S thêm (mAU.s) 39084 39442 39372 39365 39453 39732 4,42 C cũ (µg/ml) 20,02 20,22 20,20 20,21 20,14 20,34 cxlii % tìm lại 99,30 99,94 99,26 99,00 101,84 101,28 100,10 PHỤ LỤC 18 cxliii PHỤ LỤC 18 MỘT SỐ HÌNH ẢNH KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CÁC CHẤT PHÂN LẬP BẰNG SKLM VÀ HPLC  BBV6 BBV6&TP C:M:W T:E:AC:AF (4:1:0,1) (5:3:3:1) C: M (8:3) T:E:AC:AF (5:3:3:1)  BBV7 BBV7&TP H:E (9:1) cxliv C:E:H (19:1:1) C:M (19:1) ... án ? ?Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học số tác dụng sinh học Gạo Bombax malabaricum DC. , họ Gạo Bombacaceae? ?? đƣợc tiến hành với mục tiêu sau: Nghiên cứu đặc điểm thực vật loài Bombax. .. 1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT 1.1.1 Họ Gạo (Bombacaceae L.) 1.1.2 Chi Bombax L 1.1.3 Bombax malabaricum DC (Bombax ceiba L.) 1.2 THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA MỘT SỐ LỒI... đặc điểm thực vật loài Bombax malabaricum DC thu hái Hà Nội Nghiên cứu thành phần hóa học mẫu nghiên cứu Đánh giá độc tính cấp thăm dò số tác dụng sinh học mẫu nghiên cứu Để đạt đƣợc mục tiêu đề