KĨ THUẬT CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU CHỨA ALCALOID - Copy

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI Bộ môn Công Nghiệp Dược TIỂU LUẬN KĨ THUẬT CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU CHỨA ALCALOID DẪN XUẤT CỦA TERPENOID Tổ 4+5 M1K71 Nguyễn Thị Thu Trang Đào Ngọc Toàn Nguyễn Thị Kim Dung Phạm Thị Thư HÀ NỘI - 2020 1601802 1601418 1501106 1501477 ĐẶT VẤN ĐỀ Các chất chuyển hóa thứ cấp thực vật cơng nhận tốt để cung cấp bảo vệ chống lại sinh vật gây hại Các alcaloid nhóm chất chuyển hóa có số lượng đa dạng Chúng sản xuất nhiều loại sinh vật, bao gồm vi khuẩn, nấm, thực vật động vật Tác động tích cực tiêu cực alcaloid nhìn thấy lồi động vật ăn cỏ côn trùng khác Các alcaloid độc hại tự nhiên giúp thực vật, động vật ăn cỏ côn trùng xua đuổi kẻ thù đối thủ cạnh tranh tạo điều kiện cho tồn chúng hệ sinh thái.Ơ đầu- phụ tử vị thuốc quý sử dụng lâu đời Những vị thuốc lấy từ củ lồi thuộc chi Aconitum L ( chi Ơ đầu) Trong Y học cổ truyền nước ta Trung Quốc thường sử dụng rễ củ lồi với tên vị thuốc : Ô đầu ( Củ mẹ ) Phụ tử ( củ con) Phụ tử vị thuốc hồi dương cứu nghịch, khử phong hàn dùng chưa số triệu trứng nguy cấp: truy tim, nhiều mồ hôi, chân tay lạnh giá; vị thuốc quý thành phần hoạt chất alcaloid đặc biệt có tác dụng Aconitin ( Aconite) mesaconitine and hypaconitine có cấu trúc C19 diterpenoid alkaloid Việc chiết xuất hoạt chất nghiên cứu tiềm đem lại lợi ích lớn nhiều lĩnh vực Y học I TỔNG QUAN I.1 Đặc điểm thực vật Ô đầu Nguồn gốc - Cây Ô đầu Việt Nam thuộc chi Aconitum L - Có nguồn gốc nhập nội từ nguồn: Nguồn thứ ngành Y tế thức nhập giống từ trung Quốc trồng Sapa, Lào Cai từ năm 70 kỷ trước sau trồng Bắc Hà, Lào Cai Sin Hồ, lai Châu Nguồn thứ cộng đồng người Hoa huyện Quán Bạ, huyện Đồng Văn, Tỉnh Hà Giang tự nhập giống Ô đầu từ bên biên giới trồng vườn nhà nương rẫy Có tài liệu cho Ô Đầu Việt Nam mọc hoang tỉnh Hà Giang, Lào Cai, Lai Châu, Cao Bằng - Trong tiểu luận tập trung vấn đề Kỹ thuật chiết xuất Alcaloid có cấu trúc Terpen Ô đầu Ứng dụng Y học Theo y học cổ truyền: Cây ô đầu từ trước tới chủ yếu dùng phần củ mẹ (ô đầu) củ (phụ tử) - Ơ đầu Cơng năng: Khu phong, trừ thấp tý, ôn kinh thống Chủ trị: dùng trị đau khớp, tê mỏi Cách dùng, liều lượng: dùng ngồi xoa bóp dạng thuốc ngâm rượu, khơng uống - Phụ tử Công năng: Hồi dương cứu nghịch, bổ hòa trợ dương, tán hàn, thống Chủ trị: Chứng vong dương, thoát dương, chân tay lạnh, đau nhức xương khớp, lưng gối đau lạnh, chân tay tê phù Cách dùng, liều lượng: Ngày dùng 4-12g dược liệu bào chế đật tiêu chuẩn giới hạn aconitin, dạng thuốc sắc - Tác dụng Dược lý nghiên cứu: Dịch chiết, chất phân lập từ củ Ô đầu thử nghiệm có nhiều tác dụng như: tác dụng giảm đau, gây hạ đường huyết, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, chống tăng sinh tế bào, chống hạ thân nhiệt, chống viêm, chống động kinh,…( thích nguồn) Thành phần hoạt chất chi Aconitum L - Căn vào cấu trúc khung diterpenoid, số lượng nguyên tử C chia alcaloid thành nhóm chính: • Khung C18-diterpenoid alcaloid • Khung C19-diterpenoid alcaloid • Khung C20-diterpenoid alcaloid • Nhóm Bisditerpenoid • Nhóm alcaloid khác: • Dựa vào số liên kết ester với khung diterpenoid: alcaloid diester, alcaloid monoeste, alcaloid alkamin[2] • Trong tiểu luận tập trung vấn đề Kỹ thuật chiết xuất Alcaloid có cấu trúc Terpen chi Ô đầu I.2 Cấu trúc, tác dụng sinh học số hoạt chất Ơ Đầu Aconitine ( Aconitin) Tính chất hóa lý (11) - Chất bột màu trắng hay trắng ngà - Nhiệt độ nóng chảy : 204oC, nhiệt độ sôi: 675 oC - pKa: 5.88 25 oC - Dạng tự tan nước, tan tốt dung môi hữu Benzen, CHCl3, EtOH… Cịn dạng muối tan tốt nước số dung môi phân cựu lại khó tan gây tủa dung mơi hữu - Aconitine có hiệu mở kênh natri để bắp tế bào thần kinh cách khơng hồi phục Do đó, aconitine tạo chứng rối loạn nhịp thất tim dẫn đến tử vong Nó vượt qua hàng rào máu não tạo hiệu ứng thần kinh.(Aconitine, n.d.) - Aconite chiết xuất thô rễ khơ từ nhiều loại Aconitum L có chứa thành phần Aconitine alcaloid ester diterpenoid khác (benzoylaconitine, mesaconitine, jesaconitine, hypaconitine) Aconite loại thuốc dược liệu sử dụng từ lâu thông qua nghiên cứu mũi tên độc Việc sử dụng Aconite gây tử vong thời cổ đại với biểu đột quỵ, đau đớn thể xác ngộ độc aconite gây tử vong Các học viên truyền thống Trung Quốc sử dụng aconite để giảm đau đau dây thần kinh sinh ba dây thân kinh liên sườn; điều trị thấp khớp, đau nửa đầu Aconite ban đầu kích thích sau dây thần kinh para-lyze giao tiếp với đau, chạm nhiệt độ, gây mê trung gian nhiều ancaloid khác ngăn chặn dòng natri qua kênh natri - Aconitine alkaloid liên kết với lực cao với protein vận chuyển Natri “kênh Na+” Sự gắn kết aconitine với kênh Na + mở làm thay đổi phụ thuộc điện áp màng tế bào Do đó, aconitine ban đầu kích thích sau kích hoạt kênh natri tham gia tạo điện màng tế bào tim hệ thần kinh, dẫn đến vào lan truyền điện hoạt động Aconite sử dụng loại thuốc trị ho nhẹ làm chậm nhịp tim tác dụng trung tâm não Tuy nhiên, rung tâm nhĩ tâm thất kết tác động trực tiếp aconite lên tim Tác dụng phụ xảy tiếp xúc với nhựa từ Aconitum, làm nhịp tim chậm hạ huyết áp đến rối loạn thất (Aconitine, n.d.) Hypaconitine, Mesaconitine (Cheng Hao & Gen Xiao, n.d.) - Aconitine, hypaconitine, mesaconitine oxonitine, phân lập từ Aconitumcarmichaelii, tìm thấy có khả ức chế mạnh mẽ phát triển dòng tế bào HepG2(Donato et al., 2015) cho thấy có mặt số lượng nhóm ester có ảnh hưởng lớn đến chất cytoid (Gao et al., 2012) Hai alcaloid amide Aconitum taipeicum thể hoạt động ức chế tăng trưởng tế bào đáng kể chống lại tế bào ung thư bạch cầu HL-60 so với Adriamycin (Xu et al., 2010b), chúng cho thấy hoạt động chống ung thư chống lại tế bào K562.(Cheng Hao & Gen Xiao, n.d.) II Phương pháp chiết xuất tinh chế: II.1 Phương pháp chiết xuất tinh chế của tác giả Hikino (Hikino et al., 1983) PP Hikino gọi PP cổ điển a PP chiết xuất - Phương pháp Ammoniac Chloroform , phương pháp Ammoniac Ether phương pháp Ammoniac Metanol : Mẫu khoảng g khuấy trộn với dung môi hữu (60 ml) chứa 5% dung dịch NH3 (5 ml) nhiệt độ phòng khoảng 30 phút 24 Pha lỏng lọc cặn chiết thêm lần theo cách với dung môi (mỗi lần 60 ml) Lấy phần dịch lọc dịch rửa đem bay đến khô áp suất giảm nhiệt độ không 40 °C - Phương pháp ethanol phương pháp axit chlohydric: Mẫu (5g) chiết xuất lần với metanol HCl N ống (60 ml) nhiệt độ phòng 24 lần Pha lỏng lọc, kết hợp dịch rửa sau đem bay áp suất giảm nhiệt độ 40 °C - Phương pháp ether-metanol- ammoniacal: Mẫu g chiết liên tiếp lần với ether ammoniac (mỗi lần 60 ml) 30 phút lần sau với metanol liên tiếp lần (mỗi lần 100 ml), lần 16 hai lần sau Kết hợp phần dịch chiết thu được, đem bay đến trạng thái khô áp suất giảm nhiệt độ không 40 °C b Phương pháp tinh chế alkaloid: - Phương pháp phân vùng chloroform phân vùng dichloromethane: Chiết xuất Metanol điều chế trên(575mG) ( Chú thích ), tương đương với g dược liệu thơ, bị hịa tan CHCI3 CH2Cl2 (20 ml) chiết lần với 5% HCI (mỗi lần 15 ml) Gom dịch chiết acid thu sau trung hịa tạo dung dịch kiềm có pH= 10 dung dịch NH3 25% Sau tiến hành chiết lần với CHCI3 CH2CI2 (mỗi lần 20 ml) Pha hữu rửa lần nước bay đến khô - Phương pháp sắc ký Celite sắc ký alumina: Dịch chiết methanol từ lượng dược liệu tương ứng với g dược liệu thô trộn với celite (hai lần trọng lượng), đặt đỉnh cột celite-alumina (10 g) rửa giải liên tiếp benzen (100ml), AcOt - MeOH (7: 3, 200 ml) MeOH (100 ml) Tách riêng phần dịch đem cô cắn (Hlkino et al., 1983) II.2 Phương pháp chiết xuất tinh chế alkaloid tác giả Zhi-Hong Jiang Hai mươi lô rễ aconite chế biến chưa qua chế biến thu thập từ thị trường dược liệu ởTrung Quốc mô tả Bảng Trừ khác-khôn ngoan tuyên bố, dược liệu nghiền thành loại bột, rây qua sàng 0,45 mm lưu trữ bình hút ẩm cần dùng thử Cân xác (c.a 0,5 g) mẫu chiết xuất nhiệt độ phòng ba lần (mỗi lần 30 phút) với3.0 mL ethanol 75% với trợ giúp mơ hình Branson Máy siêu âm 5210 (CT, Hoa Kỳ), sau trộn xốy ( vortex-mixed) phút Hỗn hợp ly tâm tốc độ 3000 vòng / phútsử dụng máy ly tâm mơ hình Eppendorf 5810 (Hamburg,Đức) phút Các chất trội (supernatants) kết hợp, bay luồng khơng khí đến khoảng mL, đưa vào bình định mức 2.0mL,pha lỗng với 75% ethanol đến thể tích trộn Khi chuẩn bị dung dịch mẫu rễ aconite chưa qua chế biến , ml dung dịch hỗn hợp pha loãng thêm đến 10 mL với 75% ethanol trộn Tất dung dịch sản phẩm lọc thơng qua ống tiêm lọc 0,45µm lọc đưa vào HPLC hệ thống phân tích II.3 Phương pháp chiết xuất tinh chế alkaloid tác giả Ning Xu (Aconiti Kusnezoffii Radix (unprocessed), n.d.) Đối tượng: Loài Aconitum kusnezoffii Reichb., Thuộc chi Aconitum L., phân bố tỉnh Tân Cương, Tứ Xuyên Cát Lâm Trung Quốc • Quy trình chiết Alkaloid tồn phần: Bột Rễ khơ khử Oxy EtOH 12 Sau cất loại bỏ dung môi chân không nhiệt độ 45 ºC; phần cắn đưa vào nhựa hấp thụ X-4 rửa giải hấp thụ H2O theo thứ tự 30%, 50% 100% EtOH (v/v, H2O-EtOH).Dịch rửa giải EtOH tách sắc ký cột Silica gel với dung môi pha động Dầu mỏ / EtOAc (v / v, 5: 1), EtOAc EtOH cho kết thu phần • Tinh chế Alkaloid : Phần số xử lý phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC Kết thu tách hoạt chất là: 1,15dimethoxy-3-hydroxy-14-benzoyl-16-ketoneoline, benzoylaconine aconitine II.4 Phương pháp chiết xuất tinh chế alkaloid tác giả Phan Thị Thu Huyền - Đối tượng Cây ô đầu trồng / mọc hoang huyện Quán Bạ tỉnh Hà Giang; phận sử dụng củ mẹ củ hoa lụi, lấy Nguyên liệu sấy khô 60oC, bảo quản túi polyethylen kín, khơ + Quy trình chiết xuất Alkaloid tồn phần: Bột phụ tử xay khơ, sấy khô nhiệt độ 60oC ngâm chiết ethanol 96% lần liên tiếp Dịch chiết tổng loại cặn lọc qua giấy lọc sau đem cất thu hồi dung môi áp suất giảm thu cao chiết ethanol Cắn ethanol phân tán vào nước, kiềm hóa dung dịch NH3 đặc lắc chiết phân đoạn với n-Hexan lần liên tiếp Dịch chiết n-Hexan cần thu hồi dung môi áp suất giảm thu cao chiết n-Hexan, tiếp tục bếp cách thủy đến cắn + Quy trình tinh chế alkaloid từ cao chiết alkaloid toàn phần : Cao chiết n-Hexan hịa tan dung mơi rửa giải N-Hexan:EtOAc có độ phân cực tăng dần ( 100:0, 80:20, 50:50,nhỏ từ từ dịch lên cột tránh làm xáo trộn lớp Silicagel Bằng phản ứng hóa hoc cho thấy phân đoạn D có phản ứng dương tính rõ với thuốc thử chung alkaloid, tiến hành trình phân lập phân đoạn D kết thu hợp chất đặt tên OD7 OD8 Thông qua phương pháp định tính alkaloid phối khổi ESI-MS… xác định OD7 benzoylmesaconitin OD8 Fuzilin II.5 Một số phương pháp khác a Phương pháp chiết xuất Alkaloid toàn phần: - Theo dược điển HongKong ( đề cập đến phương pháp chiết alkaloid toàn phần để sử dụng cho định lượng )(Hlkino et al., 1983) Áp dụng cho dược liệu : Aconiti Kusnezoffii (Radix) Quy trình : Cân xác 0,5 g mẫu bột dược liệu đặt vào ống ly tâm 50 ml, sau thêm mL dung dịch amoni hydroxit (9,1%, klg/v) 20 ml hỗn hợp isopropanol ethyl acetate (1: , v/v) Đậy nắp ống Siêu âm hỗn hợp 30 phút bể nước đá Sau Ly tâm khoảng 3000 × g 10 phút Lọc chuyển dịch lọc sang bình cầu đáy trịn 250 ml Rửa cặn ba lần lần 10 ml hỗn hợp isopropanol ethyl acetate (1: 1, v / v) Kết hợp dịch rửa dịch lọc Làm bay dung môi đến khô 40 CC áp suất giảm thiết bị bay Hòa tan cặn ml axit clohydric 0,01% metanol Chuyển dung dịch vào bình định mức ml tạo thành vạch axit clohydric 0,01% metanol Lọc qua lọc nylon 0,45mcm III Kết III.1 Đánh giá hiệu phương pháp chiết xuất tinh chế a Hiệu phương pháp chiết xuất: Trong phương pháp chiết xuất tác giả Hikino, kết thể Bảng II III, chứng minh hiệu suất chiết alcaloid đạt đến mức tối đa không tăng thêm số lượng thời gian chiết xuất Dựa phát trên, người ta kết luận thu kết khả quan cách áp dụng quy trình sau: Một loại thuốc thơ dạng bột chiết xuất với ether ammoniacl lần 30 phút sau với metanol lần 16 (qua đêm) hai lần lần Dịch chiết thu được sắc ký alumina trung tính phần rửa giải ethyl acetate-methanol (7: 3) HPLC Trong trình này, hiệu suất thu hồi aconitine bezoylaconine tìm thấy 82,0±2,7% (n = 3) 71,1±2,8% (n =3) Trong phương pháp chiết xuất tác giả Zhi-Hong Jiang Bản chất dung môi ảnh hưởng đáng kể đến chiết xuất; đó, hiệu suất chiết xuất ba dung dịch ethanol nồng độ khác cần khảo sát Nồng độ Hypaconitine rễ aconite chế biến chiết xuất với 75% ethanol 50,72 ± 0,04 µg/g, với 50% ethanolnó 49,12 ± 0,15 µg/g với 95% ethanol, 6,32 ± 0,11 µg/g Do đó, 75% ethanol chọnlàm dung môi chiết.Thời gian khai thác số lần chiết hai yếu tố ảnh hưởng đến hiệu chiết Trong nghiên cứu, thời gian chiết xuất 30 60 phút thử nghiệm kết tương ứng nồng độ aconitine , Mesaconitine Hypaconitine xác định (Bảng 3) Do đó, 30 phút chọn thời gian chiết Hơn nữa, số lần chiết khác (ba năm lần) so sánh, lần nữa, khơng có khác biệt đáng kể phát (Bảng 3).Để đơn giản hóa quy trình trích xuất, lần chiết chọn So với cổ điển phương pháp (Hikino et al , 1983; Nose et al , 2001), phát triển phương pháp cung cấp giá trị cao đáng kể nồng độ aconitine , Mesaconitine Hypaconitine thấy Bảng Sau so sánh hiệu khai thác xác định sử dụng dung môi chiết khác nhau, thời gian chiết số lần lặp lại, kết thu chiết xuất dược liệu bột cách siêu âm ba lần 30 phút với ethanol 75% b Hiệu phương pháp tinh chế: Trong phương pháp tinh chế Hikino, sử dụng alumina trung tính có bán thị trường điều chế cách rửa alumina kiềm ethyl acetate, alcaloid aconitine rửa giải phần ethyl acetate methylmetanol (7: 3) giá trị phân tích cao phương pháp khác.Hiệu suất thu hồi aconitine tìm thấy 64,0±5,6% cho alumina alkaline (n = 3), 94,9± 4,4% alumina rửa ethyl acetate (n = 3) 90,7± 3,5% alumina trung tính có bán thị trường (n=3) Do phương pháp sắc ký alumina rửa etyl axetat cho thấy hiệu tinh chế cao cho giá trị phân tích cao III.2 Phân tích yếu tố ảnh hưởng Mặc dù có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới trình chiết, tiểu luận đề cập tới yếu tố khảo sát +Dung môi, pH: tỉ lệ dung mơi/ dược liệu ảnh hưởng đến q trình chiết Tỉ lệ dung mơi thích hợp cho hiệu suất chiết cao Dùng q nhiều dung mơi khiến dịch chiết lỗng, khó thu sản phẩm +Thời gian chiết: thời gian chiết ngắn không chiết kiệt hoạt chất khuếch tán hoạt chất chưa đạt tới cân bằng, chiết lâu tỷ lệ tạp tăng +Số lần chiết: nghiên cứu chọn điều kiện chiết tối ưu chiết lần; chiết lần không khác biệt nhiều so với chiết lần Tuy nhiên kết nghiên cứu, nguồn nguyên liệu, độ xác phương pháp đánh giá chiết xuất ảnh hưởng tới giá trị phần trăm hoạt chất Tài liệu tham khảo - Tài liệu tiếng Việt Phan Thị Thu Huyền.(2014) Nghiên cứu chiết xuất phân lập Alcaloid từ Ô Đầu trồng tỉnh Hà Giang, khóa luận tốt nghiệp dược sĩ Bùi Hồng Cường, phùng Hịa Bình, Nguyễn Trọng Thông (2010), Phụ tử vị thuốc quý phương pháp chế biến an toàn hiệu quả, Nxb Khoa học Kỹ thu - Tài liệu nước Aconiti Kusnezoffii Radix (unprocessed) (n.d.) Aconitine (n.d.) http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Aconitum_variegatum_110807f.jpg Cheng Hao, D., & Gen Xiao, P (n.d.) Mesaconitine Chemical and biological studies of Aconitum pharmaceutical resources Donato, M T., Tolosa, L., & Gómez-Lechón, M J (2015) Culture and functional characterization of human hepatoma HepG2 cells In Protocols in In Vitro Hepatocyte Research (pp 77–93) Springer New York Hlkino, H., Murakami, M., Konno, C., & Watanabe, H (1983) Determination of Aconitine Alkaloids in Aconitum Roots1 (Vol 48) Xu, N., Zhao, D F., Liang, X M., Zhang, H., & Xiao, Y S (2011) Identification of diterpenoid alkaloids from the roots of Aconitum kusnezoffii Reihcb Molecules, 16(4), 3345–3350 Donato M, Tolosa L, Gómez-Lechón MSpringer New York, (2015), 77-93 Culture and functional characterization of human hepatoma HepG2 cells 10 Cheng Hao D, Gen Xiao P, Mesaconitine Chemical and biological studies of Aconitum pharmaceutical resources 11 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16315485 Zhi-Hong Jiang, Ying Xie,Hua Zhou, Jing-Rong Wang, Zhong-Qiu Liu, Yuen-Fan Wong,1 Xiong Cai, Hong-Xi Xu and Liang Liu (2005) Quantification of Aconitum Alkaloids in Aconite Roots by a Modified RP-HPLC Method 12 https://www.chemicalbook.com/ChemicalProductProperty_EN_cb1343300.htm DANH SÁCH THÀNH VIÊN NHÓM TIỂU LUẬN CHỦ ĐỀ SỐ 14 STT Họ tên Đào Ngọc Toàn MSV Lớp Cơng việc 1601785 M1K71 Tìm chất, tìm tài liệu, Nội dung phần I Nguyễn Thị Thu Trang 1601802 M1K71 Tìm tài liệu Tiếng Anh, nội dung phần II.1, II.2., III.1 , III.2 Chia tài liệu cho bạn đọc Chỉnh sửa hình thức, bìa tiểu luận Nguyễn Thị Kim Dung 1501106 M1K71 Tìm tài liệu, nội dung phần II.3, II.4 Phạm Thị Thư 1501477 M1K71 Tìm tài liệu ... hoạt chất là: 1,15dimethoxy-3-hydroxy-14-benzoyl-16-ketoneoline, benzoylaconine aconitine II.4 Phương pháp chiết xuất tinh chế alkaloid tác giả Phan Thị Thu Huyền - Đối tượng Cây ô đầu trồng... • Nhóm alcaloid khác: • Dựa vào số liên kết ester với khung diterpenoid: alcaloid diester, alcaloid monoeste, alcaloid alkamin[2] • Trong tiểu luận tập trung vấn đề Kỹ thuật chiết xuất Alcaloid. .. Aconitum L - Căn vào cấu trúc khung diterpenoid, số lượng nguyên tử C chia alcaloid thành nhóm chính: • Khung C18-diterpenoid alcaloid • Khung C19-diterpenoid alcaloid • Khung C20-diterpenoid alcaloid