Nghiên cứu tổng hợp protein NS1 của virus dengue ứng dụng phát triển sinh phẩm chẩn đoán

Nghiên cứu tổng hợp protein NS1 của virus dengue ứng dụng phát triển sinh phẩm chẩn đoán Nghiên cứu tổng hợp protein NS1 của virus dengue ứng dụng phát triển sinh phẩm chẩn đoán Nghiên cứu tổng hợp protein NS1 của virus dengue ứng dụng phát triển sinh phẩm chẩn đoán luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Chu Thị Minh Hải NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP PROTEIN NS1 CỦA VIRUS DENGUE ỨNG DỤNG PHÁT TRIỂN SINH PHẨM CHẨN ĐỐN Chun ngành: Cơng nghệ sinh học LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN: PGS.TS TRƯƠNG QUỐC PHONG HÀ NỘI - 2018 Hà Nội - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn công trình tơi nghiên cứu, học viên Chu Thị Minh Hải, chuyên ngành Thạc sĩ Công nghệ sinh học, Viện công nghệ Sinh học, Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội hoàn thành hướng dẫn PGS.TS Trương Quốc Phong Một số nhiệm vụ nghiên cứu thành tập thể đồng cho phép sử dụng.Các kết trình bày luận văn trung thực chưa công bố luận văn khác Tác giả luận văn Chu Thị Minh Hải i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, cố gắng nỗ lực thân, nhận ủng hộ, giúp đỡ hướng dẫn tận tình thầy giáo, gia đình bạn bè Đầu tiên tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Trương Quốc Phong – Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, người hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu thực đề tài, người dạy kiến thức quý báu thực tiễn thái độ, phương pháp làm việc khoa học Tôi xin cảm ơn giúp đỡ, bảo động viên anh/chị /em làm phịng thí nghiệm proteomic, Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Họ tạo điều kiện tốt cho tơi q trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Viện công nghệ Sinh học, Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội giảng dạy suốt năm học qua Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè người thân, họ người sát cánh, động viên vượt qua khó khăn để hồn thành luận văn cách tốt Do điều kiện, khả thời gian thực đề tài có hạn đề tài khơng thể tránh khỏi sai sót Tơi mong nhận đóng góp thầy bạn để đề tài hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Học viên Chu Thị Minh Hải ii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cảm ơn Lời cam đoan Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình MỞ ĐẦU Chƣơng I: TỔNG QUAN 1.1.Tình hình dịch bệnh sốt xuất huyết giới Việt nam 1.1.1.Tình hình dịch bệnh sốt xuất huyết giới 1.1.2.Tình hình dịch SXHD diễn khu vực Đơng Nam Á 1.1.3.Tình hình dịch bệnh SXHD diễn Việt Nam 1.1.4 Diễn biến thể lượng virus Dengue máu người bênh sốt xuất huyết ……………………………………………………………… ….10 1.2 Đặc điểm virus Dengue 12 1.2.1 Đặc điểm hình thái cấu trúc di truyền virus Dengue 12 1.2.2 Đặc điểm protein virus Dengue 14 1.2.2.1 Protein cấu trúc 14 1.2.2.2 Protein không cấu trúc 14 1.3 Protein NS1 virus Dengue 15 1.3.1 Đặc điểm protein NS1 16 1.3.2.Vai trò ứng dụng NS1 19 1.3.2.1.Ứng dụng tạo vaccine chống SXHD 19 1.3.2.2 NS1 mục tiêu cho thuốc chống virus 20 1.3.2.3.Ứng dụng chẩn đoán DENV 20 iii 1.4 Một số phương pháp chẩn đoán sốt xuất huyết Dengue 21 1.4.1 Phương pháp chẩn đoán lâm sàng cận lâm sàng 22 1.4.1.1 Sốt xuất huyết Dengue 22 1.4.1.2 Sốt xuất huyết Dengue có dấu hiệu cảnh báo 23 1.4.1.3 Sốt xuất huyết Dengue nặng 23 1.4.2 Phương pháp phân lập virus 23 1.4.3 Phương pháp chẩn đoán dựa phát acid nucleic 24 1.4.3.1 Phương pháp RT-PCR 24 1.4.3.2 Phương pháp Real-time RT-PCR 25 1.4.4 Chẩn đoán qua xét nghiệm huyết 25 1.4.4.1 Phương pháp ngăn ngưng kết hồng cầu(Hemagglutination Inhibition) 25 1.4.4.2 Phương pháp miễn dịch enzyme phát kháng thể IgM (MACELISA)………………… 26 1.4.4.3 Phương pháp chẩn đoándựa protein kháng nguyên NS1 27 Chƣơng II: VẬT LỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1.Vật liệu 32 2.1.1 Mẫu RNA virus Dengue 32 2.1.2.Vector tách dòng 32 2.1.3.Vector biểu 33 2.1.4.Vật chủ biểu 34 2.2 Mơi trường – Hóa chất 35 2.3 Thiết bị 36 2.4 Phương pháp nghiên cứu 36 2.4.1 Phương pháp vi sinh 36 2.4.1.1 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật 36 2.4.1.2 Phương pháp giữ giống vi sinh vật 37 2.4.1.3 Phương pháp tạo tế bào khả biến 37 2.4.1.4 Biểu protein NS1 tái tổ hợp vi khuẩn E coli BL21(DE3) 38 iv 2.4.2 Phương pháp sinh học phân tử 38 2.4.2.1 Phương pháp tạo cDNA mã hóa gen NS1 enzyme phiên mã ngược38 2.4.2.2 Phương pháp khuếch đại gen mã hóa NS1 PCR 39 2.4.2.3 Phương pháp tách chiết DNA plasmid 40 2.4.2.4 Phương pháp tạo cấu trúc pJET1.2::NS1 41 2.4.2.5 Biến nạp vào tế bào E coli 42 2.4.2.6 Cắt DNA plasmid enzyme giới hạn 42 2.4.2.7 Tinh vector pET22b(+) đoạn gen mã hóa NS1 43 2.4.2.8 Thiết kế vector biểu pET22b(+)::NS1 44 2.4.3 Phương pháp hóa sinh 45 2.4.3.1 Phương pháp điện di gel agarose 45 2.4.3.2 Phương pháp điện di SDS – PAGE 45 2.4.3.3 Phương pháp tách chiết protein thể tan 46 2.4.3.4 Phương pháp tách chiết protein thể vùi 47 2.4.3.5 Phương pháp Western blot 47 2.4.3.6 Phương pháp tinh protein 48 2.4.4 Phương pháp Tin-Sinh học 49 2.4.4.1 Phương pháp thiết kế mồi 49 2.4.4.2 Phương pháp sử dụng phần mềm MultAlin 50 2.4.4.3 Phương pháp sử dụng phần mềm NEBcutter V2.0 50 2.4.4.4 Phương pháp sử dụng phần mềm FastPCR 50 2.4.4.5 Phương pháp sử dụng phần mềm BLAST 51 2.4.4.6 Phương pháp sử dụng phần mềm Translate Tool 51 2.4.4.7 Phương pháp sử dụng phần mềm Quantity One 50 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53 3.2 Kết RT-PCR khuếch đại gen mã hóa NS1 56 3.3 Kết tách dòng gen mã hóa NS1 57 3.4 Kết tạo cấu trúc biểu mang gen mã hóa protein NS1 58 3.4.1 Xử lý vector pET22b pJET1.2::ns1 enyme giới hạn 59 v 3.4.2 Chèn gen ns1 vào vector pET22b biến nạp vào E.coli 60 3.5 Chọn dòng E.coli mang cấu trúc biểu pET22b::ns1 61 3.5.1 Kết kiểm tra plasmid PCR với mồi đặc hiệu cho gen ns1 62 3.5.2 Kiểm tra plasmid cách cắt enzyme giới hạn 62 3.5.3 Giải trình tự để kiểm tra cấu trúc biểu pET22b::ns1 63 3.6 Biểu protein NS1 E.coli 66 3.7 Khảo sát điều kiện biểu protein NS1 tái tổ hợp 67 3.7.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng - IPTG 67 3.7.2 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống 68 3.7.3 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ 69 3.7.4 Khảo sát ảnh hưởng thời gian cảm ứng 70 3.8 Kết tinh Protein 68 3.9 Ứng dụng chế tạo thử nghiệm que thử phát nhanh kháng thể đặc hiệu kháng virus Dengue từ huyết 69 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AP : Alkaline Phosphatase AuNPs : Gold nanoparticles (hạt nano vàng) BCIP : 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-Phosphate BLAST : Basic Local Alignment Search Tool bp : Base pairs (cặp bazo nitơ) cDNA : Complementary Deoxyribonucleic acid (DNA bổ sung) DI : Deion E.coli : Escherichia coli ELISA : Enzyme-Linked ImmonuSorbent Assay (Thử nghiệm hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme) EtBr : Ethidium Bromide HCSD : Hội chứng sốc Dengue HI : Hemagglutination Inhibition (phương pháp ức chếngưng kết hồng cầu) IgG : Immunoglobulin G IgM : Immunoglobulin M IPTG : Isopropyl β-D-1-Thioglactopyranoside Kb : Kilo base kDa : Kilo Dalton LB : Luria Bertani (môi trường LB) NPT : Nitro Blue Tetrazolium vii NSP : Non-Structural Protein (protein phi cấu trúc) OD : Optical Density (mật độ quang) PAGE : Polyacrylamide Gel Electrophoresis (điện di gel polyacrylamide) PBS : Phosphate Buffered Saline (dung dịch đệm muối phosphat) PCR : Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) PVDF : Polyvinylidene fluoride RNA : Ribonucleic acid R-Nase : Ribonuclease RT-PCR : Revese Transcription Polymerase Chain Reaction (Phản ứng phiên mã ngược) SD : Sốt Dengue SDS : Sodium Dodecyl Sulfate Sol : Solution SXHD : Sốt xuất huyết Dengue TAE : Tris - Axit acetic - EDTA TEMED : Tera Mehylethylen Ediamine WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) viii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Thơng tin trình tự hai đoạn mồi thiết kế đặc hiệu gen ns1 virus Dengue 55 Bảng 3.2 Kết tinh gen NS1 vector pET22b sau cắt enzyme giới hạn 60 ix pET22b (5493 bp) băng có kích thước 1kb (1056 bp) tương ứng với kích thước gen ns1 Qua hai phương án kiểm tra, chúng tơi khẳng định dòng khuẩn lạc đánh số 10 kiểm tra mang cấu trúc biểu pET22b::ns1 3.5.3 Giải trình tự để kiểm tra cấu trúc biểu pET22b::ns1 Để khẳng định liệu gen nằm vector pET22b có thật mã hóa cho protein NS1 virus Dengue type hay không gen chèn vào có khung đọc mở hay khơng chúng tơi thực giải trình tự plasmid dịng số 10 Quá trình giải trình tự sử dụng cặp mồi T7 promotor T7 Terminator, hai mồi thiết kế có trình tự trùng với trình tự hai đầu vector pET22b Kết giải trình tự thể hình 3,9 Kết thu cho cho thấy rằng, gen chèn vào vector pET22b hai vị trí cắt enzyme giới hạn BamHI SalI Trên trình tự thấy vùng RBS (ribosme binding site) vector pET22b Tiếp tục, trình tự đem phân tích so sánh với ngân hàng gen NCBI để xác định đoạn gen chèn vào có mã hóa cho protein NS1 hay khơng Kết so sánh với ngân hàng gen NCBI thể Hình 3.10 63 Hình 9: Kết giải trình tự đoạn gen chèn vector pET22b(+)và trình tự axit amin suy diễn đoạn gen giải trình tự (RBS-vị trí bám ribosome; BamHI SalI vị trí cắt hai enzyme giới hạn) 64 Hình 10: Kết so sánh trình tự gen chèn vào vector pET22b nghiên cứu với trình tự gen NCBI Kết cho thấy, trình tự gen nghiên cứu có độ tương đồng đến 99% so với trình tự gen mã hóa cho protein NS1 virus Dengue ngân hàng gen NCBI Như vậy, gen chèn vào vector biểu pET22b nghiên cứu gen mã hóa cho protein NS1 virus Dengue, yêu cầu đặt ban đầu nghiên cứu Để xác định liệu gen chèn vào vector có khung đọc mở hay khơng, chúng tơi lấy trình tự gen kiểm tra lại công cụ “Translate Tool” (Hình 3.9) Kết cho thấy gen ns1 chèn vào vector chiều khung đọc mở vector Với kết này, gen mã hóa cho Protein NS1 virus Dengue biểu E.coli Chủng E.coli mang cấu trúc biểu pET22b::ns1 chủng đánh số 10 chủng chọn lọc Như vậy, tạo thành công chủng E.coli có khả biểu cho protein NS1 virus Dengue Tiếp theo, tiến hành biểu tối ưu điều kiện biểu protein NS1 E.coli 65 3.6 Biểu protein NS1 E.coli Dòng vi khuẩn E.coli BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp pET22b(+)::ns1 nuôi cấy môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh Ampicillin nồng độ 100μg/ml, 37°C, lắc 120 vịng/phút, qua đêm Từ dịch ni qua đêm, tiếp tục cấy chuyển sang môi trường LB có bổsung Ampicillin 100μg/ml, ni 37°C, lắc 120 vòng/phút, Sau3 giờ, tiến hành bổ sung chất cảm ứng IPTG để đạt đến nồng độ cuối 0,5mM Tiếp tục nuôi cảm ứng 37°C, lắc 120 vịng/phút Sau thu sinh khối, xử lý điện di biến tính gel SDS – PAGE Theo thiết kế, protein NS1 tái tổ hợp biểu protein dung hợp gồm trình tự dẫn pelB His-Tag có kích thước khoảng 46 kDa Kết điện di cho thấy xuất băng protein đậm có kích thước lớn 40 kDa (Hình 3.11A), tương đương với kích thước NS1 Hình 11: A- Kết điện di SDS-PAGE mẫu protein thu từ dòng E.coliBL21(DE3) tái tổ hợp mang cấu trúc pET22b::ns1 Đường chạy 1, phổ protein dịch chiết từ E coli mang cấu trúc pET22::ns1; Đường chạy 2, phổ protein dịch chiết từ E coli không mang genns1; B- Kết western blot mẫu protein tương ứng 66 Mặt khác, để chắn việc biểu protein NS1, tiến hành thực phương pháp lai Western blot với kháng thể bậc sử dụng kháng thể từ chuột kháng đuôi His-Tag Kháng thể bậc kháng thể từ dê kháng kháng thể chuột pha loãng 1/50.000 Trên Western blot, xuất băng vị trí có kích thước tương ứng với kích thước protein NS1 theo lý thuyết(Hình3.11B) Như vậy, từ kết khẳng định chúng tơi biểu thành công protein NS1 tái tổ hợp virus Dengue vi khuẩn E.coli 3.7 Khảo sát điều kiện biểu protein NS1 tái tổ hợp Để protein NS1 tái tổ hợp biểu tốt hơn, tiếp tục tiến hành thêm nghiên cứu số điều kiện để nuôi cấy chủng E.coli BL21(DE3) mang cấu trúc tái tổ hợp pET22b::ns1 Các nội dung khảo sát thực nghiên cứu bao gồm: Khảo sát nồng độ chất cảm ứng IPTG; Tỷ lệ cấp giống; Thời gian cảm ứng khảo sát nhiệt độ biểu 3.7.1 Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ chất cảm ứng - IPTG Đoạn gen mã hóa cho protein NS1 chèn vào hệ thống vector pET22b(+) biểu vật chủ vi khuẩn E.coli nên IPTG yếu tố định đến biểu protein NS1 Nếu nồng độ chất cảm ứng IPTG q khơng đủ để kích thích việc tạo protein NS1, nhiều gây ức chế việc tạo protein NS1 Do vậy, cần phải khảo sát để chọn nồng độ IPTG thích hợp cho biểu protein NS1 tái tổ hợp Để xác định nồng độ IPTG thích hợp cho biểu protein NS1 tái tổ hợp E.coli tiến hành thử nghiệm ởcác nồng độ IPTG tương ứng 0mM; 0,05 mM; 0,1 mM; 0,3 mM; 0,5 mM; 0,7 mM; 1,0 mM; 1,3 mM 1,5 mM Các điều kiện khác cần thiết cho biểu protein NS1 tái tổ hợp khơng thay đổi (lắc 120 vịng/phút, nhiệt độ 37°C, thời gian cảm ứng giờ) 67 Hình 12: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ IPTG đến biểu protein NS1 vi khuẩn E.coli Đường chạy 1-8 tương ứng với nồng độ IPTG là0,05 mM; 0,1 mM; 0,3 mM; 0,5 mM; 0,7 mM; 1,0 mM; 1,3 mM 1,5 mM Kết điện di protein (Hình 3.12) cho thấy, tổng hợp protein NS1khơng có thay đổi nhiều dải nồng độ IPTG khảo sát (0,05-1,5 mM) Tuy nhiên, lượng protein NS1 thu cao nồng độ 0,3 mM, chúng tơi chọn nồng độ IPTG thích hợp cho biểu NS1 E.coli 0,3 mM 3.7.2 Khảo sát ảnh hƣởng tỷ lệ cấp giống Sau chọn nồng độ IPTG tối ưu cho việc biểu NS1, tiến hành nghiên cứu thêm tỷ lệ cấp giống vào mơi trường ni cấy Trong thí nghiệm này, chúng tơi tiến hành hoạt hóa chủng E.coli mang cấu trúc pET22b::ns1 hoạt hóa qua đêm sau tiến hành cấp giống theo tỷ lệ 1% đến 10% theo OD vào môi trường tiến hành bổ sung IPTG với nồng độ 0,3 mM, nhiệt độ nuôi 37°C, lắc 120 vòng/phút Trên sở so sánh lượng protein NS1 biểu cấp giống với tỷ lệ khác nhau, chúng tơi chọn nồng độ cấp giống thích hợp 3% tương đương với OD canh trường ban đầu 0,21 Kết thí nghiệm thể Hình 3.14 68 Hình 13: Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống đến biểu protein NS1 E.coli 3.7.3 Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ Đã có nhiều nghiên cứu trước cho thấy rằng, nhiệt độ ảnh hưởng đến tốc độ tổng hợp protein khả cuộn gấp protein biểu vi khuẩn E.coli Cụ thể, nhiệt độ thấp, việc tổng hợp protein có khả giảm hình thành cấu trúc dạng thể vùi protein Bởi vì, nhiệt độ thấp tốc độ sinh trưởng E.coli chậm lại, protein tổng hợp chậm nên protein có thời gian để cuộn gấp cấu trúc chúng, làm tăng tính tan protein Ngược lại, nhiệt độ tối ưu cho việc sinh trưởng E.coli lại làm protein tái tổ hợp biểu nhiều dạng thể vùi Vì vậy, để xác định nhiệt độ tổng hợp protein NS1 phù hợp, tiến hành khảo sát tổng hợp protein điều kiện nhiệt độ 16°C, 25°C, 37°C Kết thể Hình 3.14 69 kDa 75 – NS1 48 – 25 – 5.9 5.8 5.8 6.3 6.2 7.4 9.5 9.9 10.3r% NS1 Hình 14: Khảo sát ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ đến biểu protein NS1 vi E.coli Sau biểu hiện, tiến hành xử lý thu protein theo phương pháp khác xử lý thu protein dạng thể tan, dạng thể vùi dạng tổng thể (bao gồm thể tan thể vùi) để so sánh biểu NS1 nhiệt độ khác dạng khác Đúng theo dự đốn, nhiệt độ tăng lượng protein NS1 dạng thể vùi biểu nhiều hơn, nhiệt độ thấp lượng protein NS1 thể tan lại nhiều Ngoài ra, qua lượng protein tổng số ta thấy rằng, lượng protein NS1 biểu nhiệt độ 37°C cao Do vậy, chọn nhiệt độ 37°C làm nhiệt độ cảm ứng thích hợp cho biểu protein NS1 (Hình 3.14) 3.7.4 Khảo sát ảnh hƣởng thời gian cảm ứng Một yếu tố quan trọng không trình biểu protein tái tổ hợp vi khuẩn E.coli thời gian cảm ứng Sau chọn yếu tố khác, tiến hành khảo sát thời gian cảm ứng IPTG để sinh protein NS1 E.coli 70 Cụ thể, sau nuôi để đạt OD 0.8-1.0, tiến hành bổ sung IPTG vào nuôi tiếp với thời gian 0h, 1h, 2h, 3h, 4h, 5h sau tiến hành thu sinh khối xử lý thu protein Nhiệt độ tỷ lệ cấp giống cố định theo điều kiện khảo sát thí nghiệm trước Kết khảo sát thể Hình 3.15 cho thấy chủng E.coli BL21(DE3) mang vector pET22b(+)::ns1 tổng hợp protein NS1 tăng dần theo thời gian đạt cực đại sau giờ, mức độ biểu protein NS1 thứ sau bổ sung chất cảm ứng khơng có thay đổi nhiều so với thứ Từ kết trên, chọn thời gian cảm ứng thời gian thích hợp cho việc tổng hợp protein NS1 vi khuẩn E.coli BL21(DE3) 0h 1h 2h 3h 4h 5h M kDa – 120 – 80 – 60 rNS1 – 40 – 30 – 20 8.0 9.0 9.8 10.6 11.3 11.6 % rNS1 Hình 15: Khảo sát ảnh hưởng thời gian cảm ứng đến biểu protein NS1 vi khuẩn E.coli 3.8 Kết tinh protein NS1 tái tổ hợp Sau khảo sát điều kiện biểu protein NS1 tái tổ hợp, tiếp tục tinh protein NS1 Kết điện di protein cho thấy dịch chiết protein thô xuất nhiều băng protein có băng protein NS1 đậm kích thước khoảng 46kDa (Hình 3.16) 71 NS1 Hình 3.16: Kết tinh protein NS1 Dịch chiết protein thô từ E.coli mang cấu trúc biểu pET22b::ns1; 2.Dịch protein thu sau gắn với Niken; Dịch sau tinh NS1 từ mẫu dịch chiết thô số Ở đường chạy số mẫu dịch thu sau ủ với Niken xuất tất băng protein mẫu dịch chiết thô ngoại bào trừ băng protein NS1 giảm nhiều, điều chứng tỏ NS1 giữ lại cột Trong mẫu rửa giải EDTA (đường chạy số 3) xuất băng protein NS1 đậm băng khác giảm nhiều Từ kết đưa đến kết luận protein NS1 tinh từ dịch chiết sinh khối vi khuẩn E.coli Qua phương pháp định lượng dựa phần mềm QuantityOne, băng protein chứa kháng nguyên sau tinh chiếm 88% tổng lượng protein có mẫu 3.9 Ứng dụng chế tạo thử nghiệm que thử phát nhanh kháng thể đặc hiệu kháng virus Dengue từ huyết Theo nguyên lý trình bày, kháng nguyên NS1 tái tổ hợp cộng hợp với hạt nano vàng với hàm lượng μg rNS1/miếng cộng hợp (conjugate) Kháng thể IgG từ chuột kháng lại IgM người phun lên màng cellulose vạch kiểm tra Kết thử nghiệm que thử với mẫu huyết từ bệnh nhân nhiễm Dengue thể hình 3.17 72 phút 10 phút 15 phút Hình 3.17 Kết chế tạo que thử nhanh phát kháng thể kháng virus Dengue từ huyết Kết thí nghiệm cho thấy có vạch hồng xuất vị trí phun kháng thể IgG chuột kháng IgM người Vạch hồng xuất que thử đậm lên dần theo thời gian quan sát rõ thời gian 15 phút sau nhỏ mẫu Kết chứng minh rằng, có bắt cặp kháng thể IgM huyết người nhiễm virus Dengue với phức hợp kháng nguyên rNS1-hạt vàng (gọi Phức hợp I), tạo phức hợp IgM người – Phức hợp I (gọi Phức hợp II) Do vậy, Phức hợp II di chuyển tới vị trí phun kháng thể IgG chuột kháng lại IgM người bị giữ lại tạo thành phức hợp IgG chuột – Phức hợp II xuất màu hồng tía hạt vàng Phức hợp II có màu bị giữ lại Như vậy, nghiên cứu thử nghiệm thành công tạo que thử phát kháng thể đặc hiệu kháng lại virus Dengue từ mẫu huyết người bệnh nhiễm Dengue, dựa protein NS1 tái tổ hợp tạo nghiên cứu này.Việc mở triển vọng phát triển que thử nhanh phát virus Dengue giúp chẩn đoán sớm bệnh nhân sốt xuất Việt Nam Mặt khác, kết cho thấy kháng nguyên NS1 tái tổ hợp tạo nghiên cứu có cấu trúc kháng nguyên tương tự với kháng nguyên NS1 virus Dengue tự nhiên bắt cặp đặc hiệu với kháng thể IgM kháng lại virus Dengue người bệnh nhiễm Dengue 73 Với kết trên, nghiên cứu tạo sở cho việc tạo que thử phát nhanh virus Dengue người Không phát kháng thể kháng virus Dengue đặc hiệu mà NS1 tái tổ hợp nghiên cứu dùng để gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể, sau dùng kháng thể tạo để tạo que thử phát kháng nguyên NS1 người bệnh Với nguyên lý phát kháng nguyên NS1 Dengue, que thử chế tạo có khả phát sớm bệnh nhân nhiễm Dengue từ ngày bị bệnh, thời điểm phương pháp phát kháng thể hay PCR hay phân lập virus chưa có khả thực Điều góp phần lớn cho việc đưa phác đồ điều trị hợp lý Bác sĩ, tiết kiệm nhiều thời gian công sức đảm bảo sức khỏe người bệnh 74 CHƢƠNG V KIẾN LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết thu được, đưa số kết luận sau: Thiết kế thành công cặp mồi đặc hiệu gen ns1týp I virus Dengue tách dịng thành cơng gen ns1 vector tách dịng pJET::ns1 vector biểu pET22::ns1 Xác định trình tự gen ns1 týp I từ virus Dengue phân lập Việt Nam Biểu thành cơng gen mã hóa protein NS1 virus Dengue E coli;Xác định điều kiện biểu thích hợp tinh thành công protein NS1 tái tổ hợp Thử nghiệm ứng dụng protein NS1 tái tổ hợp để chế tạo thành công que thử phát kháng thể IgM người kháng virus Dengue từ huyết bệnh nhân sốt xuất huyết Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu để sử dụng protein NS1 tái tổ hợp chế tạo que thử phát nhanh IgM IgG đặc hiệu virus Dengue huyết bệnh nhân sốt xuất huyết Ứng dụng protein NS1 tái tổ hợp để gây đáp ứng miễn dịch động vật tạo kháng thể đặc hiệu để ứng dụng tạo que thử nhanh phát kháng nguyên NS1 huyết bệnh nhân sốt xuất huyết 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng Anh Akey, D.L., et al (2015), Structure‐guided insights on the role of NS1 in flavivirus infection Bioessays 37(5): pp 489-494 Amorim, J.H., et al (2014), The dengue virus non-structural protein: Risks and benefits Virus research 181: pp 53-60 Fan, J., Y Liu, and Z Yuan (2014), Critical role of Dengue Virus NS1 protein in viral replication Virologica Sinica 29(3): pp 162-169 Ha, D.Q., et al (2003), Virological and serological surveillance of dengue epidemics in 19 Provinces in Southern Viet Nam during 2001 Dengue Bulletin 27: pp 46-51 Kassim, F.M., et al (2011), Use of dengue NS1 antigen for early diagnosis of dengue virus infection Southeast Asian J Trop Med Public Health 42(3): pp 562-569 Miller, S., et al (2007), The non-structural protein 4A of dengue virus is an integral membrane protein inducing membrane alterations in a 2K-regulated manner Journal of Biological Chemistry 282(12): pp 8873-8882 Muller, D.A., et al (2012), Structure of the dengue virus glycoprotein nonstructural protein by electron microscopy and single-particle analysis Journal of General Virology 93(4): pp 771-779 Muller, D.A and P.R Young (2013), The flavivirus NS1 protein: molecular and structural biology, immunology, role in pathogenesis and application as a diagnostic biomarker Antiviral research 98(2): pp 192-208 Mustafa, M., et al (2015), Discovery of fifth serotype of dengue virus (DENV-5): A new public health dilemma in dengue control Medical Journal Armed Forces India 71(1): pp 67-70 10 Perera, R and R.J Kuhn (2008), Structural proteomics of dengue virus Current opinion in microbiology 11(4): pp 369-377 76 11 Pok, K.-Y., et al (2010), Evaluation of nonstructural antigen assays for the diagnosis and surveillance of dengue in Singapore Vector-Borne and Zoonotic Diseases 10(10): pp 1009-1016 12 Qi, R.-f., L Zhang, and C.-w Chi (2008), Biological characteristics of dengue virus and potential targets for drug design Acta biochimica et biophysica Sinica 40(2): pp 91-101 13 Samuel, P.P and B Tyagi (2006), Diagnostic methods for detection & isolation of dengue viruses from vector mosquitoes Indian journal of medical research 123(5): pp 615 14 Scaturro, P., et al (2015), Dengue virus non-structural protein modulates infectious particle production via interaction with the structural proteins PLoS Pathog 11(11): pp e1005277 15 WHO (2012), Global strategy for dengue prevention and control 2012-2020 16 WHO (2014), Comprehensive Guidelines for Prevention and Control of Dengue and Dengue Haemorrhagic Fever: Revised and Expanded Edition WHO Regional Office for South East Asia 17 WHO (2014), A global brief on vector-borne diseases 18 WHO, et al (2009), Dengue: guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control World Health Organization 19 Zhang, C (2004), Problems encountered in the molecular detection of dengue viruses Dengue Diagnostics: Proceedings of an International Workshop Tài liệu tham khảo tiếng Việt 20 Bé, P.V and H.T Mỹ (2009), Xét nghiệm ELISA phát kháng nguyên NS1 chẩn đoán sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue Tạp chí Y học Thành Phố Hồ Chí Minh 13(1): pp 249-255 21 Phòng, C.Y.T.D., Cục Y tế dự phòng báo cáo tình hình SXH lên Bộ Y tế, in 22 http://www.nhandan.com.vn/megastory/2017/08/16/ 23 http://lamhuuhoa.blogspot.com/2017/08/ 77 ... Xuất phát từ tình hình đó, chúng tơi thực đề tài ? ?Nghiên cứu tổng hợp Proteins NS1 virus Dengue ứng dụng phát triển sinh phẩm chẩn đoán? ?? để phục vụ phát triển sinh phẩm chẩn đoán nhanh virus Dengue. .. Dengue phù hợp điều kiện Việt Nam Mục tiêu đề tài: - Tạo protein NS1 tái tổ hợp để ứng dụng phát triển kit chẩn đoán nhanh Nội dung nghiên cứu: - Tách dịng gen mã hóa protein NS1 từ virus Dengue. .. không phù hợp chẩn đoán điều trị, chủ yếu phục vụ cho công tác giám sát dịch tễ Kỹ thuật sinh học phân tử Nested RT-PCR, real-time RT-PCR để chẩn đoán virus Dengue phát triển ứng dụng chẩn đoán Tuy