Nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme tirosinase của rong gelidiella acerosa thu hoạch tại vùng biển khánh hòa và thử nghiệm khả năng chống biến đen tôm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM - o0o - ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYME TYROSINASE CỦA RONG GELIDIELLA ACEROSA THU HOẠCH TẠI VÙNG BIỂN KHÁNH HÒA VÀ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG CHỐNG BIẾN ĐEN TÔM Giảng viên hƣớng dẫn 1: ThS Vũ Lệ Quyên Giảng viên hƣớng dẫn 2: TS Nguyễn Thế Hân Sinh viên thực hiện: Lâm Thanh Ngọc Mã số sinh viên: 57132565 Khánh Hòa - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM - o0o - ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYME TYROSINASE CỦA RONG GELIDIELLA ACEROSA THU HOẠCH TẠI VÙNG BIỂN KHÁNH HÒA VÀ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG CHỐNG BIẾN ĐEN TÔM GVHD 1: ThS Vũ Lệ Quyên GVHD 2: TS Nguyễn Thế Hân SVTH: Lâm Thanh Ngọc MSSV: 57132565 Khánh Hòa - Tháng 6/2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan nghiên cứu thân Các số liệu, kết nghiên cứu trình bày luận án hoàn toàn trung thực chƣa có cơng bố nghiên cứu khoa học Khánh Hòa , Ngày tháng năm 2019 Sinh viên thực Lâm Thanh Ngọc i LỜI CẢM ƠN Sau ba tháng nghiên cứu thực tập phịng thí nghiệm, đến em hồn thành xong đồ án tốt nghiệp, với nổ lực cố gắng thân với giúp đỡ quý báu từ phía thầy giáo, gia đình bạn bè Để hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp này.Trƣớc tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn đến thầy cô giáo trƣờng đại học Nha Trang, thầy cô khoa công nghệ thực phẩm tận tình truyền đạt cho em kiến thức bổ ích suốt thời gian em học tập trƣờng Đặc biệt em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Th.S Vũ Lệ Quyên T.S Nguyễn Thế Hân trực tiếp tận tình hƣớng dẫn em suốt thời gian thực đồ án tốt nghiệp Cuối em xin chân thành cảm ơn thầy cô quản lí phịng thí nghiệm điều kiện thuận lợi cho em dụng cụ máy móc để thực đồ án tốt nghiệp Tuy có nỗ lực, cố gắng c ng với kiến thức c n hạn chế, viết khơng tránh khỏi sai sót Rất mong nhận đƣợc lời góp Qu thầy để đồ án tốt nghiệp em đƣợc hoàn thiện với chất lƣợng tốt Em xin chân thành cảm ơn Khánh H a, ngày tháng năm 2019 Sinh viên thực Lâm Thanh Ngọc ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT viii LỜI MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan rong biển tôm thẻ chân trắng 1.1.1 Giới thiệu chung rong biển 1.1.2 Nguồn lợi rong biển 1.1.3 Giới thiệu rong đỏ Gelidiella acerosa 1.2 Tổng quan nguyên liệu tôm 1.2.1 Nguyên liệu tôm thẻ chân trắng .6 1.2.2 Tình hình ni trồng xuất tôm 1.2.3 Thành phần hóa học tơm 1.3 Các biến đổi tôm sau chết 10 1.3.1 Các biến đổi cảm quan .11 1.3.2 Biến đổi hóa học 11 1.3.3 Biến đổi vi sinh vật 13 1.3.4 Biến đổi enzyme 13 1.4 Tổng quan enzyme tyrosinase, tƣợng biến đen biện pháp ngăn chặn 15 1.4.1 Enzyme tyrosinase 15 1.4.2 Hiện tƣợng biến đen biện pháp ngăn chặn biến đen tôm 16 1.5 Các phƣơng pháp tách chiết dung môi 17 1.5.1 Cơ sở trình tách chiết 17 1.5.2 Phƣơng pháp ngấm kiệt (Percolation) 17 1.5.3 Phƣơng pháp ngâm dầm (Marceration) 18 1.5.4 Tách chiết phƣơng pháp chiết hồi lƣu 18 1.5.5 Phƣơng pháp lôi nƣớc 18 1.6 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến trình chiết 19 iii 1.6.1 Dung môi chiết 19 1.6.2 Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu 19 1.6.3 Thời gian chiết 19 1.6.4 Nhiệt độ chiết 19 1.6.5 Độ ẩm nguyên liệu 20 1.7 Tổng quan tình hình nghiên cứu liên quan đến nội dung đề tài 20 1.7.1 Nghiên cứu giới .20 1.7.2 Nghiên cứu nƣớc 22 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 24 2.1.1 Nguyên liệu rong 24 2.1.2 Nguyên liệu tôm 24 2.2 Hóa chất thuốc thử 24 2.3 Dụng cụ, thiết bị .24 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm phƣơng pháp nghiên cứu 25 2.4.1 Quy trình bố trí thí nghiệm tổng quát 25 2.4.2 Thí nghiệm xác định điều kiện chiết thích hợp 26 2.4.3 Bố trí thí nghiệm tách phân đoạn qua loại dung mơi có độ phân cực khác từ rong đỏ Gelidiella acerosa 29 2.4.4 Thí nghiệm sử dụng dịch chiết từ rong nguyên liệu đỏ Gelidiella acerosa để hạn chế q trình biến đen tơm thẻ chân trắng trình bảo quản lạnh 30 2.5 Phƣơng pháp phân tích 32 2.5.1 Phƣơng pháp phân tích số thành phần hóa học mẫu rong Gelidiella acerosa 32 2.5.2 Phƣơng pháp phân tích số hợp chất hóa học dịch chiết rong Gelidiella acerosa 32 2.5.3 Xác định hiệu xuất chiết .32 2.5.4 Phƣơng pháp cho điểm 34 2.5.5 Phƣơng pháp cảm quan biến đen tôm 34 2.5.6 Phƣơng pháp xử lý số liệu 34 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Định lƣợng định tính số thành phần có rong đỏ Gelidiella acerosa 35 iv 3.1.1 Kết định lƣợng số thành phần hóa học có rong rong Gelidiella acerosa 35 3.1.2 Kết định tính số hợp chất có dịch chiết rong Gelidiella acerosa.37 3.2 Ảnh hƣởng điều kiện chiết đến khả ức chế enzyme tyrosinase rong Gelidiella acerosa 38 3.2.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ chiết đến khả ức chế enzyme tyrosinase rong Gelidiella acerosa 38 3.2.2 Ảnh hƣởng thời gian chiết đến khả ức chế enzyme tyrosinase rong Gelidiella acerosa 41 3.3 Phân đoạn dung mơi cho hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase cao .42 3.4 Nghiên cứu khả hạn chế biến đen tôm thẻ chân trắng trình bảo quản lạnh dịch chiết từ rong đỏ Gelidiella acerosa 45 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 4.1 Kết luận 50 4.2 Kiến nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC 59 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh rong đỏ Gelidiella acerosa Hình 1.2 Hình ảnh tơm thẻ chân trắng Hình 1.3 Sơ đồ biến đồi động vật thủy sản sau chết 11 Hình 1.4 Quá trình oxy hóa phenol thơng qua enzyme tyrosinase 15 Hình 1.5 Sơ đồ chế biến đen tôm 17 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu tổng quát 25 Hình 2.2 Sơ đồ thí nghiện ảnh hƣởng nhiệt độ chiết 27 Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm ảnh hƣởng thời gian chiết 28 Hình 2.4 Sơ đồ thí nghiệm tách phân đoạn qua dung mơi phân cực khác 29 Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm hạn chế biến đen tơm dịch chiết từ rong đỏ Gelidiella acerosa 31 Hình 3.1 Hình ảnh màu sắc hợp chất có rong Gelidiella acerosa 37 Hình 3.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ chiết đến khả ức chế enzyme tyrosinase dịch chiết rong đỏ Gelidiella acerosa 39 Hình 3.3 Ảnh hƣởng thời gian chiết đến khả ức chế enzyme tyrosinase dịch chiết rong đỏ Gelidiella acerosa 41 Hình 3.4.Biến đổi điểm cảm quan biến đen tôm thẻ chân trắng bảo quản lạnh nồng độ khác 30 phút 45 Hình 3.5.Biến đổi điểm cảm quan chất lƣợng tôm thẻ chân trắng bảo quản lạnh nồng độ khác 30 phút 46 Hình 3.6 Hình ảnh tơm qua ngày bảo quản 48 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần hóa học thịt tơm so với thịt động vật khác Bảng 1.2 Thành phần hóa học số loại tôm tƣơi .10 Bảng 2.1 Tiến hành định tính số hợp chất thiên nhiên cao chiết methanol từ mẫu rong nguyên liệu .32 Bảng 3.1 Thành phần hóa học rong Gelidiella acerosa 35 Bảng 3.2 Bảng định tính nhóm chất hữu có rong Gelidiella acerosa .37 Bảng 3 Giá trị IC50 phân đoạn dịch chiết từ rong đỏ Gelidiella acerosa 43 vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Ý nghĩa FAO Tổ chức Lƣơng thực Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (Food and Agriculture Organization) VASEP Hiệp hội chế biến xuất thủy sản Việt Nam (Vietnam Association of Seafood Exporters and Producers) CEVA Trung tâm nghiên cứu châu Âu rong biển (European research center for algae) SPSS Phần mềm phân tích thống kê (Statistical Package for the Social Sciences) NL/DM Nguyên liệu/dung môi PPO Polyphenoloxydase ATP ADP AMP 10 IMP 11 HxR Inosin 12 Hx Hipoxanthin Adenosintriphosphat Adenosidephosphat Adenosinmonophosphat Inosinmonophosphat viii 22 Bucić-Kojić, A., Planinić, M., Tomas, S., Jokić, S., Mujić, I., Bilić, M., & Velić, D (2011) Effect of extraction conditions on the extractability of phenolic compounds from lyophilised fig fruits (Ficus carica L.) Polish Journal of Food and Nutrition Sciences, 61(3), 195-199 23 Chakraborty, S., & Santra, S C (2008) Biochemical composition of eight benthic algae collected from Sunderban 24 Chang, T S., Ding, H Y., Tai, S S K., & Wu, C Y (2007) Mushroom tyrosinase inhibitory effects of isoflavones isolated from soygerm koji fermented with Aspergillus oryzae BCRC 32288 Food chemistry, 105(4), 1430-1438 25 Chang, V S., & Teo, S S (2016) Evaluation of heavy metal, antioxidant and anti-tyrosinase activities of red seaweed (Eucheuma cottonii) International Food Research Journal, 23(6), 2370 26 Critchley, A T., & Ohno, M (Eds.) (1993) Seaweed cultivation and marine ranching Kanagawa International Fisheries Training Center, Japan International Cooperative Agency 27 Cvetković, D., & Marković, D (2008) Stability of carotenoids toward UVirradiation in hexane solution Journal of the serbian chemical society, 73(1) 28 De Queiroz, I N L., Rodrigues, J A G., Quinderé, A L G., Holanda, M L., Pereira, M G., & Benevides, N M B (2014) Inhibition of coagulation proteases and thrombosis and sub-chronic toxicological study of a sulfated polysaccharidic fraction from the red alga Gelidiella acerosa Acta Scientiarum Biological Sciences, 36(4), 393-401 29 Devi, K P., Suganthy, N., Kesika, P., & Pandian, S K (2008) Bioprotective properties of seaweeds: in vitro evaluation of antioxidant activity and antimicrobial activity against food borne bacteria in relation to polyphenolic content BMC complementary and alternative medicine, 8(1), 38 30 DeWitt III, B J (1987) Improved methodology for the estimation of sulfur dioxide in shrimp Texas A and M Univ., College Station (USA) 31 Elsie, B H., Dhanarajan, M S., & Sudha, P N (2011) Nvitro screening of secondary metabolites and antimicrobial activities of ethanol and acetone 53 extract from red seaweed Gelidium Acerosa International Journal of Chemistry Research, 27-29 32 Eom, S H., Kang, M S., & Kim, Y M (2008) Antibacterial activity of the phaeophyta Ecklonia stolonifera on methicillin-resistant Staphylococcus aureus Fisheries and aquatic sciences, 11(1), 1-6 33 Fernando, I P., Sanjeewa, K K., Samarakoon, K W., Lee, W W., Kim, H S., Kim, E A., & Lee, H S (2017) FTIR characterization and antioxidant activity of water soluble crude polysaccharides of Sri Lankan marine algae Algae, 32(1), 75-86 34 Food and Agriculture Organization of the United Nations Fisheries Department (1997) The State of World Fisheries and Aquaculture 1996 Food and agriculture organization of the United Nations 35 Han, J., & Gong, G M (2016, February) Optimization of ultrasound-assisted extraction conditions for active substances with anti-tyrosinase activity from tomatoes In Advanced Materials and Structural Engineering: Proceedings of the International Conference on Advanced Materials and Engineering Structural Technology (ICAMEST 2015), April 25-26, 2015, Qingdao, China (p 147) CRC Press 36 Han, T C., Nam, N D., Hing Anh, L T., Vu, T A., & Man, P V (2016) Enzyme assisted extraction of polyphenols from the old tea leaves J Nutr Health Sci, 3(4), 404 37 Haroon, A M., Szaniawska, A., Normant, M., & Janas, U (2000) The biochemical composition of Enteromorpha spp from the Gulf of Gdańsk coast on the southern Baltic Sea Oceanologia, 42(1) 38 Hyun, S K., Lee, W H., Jeong, D M., Kim, Y., & Choi, J S (2008) Inhibitory effects of kurarinol, kuraridinol, and trifolirhizin from Sophora flavescens on tyrosinase and melanin synthesis Biological and Pharmaceutical Bulletin, 31(1), 154-158 39 Kaehler, S., & Kennish, R (1996) Summer and winter comparisons in the nutritional value of marine macroalgae Marina, 39(1-6), 11-18 54 from Hong Kong Botanica 40 Kang, H S., Kim, H R., Byun, D S., Son, B W., Nam, T J., & Choi, J S (2004) Tyrosinase inhibitors isolated from the edible brown algaEcklonia stolonifera Archives of pharmacal research, 27(12), 1226 41 Kannu, K D., Rani, K S., Jothi, R A., Gowsalya, G U., & Ramakritinan, C M (2014) In-vivo anticancer activity of red algae (Gelidiela acerosa and Acanthophora spicifera) International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, 5(8), 3347 42 Khairy, H M., & El-Shafay, S M (2013) Seasonal variations in the biochemical composition of some common seaweed species from the coast of Abu Qir Bay, Alexandria, Egypt Oceanologia, 55(2), 435-452 43 Komatsu, Y., Suematsu, S., Hisanobu, Y., Saigo, H., Matsuda, R., & Hara, K (1993) Effects of pH and temperature on reaction kinetics of catechins in green tea infusion Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 57(6), 907-910 44 Kumar, M., Kumari, P., Trivedi, N., Shukla, M K., Gupta, V., Reddy, C R K., & Jha, B (2011) Minerals, PUFAs and antioxidant properties of some tropical seaweeds from Saurashtra coast of India Journal of Applied Phycology, 23(5), 797-810 45 Kumbhar, R D., Rode, S P., & Sabale, A B (2014) Phycochemical screening of seaweeds from Sindhudurg district of Maharashtra Int J Pharm Sci Rev Res, 29, 77-81 46 Lakmal, H C., Samarakoon, K W., Lee, W., Lee, J H., Abeytunga, D T U., Lee, H S., & Jeon, Y J (2014) Anticancer and antioxidant effects of selected Sri Lankan marine algae Journal of the National Science Foundation of Sri Lanka, 42(4) 47 Lee, D U., Weon, K Y., Nam, D Y., Nam, J H., & Kim, W K (2016) Skin protective effect of guava leaves against UV‐ induced melanogenesis via inhibition of ORAI1 channel and tyrosinase activity Experimental dermatology, 25(12), 977-982 48 Lee, D W., & Lee, S C (2012) Effect of heat treatment condition on the antioxidant and several physiological activities of non-astringent persimmon fruit juice Food Science and Biotechnology, 21(3), 815-822 55 49 Liyana-Pathirana, C., & Shahidi, F (2005) Optimization of extraction of phenolic compounds from wheat using response surface methodology Food chemistry, 93(1), 47-56 50 Manivannan, K., Thirumaran, G., Karthikai Devi, G., Anantharaman, P., & Balasubramanian, T (2009) Proximate composition of different group of seaweeds from Vedalai Coastal waters (Gulf of Mannar): Southeast Coast of India Middle-East Journal of scientific research, 4(2), 72-77 51 McDermid, K J., & Stuercke, B (2003) Nutritional composition of edible Hawaiian seaweeds Journal of Applied Phycology, 15, 513–524 52 Mercer, J P., Mai, K S., & Donlon, J (1993) Comparative studies on the nutrition of two species of abalone, Haliotis tuberculata Linnaeus and Haliotis discus hannai Ino I Effects of algal diets on growth and biochemical composition Invertebrate reproduction & development, 23(2-3), 75-88 53 Murugan, K., & Iyer, V V (2013) Differential growth inhibition of cancer cell lines and antioxidant activity of extracts of red, brown, and green marine algae In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal, 49(5), 324-334 54 Nguyen, H., & Kim, S M (2012) Antioxidative, anticholinesterase and antityrosinase activities of the red alga Grateloupia lancifolia extracts African Journal of Biotechnology, 11(39), 9457-9467 55 Nielsen, S S (Ed.) (2010) Food analysis (pp 139-141) New York: Springer 56 Nobel Surya Pandidurai, R., Kalavathi, K., & Perumal, P (2014) Studies on antibacterial activity of seaweeds, Enteromorpha intestinalis (Linnaeus) and Gelidiella acerosa (forsskal) from Puducherry and rameswaram (southeast coast of India) 57 Paudel, P., Wagle, A., Seong, S H., Park, H J., Jung, H A., & Choi, J S (2019) A New Tyrosinase Inhibitor from the Red Alga Symphyocladia latiuscula (Harvey) Yamada (Rhodomelaceae) Marine drugs, 17(5), 295 58 Perva-Uzunalić, A., Škerget, M., Knez, Ž., Weinreich, B., Otto, F., & Grüner, S (2006) Extraction of active ingredients from green tea (Camellia sinensis): Extraction efficiency of major catechins and caffeine Food chemistry, 96(4), 597-605 56 59 Rao, g V., rao, k S., annamalai, t., radhakrishnan, n., & mukhopadhyay, t (2009) Chemical constituents and mushroom tyrosinase inhibition activity of chloroxylon swietenia leaves Turkish journal of chemistry, 33(4), 521-526 60 Ratnasooriya, W D., Premakumara, G A S., & Tillekeratne, L M V (1994) Post-coital contraceptive activity of crude extracts of Sri Lankan marine red algae Contraception, 50(3), 291-299 61 Reilly, A., & Bernarte, M (1984) Storage stability of brackishwater prawns during processing for export Food Technology Australia., 36(6), 283-286 62 Robledo, D., & Pelegrin, Y F (1997) Chemical and mineral composition of six potentially edible seaweed species of Yucatan Botanica Marina, 44, 301– 306 63 Rydberg, J (Ed.) (2004) Solvent extraction principles and practice, revised and expanded CRC press 64 Sai-Ut, S., Benjakul, S., Kraithong, S., & Rawdkuen, S (2015) Optimization of antioxidants and tyrosinase inhibitory activity in mango peels using response surface methodology LWT-Food Science and Technology, 64(2), 742-749 65 Shanmugam, A., & Palpandi, C (2008) Biochemical composition and fatty acid profile of the green alga Ulva reticulata Asian J Biochem, 3(1), 26-31 66 Spigno, G., Tramelli, L., & De Faveri, D M (2007) Effects of extraction time, temperature and solvent on concentration and antioxidant activity of grape marc phenolics Journal of food engineering, 81(1), 200-208 67 Suffness, M (1989) “Development of antitumor natural products at the National Cancer Institute”, Gann Monograph on Cancer Research, 36, 21-44 68 Suganthy, N., Nisha, S A., Pandian, S K., & Devi, K P (2013) Evaluation of Gelidiella acerosa, the red algae inhabiting South Indian coastal area for antioxidant and metal chelating potential Biomedicine & Preventive Nutrition, 3(4), 399-406 69 Sun, l P., zhang, b., zhao, d Q., & xu, h (2007) Optimization of Ethanol Extraction of Polyphenols from Pomegranate Peel [J] Packaging and Food Machinery, 57 70 SW A Naqvi, S., Kamat, S Y., Fernandes, L., Reddy, C V G., Bhakuni, D S., & Dhawan, B N (1981) Screening of some marine plants from the Indian coast for biological activity Botanica Marina, 24(1), 51-56 71 Syad, A N., Shunmugiah, K P., & Kasi, P D (2012) Assessment of anticholinesterase activity of Gelidiella acerosa: implications for its therapeutic potential against Alzheimer’s disease Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2012 72 Syad, A N., Shunmugiah, K P., & Kasi, P D (2013) Seaweeds as nutritional supplements: Analysis of nutritional profile, physicochemical properties and proximate composition of G acerosa and S wightii Biomedicine & Preventive Nutrition, 3(2), 139-144 73 Türkyılmaz, M., Tağı, Ş., Dereli, U., & Özkan, M (2013) Effects of various pressing programs and yields on the antioxidant activity, antimicrobial activity, phenolic content and colour of pomegranate juices Food chemistry, 138(2-3), 1810-1818 74 Velioglu, Y S., Mazza, G., Gao, L., & Oomah, B D (1998) Antioxidant activity and total phenolics in selected fruits, vegetables, and grain products Journal of agricultural and food chemistry, 46(10), 4113-4117 75 Vinatoru, M (2001) An overview of the ultrasonically assisted extraction of bioactive principles from herbs Ultrasonics sonochemistry, 8(3), 303-313 76 Vivek, M., Kumar, P S., Steffi, S., & Sudha, S (2011) Biogenic silver nanoparticles by Gelidiella acerosa extract and their antifungal effects Avicenna journal of medical biotechnology, 3(3), 143 77 Waghmare, v N Phytochemical constituents and bioactivity of extract obtained from algae gelidium spps 78 Wangthong, S., Palaga, T., Rengpipat, S., Wanichwecharungruang, S P., Chanchaisak, P., & Heinrich, M (2010) Biological activities and safety of Thanaka (Hesperethusa crenulata) stem bark Journal of ethnopharmacology, 132(2), 466-472 79 Yadav, M., Chatterji, S., Gupta, S K., & Watal, G (2014) Preliminary phytochemical screening of six medicinal plants used in traditional medicine Int J Pharm Pharm Sci, 6(5), 539-542 58 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Xác định hàm lƣợng ẩm phƣơng pháp sấy nhiệt độ 105C theo tiêu chuẩn 3700-1990 Nguyên tắc: Dùng nhiệt độ cao làm bay hết nƣớc thực phẩm Cân khối lƣợng thực phẩm trƣớc sau sấy khô từ tính phần trăm nƣớc có thực phẩm Cách tiến hành: Sấy cốc đến khối lƣợng không đổi Cốc đƣợc rửa đem sấy khô sau lấy làm nguội bình hút ẩm đem cân Cân 1g rong biển khô cho vào cốc sấy khô đến khối lƣợng không đổi, cho cốc vào tủ sấy, sấy đến nhiệt độ 105- 120C vòng 4-6 Lấy cốc sấy làm nguội bình hút ẩm sau đem cân đến khối lƣợng khơng đổi Tính kết quả: Hàm lƣợng ẩm rong đƣợc tính theo cơng thức: X= (G1-G2)/(G1-G) * 100% Trong đó: X : hàm lƣợng ẩm (%) G : khối lƣợng cốc ( g ) G1 : khối lƣợng cốc sấy mẫu trƣớc sấy ( g ) G2 : khối lƣợng cốc sấy mẫu sau sấy ( g ) Kết xác định độ ẩm nguyên liệu Số lần lập Khối lƣợng cốc nung (G) 38,0221 37,2210 Khối lƣợng cốc + mẫu trƣớc sấy (G1) 43.0339 41,9213 Khối lƣợng cốc + mẫu sau sấy (G2) 41,8012 40,7512 59 Độ ẩm (X%) Trung bình 24,6 24,89 24,75 ±0,29 % Phụ lục 2: Định lƣợng chất béo theo phƣơng pháp Folch Mục đích: Phƣơng pháp d ng để xác định hàm lƣợng chất béo sản phẩm rắn lỏng Nguyên tắc: Dùng hỗn hợp dung môi Chloroform:Methanol với tỷ lệ 2:1 để hòa tan tất chất béo mẫu, tách lớp chiết qua phễu lọc nhiều lần Sau làm bay hết dung môi, cân chất béo cịn lại tính hàm lƣợng lipid 100g mẫu Dụng cụ hóa chất:  Dụng cụ: Tủ hút, máy đồng hóa, máy quay chân khơng, tủ sấy, phễu chiết 250ml 100ml, bình cầu, bình định mức 5ml, cốc/ống nghiệm, giấy lọc, giá đỡ dụng cụ chiết  Hóa chất: Methanol 50% (CH3OH:H2O tỷ lệ 1:1), Chloroform, NaCl 0,9% Tiến hành:  Chuẩn bị mẫu: Cân 1g mẫu trộn đều, cho vào cốc/ ống nghiệm cao thể tích 20ml Cho thêm 600µl nƣớc cất, 5ml Methanol Ngâm mẫu dụng môi khoảng 10 phút Đồng hóa mẫu máy phút Lọc, lấy dich lọc Cho thêm 5ml Methanol 10ml Chloroform vào ống nghiệm đồng hóa mẫu 20 giây Lọc, lấy dịch lọc cho vào phễu chiết Cho thêm 7,5 ml NaCl 0.9% vào dung dịch mẫu Đảo trộn ngƣợc phễu chiết nhiều lần giữ mẫu 5⁰ C khoảng để dịch mẫu phân thành lớp  Chiết rút lipid: Tách lớp dƣới (chứa hàm lƣợng lipid hịa tan dung mơi) cho chảy vào phễu chiết tích 50ml Loại bỏ lớp dịch phía (chứa phần hóa hợp gồm tạp chất đƣợc loại nhƣ nƣớc, muối, protein, ) Xác định thể tích chiết (Vdm) Cho thêm ml CH3OH 50% vào mẫu phễu chiết 100ml Đảo trộn ngƣợc phễu chiết nhiều lần Cho phân chia tách thành hai lớp lắng qua đêm 5⁰ C  Định lƣợng lipid: Lớp dƣới đƣợc rút chảy xuống bình cầu 100ml Cô quay chân không làm bay dung mơi bình cầu 37⁰ C đến cịn lại thể tích khoảng 1ml Hịa tan mẫu 60 lại lƣợng thể tích nhỏ Chloroform (chỉ cho phép tiếp xúc nhỏ lƣợng mẫu làm khơ với khơng khí) Chuyển mẫu qua bình định mức 5ml, tráng rửa bình cầu nhiều lần định mức Chloroform vừa đủ 5ml Sau xử lý xong, dung dịch đƣợc mang xác định hàm lƣợng lipid tổng  Xác định hàm lƣợng lipid tổng: Lấy xác 2ml (Vm) dung dịch mẫu xử lý, cho vào cốc/ống thủy tinh có nắp 4ml đƣợc sấy đến khối lƣợng không đổi Cho vào tủ sấy đến khối lƣợng không đổi Lipid tổng số (%) tính theo cơng thức: % XT (g/g) = ((m₁ -m₀ )*Vdm)/(m*Vm)*100 % X (g/g) = ((m₁ -m₀ )*Vdm)/(m*T*Vm)*100 Trong đó: XT: Hàm lƣợng lipid tổng số tính theo trọng lƣợng tƣơi mẫu X: Hàm lƣợng lipid tổng số tính theo hàm lƣợng khô mẫu m₁ : Trọng lƣợng cân cốc/ ống nghiệm mẫu sau sấy (g) m₀ : Trọng lƣợng cân cốc/ ống nghiệm khối lƣợng không đổi (g) m: Trọng lƣợng cân mẫu Vdm: Thể tích định mức sau xử lý (ml) Vm: Thể tích mẫu sau xử lý lấy để sấy (ml) T: Thành phần khô mẫu, T = (100-W)/100 W: Độ ẩm mẫu (%) Phụ lục 3: Bảng điểm đánh giá cảm quan tôm nguyên liệu Số đốm đen xuất Không có Nhẹ ( lên đến 20% phần trăm bề mặt tơm bị ảnh hƣởng) Trung bình( 20-40% bề mặt tôm bị ảnh hƣởng) Nặng ( 40- 60% bề mặt tôm bị ảnh hƣởng) Nghiêm trọng ( 60-80% bề mặt tôm bị ảnh hƣởng) Đặc biệt nghiêm trọng ( 80-100% bề mặt tôm bị ảnh hƣởng) 61 Điểm 10 Phụ lục 4: Bảng điểm cảm quan chất lƣợng tôm nguyên liệu Điểm 10 Mùi Ngoại dạng Đầu xanh xám, hoàn Mùi tự nhiên đặc toàn gắn chật vào thân, trƣng lồi tơm thân có màu đặc trƣng tôm, đuôi vàng trắng Đầu xám đen gắn Mùi tự nhiên nhẹ, có chặt vào thân, thân xám mùi đặc trƣng đen với giải lồi tơm có xám đen đến đen mùi rong biển với vệt vàng Đầu xám đặc trƣng bị đen, thân xám với M i đặc trƣng nhẹ dải màu tối, đuôi đen c ng với dải màu vàng sáng Đầu xám đặc trƣng bị đen, thân xám với Trung tính đến vơ vị dải màu tối, đuôi đen c ng với dải màu vàng sáng Đầu có biến đen gần vùng mắt gan, vỏ long nhẹ, thân xám bị Mùi amoniac nhẹ biến đen nhẹ, đuôi xanh đen với giải màu vàng bẩn Đầu gần nhƣ hồn tồn đen khơng cịn dính Hơi khai m i tôm vào thân, thân xám nhẹ với giải màu nâu đỏ nhẹ, đuôi nâu tới nâu đen Đầu hồn tồn đen dính lỏng lẻo vào thân, thân Mùi khai chuyển màu đỏ xám với băng màu nâu đen, đuôi màu đen Đầu hồn tồn đen dính lỏng lẻo vào thân, thân Mùi khai, mùi chuyển màu đỏ xám sunfua nhẹ với băng màu nâu đen, đuôi màu đen Mùi amoniac, Đầu hoàn toàn đen sunfua khó chịu tách khỏi thân, thân đỏ 62 Cơ thịt Chắc, đàn hồi, vỏ cứng, thân Khá chắc, đàn hồi nhẹ Thân vỏ mềm Thân vỏ mềm Thân vỏ mềm Thân vỏ mềm Thân vỏ mềm Thân vỏ mềm Mềm nhũn, vỏ nhũn xốp Mùi sunfua mạnh Mùi thối mạnh, khó chịu xám xen lấn vệt đen nâu, đuôi đen Đầu hoàn toàn đen tách khỏi thân, thân đỏ xám xen lấn vệt đen nâu, đen Đầu hồn tồn đen gần nhƣ hồn toàn long đầu khỏi thân, thân đen với vệt màu nâu tối đen c ng với chấm đen tồn thân tơm, đen Mềm nhũn, vỏ nhũn xốp Mềm nhũn, vỏ nhũn xốp Phụ lục 5: Ảnh hƣởng thời gian đến khả ức chế enzyme tyrosinase nồng độ 3,5 mg/ml Thời gian (phút) Khả ức chế tyrosinase (%) Độ hấp thụ bƣớc sóng 475nm Mẫu Mẫu Control Control Blank Blank Lần Lần 2 15 0,203 0,200 0,296 0,297 0,018 0,018 37,5 38,51 30 0,197 0,194 0,296 0,297 0,019 0,023 39,86 42,23 45 0,190 0,191 0,296 0,297 0,037 0,035 48,31 47,30 60 0,175 0,171 0,296 0,297 0,052 0,053 58,44 60,13 75 0,192 0,195 0,296 0,297 0,025 0,023 43,58 41,90 TB 38,01± 0,71a 41,05± 1,68b 47,81 ± 0,71c 59,29± 1,20d 42,74± 1,19b Phụ lục 6: Ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả ức chế enzyme tyrosinase nồng độ 3,5 mg/ml Nhiệt độ (C) Khả ức chế tyrosinase(%) Độ hấp thụ bƣớc sóng 475nm Mẫu Mẫu Control Control Blank Blank Lần Lần 30 0,248 0,256 0,289 0,288 0,026 0,026 23,18 20,40 40 0,205 0,210 0,289 0,288 0,028 0,028 38,75 50 0,168 0,163 0,289 0,288 0,038 0,039 55,01 63 TB 21,80± 1,96a 37,89± 37,02 1,22b 57,09 56,05± 60 0,152 0,148 0,289 0,288 0,050 0,050 64,70 66,08 70 0,166 0,163 0,289 0,288 0,050 0,049 59,86 60,55 80 0,193 0,195 0,289 0,288 0,035 0,035 45,32 44,63 90 0,199 0,205 0,289 0,288 0,027 0,027 41,86 39,79 1,47d 65,39± 0,98f 60,21± 0,49e 52,42± 1,71c 40,83± 1,46b Phụ lục 7: Kết đánh giá khả ức chế enzyme tyrosinase dịch chiết rong đỏ G acerosa Bảng PL7: Kết xác định khả ức chế enzyme tyrosinase dịch chiết rong đỏ G.acerosa Nồng độ (mg/ml) 2,5 3,5 Khả ức chế tyrosinase(%) Mẫu Mẫu Control Control Blank Blank Lần Lần TB 2 2 33,38± 0,299 0,227 0,314 0,313 0,019 0,020 32,90 33,86 0,68ª 39,16± 0,215 0,212 0,314 0,313 0,022 0,024 38,39 39,93 1,09ᵇ 48,88± 0,189 0,183 0,314 0,313 0,025 0,025 47,60 50,15 1,80c 58,78± 0,143 0,137 0,314 0,313 0,029 0,030 62,93 65,81 0,91e 55,27± 0,147 0,151 0,314 0,313 0,020 0,020 59,42 58,14 1,36d Độ hấp thụ bƣớc sóng 475nm 64 Hình PL7: Kết xác định khả ức chế enzyme tyrosinase dịch chiết rong đỏ G.acerosa Phụ lục 9: Phân đoạn dung môi cho hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase cao Bảng PL9.1 3,5 (mg/ml) n-hexan etyl acetate butanol nƣớc mẫu mẫu blank1 blank2 0,201 0,271 0,277 0,272 0,198 0,266 0,275 0,275 0,004 0,022 0,011 0,014 0,005 0,023 0,012 0,016 control control % ức % ức chế chế 0,276 0,277 28,62 30,32 0,282 0,281 11,70 13,52 0,281 0,281 5,34 6,41 0,281 0,279 8,19 7,17 Bảng PL9.2 3,0 (mg/ml) mẫu1 mẫu n-hexan etyl acetate butanol nƣớc 0,221 0,271 0,278 0,281 0,219 0,269 0,276 0,279 blank 0,005 0,015 0,008 0,014 blank 0,006 0,017 0,009 0,015 65 control control % ức chế 0,276 0,277 21,74 0,282 0,281 9,22 0,281 0,281 3,91 0,284 0,283 5,99 % ức chế 23,10 10,32 4,98 6,71 Bảng PL9.3 Nồng độ % ức chế (mg/ml) TB 22,42 3,0 9,77 3,5 4,45 4,0 Bảng PL9.4: 4,0 (mg/ml) n-hexan etyl acetate butanol nƣớc % ức chế TB % ức chế TB SD1 SD2 SD3 29,65 12,61 5,87 35,80 19,54 9,96 0,97 0,78 0,75 0,94 1,29 0,75 0,93 0,96 0,50 mẫu mẫu 0,187 0,244 0,265 0,262 0,186 0,249 0,267 0,264 blank blank 0,008 0,019 0,013 0,017 0,01 0,021 0,013 0,017 control control 0,276 0,277 0,282 0,281 0,281 0,281 0,284 0,283 % ức chế 35,14 20,21 10,32 13,73 % ức chế 36,46 18,86 9,61 12,72 Phụ lục 10: Tổng hợp điểm cảm quan biến đen q trình bảo quản tơm ngun liệu Ngày thứ 12 Mẫu 10 mg/ml 10 9,2 7,2 3,2 1,6 Đối chứng 10 8,4 6,4 1,6 20 mg/ml 10 9,6 7,6 4,4 2,4 Phụ lục 11: Tổng hợp điểm cảm quan chất lƣợng trình bảo quản tơm ngun liệu Ngày thứ Mẫu Đối chứng 10 (mg/ml) 20 (mg/ml) 10 10 10 9,2 9,4 9,6 6,8 7,6 7,8 4,8 6,0 6,4 12 2,4 3,4 3,8 66 67 ... tài: Nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase loài rong đỏ Gelidiella acerosa thu hoạch vùng biển Khánh Hòa thử nghiệm khả chống biến đen tôm bảo quản lạnh  Nội dung nghiên cứu:  Nghiên cứu. .. chọn đề tài ? ?Nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase loài rong đỏ Gelidiella acerosa thu hoạch vùng biển Khánh Hòa thử nghiệm khả chống biến đen tôm thẻ chân trắng sau thu hoạch? ??’  Mục... tyrosinase từ rong đỏ Gelidiella acerosa  Nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase phân đoạn dung môi chiết từ rong đỏ Gelidiella acerosa  Nghiên cứu khả hạn chế biến đen tôm thẻ chân trắng