Đây là lý do nhóm nghiên cứu đặt mục tiêu kết hợp combretastatin, một hợp chất kháng ung thư, và celecoxib, một chất kháng viêm theo cơ chế COX2, là các chất bắt nguồn ch[r]
(1)CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-
NGUYỄN THỊ THÚY HẰNG
NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM, KHÁNG UNG THƢ CÁC HỢP CHẤT LAI COXIB – COMBRETASTATIN
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1.PGS TS Ngô Quốc Anh PGS.TS Vũ Đình Hồng
(2)Phịng Nghiên cứu phát triển dƣợc phẩm
Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS TS Ngô Quốc Anh PGS TS Vũ Đình Hồng
Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3:
Luận án bảo vệ hội đồng chấm luận án cấp Nhà nước Học Viện Khoa học Cơng nghệ
Vào hồi
Có thể tìm thấy luận án tại:
(3)MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết luận án
Ung thư nhóm bệnh liên quan đến việc phân chia tế bào cách vô tổ chức tế bào có khả xâm lấn mô khác cách phát triển trực tiếp vào mô lân cận di chuyển đến nhiều vị trí khác (di căn) Theo thống kê tổ chức Ung thư toàn cầu GLOBOCAN năm 2018 nước có 300.000 người sống chung với ung thư, có 164.671 ca mới, 114.871 người tử vong bệnh Tồn cầu có khoảng 23 triệu người mắc, năm có 14 triệu người mắc triệu trăm nghìn người tử vong Tổ chức Y tế giới (WHO) xếp Việt Nam nằm 50 nước thuộc top đồ ung thư
Việc nghiên cứu tìm thuốc điều trị ung thư lại tác dụng phụ hướng giới khoa học quan tâm Trong số phương pháp điều trị nay, hóa trị liệu phương pháp điều trị ung thư sử dụng nhiều thuốc kháng ung thư - gây độc tế bào Một loại thuốc chống ung thư, sử dụng ngày hóa trị liệu, tác động đến chu kỳ tế bào để ức chế phát triển tế bào ung thư sau gây chết tế bào theo chương trình (apoptosis)
(4)tiêu vi ống sử dụng lâm sàng, cần tìm kiếm tác nhân khắc phục hạn chế kháng thuốc tác dụng phụ không mong muốn liệu pháp [3]
2 Mục tiêu luận án
1 Thiết kế cấu trúc hợp chất lai coxib - combretastatin Tổng hợp hợp chất lai coxib - combretastatin
3 Sàng lọc hoạt tính kháng ung kháng viêm hợp chất lai Xác định chế kháng viêm kháng ung thư hợp chất lai Tiến hành docking phân tử hợp chất lai coxib - combretastatin với hai đích tác dụng COX2 tubulin
3 Những nội dung nghiên cứu chủ yếu luận án
- Nghiên cứu tổng hợp hợp chất dị vịng lai hóa combretastatin celecoxib - Nghiên cứu tổng hợp hợp chất dị vòng aza- podophyllotoxin
- Xác định cấu trúc hợp chất tổng hợp - Sàng lọc hoạt tính chất tổng hợp
- Nghiên cứu sâu mặt chế tác dụng tác động lên chu kỳ tế bào số chất tiêu biểu
- Nghiên cứu khẳng định tương quan mơ hình cấu trúc lai hóa mặt hóa học sinh học lớp chất mục tiêu
(5)CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
Tổng quan trình bày chung hợp chất kháng ung thư theo chế ức chế tubulin, sơ lược chế tubulin Nhóm hợp chất theo chế tubulin đề tài đáng quan tâm lĩnh vực nghiên cứu thuốc chống ung thư Các hợp chất combretastatin có hoạt tính sinh học phong phú ứng dụng điều trị số bệnh ung thư, chúng biết đến với hoạt tính gây độc tế bào theo chế ức chế trùng hợp tubulin vị trí colchicin [2] Cho đến hợp chất điều trị ung thư theo chế ứng dụng rộng rãi hướng nghiên cứu nhận nhiều quan tâm
- Tổng quan hợp chất combretastatin, thuộc lớp chất cis-stilben, nguồn phong phú hợp chất dẫn đường việc tìm kiếm loại thuốc mới, hợp chất điển resveratrol combretastatin A-4 phosphat thử nghiệm để điều trị bệnh Alzheimer ung thư lâm sàng Các stilben phân lập gần cho thấy có nhiều hoạt tính sinh học đa dạng, bao gồm tính chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống sốt rét, gây độc tế bào, bảo vệ gan chống viêm Combretastatin A-4 (CA4) xem tác nhân gây độc tế bào tiềm ức chế mạnh trùng hợp vi ống cách gắn vào điểm gắn kết colchicin tubulin CA-4 có độc tính cao nhiều mơ hình tế bào ung thư, cấu trúc mục tiêu quan tâm
(6)nhất hợp chát pyrazole ứng dụng thương mại celecoxib, chất biết đến với hoạt tính kháng viêm mạnh, thuốc ức chế chọn lọc COX2 thông qua hoạt động prostaglandin gây q trình viêm đau mà khơng tác dụng lên prostaglandin COX1 có tác dụng bảo vệ đường tiêu hóa Hơn Celecoxib ức chế tăng sinh mơ hình
in vitro tế bào ung thư vú người MCF7 MDAMB-231 Một số nghiên cứu celecoxib hợp chất liên quan gây bắt giữ chu kỳ tế bào giai đoạn G0 /G1 dẫn đến tế bào chết theo chu trình apotosis, ức chế phát triển khối u ngăn chặn hình thành mạch khối u khơng có diện COX2
(7)CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1 Hóa chất thiết bị
2.1.1 Hóa chất dung mơi 2.1.2 Thiết bị nghiên cứu
2.2 Các phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp tổng hợp hữu 2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học
2.3 Tổng hợp hợp chất lai coxib- combrestatin
2.3.1 Tổng hợp dẫn chất este chất lai este coxib - combretastatin
Hình 2.2. Tổng hợp dẫn chất este hợp chất lai hóa coxib - combrestatin (i) Kiềm: t-BuOLi (3 mmol, eq), đun hồi lưu, (ii) Ethyl chlorooxoacetate (1 mmol, eq) (77), ml THF; (iii) HCl (4 mmol); đun hồi lưu, ml C2H5OH
khan; phenylhydrazin (1 mmol, eq) (78)
Tổng hợp 20 chất lai dang lai hóa dạng este coxib - combretastatin chất từ 79 đến 98
2.3.2 Tổng hợp hợp chất lai coxib - combrestastatin chứa nhóm CF3
Hình 2.5. Tổng hợp hợp lai hóa coxib - combretastatin chứa nhóm CF3
(a) 100 (1.0 mmol), 99 etyl trifluoroacetat (1,2 eq) NaH (2,5 eq) THF (5 mL), h
(8)2.3.3 Tổng hợp dẫn chất axit hợp chất lai hóa coxib - combrestatin
Hình 2.8. Tổng hợp khung lai ghép combretastatin coxib dạng axit (i) Kiềm: t-BuOLi (3 mmol, eq), đun hồi lưu, (ii) Ethyl chlorooxoacetate (1 mmol, eq), ml THF; (iii) HCl (4 mmol); đun hồi lưu, ml C2H5OH khan;
phenylhydrazin (1 mmol, eq) (78) Sản phẩm thu sau phân lập qua sắc ký cột hịa tan hệ dung mơi THF/MeOH/H2O = 3:1:1, sau NaH
(1,2 eq) thêm vào hỗn hợp Thực phản ứng 3h thu chất lai hóa dạng axit 103-122
Tổng thành cơng 20 chất lai dang lai hóa dạng axit combretastatin-coxib chất từ 103-122
2.5 Thử nghiệm hoạt tính sinh học hợp chất nghiên cứu
(9)CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Những ưu điểm việc sử dụng phân tử lai so với việc đồng thời kết hợp nhiều loại thuốc riêng lẻ cải thiện hạn chế phản ứng phụ kháng thuốc [107] Tuy có hoạt tính trội, combretastatin cịn nhiều tác dụng khơng mong muốn Đây lý nhóm nghiên cứu đặt mục tiêu kết hợp combretastatin, hợp chất kháng ung thư, celecoxib, chất kháng viêm theo chế COX2, chất bắt nguồn cho hợp chất lai với hy vọng tìm chất mang đặc điểm hoạt tính sinh học lý thú kháng ung thư kháng viêm chất gốc đồng thời gây tác dụng phụ
3.1 Thiết kế cấu trúc hoạt tính sinh học phân tử lai
3.1.1 Thiết kế cấu trúc phân tử lai
(10)Hình 3.1. Cấu trúc celecoxib, Combretastatin A4 hợp chất lai combretastatin – coxib
3.1.2 Thiết kế hoạt tính sinh học phân tử lai
(11)đích cách kết hợp ức chế chọn lọc COX2 với hoạt động phụ thuộc nitric oxide (NO) triển khai [112-114]
Trong trình viêm nhiễm, tế bào miễn dịch kích hoạt đại thực bào tiết số chất trung gian gây viêm cytokine tiền viêm, oxit nitric (NO) prostaglandin E2 (PGE2) Hơn nữa, có mối liên quan rõ ràng mức độ prostaglandin khối u vú người với phát triển di khả sống sót [115] Prostaglandin E2 tồn với nồng độ cao khối u vú thể trạng ung thư di căn, thiếu thụ thể estrogen progesterone [116-117] Do đó, khả ức chế sản xuất PGE2 coi chiến lược tốt việc thiết kế chất chống ung thư Tuy nhiên, tế bào ung thư vú MCF7 sản sinh mức PGE2 thấp theo báo cáo khác [109] Do đó, hiệu lực hoạt tính hợp chất lai thử nghiệm đáp ứng viêm gây LPS thay ức chế PGE2 MCF7 [118]
Do vậy, dòng tế bào ung thư HT-29, Hep-G2, MCF-7 khả ức chế sản sinh NO lựa chọn cơng cụ bước đầu sàng lọc hoạt tính kháng viêm lớp chất nghiên cứu Và để xác định chế kháng viêm kháng ung thư chất lai, nghiên cứu hoạt tính ức chế sản sinh PGE2, phương pháp phân tích chu kỳ tế bào, phương pháp nghiên cứu hoạt tính gây apoptosis nhờ nhuộm nhân tế bào với Hoechst 33342, nghiên cứu hoạt tính gây apotosis thị caspase ‑ 3, nghiên cứu cảm ứng apoptosis phương pháp trắc lưu tế bào nhuộm FITC-anexin V PI Sau cùng, chất chọn lọc nghiên cứu chế sinh học thử nghiệm tương tác với đích tác dụng tubulin COX2 phương pháp docking phân tử để khẳng định độ xác hoạt tính sinh học mơ hình in vitro
(12)Phương pháp bình phản ứng áp dụng để điều chế dẫn chất etyl 1,4,5-triaryl-1H pyrazole-3-cacboxylat từ ethyl oxalyl chlorid, 1,2-diarylethanon ethyl oxalyl chlorid arylhydrazin hydrochlorid (Hình 2.1, Hình 2.2, Hình 2.7, Hình 2.8) [109] Phản ứng ngưng tụ Claisen hai thành phần 1,2-diarylethanon ethyl oxalyl chloride với tác nhân kiềm sử dụng
tert-BuOLi, thu sản phẩm trung gian muối lithium ethyl 2,4-dioxo-3,4-diarylbutanoat, phản ứng tiếp tục với arylhydrazin hydrochlorid thông qua phản ứng Knorr xúc tác axit clohydric để tạo triarylpyrazole-3-cacboxylat (hợp chất lai 79 đến 98) (hợp chất lai 103 đến 122) Một chu trình điều chế dạng dẫn chất celecoxib áp dụng (Hình 2.4, Hình 2.5) 3,4,5-trimethoxyphenyl - 1,1,1-trifluoro-2,4-butanedion (43, 102) thu từ ngưng tụ Claisen dẫn xuất acetophenon etyl trifluoroacetat sau tiếp tục phản ứng với muối halogenua 4-sulfamidophenyl hydrazin để tạo thành 3,4,5-trimethoxyphenyl, chất có cấu trúc tương tự celecoxib
Theo quy trình phản ứng mơ tả Hình 2.1, Hình 2.2, 20 hợp chất lai coxib - combretastatin –đã tổng hợp thành công với hiệu suất từ 64 – 83% (Bảng 3.1) 02 hợp chất chứa nhóm CF3 với hiệu suất 95%
78% (bảng 3.2) 20 hợp chất dạng axit chất lai coxib - combretastatin với hiệu suất từ 54 – 74 % ( bảng 3.3); chất xác định cấu trúc phương pháp tinh chế phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 1D, 2D
Trong số hợp chất lai thu được, chất 79 đến 98 102 đến 122 lần tổng hợp chưa công bố trước Và 01 hợp chất công bố dùng chất so sánh celecoxib (43) biết đến với nhiều cơng trình nghiên cứu [78-79]
(13)3.3.1 Sàng lọc hoạt tính sinh học hợp chất lai coxib - combretastatin
Sàng lọc hoạt tính 20 hợp chất lai hóa coxib - combretastatin dạng este và 02 chất lai chứa nhóm CF3
Độc tính tế bào 20 hợp chất lai hóa coxib dạng este 02 hợp chất chứa nhóm CF3 đánh giá tỷ lệ ức chế phát triển tế bào ba
dòng HT-29, Hep-G2 MCF-7 phương pháp phát triển Monks cộng [120] Kết tóm tắt Bảng 3.4 theo hoạt tính giảm dần Các hoạt tính chống tăng sinh celecoxib thể tế bào ung thư người ung thư vú (MCF-7), ung thư gan (Hep-G2) ung thư trực tràng (HT-29) công bố [121-123] Trong phạm vi cơng trình nghiên cứu 12 hợp chất lai hóa 102, 96, 81, 82, 94, 93, 91, 92, 89, 90, 97, 85 thể độc tính tế bào dòng MCF-7 mạnh celecoxib năm hợp chất 102, 96, 81, 82, 94 có IC50 < 10 µM Trong số hợp chất 102, 96, 94, 93
và 97 có độc tính Hep-G2 tương đương với chất gốc celecoxib (65) Hơn nữa, 05 hợp chất lai 96, 94, 90, 97, 80 cho thấy khả chống lại tế bào HT-29 mạnh 3-6 lần so với chất gốc celecoxib hợp chất 90 có IC50 10 µM
(14)chế sản xuất NO yếu , nhấn mạnh chúng có tính an tồn tốt hệ thống tim mạch so với celecoxib [110]
Bảng 3.4. Tác dụng gây độc tế bào hợp chất lai hóa dạng este ba dòng tế bào ung thư HT-29, Hep-G2, MCF7 ức chế sản xuất NO
STT Hợp chất
R R’ R’’ IC50 (µM)
Ức chế sản xuất NO
HT-29 Hep-G2 MCF-7
1 102
3,4,5-triOMe
4-NH2SO2 1.95±0.11 43.0 ± 6.0 39.96± 3.36 4.63± 0.59
2 96 H 4-F 4-NH2SO2 81.6 ± 10.6 18.7 ± 1.7 29.37± 1.90 7.97±0.51
3 81 H H 4-CN 116.83±7.7 37.6±3.5 >254 8.20± 0.93
4 82 H H 4-NO2 129.88±15.7 21.2±2.1 >242 9.67± 0.92
5 94 H 4-OH 4-NH2SO2 92.3 ± 7.2 18.8 ± 1.5 14.51±1.36 8.90± 0.79
6 93 H 4-Br 4-NH2SO2 73.7 ± 2.6 23.5 ± 1.8 35.48±2.85 19.27±0.27
7 91 H 4-Br 4-CN 116.01±13.6 32.6± 3.0 >211 20.16± 1.83
8 92 H 4-Br 4-NO2 91.58±7.8 153.2± 10 >203 21.30± 1.40
9 89 H 4-Br 4-OMe 21.01±4.3 39.6±2.9 >209 21.51± 1.48
10 90 H 4-Br 4-CF3 > 233 10.0±0.7 75.87±4.41 21.65± 1.86
11 97 H 4-Cl 4-NH2SO2 122.2 ± 9.7 14.1 ± 37.04±4.95 23.79± 3.11
12 85 4-OMe 4-OMe 4-CF3 134.10±15.7 107± 10 >201 29.80± 2.71
13 43 4-Me 4-NH2SO2 83.59 ± 5.0 58.4 ± 3.4 37.11±2.14 30.67±3.79
14 98 H 4,6-
diOMe
4-NH2SO2 4.41±0.17 136.0 ± 12 >197 39.93± 2.64
(15)Bảng 3.5. So sánh tác dụng gây độc tế bào hợp chất lai hóa dạng axit dạng este tế bào ung thư MCF-7 ức chế sản xuất NO
16 79 H H 4-OMe 30.0±13.4 >251 21.43±1.93 43.19±4.86
17 87 4-OMe 4-OMe 4-NO2 148.85±8.4 >211 >211 48.81± 2.62
18 86 4-OMe 4-OMe 4-CN 76.42±9.4 110.3±7.0 >220 48.86± 3.13
19 84 4-OMe 4-OMe 4-OMe 67.06±3.7 160±15 >218 49.32± 1.72
20 80 H H 4-CF3 59.52±5.5 17.3±2.0 63.17± 3.01 50.66± 4.46
21 88 4-OMe 4-OMe 4-NH2SO2 103.4 ±10.5 99.0±6.3 58.57± 4.70 68.43± 7.05
22 98 H 4,6-diOH 4-NH2SO2 > 208.5 173.9 ± 12 64.03± 5.75 83.60± 3.44
L-NMMA 8.39±0.31
Ellipticine 0.18± 0.04 0.44± 0.05 0.36± 0.04
STT R R’ R’’
IC50 (µM) Este (NO) Acid (NO) Este
(MCF-7)
Acid (MCF7)
1 3,4,5-triOMe 4-NH2SO2 1.95±0.11 43.0 ± 6.0 39.96± 3.36 4.63± 0.59
2 H 4-F 4-NH2SO2 81.6 ± 10.6 194.5±7.6 7.97±0.51 187.7±9.5
3 H H 4-CN 116.83±7.7 256.7±22.1 8.20± 0.93 154.5±15.1
4 H H 4-NO2 129.88±15.7 >261.1 9.67± 0.92 187.6±10.4
5 H 4-OH 4-NH2SO2 92.3 ± 7.2 75.8±2.6 8.90± 0.79 34.6±2.6
6 H 4-Br 4-NH2SO2 73.7 ± 2.6 >202.0 19.27±0.27 149.5±7.3
7 H 4-Br 4-CN 116.01±13.6 97.9±9.4 20.16± 1.83 70.1± 4.6
8 H 4-Br 4-NO2 91.58±7.8 111.2±8.7 21.30± 1.40 34.0±6.4
(16)Ghi chú: * : Cột thống kê hoạt tính chất este
**: Cột thống kê hoạt tính chất axit
Các hợp chất lai 102, 96, 81, 82, 94 celecoxib thể hoạt tính vượt trội tiếp tục chuyển sang thử nghiệm sản sinh PGE2 nhằm sàng lọc kỹ hoạt tính kháng viêm lẫn kháng ung thư hoạt chất
3.3.2 Nghiên cứu chế kháng viêm kháng ung thư
3.3.2.1 Nghiên cứu hoạt tính ức chế sản sinh PGE2
Các hợp chất tiêu biểu 102, 96, 81, 82, 94, celecoxib tiếp tục thử nghiệm khả ức chế sản sinh PGE2
10 H 4-Br 4-CF3 > 233 80.0±6.3 21.65± 1.86 129.5±9.7
11 H 4-Cl 4-NH2SO2 122.2 ± 9.7 >220.7 23.79± 3.11 191.1±20.6
12 4-OMe 4-OMe 4-CF3 134.10±15.7 140.3±16.7 29.80± 2.71 136.0±8.4
13 4-Me 4-NH2SO2 83.59 ± 5.0 30.67±3.79 30.0±3.3
14 H 4,6- diOMe 4-NH2SO2 4.41±0.17 >208.7 39.93± 2.64 94.0±6.4
15 H H 4-NH2SO2 > 233 >239.8 40.54±2.56 178.9±12.9
16 H H 4-OMe 30.0±13.4 >271.7 43.19±4.86 209.3 ± 20.0
17 4-OMe 4-OMe 4-NO2 148.85±8.4 185.9±9.8 48.81± 2.62 31.8±3.7
18 4-OMe 4-OMe 4-CN 76.42±9.4 157.0±12.2 48.86± 3.13 83.0±10.3
19 4-OMe 4-OMe 4-OMe 67.06±3.7 145.7±15.2 49.32± 1.72 75.7±6.9
20 H H 4-CF3 59.52±5.5 109.4±5.8 50.66± 4.46 203.8 ± 5.1
21 4-OMe 4-OMe 4-NH2SO2 103.4 ±10.5 >209 68.43± 7.05 150.0±14.7
22 H 4,6-diOH 4-NH2SO2 > 208.5 >222.0 83.60± 3.44 >222.0
L-NMMA 8.39±0.31
(17)Bảng 3.7. Ảnh hưởng hợp chất thử nghiệm đến việc sản xuất PEG2 đại thực bào RAW 264.7 kích thích LPS
PGE2 (pg/ml)
Nồng độ (µM) 102 96 81 82 94 Nồng độ (µM) Celecoxib (43)
20 65.31 223.82 253.60 155.07 246.88 100 41.45
4 133.59 326.20 277.23 383.49 488.82 20 129.83
0.8 225.56 399.56 490.73 478.52 560.34 278.64
LPS 329.60
3.3.2.2 Phân tích chu kỳ tế bào
Hợp chất 96, 81, 82 94 gây tăng số lượng tế bào pha G0 /G1 giảm số lượng pha S G2 /M tương tự celecoxib Celecoxib hợp chất liên quan biết có khả ức chế phát triển khối u tạo trình apoptosis Sự bắt giữ tế bào pha G0 /G1 celecoxib xác định khơng có tham gia COX2 PGE2 [104] Mặt khác, hợp chất 102 tạo bắt giữ tế bào pha G2 M đồng thời giảm tế bào pha S Việc bắt giữ tế bào Pha G2 /M dẫn đến ngăn cản tế bào khỏi q trình ngun phân, tính thể tác nhân ức chế vi ống giống colchicin combretastatin [78] Trong trường hợp hợp chất 102, thay liên kết đôi CA4 với vòng pyrazol celecoxib mà trì gốc trimethoxybenzen CA4 quan trọng để thu tính gây độc tế bào kháng phân bào chất gốc [98, 115]
Bảng 3.8. Phần trăm tế bào theo pha hợp chất thử nghiệm với MCF7
STT Hợp chất Phần trăm tế bào theo phase (%) % G0/G1 % S % G2/M
1 Negative control
(DMSO 0,5%) 42.46 40.47 13.15
2 102 (10 µM) 40.72 35.09 21.04
3 96 (10 µM) 49.00 34.17 14.17
4 81 (10 µM) 45.22 34.46 17.45
5 82 (10 µM) 50.96 30.75 14.80
6 94 (10 µM) 49.55 34.50 14.34
(18)Đối chứng 102 96
81 82 94
Celecoxib (43)
Hình 3.3 Phân tích chu kỳ tế bào hợp chất thử nghiệm bao gồm 102, 96, 81, 82, 94 Celecoxib (43) nồng độ 10 µM MCF-7
3.3.2.3 Kết nghiên cứu hoạt tính gây apoptosis hai chất 82 và 102
(19)Nghiên cứu hoạt tính gây apoptosis hoạt chất nhờ nhuộm nhân tế bào với Hoechst 33342
Bảng 9. Phần trăm ngưng tụ phân mảnh nhân tế bào hợp chất 102 82 gây
Tế bào Apoptosis (%)
82 (20 µM) 82 (10 µM) 82 (5 µM) 102 (20 µM) 102 (10 µM) 102 (5 µM) Camptotheci n (5µM) (-) Đối chứng
5.33 ± 0.34 2.69± 0.22
2.42±
0.27 12.38± 0.96
5.18± 0.33
3.55±
0.39 22.71± 2.01
2.71± 0.29
Các mẫu nghiên cứu thu Hình ảnh tế bào MCF7 sau nhuộm Hoechst 33342 nồng độ khác nhau:
Đối chứng âm Camptothecin (5 µM)
102 (20 µM) 102 (10 µM)
(20)Hình 3.4. Hình ảnh tế bào MCF7 tác động mẫu nghiên cứu nhuộm Hoechst 33342 nồng độ khác
Nghiên cứu hoạt tính gây apotosis thị caspase ‑
Bảng 3.10. Hoạt tính caspase - 102 82
% Tế bào Apoptosis Hợp
chất 102 (20 µM) 102 (10 µM) 102 (5 µM) 82 (20µM) 82 (10 µM) 82 (5 µM) Camptothecin (5µM) (-) Đối chứng
Giá trị 1.36* 1.21* 1.01 1.08 1.12 1.11 1.67** 1.00
Độ lệch 0.033 0.013 0.037 0.023 0.056 0.040 0.020 0.070
- * P<0.05 and ** P<0.01
Nghiên cứu cảm ứng apoptosis phƣơng pháp trắc lƣu tế bào nhuộm FITC-anexin V PI
Bảng 3.11. Tỉ lệ tế bào apoptosis
Mẫu thí nghiệm % tế bào hoại tử
% tế bào
apoptosis sớm
% tế bào
apoptosis muộn
% tế bào apoptosis
ĐC âm 0.22 18.32 1.90 20.22
82 (20 µM) 1.39 18.49 4.08 22.57
82 (10 µM) 0.27 21.62 4.59 26.21
82 (5 µM) 0.16 22.74 3.27 26.01
102 (20 µM) 0.42 42.24 6.73 48.97*
102 (10 µM) 0.49 19.90 3.45 23.35
102 (5 µM) 0.27 15.84 2.17 18.01
Camptothecin (5µM) 0.08 73.83 4.96 78.79**
Ghi chú: * P<0.05; ** P<0.01
(21)µg/ml) 48h (10 µg/ml) 48h (5 µg/ml) 48h
Tế bào ủ với mẫu 102 (20 µg/ml) 48h
Tế bào ủ với mẫu 102 (10 µg/ml) 48h
Tế bào ủ với mẫu 102 (5 µg/ml) 48h
Tế bào ủ với 0.5% DMSO 48h
Tế bào ủ với µM Camptothecin 48h
Hình 3.5. Tác động mẫu nghiên cứu đến q trình apoptosis tế bào thơng qua Alexa Fluor® 488 annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit Các mẫu thử phân tích hệ thống trắc lưu tế bào Trục x thể mức độ nhuộm mầu FITC-Anexin V, trục y thể mức độ nhuộm mầu PI theo đơn vị Log
Phần kết luận xác định khả cảm ứng apoptosis mẫu nghiên cứu
(22) Mẫu 82 nồng độ thử nghiệm làm tăng nhẹ tỉ lệ tế bào giai đoạn apoptosis sớm apoptosis muộn so với đối chứng âm, đạt từ 22.57- 26.21%
Mẫu 102, nồng độ 20 µg/ml làm tăng cao tỉ lệ tế bào giai đoạn apoptosis sớm muộn so với đối chứng âm từ 18.3% đến 42.2% 1.90% đến 6.7%, cách tương ứng Ở nồng độ thấp làm tăng nhẹ (10 µg/ml 5µg/ml) tỉ lệ tế bào apoptosis so với đối chứng âm
Camptothecin - đối chứng dương tăng tỷ lệ tế bào apoptosis, đạt từ 78.79%
Mẫu 82 chưa thể rõ khả cảm ứng apoptosis với nồng độ nghiên cứu thử nghiệm thực hiện;
Mẫu 102 nồng độ 10 µM có khả cảm ứng apoptosis tế bào MCF7 thông qua cảm ứng sinh caspase với hàm lượng tăng 1.21 lần so với đối chứng âm (P<0.05);
(23)4 Docking phân tử
Theo tiêu chí xếp hạng AutoDock 4.2.6, giá trị âm lượng khả liên kết hợp chất với thụ thể nhắm mục tiêu tốt Hợp chất 102 82 được chứng minh hai ứng cử viên tiềm với lượng kết nối tốt cho hai mục tiêu coi chất ức chế kép COX2 /tubulin tiềm năng, tương tác chúng phân tích thêm cách sử dụng mơ hình Studio Visualizer Tính tốn thu kết sử dụng để dự đốn chất ức chế tốt cho mơ hình protein dựa độ lệch (Δ) giá trị tương tác COX2 tubulin (Phương trình 1–2)
Docking hợp chất 102 với COX2 cho thấy ba tương tác liên kết hydro nhóm sulfonamid (NH2) Gln178, Leu338, Phe504 (khoảng cách = 2.71;
2.93; 3.33 Å, tương ứng), vị trí liên kết tubulin nhóm tạo ba liên kết hydro với Asn258, Met259, Lys352 (khoảng cách = 2.91; 3.20; Tương ứng 2.86 Å) Ngoài ra, tương tác hợp chất 102 tubulin tăng cường thông qua hai liên kết hydro trimethoxybenzen với Asn101, Ala250 Phân tích liên kết hợp chất 82 liên kết hydro hình thành nhóm etyl este (CO2C2H5) với
Arg106 COX2 Ala250 tubulin (khoảng cách = 2.99; 3.18 Å, tương ứng); đặc biệt NO2 của82 liên kết với Phe504 COX2 Liên kết hỗ
(24)Bảng 3.12. Tập hợp hợp chất thiết kế với điểm kết nối tương ứng hai mơ hình protein (kcal/mol)
Hợp chất Năng lƣợng (kcal/mol)
COX2 (3LN1) Tubulin (1Z2B)
102 -11.90 -8.06
82 -11.92 -9.37
Combretastatin A4 -9.63 -7.75
Colchicin - -8.06
Celecoxib -11.50 -
Docking 82 -Cox2
Docking 82 – tubulin
Docking 102 - COX2
(25)Bảng 3.13. Tương tác hợp chất, phối tử COX2 (ID: 3LN1) mơ hình protein tubulin (ID: 1Z2B)
Hợp chất thiết kế
Năng lượng liên kết (LE)
COX2 Tubulin ΔLE
102 - 0.38 - 0.26 -0.12
82 - 0.38 - 0.30 -0.08
Combretatin A4 - 0.42 - 0.34 -0.08
Colchicin - - 0.28 -
Celecoxib - 0.44 - -
KẾT LUẬN
Luận án đạt đƣợc kết nhƣ sau:
1 Đã thiết kế tiến hành tổng hợp thành công 41 hợp chất lai Trong có 20 chất lai coxib - combretastatin dạng este, 20 hợp chất lai coxib - combretastatin dạng axit, 01 hợp chất lai coxib – combretastatin chứa nhóm CF3
2 Đã đánh giá hoạt tính sinh học 22 chất dòng tế bào ung thư người HT-29, Hep-G2, MCF-7 ức chế sản sinh NO Trong có 12 chất 102, 96, 81, 82, 94, 93, 91, 92, 89, 90, 97, 85 thể hoạt tính trội so với chất gốc celecoxib, 05 chất 102, 96, 81, 82, 94 có hoạt tính IC50 < 10 µM
3 Đã đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO ung thư vú MCF-7 chất lai coxib – combretastatin dạng gốc axit tiến hành so sánh hoạt tính với chất lai coxib – combretastatin dạng gốc este Tuy nhiên, kết cho thấy có 02 chất 118 114 thể độc tính tế bào dịng MCF-7 mạnh celecoxib 02 chất 116 111 tương đương với hoạt tính ức chế sản sinh NO celecoxib
(26)apotosis nhờ nhuộm nhân tế bào với Hoechst 33342, thị caspase ‑ trắc lưu tế bào
5 Đã thu chất tiêu biểu 82 102 phân tử đa đích sinh học, có hoạt tính trội hoạt tính kháng ung thư so với combretastatin kháng viêm so với celecoxib,
6 Trên mô hình docking phân tử, khảng định hai chất 82 102 thể hoạt tính kép với hai đích tác dụng tubulin COX2 theo mục tiêu thiết kế luận án
7 Các chất thu được chứng minh không độc với tế bào thường mơ hình in vitro
Kiến nghị: Tiếp tục nghiên cứu sâu hoạt tính kháng ung thư kháng viêm hợp chất lai thu thử nghiệm lâm sàng để đưa loại thuốc chống ung thư
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
1 Đã tổng hợp thành công 41 phân tử lai đa đích sinh học coxib – combretatastatin theo mục tiêu thiết kế ban đầu
2 Đã sàng lọc hoạt tính kháng viêm NO kháng ung thư HepG2, HT-29, MCF7 lớp chất lai
3 Đã chứng minh chế hoạt tính sinh học hợp chất lai với mơ hình in vitro
(27)DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ CỦA TÁC GIẢ
1 Thuy Hang Nguyen Thi, Yen Tran Thi, Le Anh Nguyen, Ngoc Binh Vo, Quoc Anh Ngo “Design, Synthesis and Biological Activities of New Pyrazole Derivatives Possessing Both Coxib and Combretastatins Pharmacophores”
Chem Biodiversity, 2019
2 Quoc Anh Ngo, Thuy Hang Nguyen Thi, Minh Quan Pham, Domenico Delfno, Thi Thao Do “Antiproliferative and antiinfammatory coxib– combretastatin hybrids suppress cell cycle progression and induce apoptosis of MCF7 breast cancer cells” Molecular Diversity, 2020
3 Nguyễn Thị Thúy Hằng, Nguyễn Lê Anh, Trần Thị Yến, Võ Ngọc Bình, Vũ Đình Hồng, Ngơ Quốc Anh “Nghiên cứu tổng hợp dẫn chất lai ghép combretastatin celecoxib” Tạp chí hóa học, 2017, 55(4E23), 235-239