Nghiên cứu tính đa hình di truyền và vai trò truyền bệnh của các thành viên trong nhóm loài anopheles maculatus ở việt nam

Nghiên cứu tính đa dạng và hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi Ba bét Mallotus Lour họ Thầu dầu Euphorbiaceae ở Việt Nam Nghiên cứu tính đa dạng và hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi Ba bét Mallotus Lour họ Thầu dầu Euphorbiaceae ở Việt Nam Nghiên cứu tính đa dạng và hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi Ba bét Mallotus Lour họ Thầu dầu Euphorbiaceae ở Việt Nam Nghiên cứu tính đa dạng và hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi Ba bét Mallotus Lour họ Thầu dầu Euphorbiaceae ở Việt Nam Nghiên cứu tính đa dạng và hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi Ba bét Mallotus Lour họ Thầu dầu Euphorbiaceae ở Việt Nam

Đại học quốc gia Hà Nội Tr-ờng Đại học khoa học tự nhiên Nguyễn Thị H-ơng Bình Nghiên cứu tính đa hình di truyền vai trò truyền bệnh thành viên nhóm loài Anopheles maculatus việt Nam Luận án tiến sỹ sinh học Hà Nội 2009 Đại học quốc gia Hà Nội Tr-ờng Đại học khoa học tự nhiên Nguyễn Thị H-ơng Bình Nghiên cứu tính đa hình di truyền vai trò truyền bệnh thành viên nhóm loài Anopheles maculatus việt Nam Chuyên ngành: Di truyền học Mà số: 62.42.70.01 Ln ¸n tiÕn sü sinh häc Ng-êi h-íng dÉn khoa học: PGS TS Trịnh Đình Đạt Tr-ờng Đại học Khoa học Tự nhiên TS Trần Đức Hinh Viện sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng Trung -ơng Hà Nội – 2009 Mơc lơc Trang Trang phơ b×a Lêi cam đoan Mục lục Danh mục ký hiệu chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình vẽ, đồ thị Mở đầu Ch-ơng : Tổng quan tài liệu 1.1 Đại c-ơng vấn đề nghiên cứu loài đồng hình 1.2 Đa hình di truyền nghiên cứu đa hình di truyền muỗi 1.2.1 Đa hình enzym ứng dụng để nghiên cứu đa hình di truyền muỗi 1.2.2 Di truyền tế bào ứng dụng nghiên cứu đa hình di truyền 13 1.2.3 Đại c-ơng PCR ứng dụng nghiên cứu đa hình di truyền muỗi 19 1.3 Những nghiên cứu vai trò truyền bệnh tính -a vật chủ vectơ 35 1.3.1 Những nghiên cứu vai trò truyền bệnh sốt rét muỗi 35 1.3.2 Xác định tính -a vật chủ vectơ 35 1.4 Những nghiên cứu vỊ nhãm loµi An maculatus 36 1.4.1 Những nghiên cứu n-ớc 37 1.4.2 Nghiªn cøu n-íc 41 Ch-ơng : Đối t-ợng ph-ơng pháp nghiên cứu 43 2.1 Đối t-ợng nghiªn cøu 43 2.2 Thời gian nghiên cứu, địa ®iĨm nghiªn cøu 43 2.3 Ph-ơng pháp nghiên cứu 43 2.3.1 Ph-ơng pháp thu thập xử lý mẫu vật thực địa 45 2.3.2 Nghiên cứu phòng thÝ nghiÖm 45 Ch-ơng : Kết nghiên cứu 60 §a hình dấu hiệu kiểu hình thành viên nhãm loµi An maculatus 60 3.1.1 §a hình dấu hiệu hình thái thành viên nhãm loµi An maculatus 60 3.1.2 Đa hình di truyền dấu hiệu sinh học, sinh thái học thành viên nhóm loài An maculatus 80 3.2 Đa hình di truyền tế bào dấu hiệu kiểu gen thành viên nhóm loµi An maculatus 89 3.2.1 Đa hình dấu hiệu di truyền tế bào thành viên nhóm loµi An maculatus 89 3.2.2 Đa hình di truyền đặc điểm điện di enzym thành viên nhóm loài An maculatus 92 3.2.3 Kết phân tích đa hình dựa vào thị PCR-RFLP nhãm loµi An maculatus 112 3.2.4 KÕt qu¶ đánh giá đa hình di truyền thành viên nhóm loài An maculatus dựa vào thị RAPD 116 3.2.5 Định loại thành viên nhóm loài An maculatus PCR ®a måi 126 3.2.6 KÕt đánh giá đa hình di truyền thành viên nhóm loài An maculatus dựa vào kết giải trình tự đoạn ITS2 128 3.3 Thành phần loài phân bố thành viên nhãm loµi An maculatus 135 3.3.1 Bảng định loại thành viên đà xác định tên nhãm loµi 135 An maculatus 135 3.3.2 Phân bố thành viên nhóm loài An maculatus 137 3.4 Vai trò truyền bệnh thành viên nhóm loài An maculatus 141 Ch-ơng 4: Bàn luận 144 4.1 Đa hình di truyền mối quan hệ di truyền thành viên nhóm loài An maculatus 144 4.1.1.Đa hình dấu hiệu kiểu hình thành viên nhóm loài An maculatus 144 4.1.2 Đa hình di truyền dấu hiệu kiểu gen thành viên nhóm loài An maculatus ë ViÖt Nam 155 4.2 Thành phần loài phân bố thành viên nhóm loài An maculatus 161 4.2.1 Xây dựng bảng định loại thành viên đà đ-ợc định tên nhóm loài An maculatus ViÖt Nam 161 4.2.2 Phân bố thành viên nhóm loài An maculatus 162 4.3 Vai trß trun bệnh thành viên nhóm loài An maculatus 163 KÕt luËn 164 Các công trình tác giả liên quan đến luận án đà công bố 167 NHững đóng góp cđa ln ¸n 168 tài liệu tham khảo 169 Phô lôc 189 -1- Đặt vấn đề Những nghiên cứu côn trùng truyền bệnh, có muỗi Anopheles, trung gian truyền bệnh sốt rét ngày đ-ợc đẩy mạnh ph-ơng diện: phân loại, phân bố, vai trò truyền bệnh, sinh học, tập tính biện pháp phòng chống Nhiều ph-ơng pháp kỹ thuật, nghiên cứu nhằm phân loại xác định nguồn gốc phát sinh đ-ợc ứng dụng mạnh Việc kết hợp ph-ơng pháp nghiên cứu truyền thống với ph-ơng pháp sinh học phân tử cần thiết để nghiên cứu quần thể muỗi truyền bệnh Nhiều loài muỗi lúc đầu đ-ợc xác định nh- loài đơn, nh-ng trình nghiên cứu sâu vai trò dịch tễ, đặc tính sinh học việc sử dụng kỹ thuật mới, ¸p dơng c¸c dÊu hiƯu nhËn biÕt vỊ di trun, hoá sinh đà xác định chúng nhóm loài đồng hình (sibling species complex, cryptic species complex), v chúng có vai trò truyền bệnh khác Loài muỗi Anopheles (Cellia) maculatus đ-ợc Theobald phát Hồng Kông, Trung Quốc vào năm 1901 Đây loài muỗi phân bố rộng rÃi vùng Đông ph-ơng Cho ®Õn nay, phøc hỵp An maculatus gåm Ýt nhÊt 12 loài thành viên Nhiều thành viên nhóm đà đ-ợc xác định có vai trò truyền bệnh Malaysia, Th¸i Lan, Nepal, Trung Qc, Singapore ë ViƯt Nam, tr-íc đây, muỗi Anopheles maculatus đ-ợc xác định loài đơn, phân bố rộng rÃi vùng rừng núi toàn quốc Những nghiên cứu gần hình thái, tế bào cho thấy phức hợp loài gồm loài đà đ-ợc định tên số dạng ch-a xác định rõ vị trí phân loại Đến loài An maculatus đ-ợc coi vectơ truyền bệnh thø u ë n-íc ta NhiỊu vÊn ®Ị mang tÝnh hệ thống liên quan đến phân loại, vai trò truyền bệnh loài muỗi Việt Nam cần đ-ợc giải Với lý nêu tiến hành đề tài :Nghiên cứu tính đa hình di truyền vai trò truyền bệnh thành viên nhãm loµi Anopheles maculatus ë ViƯt Nam” nh»m mơc đích : Xác định thành phần loài phân bố thành viên phức hợp loài An maculatus Việt Nam Xác định tính đa hình di truyền mối quan hệ di truyền thành viên phức hợp loài Xác định vai trò truyền bệnh chúng nhằm góp phần vào việc phòng chống vectơ sốt rét n-ớc ta Những đóng góp mặt khoa học ý nghĩa thực tiễn luận án 1- Lần đà phối hợp nhiều kiểu dấu hiệu từ dấu hiệu hình thái kiểu hình đến dấu hiệu di truyền tế bào, điện di enzym phân tích phân tử ADN để nghiên cứu nhóm loài đồng hình có vai trò truyền sốt rét Việt Nam xác định mối quan hệ di truyền thành viên nhóm loài An maculatus 2- Lần đà xây dựng đ-ợc bảng định loại hình thái đầy đủ pha phát triển thành viên, đà định tên nhóm loài An maculatus lập đồ phân bố chúng Việt Nam 3- Đà bổ sung thêm đặc điểm đa hình sinh học, sinh thái học muỗi bọ gậy thành viên nhóm loài An maculatus Việt Nam 4- Đà xác định đ-ợc khả truyền hai loài KST P.falciparum P.vivax muỗi An maculatus Cấu trúc luận án Luận án có 188 trang (không kể phụ lục) bao gồm phần: Đặt vấn đề (3 trang); ch-ơng 1: Tổng quan tài liệu (40 trang); ch-ơng 2: Đối t-ợng ph-ơng pháp nghiên cứu (17 trang); ch-ơng 3: Kết nghiên cứu (83 trang); ch-ơng 4: Bàn luận (20 trang); Kết luận đề nghị (3 trang); công trình đà công bố tác giả có liên quan đến nội dung luận án (1 trang); đóng góp luận án (1 trang); tài liệu tham khảo (20 trang, gåm 27 tµi liƯu tiÕng viƯt, 192 tµi liệu tiếng Anh, tài liệu tiếng Pháp) phụ lục (32 trang) Luận án đ-ợc trình bày với 33 bảng, 72 hình Ch-ơng (3 hình), ch-ơng (8 bảng, hình), ch-ơng (25 bảng, 63 hình) Phụ lục (10 bảng) Ch-ơng 1: tổng quan tài liệu 1.1 Đại c-ơng vấn đề nghiên cứu loài đồng hình Nhiều loài muỗi vectơ truyền bệnh sốt rét tồn nh- thành viên phức hợp loài, có loài truyền bệnh loài vai trò (Torres cs, 2000; Van Bostel cs, 2001) Để nghiên cứu phức hợp loài đồng hình đòi hỏi phải áp dụng nhiều ph-ơng pháp khác từ đơn giản đến phức tạp để kết hợp đ-ợc -u điểm ph-ơng pháp (Cockburn, 1997) 1.2 Đa hình di truyền nghiên cứu đa hình di truyền muỗi Tính đa hình di truyền đ-ợc xác định cấp độ tổ chức bao gồm từ số l-ợng nucleotit đến cấu trúc ADN tế bào nh- số l-ợng, cấu trúc nhiễm sắc thể, protein, hay hình thái thể loài điều kiện tự nhiên khác 1.2.1 Đa hình enzym ứng dụng để nghiên cứu đa hình di truyền muỗi: Hiện t-ợng đa hình izozym tự nhiên kết đột biến gen cấu trúc locut kiểm soát việc tổng hợp sản phẩm gen, cã tÝnh øng dơng cao, cung cÊp nh÷ng sè liƯu có giá trị cho nghiên cứu Anopheles Những dấu hiệu đa hình di truyền đà đ-ợc phát hầu hết loài Anopheles loài đồng hình Có nhiều nhóm loài, phức hợp loài đà đ-ợc nghiên cứu ph-ơng pháp nh-: An minimus, An dirus Châu á, An quandrimaculatus ë -2Nam Mü, An gambiae, An funestus ë ch©u Phi…( Coluzzi vµ cs, 1977; Narang vµ cs, 1989; Sylvie Marguin vµ cs, 1998…) 1.2.2 Di trun tÕ bµo vµ øng dụng nghiên cứu đa hình di truyền: Ph-ơng pháp di truyền tế bào tập trung vào nghiên cứu nhiễm sắc thể tế bào: nhiễm sắc thể khổng lồ (polytene chromosome) nhiễm sắc thể kỳ nguyên phân (karyotype) Di truyền tế bào hữu ích việc phân biệt loài đồng hình phức hợp loài An gambiae (Coluzzi 1968, Green 1972), An culicifacies (Green & Miles 1980; Subbarao vµ cs 1983) vµ An maculatus (Green cs 1985) Tần số đảo đoạn nhiễm sắc thể đ-ợc sử dụng để nghiên cứu cấu trúc quần thể (Taylor cs., 1993; Petrarca cs, 2000; Kamau cs, 2002) 1.2.3 Đại c-ơng PCR ứng dụng nghiên cứu đa hình di truyền muỗi - Phản ứng PCR: Phản ứng PCR có ứng dụng hiệu để nghiên cứu khác mức độ phân tử, xác định xác quan hệ tiến hoá loài Các nhóm loài muỗi truyền bệnh quan trọng đà đ-ợc sử dụng phản ứng PCR để định loại nh-: An gambiae (Scott, 1993); An quandrimaculatus (Collins vµ cs 1996), An dirus (Jian vµ Feng, 1997); An sinensis (Ma Yajunvµ cs, 1998), An funestus (Kaumau, 2002; Anna Cohuet vµ cs, 2003) - Kỹ thuật RAPD-PCR ứng dụng RAPD- PCR nghiên cứu đa hình muỗi : Kỹ thuật RAPD sử dụng mồi ngẫu nhiên tạo đoạn nhân đa hình Chỉ thị RAPD đ-ợc dùng để phân tích xác định mối quan hệ quần thể, loài sinh vật Wilkerson cs (1993) đà sử dụng RAPD-PCR để phân biệt loài muỗi phức hợp Anopheles gambiae An gambiae An arabiensis Phức hợp loài An dirus đ-ợc Sylvie Manguin cs (2002) phân biệt nhờ sử dụng kỹ thuật RAPD - Đại c-ơng PCR- RFLP ứng dụng PCR- RFLP nghiên cứu đa hình muỗi: Phân tích PCR- RFLP dựa nguyên tắc khác kích th-ớc phân đoạn đ-ợc tạo xử lý enzym giới hạn đoạn ADN đích đà đ-ợc nhân RFLP-PCR đ-ợc sử dụng để phân biệt loài phức hợp An.maculipennis Anh An maculatus nhận biết đ-ợc dùng enzym HaeII cắt đoạn ITS2 (Torress cs, 2000) Favia cs (1997) phân biệt dạng An gambiae PCR-RFLP - Kỹ tht sư dơng mÉu dß ADN (DNA - probe): Sư dụng mẫu dò ADN dùng phân loại loài vectơ sốt rét dựa đặc tính bắt cặp bổ sung nucleotit Các dòng mẫu dò ADN để phân biệt đ-ợc loài thuộc phức hợp Anopheles gambiae (Collins cs, 1987) - Kỹ thuật đa hình cấu tạo sợi đơn (Single strand conformational polymorphism-SSCP): Kỹ thuật phát điểm đột biến sản phẩm phản ứng PCR Sharpe cs (1999) dùng SSCP để phân loại loài thuộc series Myzomyia An aconitus, An varuna vµ An minimus - Kü thuËt khuếch đại allen đặc biệt (Allene-specific amplification-ASA) Dựa vào thiết kế mồi bắt cặp với allen định allen đặc tr-ng cho loài Walton cs (1999), Manguin cs (2002) nghiên cứu phức hợp loài An dirus ASA Năm 1999, Sharp cs đà phân biệt loài series Myzomyia ASA - Microsattellite ADN-SSR: Microsattellite đà đ-ợc chứng minh đặc biệt hữu ích cho việc nghiên cứu di truyền quần thể lập đồ di truyền châu , Rongnoparus cs (1996, 1999) đà phân tích locut An maculatus Nam Mỹ, Conn cs (2001) đà mô tả tính chất locut đa hình muỗi An.darlingi châu Phi, Sharakhov cs (2001) đà mô tả tính chất 31 locut An.funestus - Ph-ơng pháp giải trình tự: Giải trình tự ADN trình xác định trật tự nucleotit đoạn ADN định Các đoạn gen đ-ợc giải trình tự nhiều muỗi IST1, IST2, COI COII nh- D3 Việc giải mà toàn bé hƯ gen An gambiae, vect¬ trun bƯnh sèt rÐt Châu Phi đà đ-ợc bắt đầu vào năm 2001 Tháng 5/2007 nhà khoa học đà phác thảo xong trình tự gen muỗi Aedes aegypti, vectơ trun bƯnh sèt dengue, dengue xt hut, sèt vµng 1.3 Những nghiên cứu vai trò truyền bệnh tính -a vật chủ vectơ 1.3.1 Những nghiên cứu vai trò truyền bệnh sốt rét muỗi Để chứng minh vai trò truyền bệnh vectơ ng-ời ta phải chứng minh đ-ợc chúng có mang vật gây bệnh Có nhiều ph-ơng pháp để chứng minh điều nh-: mổ muỗi phát thoa trùng (Ronal Ross, 1901) Kỹ thuật miễn dịch liên kết enzym (ELISA) kỹ thuật PCR 1.3.2 Xác định tính -a vật chủ vectơ Một biện pháp để chứng minh đ-ợc loài muỗi có truyền bệnh hay không xem muỗi có hút máu ng-ời hay không Nếu xác định đ-ợc loài muỗi có tính -a thích vật chủ ng-ời có chứng để nghĩ tới loài muỗi có khả truyền bệnh cho ng-ời nhiều loài khác không thích đốt máu ng-ời Ph-ơng pháp miễn dịch, xác định máu vật chủ thạch; năm 1986, Bukort cs, đà áp dụng ph-ơng pháp ELISA; gần sử dụng kỹ thuật PCR để xác định máu vật chủ 1.4 Những nghiên cứu nhóm loài An maculatus 1.4.1 Nghiên cứu An maculatus n-ớc -3- Từ loài muỗi Anopheles maculatus đến nhóm loài An maculatus: Loài muỗi Anopheles maculatus đ-ợc Theobald phát năm 1901 Hồng Kông Hiện nay, tổng số loài đà đ-ợc định tên 12 loài, có số dạng ch-a đ-ợc định tên - Vấn đề xác định thành viên nhóm loài An maculatus Các thành viên nhóm loài An maculatus đ-ợc định loại nhiều ph-ơng pháp nh-: hình thái (th-ờng dựa vào dấu hiệu muỗi tr-ởng thành, Rattanarithikul Green [1986] mô tả muỗi tr-ởng thành trứng An notanandai An sawadwongporni Hai loµi míi An dispar vµ An greeni ë Philippine cđa Rattanarithikul vµ Harbach (1990) cã thĨ nãi lµ mô tả đầy đủ nhất); dấu hiệu di truyền tế bào (Năm 1993, Baimai cs đà mô tả NST (Karyotype) thành viên nhóm loài An maculatus vùng Đông Nam á, điện di enzym phân tích ADN (những nghiên cứu điển hình cđa Torres, 1999; C.Walton, 2007 vµ Ma Ya Jun 2002, 2006) - Phân bố: Nhóm loài An maculatus phân bố rộng vùng Đông Ph-ơng từ ấn Độ, qua Miến Điện, Thái Lan, Lào, Campuchia, Việt Nam, Nam Trung Quốc; phía Đông Bắc đến Đài Loan, Trung Quốc; phía Tây Nam đến bán đảo Mà Lai, phía Đông đến quần đảo Philippine - Đặc điểm sinh học: Tuỳ vùng phân bố, thành viên nhóm loài có đặc điểm sinh học sinh thái học khác Bọ gậy chúng th-ờng thấy mạch n-ớc, suối nhỏ có ánh sáng rọi trực tiếp không trực tiếp Muỗi thích sống gần chuồng gia súc, vùng muỗi -a đốt máu ng-ời vectơ truyền bệnh chính, đại đa số thành viên nhóm loài -a đốt máu súc vật không cã vai trß trun bƯnh -Vai trß trun bƯnh: Anopheles maculatus s.l đ-ợc coi vectơ sốt rét quan trọng bán đảo Malaysia, Thái Lan, ấn Độ, Nepal, Miến §iƯn (Rao, 1984) 1.4.2 Nghiªn cøu vỊ An maculatus n-ớc - Những nghiên cứu sinh học, sinh thái học muỗi An maculatus: An maculatus loài muỗi hoang dại phân bố rộng, trú ẩn tiêu máu nhà chủ yếu An maculatus phát triển mạnh vào mùa m-a Bọ gậy bắt đ-ợc suối ven rừng, có ánh sáng nhiều, bắt đ-ợc ë c¸c rng lóa, giÕng, vịng n-íc ven si - VỊ vai trß trun bƯnh cđa An maculatus: An maculatus s.l đ-ợc xác định vectơ truyền sốt rét thø u ë ViƯt Nam, Toumanoff (1936) ®· mỉ thÊy loài muỗi mang thoa trùng oocysts, Đặng Văn Ngữ (1966) xác định tỷ lệ mang KST loài muỗi khoảng 1,9% Ch-ơng 2: Đối t-ợng ph-ơng pháp nghiên cứu 2.1 Đối t-ợng nghiên cứu: Các loài muỗi thuộc nhóm loài Anopheles maculatus Việt Nam 2.2 Thời gian nghiên cứu, địa điểm nghiên cứu - Tháng 10-2001 đến tháng 12-2006 - Địa điểm thu mẫu toàn quốc 2.3 Ph-ơng pháp nghiên cứu: Mô tả thực địa phòng thí nghiệm 2.3.1 Ph-ơng pháp thu thập xử lý mẫu vật thực địa Muỗi đ-ợc thu thập bảo quản theo ph-ơng pháp chuẩn cđa Tỉ chøc Y tÕ ThÕ giíi vµ ViƯn Sèt rét, Ký sinh trùng, Côn trùng (1975, 1987) 2.3.2 Nghiên cứu phòng thí nghiệm -Nuôi muỗi: Theo dòng gia đình để làm tiêu đồng phân tích dấu hiệu di truyền theo dòng gia đình - Phân loại muỗi dựa dấu hiệu hình thái: theo R.Rattanarithikul vµ C A Green, 1986, R.Rattanarithikul vµ R.E Harbach, 1990, Rattanarithikul vµ cs, 2006, J A Reid, 1968 , Lục Bảo Lân, 1997 - Phân tích đặc điểm di truyền tế bào: Làm tiêu NST từ tế bào nÃo bọ gậy tuổi theo ph-ơng pháp: Ph-ơng pháp V.Baimai (1997) có sửa đổi ph-ơng pháp Frank (1962) có cải tiến Phân tích kết theo Baimai cs (1993), xác định đặc điểm cấu trúc, cân tâm, lệch tâm, cận tâm mút - Điện di enzym phân tích kết điện di: Điện di gel cellullose acetate (Itan II, Helana Laboratories, U.K) theo ph-ơng pháp Smith cs, 1996 víi 11 hƯ enzym: ODH, LDH, MDH, GPI, PGM, MPI, IDH, 6-PGD, -GPD, GOT, HAD Ph©n tÝch kÕt theo Futuyma, D.J 1986, sử dụng phần mềm TFPGA version 1.3 (Mark P Miller, 1997): tÝnh tÇn sè alen, tính phù hợp với định luật cân Hardy Weinberg, hệ số t-ơng đồng di truyền khoảng cách di truyền - Tách chiết ADN muỗi: theo Collin cs (1987) tủa ADN ethanol - Ph-ơng pháp PCR-RFLP : Cắt sản phẩm nhân đoạn ITS2 loài nhóm An maculatus 10 enzym cắt giới h¹n AluI, EcoRI, BamHI, HindIII, XbaI, MspI, Cfr131, HaeII, HindII, HeaIII - Ph-ơng pháp RAPD-PCR: tiến hành PCR với måi A1, A5, F2, F4, OPL1, OPA4, OPA10 Ph©n tÝch sè liƯu b»ng phÇn mỊm TFPGA 1.3, tÝnh hƯ sè t-ơng đồng di truyền, khoảng cách di truyền lập chủng loại phát sinh - Ph-ơng pháp giải trình tự: giải trình tự đoạn ITS2 máy AB3730 Xử lý phân tích kết phần mềm MEGA version 3.1 -4- Xác định ký sinh trùng muỗi ph-ơng pháp ELISA: Theo ph-ơng pháp Wirtz cs (1987) với loại kháng thể đơn dòng P.falciparum, P.vivax 210 P.vivax 247 - Kiểm tra lại mẫu ELISA d-ơng tính: ph-ơng pháp PCR lồng theo G.Snounou cs (1992) Ch-ơng 3: Kết nghiên cứu 3.1 Đa hình dấu hiệu kiểu hình thành viên nhóm loài An maculatus 3.1.1 Đa hình dấu hiệu hình thái thành viên nhóm loµi An maculatus Tỉng sè mÉu vËt cã thĨ sư dụng để nghiên cứu 9583 mẫu bao gồm mẫu vật nuôi theo dòng gia đình, muỗi tr-ởng thành bọ gậy thu thập từ tự nhiên (bảng 3.2) Bảng 3.1: Số l-ợng mẫu vật đà thu thập giai đoạn 2001-2005 Stt Tên muỗi Muỗi bắt TN An maculatus An dravidicus An notanandai An pseudowillmori An sawadwongporni An willmori Các dạng khác Tổng cộng Muỗi nuôi theo GĐ Bọ gậy 483 26 52 247 386 104 189 1487 1450 19 595 247 1187 249 278 4025 1161 18 28 104 1950 36 324 4071 Tæng céng 3544 63 675 598 3523 389 791 9583 Ghi chú: TN: tự nhiên GĐ: gia đình - Đa hình hình thái muỗi tr-ởng thành thành viên nhóm loài An maculatus Các thành viên nhóm loài An maculatus Việt Nam đa dạng dẫn liệu hình thái - An maculatus: Tấm l-ng đốt bụng II-IV vẩy trắng Đốt bụng V-VIII đặc biệt đốt bụng VII-VIII tập trung nhiều vẩy trắng hình thìa Không có vẩy đen chỗ chia nhánh gân cánh L2 Gân L3 điểm đen dài - An dravidicus: Các đốt bụng II-VIII có phủ vẩy trắng hình thìa Gân L3 điểm đen gốc ngọn, có băng đen dài vài băng đen nhỏ bên cánh - An notanandai: Tất l-ng đốt bụng II- VIII phủ vảy trắng, chỗ chia nhánh gân L2 cánh có đám vảy đen Phần cuối l-ng đốt bụng IV-VII có hàng vẩy đen - An pseudowillmori: Tấm l-ng đốt bụng II- VII vảy trắng, có vảy trắng đốt bụng VIII Thân L2 ngắn, ô tr-ớc cánh dài - An sawadwongporni: Tấm l-ng đốt bụng II- VIII phủ đầy vảy trắng hình thìa, có vài vảy đen bên mép Chỗ chia nhánh gân L2 th-ờng có đám vảy đen bên cánh Cuối l-ng đốt bụng có chùm vẩy đen hai bên - An willmori: Các l-ng đốt đốt bụng II- VII phủ đầy vảy trắng, chỗ chia nhánh gân L2 chïm vÈy ®en An maculatus An pseudowillmori An sawadwongporni An willmori An notanandai An dravidicus Hình 3.1: Đa hình hình thái muỗi tr-ởng thành thành viên thuộc nhóm loài An maculatus - Đa hình hình thái quan sinh dục đực Đặc điểm quan sinh dục đực thành viên nhóm loài An maculatus đa hình dựa vào cấu trúc thuỳ l-ng, thuỳ bụng phụ gai giao cấu Thuỳ l-ng Thuỳ bụng Lá phụ gai giao cấu -5- - Đa hình hình thái quăng Các dấu hiệu hình thái chủ yếu dùng để phân tích tính đa hình giai đoạn quăng gồm số bánh lái (chiều dài bánh lái/chiều rộng), độ dài gai bên đốt bụng IV, phân bố gai cứng bờ cong bánh lái (Hình 3.3) Hình3.2 Cơ quan sinh dục đực An.maculatus Phiến đỉnh Bánh lái đực Gai bên đốt bụng Bánh lái Hình 3.3 Dấu hiệu hình thái bọ gậy An maculatus - Đa hình hình thái bọ gậy Đầu Lông số ngực Lông cọ đốt bụng Tấm kitin đốt bụng Bọ gậy thành viên nhóm loài đa hình có nhiều dấu hiệu gối Một số dấu hiệu th-ờng dùng để phân tích đa hình hình thái giai đoạn bọ gậy là: cấu trúc lông cọ (lông số 1) hình thể kitin đốt bụng, số l-ợng nhánh lông số đốt ngực giữa.(Hình 3.4) Hình 3.4 Dấu hiệu hình thái quăng An maculatus - Đa hình hình thái trứng Các dấu hiệu dễ nhận biết tính đa hình hình thái pha trứng thành viên nhãm loµi lµ cÊu tróc khoang trøng, cÊu tróc, số l-ợng rẻ phao Khoang trứng Phao Hình 3.25 Dấu hiệu hình thái trứng An.sawadwongporrni 3.1.2 Đa hình dấu hiệu sinh học, sinh thái học thành viên nhóm loài An maculatus - Đa hình dấu hiệu sinh học, sinh thái học giai đoạn tr-ớc tr-ởng thành: Nghiên cứu ổ bọ gậy thành viên nhóm loài ổ n-ớc đứng có l-u thông nhiều bọ gậy hơn: 62,26% (2506/4025) Nhiều vũng n-ớc mạch: 45,69%, hố đào vàng, đáy suối cạn Có thể bắt đ-ợc bọ gậy tất loài muỗi ổ n-ớc chảy nh-ng thấp (37,74%) Hai loài muỗi An sawadwongporni vµ An notanandai chiÕm tû lƯ cao nhÊt ë ổ n-ớc chảy (40,68% 28,53%) Hình 3.26: ổ bọ gËy cđa An notanandai vµ An sawadwongporni ë si lín - Đa hình dấu hiệu sinh học, sinh thái học giai đoạn tr-ởng thành: Các loài muỗi chủ yếu bắt đ-ợc chuồng trâu (83,5% - 95,21%) Tỷ lệ muỗi bắt đ-ợc ph-ơng pháp mồi ng-ời thấp (mồi ng-êi nhµ 0,7 - -61,32%; måi ng-êi ngoµi nhµ 0,94- 4,49%) Nh- vậy, muỗi An maculatus chủ yếu trú ẩn nhà -a đốt máu súc vật 3.2 Đa hình kiểu gen thành viên nhóm loài An maculatus 3.2.1 Đa hình di truyền dấu hiệu di truyền tế bào thành viên nhãm loµi An maculatus: Bé NST 2n = 6, NST giới tính X, Y có hình thái khác (Hình 3.30) - An maculatus: Các dạng có NST th-ờng giống nhau, kh¸c ë NST giíi tÝnh, cã ba kiĨu NST X: X1, X2, X3 vµ hai kiĨu NST Y: Y1, Y2 - An sawadwongporni: NST X t©m cËn mót gồm có khối dị NS tâm động NST Y cận tâm mút xấp xỉ độ lớn khối dị nhiễm sắc NST X Những khối dị nhiễm sắc quanh tâm động rõ - An dravidicus: Bé NST gièng víi cđa An sawadwongporni nh-ng khèi dị nhiễm sắc trung tâm lớn - An notanandai: NST X tâm cận Vai ngắn hầu hết đồng nhiễm sắc vai dài toàn dị nhiễm sắc - An willmori: NST giới tính lớn bất th-ờng NST X tâm cận vai ngắn có phần đồng nhiễm sắc phần dị nhiễm sắc, vai dài toàn dị nhiễm sắc - An pseudowillmori: Cả NST X Y loài cận tâm lín; NST X h¬i lín h¬n NST Y NST An maculatus dạng NST An maculatus đực dạng NST An pseudowillmori NST An pseudowillmori đực Hình 3.30 Bộ NST thành viên nhóm loài An maculatus 3.2.2 Đa hình di truyền đặc điểm điện di enzym thành viên nhóm loài An maculatus - Hệ izozym ODH: Hệ izozym có alen đồng tréi mét locut, cÊu tróc dimer C¸c alen gåm: Odha, Odhb, Odhc,Odhd; víi Rf t-¬ng øng: 96, 100, 109, 116 - Hệ izozym LDH: Tần số alen phân bố tần số alen hệ izozym LDH phù hợp với định luật Hardy Weinberg - Hệ izozym MDH: MDH có tính đa hình cao, hai phần ba quần thể nghiên cứu có tính đa hình Phân thành vùng Mdh1 Mdh2, vùng gen riêng biệt kiểm soát -Hệ izozym GOT: hai locut cđa hƯ enzym GOT, alen chiÕm -u thÕ lµ Got1b víi Rf = 100 vµ Got2c víi Rf = 160 - HÖ izozym 6PGD 10 11 12 HÖ izozym 6PGD thể tính đa hình cao hệ enzym có khả phân biệt thành viên nhóm loài An maculatus cách rõ ràng An notanandai alen 6Gpda (Rf = 83), H×nh 3.34: H×nh ảnh điện di enzym 6PGD thành viên nhóm alen 6Gpd (Rf = 86) đặc tr-ng loài An.maculatus cho An pseudowillmori C¸c GiÕng 1, 2, 3, 6, 10, 11: An sawadwongporni d¹ng An sawadwongporni cã GiÕng 4,7: An.maculatus d¹ng alen 6Gpdf (Rf = 114), An GiÕng 5: An.maculatus d¹ng dravidicus cã alen 6Gpdd (Rf = GiÕng 8: An willmori GiÕng 12: An pseudowillmori 100) chiÕm -u thÕ (H×nh 3.34) GiÕng 9: An.maculatus -HƯ izozym IDH: IDH thể tính đa hình cao có khả phân biệt thành viên nhóm loài An maculatus Việt Nam -7- Hệ izozym PGM: PGM đ-ợc kiểm soát alen đồng trội Pgma (Rf = 85), Pgmb (Rf = 100), Pgmc (Rf = 120) CÊu trúc enzym monomer - Hệ izozym GPI: Đây enzym có cấu trúc dimer alen t-ơng ứng với Rf 91, 100 109 An willmori phân biệt với loài khác dựa vào alen Gpic - Hệ izozym - GPD: Enzym có tính đa hình cao, 100% quần thể nghiên cứu thể tính đa hình Cấu trúc monomer, alen ®ång tréi thc cïng mét locut kiĨm so¸t - HƯ izozym MPI: loài đà đ-ợc đặt tên alen Mpid chiếm tần số cao, dạng ch-a đ-ợc đặt tên thức tần sè l¹i cao ë alen Mpia - HƯ izozym HAD: HAD hệ enzym đa hình alen đồng trội quy định Hada (Rf = 89) vµ Hadb (Rf = 100) Mèi quan hƯ di trun (Hệ số t-ơng đồng di truyền: I khoảng cách di truyền: D) thành viên phức hợp An maculatus đ-ợc tổng kết bảng 3.18, hình 3.38, 3.39 Bảng 3.18: Hệ số t-ơng đồng di truyền (I) khoảng cách di truyền (D) thành viên đà định tên nhóm loài An maculatus dựa số liệu phân tích izozym Hệ số t-ơng đồng di truyÒn (I) An dravidicus An maculatus An notanandai An sawadwongporni An pseudowillmori An willmori An dravidicus An maculatus An notanandai An sawadwongporni An pseudowillmori An willmori **** 0,35 0,28 0,64 0,57 0,23 0,70 **** 0,17 0,50 0,70 0,61 0,76 0,85 **** 0,33 0,65 0,58 0,55 0,60 0,72 **** 0,70 0,78 0,57 0,50 0,52 0,50 **** 0,66 0,80 0,54 0,56 0,46 0,52 **** Khoảng cách di truyền (D) D An sawadwongporni An notanandai An speudowillmori An maculatus An dravidicus An willmori Hình 3.38: Sơ đồ hình biểu thị mối quan hệ di truyền thành viên đà định tên nhóm loài An maculatus dựa số liệu phân tích izozym Sáu loài loài độc lập nh-ng thể sơ đồ hình gồm nhánh rõ: (1) An sawadwongporni An notanandai, (2) An pseudowillmori, (3) An maculatus vµ An dravidicus, (4) An willmori nhánh An D willmori tách xa An maculatus s.s An maculatus dạng Khoảng cách di An maculatus dạng An pseudowillmori xa (D = 0,65 vµ 0,67); theo lµ nhãm An willmori (D = 0,64 gần An An dravidicus An willmori An willmori d¹ng An sawadwongporni d¹ng An sawadwongporni d¹ng An sawadwongporni trun víi nhÊt tiÕp An notanandai An maculatus d¹ng An maculatus d¹ng An maculatus dạng An pseudowillmori dạng An pseudowillmori Hình 3.39: Sơ đồ hình biểu thị mối quan hệ di truyền thành viên toàn nhóm loài An.maculatus dựa số liệu phân tích izozym 0,57), -8sawadwongporni (D = 0,31; 0,28) An maculatus cã quan hÖ gần gũi với An notanandai (D = 0,35) An dravidicus (D = 0,23) Đối với dạng An maculatus, An maculatus dạng gần gũi (D = 0,01), An maculatus dạng xa giống nh- loài tách biệt (D = 0,53) 3.2.3 Kết phân tích đa hình dựa vào thị PCRRFLP nhóm loài An maculatus: Đoạn ITS2 có kích th-ớc 500bp đ-ợc c¾t víi 10 enzym - Enzym HaeIII: Enzym HeaIII c¾t sản phẩm PCR đoạn ITS2 nhóm loài An maculatus thµnh nhãm: nhãm gåm An sawadwongporni, An maculatus vµ An pseudowillmori; nhãm 2: An notanandai, An willmori dạng An maculatus dạng Nhóm cắt thành băng rõ rệt 350 bp 150 bp An sawadwongporni dạng An dravidicus - Enzym HindII: Chỉ cắt đoạn ITS2 An dravidicus - Enzym Cfr131: Cfr131 chØ cã thĨ ph©n biƯt An notanandai - Enzym HindIII: phân biệt đ-ợc An notanandai - Enzym HeaIII: phân biệt đ-ợc An willmori dạng - Enzym MspI: đoạn ITS2 An sawadwongporni đ-ợc MspI cắt thành hai băng 330 bp 170 bp, ITS2 An maculatus cắt thành băng 330 bp, 200 bp, 170 bp 100 bp Đoạn ITS2 An willmori cắt thành băng có kích th-ớc 300 bp, 150 150bp 10 11 12 Hình 3.43 Sản phẩm cắt đoạn ITS2 thành viên nhóm loài An maculatus enzym MspI Lµn 1: Thang chuÈn 50 bp Lµn 2: An sawadwongporni Làn 3: An maculatus Làn 4: An sawadwongporni dạng Làn 5: An notanandai Làn 6: An maculatus dạng Làn 7: An willmori dạng Làn 8: An willmori Làn 9: Đối chứng âm Làn 10: An pseudowillmori Làn 11: An dravidicus Làn 12: An maculatus dạng - Enzym XbaI: phân biệt đ-ợc số thành viên - Enzym AluI: Enzym AluI cắt An sawadwongporni An willmori giống nhau, cắt An maculatus thành băng không cắt sản phẩm PCR đoạn ITS2 dạng loài khác Trong số 10 enzym sử dụng, hai enzym EcoRI, BamHI không cắt đoạn ITS2 Các enzym lại Cfr13l, MspI, Alul, HindII, HindIII, HaeII, HaeIII XbaI có khả cắt đoạn ITS2 tạo băng đa hình thành viên nhóm loài An maculatus mức độ khác 3.2.4 Kết đánh giá đa hình di truyền thành viên nhóm loài An maculatus dựa vào thị RAPD - Mồi A1: Các băng rõ nét đa hình cao, tạo 26 băng có kích th-íc tõ 0,15 ®Õn 1,5 kb Vïng cã kÝch th-íc 0, 15 đến 0,4 kb chứa 12 băng đa hình có khả phân biệt loài nhóm loµi An maculatus râ rƯt nhÊt - Måi A5: khch đại 23 băng đa hình có kích th-ớc 0,12 đến 1,4 Kb, 17 băng có kích th-ớc 0,25 đến 0,9 Kb cho phép phân biệt loài nhóm loài An maculatus - Mồi F2: Đây mồi tạo nhiều băng đa hình 26 băng, có tới 20 băng nằm khoảng từ 0,1 đến 1,1 Kb thể khác biệt loµi nhãm loµi An maculatus 10 11 12 13 14 15 16 17 -9- Hình 3.47: Sản phẩm phản øng RAPD- PCR sư dơng måi F2 Lµn 1: Thang chuẩn 50 bp Làn 2: Đối chứng âm Làn 3, 16: An maculatus Làn 4: An maculatus dạng Làn 5: An notanandai Lµn 6: An sawadwongporni Lµn 7: An sawadwongporni dạng Làn 8: An sawadwongporni dạng Làn 9: An maculatus dạng Làn 10: An pseudowillmori dạng Làn 11: An pseudowillmori dạng Làn 12: An willmori Làn 13: An willmori dạng Làn 14: An dravidicus Làn 15: An maculatus dạng Làn 17: Thang chuẩn 100 bp - Mồi OPL1: Phân biệt thành viên 12 băng đa hình nằm khoảng kích th-íc tõ 0,1 ®Õn 0,6 Kb - Måi OPA10: 25 băng đa hình kích th-ớc từ 0,2 đến 1,5 kb có băng kích th-ớc từ 0,2 đến 0,5 kb phân biệt đ-ợc loài - Mồi F4 mồi OPA4: Các băng rõ nét, tính đa hình thấp khó phân biệt thành viên nhóm loài An maculatus Năm mồi có mức độ đa hình cao phân biệt loài A1, A5, F2, OPL1, OPA10; hai mồi F2 OPA4 có mức độ đa hình thấp khó phân biệt đ-ợc loài với áp dụng phần mềm TFPGA 3.1 để xử lý kết đ-a bảng ma trận t-ơng đồng di truyền quan hệ di truyền thành viên nhóm loài An maculatus (Bảng 3-20; Hình 3-59) Bảng 3.20: Hệ số t-ơng đồng di truyền(I) khoảng cách di truyền (D) thành viên đà định tên nhóm loài An maculatus dựa số liệu RAPD-PCR Hệ số t-ơng đồng di truyền (I) An maculatus An notanandai An sawadwongporni An pseudowillmori An willmori An dravidicus **** 0,67 0,69 0,53 0,64 0,72 **** 0,72 An sawadwongporni 0,40 0,37 0,32 **** 0,64 0,67 0,72 0,70 0,61 0,56 An pseudowillmori 0,62 0,45 0,40 **** 0,62 0,60 An willmori 0,44 0,32 0,33 0,49 0,37 0,57 0,47 0,52 **** 0,57 0,56 **** An maculatus An notanandai An dravidicus Khoảng cách di truyền (D) D An maculatus An dravidicus An notanandai An sawadwongporni An pseudowillomri An willmori H×nh 3.50: Sơ đồ hình biểu thị mối quan hệ di truyền thành viên đà định tên nhóm loài An maculatus dựa vào số liệu RAPD-PCR Khoảng cách di truyền biến động khoảng từ 0,12 đến 0,62 An pseudowillmori An maculatus dạng có khoảng cách di truyền lớn (D = 0,62) Các thành viên có quan hệ gần gũi An willmori An willmori dạng (D = 0,12); An maculatus dạng An maculatus dạng (D = 0,14) Khoảng cách di truyền dạng An sawadwongporni dao động từ 0,25 0,28 Khoảng cách di truyền dạng An pseudowillmori 0,26 Sơ đồ hình dựa kết phân tích RAPD-PCR t-ơng tự nh- sơ đồ hình dựa kết phân tích điện di enzym 3.2.5 Định loại thành viên nhóm loài An maculatus PCR đa mồi Trong loài muỗi thử nghiệm với mồi C.Walton có loài bắt vị trí thiết kế An maculatus, An sawadwongporni, An dravidicus An pseudowillmori Muỗi An notanandai bắt mồi vào vị trí An maculatus dạng K An willmori bắt vào vị trí An sawadwongporni bắt vào vị trí An maculatus Hệ thống mồi Ma Ya Jun có loài bắt vị trí An maculatus, An dravidicus, An pseudowillmori An willmori Trong An sawadwongporni không bắt vào vị trí mồi Ma Ya Jun thiÕt kÕ cho An sawadwongporni ë Trung Quèc - 10 3.2.6 Kết đánh giá đa hình di truyền thành viên nhóm loài An maculatus dựa vào kết giải trình tự đoạn ITS2 Trình tự đoạn ITS2 thành viên nhóm loài có kích th-ớc từ 507 đến 519 bp Các đỉnh đồ thị thu đ-ợc rõ ràng, sắc nét, chồng chéo, chứng tỏ kết thu đ-ợc đáng tin cậy Hình 0.53: Hình ảnh giải trình tự đoạn gen ITS2 An maculatus dạng Dựa sai khác trình tự nucleotit lập quan hệ di truyền thành viên nhóm loài Kết hình 3.67 An.notanandai 99 sawadwongporni VNQBP12-16 100 maculatus NA126 54 maculatus QN80 dravidicus Vietnam 36 willmori Vietnam pseudowillmori Vietnam 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 D Hình 3.58: Sơ đồ hình biểu thị mối quan hệ di truyền thành viên đà định tên nhóm loài An maculatus dựa vào số liệu giải trình tự đoạn ITS2 Sự sai khác trình tự nucleotit đoạn ITS2 loài thành viên nhóm loài An maculatus nhỏ d-ới 15% Trình tự loài thu thập từ Việt Nam trùng khớp với trình tự loài đ-ợc l-u giữ Genebank Tr-ờng hợp An sawadwongporni Y.J Ma (2002) thu thập Vân Nam Trung Quốc, trình tự trùng khớp với An maculatus, An maculatus dạng K theo C.Walton cộng (2006) có trình tự giống với An notanandai nghiên cứu 3.3 Thành phần loài phân bố thành viên nhóm loài An maculatus ë ViƯt Nam nhãm loµi An maculatus cã 14 thµnh viên, có loài đà đ-ợc định tên lµ: An maculatus Theoblad, 1901; An dravidicus Christophers, 1924; An notanandai Rattanarithikul and Green, 1986; An pseudowillmori (Theobald, 1910), An sawadwongporni Rattanarithikul and Green, 1986; vµ An willmori (James, 1903) Tám thành viên ch-a đ-ợc định tên : An maculatus d¹ng 3, An maculatus d¹ng 4, An maculatus d¹ng 5, An maculatus d¹ng 6, An pseudowillmori d¹ng 2, An sawadwongporni d¹ng 2, An sawadwongporni d¹ng 3, An willmori d¹ng 3.3.1 Bảng định loại thành viên đà xác định tên nhóm loài An maculatus: Dựa số liệu phân tích hình thái đà lập bảng định loại bao gồm: - Bảng định loại muỗi tr-ởng thành nhóm loài An maculatus - Bảng định loại quăng nhóm loài An maculatus - Bảng định loại bọ gậy nhóm loài An maculatus - Bảng định loại trứng nhóm An maculatus 3.3.2 Phân bố thành viên nhóm loài An maculatus Muỗi An maculatus loài phân bố rộng, tìm thấy tất điểm điều tra Muỗi An sawadwongporni chiếm -u miền rừng núi từ tỉnh Quảng Bình trở vào phía Nam Muỗi An willmori An pseudowillmori ng-ợc lại Muỗi An notanandai vµ An dravidicus chØ míi thÊy ë mét vµi địa điểm 3.4 Vai trò truyền bệnh thành viên nhóm loài An maculatus Tại Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà, muỗi thử nghiệm nhiễm KST P.vivax chiếm tỷ lệ 0,57% Tại Đắc Ơ, Ph-ớc Long, Bình Ph-ớc An maculatus nhiƠm KST P.falciparum víi tû lƯ 0,58% Nh- tính chung cho hai điểm, loài An maculatus nhiƠm KST víi tû lƯ lµ 0,58%, (0,29% P.falciparum vµ 0,29% P.vivax) Ch-ơng 4: Bàn luận 4.1 Đa hình di truyền mối quan hệ di truyền thành viên nhóm loài An maculatus - 11 4.1.1.Đa hình dấu hiệu kiểu hình thành viên nhóm loài An maculatus - Đa hình dấu hiệu hình thái - Đa hình hình thái muỗi tr-ởng thành: Kết nghiên cứu cho thấy tính đa hình dấu hiệu hình thái giai đoạn muỗi tr-ởng thành thành viên nhóm loài An maculatus Việt Nam có nhiều điểm giống với muỗi Thái Lan - Về hình thái quan sinh dục đực thành viên nhóm loài An maculatus: quan sinh dục đực thành viên nhóm loài An maculatus đa hình có dấu hiệu gối nh-ng đ-ợc di truyền tách biệt loài với dựa vào phân tích chi tiết cấu tạo nắp gai giao cÊu (cÊu t¹o th l-ng, th bơng), cđa gai giao cấu (hình dạng gai giao cấu, số l-ợng cấu tạo phụ gai giao cấu), hậu môn v.v - Về hình thái giai đoạn nhộng: Dấu hiệu hình thái nhộng thành viên nhóm loài An maculatus đa hình biến đổi Trong nghiên cứu chúng tôi, có điều khác rõ nét so với nghiên cứu Rattanarithikul Harbach (1990) là: muỗi An pseudowillmori (dạng dạng 2) có gai bên đốt bụng IV dµi vµ nhän gièng nh- cđa An greeni vµ An.dispar phân bố Philippine Theo hai tác giả trên, An pseudowillmori phân bố đất liền Thái Lan có gai bên đốt bụng IV nhộng ngắn tù - Về hình thái giai đoạn bọ gậy: Theo nghiên cứu chúng tôi, muỗi An willmori (dạng 2) loài muỗi có lông cọ đốt bụng phát triển nhất, phát triển từ đốt bụng II ®Õn ®èt bơng VII víi c¸c ngän l¸ cä rÊt rõ ràng Khác với Rattanarithikul Green (1986) cho loài An pseudowillmori có lông cọ đốt bụng phát triển - Về đa hình hình thái trứng thành viên nhóm loài An maculatus: Kết t-ơng tự với kết Rattanarithikul Green (1986) Thái Lan thấy có biến đổi nội loài nh-ng dấu hiệu kiểu hình thái khoang trứng đặc điểm bật để nhận dạng thành viên nhóm loài An maculatus - Tổng kết đa hình dấu hiệu hình thái liên quan đến phân loại thành viên nhóm loài An maculatus: Kết ủng hộ ý kiến nghiên cứu Rattanarithikul Green (1986); Rattanarithikul Harbach (1990); Lục Bảo Lân (1997) rằng: dấu hiệu hình thái có đa hình biến ®ỉi, cã nhiỊu dÊu hiƯu gèi nh-ng vÉn cã thể xác định đ-ợc đặc điểm loài riêng biệt nhóm loài qua dấu hiệu giai đoạn phát triển - Tính đa dạng dấu hiệu sinh học, sinh thái học thành viên nhóm loài An maculatus - Đa dạng kiểu ổ bọ gậy: Các kiểu ổ bọ gậy thành viên nhóm loài có đặc điểm chung: ngn n-íc th-êng trong, cã ¸nh s¸ng, c¸c ỉ n-ớc ngầm, đứng nh-ng có l-u thông phù hợp cho tất loài giống nh- nghiên cứu Rattanarithikul v Lục Bảo Lân Riêng An notanandai An sawadwongporni có mật độ cao thuỷ vực n-ớc chảy - Đa dạng sinh học, sinh thái học giai đoạn muỗi tr-ởng thành: Muỗi thuộc nhóm An maculatus muỗi trú ẩn tiêu máu nhà Rất gặp muỗi trú ẩn tiêu máu nhà ban ngày Điều phù hợp với kết nghiên cứu Nguyễn Đức Mạnh (1988), Reid (1968), Lục Bảo Lân (1997), Toumanoff (1936), Lindsay cs (2004) 4.1.2 Đa hình di truyền dấu hiệu kiểu gen thành viên nhóm loài An maculatus Việt nam - Đa hình dấu hiệu di truyền tế bào thành viên nhóm loài An maculatus Có thể dựa sai khác cấu trúc phần nguyên nhiễm dị nhiễm NST giới tính để phân biệt loài dạng An maculatus với nhau, có khác biệt tổ hợp NST giới tính X Y Sự khác biệt giữ kiểu tổ hợp cho thấy biến đổi loài, loài với - Đa hình di truyền dấu hiệu điện di enzym thành viên nhóm loài An maculatus Kết điện di 11 hệ izozym thấy hầu hết locut gen thành viên nhóm loài An maculatus đa hình, có giá trị để phân biệt thành viên nhóm Tuy nhiên, đa hình enzym 6GPD có giá trị việc phân loại loài đồng hình - Phân tích đa hình dựa vào thị PCR-RFLP M-ời enzym giới hạn đ-ợc sử dụng cắt đoạn ITS2 thành viên nhóm loài An maculatus Việt Nam, hai enzym EcoRI BamHI không cắt Các enzym Cfr131, MspI, AluI, HindI, HindIII, HeaII, HeaIII XbaI có khả cắt đoạn ITS2 tạo băng đa hình khác biệt thành viên nhóm loài mức độ khác - Phân tích đa hình di truyền dựa vào thị RAPD-PCR Sử dụng mồi đơn ngẫu nhiên có mồi cho mức độ đa hình cao phân biệt rõ ràng loài mồi A1, A5, F2, OPL1 OPA10 Kết phù hợp với kết điện di izozym, nhiên hệ số t-ơng đồng di truyền không cách biệt rõ ràng nh- kết điện di izozym - Kiểm định phân biệt loài nhóm PCR đa mồi - 12 Hệ thống mồi Walton, loài An maculatus, An sawadwongporni, An dravidicus chuẩn Riêng với mẫu An notanandai Việt Nam lại bắt mồi t-ơng ứng với vị trí An maculatus dạng K Thái Lan Mẫu vật An willmori lúc bắt mồi An maculatus, lóc b¾t måi cđa An sawadwongporni Víi hƯ thèng mồi Ma Ya Jun cs (2002) loài An maculatus, An willmori, An dravidicus An pseudowillmori bắt cặp vị trí thiết kế, có An.sawadwongporrni không bắt cặp mồi - Phân tích đa hình di truyền giải trình tự ADN Tất loài dạng nhóm loài An maculatus đà đ-ợc giải trình tự đoạn ITS2 Đối chiếu với Genebank thấy loài đà đ-ợc định tên trùng khớp với trình tự đà đ-ợc l-u giữ trừ tr-ờng hợp cđa An notanandai l¹i gièng víi An maculatus d¹ng K Thái Lan Riêng muỗi An sawadwongporni thu thập Vân Nam Trung Quốc trình tự không trùng khớp với trình tự An sawadwongporni Thái Lan Việt Nam 4.2 Thành phần loài phân bố thành viên nhóm loài An maculatus Nghiên cứu đà khẳng định sáu loài muỗi đà định tên Việt Nam là: An maculatus, An notanandai, An dravidicus, An pseudowillmori, An sawadwongporni An willmori Tám dạng ch-a định tên gồm: An maculatus dạng 3, An maculatus d¹ng 4, An maculatus d¹ng 5, An maculatus d¹ng 6, An pseudowillmori d¹ng 2, An willmori d¹ng 2, An sawadwongporni dạng 2, An sawadwongporni dạng - Công bố đầy đủ bảng định loại bốn giai đoạn phát triển cho sáu thành viên đà định tên nhóm loài - Lần đầu tiên, thành viên đà đ-ợc định tên nhóm loài An maculatus đ-ợc lập đồ phân bố toàn quốc 4.3 Vai trò truyền bệnh thành viên nhóm loài An maculatus: Kết thử nghiệm ELISA kiểm tra PCR khẳng định loài An maculatus hai điểm Khánh Phú, Khánh Vĩnh, tỉnh Khánh Hoà Đắc Ơ, Ph-íc Long, tØnh B×nh Ph-íc nhiƠm ký sinh trïng sèt rÐt P.vivax vµ P.falciparum víi tû lƯ 0,57 vµ 0,58% Kết luận đề nghị I Kết luận Tất thành viên nhóm loài An maculatus biểu đa hình cao dấu hiệu hình thái, đa dạng đặc điểm sinh học, sinh thái học Tuy có đặc điểm hình thái đa hình gối nh-ng sử dụng dấu hiệu phân loại thành viên nhóm loài Đa hình di truyền tế bào nhóm loài An maculatus đ-ợc thể khác biệt hình dạng cấu trúc nhiễm sắc thể, đặc biệt nhiễm sắc thể giới tính Các locut hệ izozym nghiên cứu thể tính đa hình cao, hệ enzym 6GPD có giá trị việc phân loại thành viên nhóm loài Số liệu điện di isozym loài đà định tên thể chúng loài đồng hình dạng nằm mối quan hệ quần thể địa lý - bán loài - phân loài Riêng An maculatus dạng loài đồng hình độc lập nhóm RFLP-PCR cho thấy tính đa hình di truyền cao nhóm loµi nh-ng ch-a cã mét enzym thư nghiƯm nµo cã thể phân biệt đ-ợc tất thành viên nhãm, enzym cã -u thÕ cao nhÊt lµ MspI TÊt mồi đơn ngẫu nhiên phản ứng RAPD-PCR cho băng nhân rõ nét biểu mức độ đa hình khác nhau, mồi cho tính đa hình cao A1, A5, F2, OPL1, OPA10 hai mồi cho tính đa hình thấp F4 OPA4 Thử nghiệm PCR đa mồi khẳng định tồn loài đà đ-ợc định tên Việt Nam Số liệu giải trình tự ADN khẳng định tính đa hình vị trí phân loại thành viên đà xác định tên Sự sai khác dạng không rõ nét trừ An maculatus dạng Muỗi An maculatus Việt Nam nhóm loài đồng hình Cho đến nay, nhóm loài gồm 14 thành viên, có loài đà xác định tên An maculatus Theobald, 1901; An dravidicus Christophers, 1924; An notanandai Rattanarithikul et Green, 1986, An pseudowillmori (Theobald, 1910), An sawadwongporni Rattanarithikul et Green, 1986 vµ An willmori (James, 1903) Tám thành viên khác ch-a xác định xác vị trí phân loại là: An maculatus dạng 3, An maculatus d¹ng 4, An maculatus d¹ng 5, An maculatus dạng 6, An pseudowillmori dạng An willmori dạng 2, An sawadwongporni dạng An sawadwongporni dạng Muỗi An maculatus phân bố rộng rÃi vùng rừng núi toàn quốc An sawadwongporni chiếm -u vùng rừng núi từ Quảng Bình vào phía Nam An pseudowillmori An willmori có mặt tỉnh phía Bắc An dravidicus An notanandai có mặt rải rác số địa ph-ơng Các loài muỗi thuộc nhóm An maculatus -a đốt máu súc vật, trú đậu tiêu máu nhà Các kiểu ổ bọ gậy thành viên nhóm loài có - 13 đặc điểm chung: nguồn n-ớc th-ờng trong, có ánh sáng; ổ n-ớc ngầm đứng nh-ng có l-u thông phù hợp cho tất loài Riêng hai loài An notanandai An sawadwongporni sống thuỷ vực n-ớc chảy Có nhÊt mét loµi nhãm loµi (An maculatus s.s.) cã khả truyền hai loại ký sinh trùng sốt rét P.falciparum vµ P.vivax víi tû lƯ nhiƠm thoa trïng 0,58% (P.falciparum: 0,29%; P.vivax: 0,29%), khẳng định vai trò vectơ thứ yếu An maculatus s.l II Đề nghị Tiếp tục giải trình tự ADN tập trung vào số gen đích nh- ITS2 gen ty thể (COI, COII, D3), so sánh để xác định xác vị trí phân loại thành viên nhóm loài An maculatus, thiết lập hệ thống PCR đa mồi để phân biệt thành viên nhóm loài Tiếp tục sử dụng kỹ thuật ELISA, PCR để xác định vai trò truyền bệnh thành viên nhóm loài, tập trung vào trọng điểm sốt rét miền Trung, Tây Nguyên Đông Nam Bộ Các công trình tác giả đà công bố liên quan đến luạn án 1.Nguyễn Thị H-ơng Bình, Nguyễn Đức Mạnh, Trần Đức Hinh (2005), Dấu hiệu hình thái xác định thành viên đà đ-ợc định tên thuộc nhóm loài An maculatus Việt Nam, Hội nghị Côn trùng toàn quốc lần thứ 5, tr 565570 2.Nguyễn Thị H-ơng Bình, Nguyễn Đức Mạnh, Trần Đức Hinh, Lê Xuân Hợi (2005), Một vài dấu hiệu đặc điểm ổ bọ gậy thành viên nhóm loài An maculatus Việt Nam, Hội nghị Côn trùng toàn quốc lần thứ 5, tr 571- 577 3.Nguyễn Thị H-ơng Bình, Nguyễn Đức Mạnh, Hồ Đình Trung, Trần Đức Hinh (2006), Đặc điểm cấu tạo quan sinh dục đực thành viên nhóm loài An maculatus Việt Nam, Tạp chí phòng chống bệnh sốt rét bệnh ký sinh trùng, (4), tr 35-40 4.Nguyễn Thị H-ơng Bình, Nguyễn Đức Mạnh, Hồ Đình Trung, Nguyễn Thị Hồng Ngọc, Trần Đức Hinh (2006), Đặc điểm nhiễm sắc thể nguyên phân thành viên nhóm loài An maculatus Việt Nam, Tạp chí phòng chống bệnh sốt rét c¸c bƯnh ký sinh trïng, sè 6, tr 35-42 5.Ngun Đức Mạnh, Nguyễn Thị H-ơng Bình, Trần Đức Hinh, Trịnh Đình Đạt (2005), Định loại thành viên nhóm loài Anopheles maculatus v-ờn Quốc Gia Phong Nha- Kẻ Bàng Cát Tiên PCR đa mồi, Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc 2005 nghiên cứu b¶n khoa häc sù sèng, tr 1298- 1300 6.Ngun Đức Mạnh, Trần Đức Hinh, Nguyễn Thị H-ơng Bình (2005), Định loại Anopheles minimus s.l V-ờn Quốc Gia Phong Nha Kẻ Bảng kỹ thuật sinh học phân tử, Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc 2005 nghiên cứu khoa học sống, tr 101-104 7.Nguyen Thi Huong Binh, Nguyen Duc Manh, Vu Viet Hung, Ho Dinh Trung, Le Khanh Thuan, Toshihiko Sunahara, Masahiro Takagi (2006), “Genetic diversity of Anopheles maculatus species group, secondary vectors in Viet Nam”, The 4th international seminar on emerging and re-emerging Infectious Disease, Ha Noi, Viet Nam 4-6 December 2006, pp 36-37 Nguyen Thi Huong Binh, Nguyen Duc Manh, Ho Dinh Trung, Nguyen Hong Ngoc, Tran Duc Hinh, Trinh Dinh Dat (2007), “Random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis of Anopheles maculatus group (Diptera/Culicidea) in Vietnam", International colloquium Malaria control in the Mekong Region: Challenges and opportunities, Hanoi 3-5 December 2007.pp 38  ... tài :Nghiên cứu tính đa hình di truyền vai trò truyền bệnh thành viên nhóm loài Anopheles maculatus Việt Nam nhằm mục đích : Xác định thành phần loài phân bố thành viên phức hợp loài An maculatus. .. 4.1 Đa hình di truyền mối quan hệ di truyền thành viên nhóm loài An maculatus - 11 4.1.1 .Đa hình dấu hiệu kiểu hình thành viên nhóm loài An maculatus - Đa hình dấu hiệu hình thái - Đa hình hình... 1.2.1 Đa hình enzym ứng dụng để nghiên cứu đa hình di truyền muỗi 1.2.2 Di truyền tế bào ứng dụng nghiên cứu đa hình di truyền 13 1.2.3 Đại c-ơng PCR ứng dụng nghiên cứu đa hình di truyền