Thông tin tóm tắt về những đóng góp mới của luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu thành phần lipit, axit béo của san hô thủy tức Millepora thu thập tại vùng biển Việt Nam theo các tháng trong năm

Thực hiện phân tích định tính các lớp chất phospholipid trong lipid tổng mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla , triển khai trên bản mỏng 1 chiều và 2 chiều, so sá[r]

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Đặng Thị Minh Tuyết

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LIPID, AXIT BÉO CỦA SAN HÔ THỦY TỨC MILLEPORA THU THẬP TẠI VÙNG BIỂN

VIỆT NAM THEO CÁC THÁNG TRONG NĂM

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Đặng Thị Minh Tuyết

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LIPID, AXIT BÉO CỦA SAN HÔ THỦY TỨC MILLEPORA THU THẬP TẠI VÙNG BIỂN

VIỆT NAM THEO CÁC THÁNG TRONG NĂM

Chuyên ngành: Hóa hữu

Mã số: 8440114

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Đặng Thị Phương Ly

Lời cam đoan

Luận văn cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn khoa học TS Đặng Thị Phương Ly

Các số liệu kết luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác

Tác giả luận văn

Lời cảm ơn

Đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Đặng Thị Phương Ly, người cô tâm huyết hướng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình hồn thiện luận văn

Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên (VAST), Trung tâm nghiên cứu Quốc gia sinh vật biển – Phân viện Viễn Đông – LB Nga, GS.TS Phạm Quốc Long, PGS.TS Đồn Lan Phương anh chị Phịng Hóa sinh hữu - Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên giúp sở vật chất, trang thiết bị, dụng cụ thí nghiệm, kiến thức thực nghiệm…để tơi hồn thành tốt luận văn

Tơi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo thầy cô Học Viện Khoa học Cơng nghệ, Khoa Hóa học giảng dạy, hỗ trợ, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập thực luận văn

Tơi xin gửi lời tri ân tới gia đình, bàn bè, người thân ln động viên để tơi có động lực cơng việc hoàn thành tốt luận văn

Danh mục kí hiệu chữ viết tắt

Kí hiệu Tiếng anh Tiếng việt

CAEP Ceramide

aminoethylphosphonate

Ceramide

aminoethylphosphonate

DG Diacyl glycerol Diacyl glycerol

FFA Free fatty acid Axit béo tự

GC–MS Gas chromatography–mass

spectrometry Sắc ký khí – khối phổ

PC Phosphatidylcholine Phosphatidylcholine

PE Phosphatidylethanolamine Phosphatidylethanolamine PI Phosphatidylinositol Phosphatidylinositol

PL Polar lipid Lipid phân cực

PS Phosphatidylserine Phosphatidylserine

PUFA Polyunsaturated Fatty Acid Axit béo đa nối đôi

ST Sterol Sterol

MADAG Monoalkyldiacylglycerol Monoalkyldiacylglycerol MSC Mesenchymal stem cells Tế bào gốc trung mô TLC Thin-layer chromatography Sắc ký lớp mỏng

TAG Triacylglycerol Triacylglycerol

Danh mục bảng

Bảng 2.1 Các mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla nghiên cứu 18 Bảng 3.1 Hàm lượng lipid tổng mẫu san hô thủy tức Millepora

platyphylla được nghiên cứu 26

Bảng 3.2 Thành phần lớp chất lipid lipid tổng mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla 29 Bảng 3.3 Thành phần lớp chất phospholipid mẫu san hô thủy tức

Millepora platyphylla 36

Danh mục hình

Hình 1.1 San hơ thủy tức Millepora platyphylla Hình 1.2 Sự phân bố dạng phân tử alkenylacyl, alkylacyl diacyl số lớp chất phospholipid lồi san hô thủy tức MP: Millepora

platyphylla; MD: Millepora dichotoma; AS: Allopora steinegeri lồi san

hơ mềm SM: Sinularia macropodia; CS: Capnella sp.; XS: Xenia sp.; GR:

Gersemia rubiformis; GF: Gersemia fruticosa [25] 11

Hình 1.3 Hàm lượng (%) axit béo C20 – C22 n-6, n-3 mẫu san hô thủy tức thu thập vùng biển Việt Nam vùng biển Okhotsk [25] 12 Hình 1.4 Sự sử dụng axit béo chìa khóa sinh tổng hợp phospholipid mẫu san hô thủy tức Millepora thu thập vùng biển Việt Nam Allopora thu thập vùng biển Okhotsk [25] 12 Hình 3.1 Sắc kí đồ phân tích hàm lượng lớp chất lipid chương trình phân tích hình ảnh Sorbfil TLC Videodensitometer DV (Krasnodar, LB Nga) 28 Hình 3.2 Sắc kí đồ phân tích hàm lượng lớp chất phospholipid chương trình Sorbfil TLC Videodensitometer DV (Krasnodar, LB Nga) 35 Hình 3.3 Phổ GC methyl ester axit béo lipid tổng mẫu san hô thủy

Danh mục biểu đồ

Biểu đồ 3.1 Tỉ lệ hàm lượng lipid tổng tính trọng lượng khơ / hàm lượng lipid tổng trọng lượng tươi mẫu san hô thủy tức Millepora

platyphylla 27

Biểu đồ 3.2 Hàm lượng lớp chất axit béo tự (FFA) lipid tổng mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla 30 Biểu đồ 3.3 Hàm lượng lớp chất sterol (ST) lipid phân cực (PL) lipid tổng mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla 31 Biểu đồ 3.4 Hàm lượng lớp chất monoalkyldiacylglycerol (MADAG) sáp (W) lipid tổng mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla 32 Biểu đồ 3.5 Hàm lượng lớp chất triacylglycerol (TAG) lipid tổng mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla 33 Biểu đồ 3.6 Hàm lượng lớp chất phosphatidylinositol (PI) phosphatidylserine (PS) tổng phospholipid mẫu san hô thủy tức

Millepora platyphylla 37

Biểu đồ 3.7 Hàm lượng lớp chất ceramide aminoethylphosphonate (CAEP) tổng phospholipid mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla 38 Biểu đồ 3.8 Hàm lượng lớp chất phosphatidylchonline (PC) phosphatidylethanolamine (PE) tổng phospholipid mẫu san hô thủy

tức Millepora platyphylla 39

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Danh mục kí hiệu chữ viết tắt iii

Danh mục bảng iv

Danh mục hình v

Danh mục biểu đồ vi

MỞ ĐẦU

CHƯƠNG TỔNG QUAN

1.1.GIỚI THIỆU VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

1.1.1.Giới thiệu lớp Hydrozoa

1.1.2.Vài nét san hô thủy tức Millepora

1.1.3.Tình hình nghiên cứu san hơ thủy thức

1.2 GIỚI THIỆU VÀ Ý NGHĨA CỦA LIPID VÀ AXIT BÉO 13

1.2.1.Giới thiệu lipid axit béo 13

1.2.2.Ý nghĩa việc nghiên cứu lipid, axit béo 15

CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1.NGUYÊN LIỆU 18

2.2.SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU CHUNG 23

2.3.PHƯƠNG PHÁP 23

2.3.1 Phương pháp chiết lipid tổng 23

2.3.2 Phương pháp xác định thành phần hàm lượng lớp chất lipid 24

2.3.4 Phương pháp xác định thành phần hàm lượng axit béo 25 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 HÀM LƯỢNG LIPID TỔNG TRONG CÁC MẪU SAN HÔ THỦY

TỨC MILLEPORA PLATYPHYLLA 26

3.2 THÀNH PHẦN VÀ HÀM LƯỢNG CÁC LỚP CHẤT LIPID CỦA CÁC MẪU SAN HÔ THỦY TỨC MILLEPORA PLATYPHYLLA 28 3.3 THÀNH PHẦN VÀ HÀM LƯỢNG CÁC LỚP CHẤT PHOSPHOLIPID CỦA CÁC MẪU SAN HÔ THỦY TỨC MILLEPORA PLATYPHYLLA 34 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

MỞ ĐẦU

Các rạn san hô phần thiếu đại dương, hệ sinh thái rạn san hô Việt nam khu vực có tính đa dạng cao vùng biển Ấn độ Thái Bình Dương Trong đó, san hơ thủy tức Millepora phần quan trọng quần xã rạn san hô, tương tự san hô cứng, chúng góp phần đáng kể vào việc bồi tụ rạn san hô Mặc dù san hô thủy tức Millepora cạnh tranh với loài khác việc xây dựng rạn san hơ, chúng góp phần vào việc ngăn chặn phát triển loài biển gai Acanthaster - yếu tố làm suy thoái rạn san hơ Chính san hơ thủy tức Millepora có vai trị quan trọng q trình phục hồi rạn san hơ Sự phát triển hay suy thối chúng ảnh hưởng trực tiếp tới phát triển rạn san hô quần thể sinh vật biển sống rạn Mặc dù san hô thủy tức Millepora có tầm quan trọng lớn khung bền vững rạn san hơ bên cạnh lồi san hô cứng khác việc bảo tồn rạn san hơ, nghiên cứu lồi chưa thực nhiều Thành phần lipid đối tượng sinh vật thành phần hóa học quan trọng, số lipid ẩn chứa nhiều thơng tin thú vị sinh hóa đối tượng nghiên cứu, nhiên nghiên cứu nước lipid đối tượng chưa có

mùa góp phần có thêm thơng tin hữu ích, làm tiền đề cho nghiên cứu sâu hướng tới biện pháp bảo tồn phát triển rạn san hơ…

Do đó, định lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần lipid, axit béo san hô thủy tức Millepora thu thập vùng biển Việt Nam theo tháng năm” theo nội dung sau:

- Xác định hàm lượng lipid tổng mẫu Millepora platyphylla thu 12 tháng

- Phân tích thành phần hàm lượng lớp chất lipid mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla thu thập 12 tháng

- Phân tích thành phần hàm lượng lớp chất phospholipid mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla thu thập 12 tháng

- Phân tích thành phần hàm lượng axit béo mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla thu thập 12 tháng

CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

1.1.1. Giới thiệu lớp Hydrozoa

Trong ngành Cnidaria (Ruột khoang) người ta phân biệt lớp: Hydrozoa, Scyphozoa, Cubozoa Anthozoa Trong đó, san hơ thuộc Anthozoa, cịn san hô thủy tức thuộc Hydrozoa Hydrozoa thuộc lớp động vật khơng xương sống, lồi thuộc đa số có kích thước nhỏ vài centimet trừ tập đoàn sứa ống dài vài chục mét Số lượng lồi Hydrozoa có khoảng 3100 loài chia thành phân lớp Hydroidea Siphonophora. Các lồi thuộc Hydrozoa thường có hai dạng hình thái: dạng thuỷ tức (polyp) sống cố định dạng thuỷ mẫu (medusa) sống trơi Dạng thủy tức xuất thời gian dài chu trình sống suốt chu trình sống loài Pelmatohydra oligactic, chúng sống nước ao, hồ nước Dạng thuỷ mẫu (medusa) thấy loài sống biển Trong Hydrozoa tồn hai dạng cá thể tập đoàn, phân bố chủ yếu vùng nhiệt đới Ở Việt Nam, số loài thuộc Hydrozoa phong phú, Phú Quốc, Côn Đảo, chủ yếu dạng tập đoàn [1]

sinh sống tập đồn đó, cường độ ánh sáng thu nhận hay ảnh hưởng sóng tốc độ chuyển động nước [2]

Các xúc tu polyp bẫy mồi cách sử dụng tế bào gai chứa chất độc làm tê liệt mồi sinh vật phù du, cá nhỏ ấu trùng lồi nhuyễn thể Khi có tiếp xúc chúng phản ứng nhanh cách tiêm chất độc vào mồi làm cho mồi tê liệt chết Sau xúc tu kéo mồi vào dày polyp dải biểu mô co giãn Các chất độc san hơ lửa đủ mạnh để gây tổn thương cho người

1.1.2. Vài nét san hô thủy tức Millepora

San hô thủy tức san hô cứng thường có nhiều đặc điểm giống hình dạng sinh thái Điều phần bắt nguồn từ môi trường sống đồng rạn san hơ Cả hai nhóm bao gồm quần thể dạng đứng dạng quây với cấu trúc vôi góp phần tạo nên cấu trúc đá ngầm rạn Cơ chế canxi hóa tế bào hai nhóm tương đồng

Đặc điểm cấu tạo

Các quần thể san hô thủy tức Millepora thường có cấu trúc phân nhánh thẳng đứng giống độ dài nhánh dao động từ 30-60 cm Chúng phát triển dạng vịm thường nằm bề mặt rạn san hô bề mặt cứng khác, thường có màu vàng nâu Bề mặt bên ngồi chúng thường có dạng nốt sần hình thoi Mỗi nốt sần bao gồm tập hợp kim tinh tròn (dactylostyles) [5] Dưới lớp đá vơi xốp bên ngồi hệ thống mao dẫn nội phân bố dày đặc Khối lượng khung xương đá vôi cấu tạo từ cấu trúc đá vôi xốp bao gồm sợi tinh thể dày đặc xếp theo lớp mỏng, sợi nằm chồng lên góc độ Cho đến có vài nghiên cứu tốc độ sinh trưởng san hô giống Millepora, Stromgren (1976) công bố số lồi vùng biển Jamaica phát

triển nhánh san hơ từ 5,4 – 19,8 mm/năm [6] Witman (1988) xác định tốc độ phát triển mm/năm lồi M Complanata Floria trung bình tồn quần thể phát triển khoảng 130 cm2/năm [7]

xúc tu để giữ lại làm tê liệt mồi thời gian vài phút, sau chuyển vào biểu bì để hấp thụ [11]

Các tập đoàn Millepora nơi sinh sống tảo cộng sinh zooxanthellae, nhiên mật độ zooxanthellae Millepora thường thấp so với san hô cứng [12] Dinh dưỡng tự dưỡng Millepora tương tự san hô cứng, zooxanthellae cộng sinh sử dụng ánh sáng mặt trời CO2 để sản suất thức ăn vật liệu tế bào Các chất dinh dưỡng tổng

hợp zooxanthellae vận chuyển đến vật chủ cung cấp thức ăn cho loài Millepora

Sinh sản

Millepora có hai hình thức sinh sản, nhân giống hữu tính nhân giống vơ tính Trong hai hình thức sinh sản, hình thức sinh sản phù hợp tùy thuộc vào lồi, nhân tố mơi trường sống yếu tố địa lý

Sinh sản nhân giống vơ tính, q trình phân mảnh để hình thành tập đồn khác gây giông bão, xâm thực sinh học phá hoại số loài cá [13, 14] Sinh sản vơ tính tượng bình thường quần thể Millepora Các mảnh đơn giản mở rộng theo tăng trưởng theo giai đoạn Ngồi ra, nhiều lồi Millepora sinh sản hữu tính theo mùa, vào tháng tháng Đài Loan, tháng tháng Barbados từ tháng đến tháng Curacao [11] Trứng tinh trùng phóng biển với số lượng lớn vào ban đêm Trong Nghiên cứu Ấn Độ Dương sinh sản ba loài sống rìa rạn san hơ đảo Reunion thuộc Ấn Độ Dương là: Millepora exaesa, Millepora

platyphylla Millepora tenera, thời kỳ sinh sản hữu tính từ tháng 11 đến

tháng 1, phát triển quần thể sinh vật có liên quan với nhiệt độ nước tăng theo mùa Theo mô tả, cá thể có phận sinh sản phận sinh sản phụ, có khác biệt kích thước, mật độ phân bố tuyến trùng phận sinh sản phận sinh sản phụ ba lồi Q trình theo dõi sinh sản hàng loạt M

ngoài động vật ấu trùng Sinh sản bắt đầu trước trời tối không theo tuần trăng thủy triều [15]

Phân bố

Các san hô thủy tức Millepora phân bố nhiều vùng biển nhiệt đới giới độ sâu 1-40m mặt nước biển [16] Một số loài M.

Complanata thường phát triển với mặt phẳng đối diện với hướng sóng hay

dịng chảy nước biển Các hình thức phát triển dạng nhánh cành mỏng thường gặp loài sống vùng nước sâu rạn san hơ che kín đáo

Tốc độ phát triển san hô thuộc giống Millepora nhanh, diễn độ sâu khác thường bao phủ bề mặt chết lồi san hơ khác [17, 18]

Hình 1.1 San hơ thủy tức Millepora platyphylla

1.1.3 Tình hình nghiên cứu san hô thủy thức

Stromgren (1976), Rahav et al (1991) Lewis (1991), nhà khoa học nhận thấy tốc độ phát triển san hô thủy tức tương đương với tốc độ phân nhánh hình thành dạng đĩa san hơ cứng Bên cạnh đó, carotenoprotein chiết xuất từ khung canxi tám loài Millepora từ vùng biển Caribbean [6, 7, 19] Những năm gần đây, nhà khoa học thực nhiều phân tích số nhận dạng (fingerprinter) phenoloxidase để phục vụ việc định dạng lồi theo dõi tình hình sức khỏe rạn san hô gồm nhiễm bệnh, trắng hóa … Các lồi thuộc Millepora gây tác động có hại cho người độc tố chúng Một số nghiên cứu độc tố chứa tế bào tuyến trùng từ loài Millepora gây đau rát, hình thành ban đỏ mụn mủ da người tiếp xúc, chí gây tử vong Trong nghiên cứu Kazuo Shiomi cộng vào năm 1989 chứng minh độc tố hai loài san hơ thủy tức

Millepora platyphylla Millepora dichotoma gây tử vong, tan máu

sưng phù xúc tác cho trình thủy phân phospholipid phospholipase A acid phosphatase Độc tố M platyphylla có khác biệt đáng kể so với độc tố M dichotoma độ ổn định; M platyphylla có tính ổn định với đơng lạnh, đơng khơ bảo quản 4oC trái ngược với thiếu

ổn định M dichotoma Độc tố Millepora platyphylla gây hai dạng tử vong chuột, tử vong nhanh tử vong chậm kèm theo xuất huyết sắc tố niệu, phụ thuộc vào liều sử dụng, loài Millepora

dichotoma chỉ có kiểu tử vong nhanh quan sát thấy [20]

cao mức độ collagen loại I cao so với sinh học Porites lutea

đối chứng Hoạt động phosphatase kiềm cho thấy MSC gieo ma trận sinh học Millepora dichotoma có khả tạo xương cao so với MSC gieo ma trận sinh học đối chứng Hàm lượng osteocalcin MSC gieo Millepora dichotoma không đổi tuần trước tăng lên vượt qua ma trận sinh học P lutea gieo hạt sau 28 ngày Do đó, nghiên cứu ma trận sinh học Millepora

dichotoma tăng cường phân biệt MSCs thành nguyên bào xương có

tiềm tuyệt vời việc sử dụng khung sinh học cho kỹ thuật mơ cứng [21]

Năm 2012 García-Arredondo A cộng phân lập cấu trúc tế bào tuyến trùng từ lồi san hơ thuỷ tức Millepora alcicornis

Millepora complanata thu thập vùng biển Caribbean Mexico Đặc

điểm cấu trúc tuyến trùng thải tích tụ từ Millepora

alcicornis Millepora complanata, kiểm tra cách sử dụng kính

hiển vi điện tử truyền qua kính hiển vi điện tử quét Trong nghiên cứu phát qua hình ảnh tuyến trùng tìm thấy lồi có độc tố vùng Caribe Mexico Hai loại tuyến trùng quan sát thấy hai loài, tuyến trùng nhỏ xác định phong phú so với loại tuyến trùng lớn Các loại tuyến trùng nhỏ có kích thước trung bình (10,6 - 13,0 x 18,1 - 21,6 µm) lớn (17,5 - 21,8 x 25,0 - 33,1 µm) tuyến trùng lớn xuất kích thước (10,5 - 15,6 x 18,7 - 25,0 µm) Tuyến trùng nhỏ loại tuyến trùng tìm thấy loài Millepora lý để xếp vào phân riêng biệt Radwan quan sát thấy hai loài M.dichotoma M platyphylla thu thập Biển Đỏ xuất loại tuyến trùng [22]

trình nghiên cứu 150 mẫu san hơ lồi san hơ thủy tức Millepora thu thập vùng biển nhiệt đới nước lạnh, tác giả công bố số liệu thành phần axit béo lớp chất lipid đối tượng này, liệu ảnh hưởng yếu tố môi trường đến thành phần lipid lồi Các đường trình sinh tổng hợp axit béo đối tượng san hô san hô thuỷ tức thảo luận tới Qua kết thu giúp cho nhà khoa học hiểu rõ cấu tạo hóa sinh, chế trao đổi chất nhiều thơng tin hữu ích khác dinh dưỡng, sức khỏe, ảnh hưởng đến rạn san hô v.v

Năm 2019, tác giả Andrey Imbs cộng nghiên cứu lần lipid phân cực san hô, san hô thủy tức so sánh thành phần axit béo, phospholipid san hô, san hô thủy tức từ vùng nhiệt đới nước lạnh Cấu trúc hàm lượng axit béo thành phần dạng phân tử phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylcholine (PC), phosphatidylserine (PS), phosphatidylinositol (PI), ceramide aminoethylphosphonate (CAEP) loài san hô thủy tức nhiệt đới

Millepora platyphylla Millepora dichotoma thu thập Hòn Ré (Việt

Nam) lồi san hơ thủy tức nước lạnh Allopora steinegeri thu thập đảo Kuril, Nga) xác định phổ khối phổ khối phân giải cao [25] Sự phân bố dạng phân tử alkenylacyl, alkylacyl diacyl số lớp chất phospholipid thể hình 1.2

Lớp chất phosphatidylethanolamine bao gồm chủ yếu dạng phân tử alkenylacyl, đặc biệt lồi san hơ mềm Xenia sp., Gersemia

rubiformis Gersemia fruticosa PE loài san hơ thủy tức có thêm phần

đáng kể PE dạng diacyl Lớp chất phosphatidylcholine bao gồm dạng phân tử chủ yếu dạng alkylacyl, trừ lớp chất PC lồi Allopora steinegeri

có phần chiếm ưu diacyl PC Lớp chất phosphatidylserine mẫu san hơ thủy tức tồn dạng phân tử diacyl, ngược lại loài san hô

Sinularia macropodia Capnella sp lớp chất PS toàn dạng phân

mẫu, trừ lồi san hơ Gersemia rubiformis có phần đáng kể dạng phân tử PI alkylacyl

Hình 1.2 Sự phân bố dạng phân tử alkenylacyl, alkylacyl diacyl số lớp chất phospholipid lồi san hơ thủy tức MP: Millepora

platyphylla; MD: Millepora dichotoma; AS: Allopora steinegeri lồi san

hơ mềm SM: Sinularia macropodia; CS: Capnella sp.; XS: Xenia sp.; GR:

Gersemia rubiformis; GF: Gersemia fruticosa [25]

Hình 1.3 Hàm lượng (%) axit béo C20 – C22 n-6, n-3 mẫu san hô thủy tức thu thập vùng biển Việt Nam vùng biển Okhotsk [25]

Sơ đồ trình sử dụng axit béo chìa khóa n-3, n-6 sinh tổng hợp dạng phân tử phospholipid mẫu san hô thủy tức Allopora

Millepora mơ tả theo sơ đồ hình 1.4 Hàm lượng cao

22:5n-6 cho thấy, mẫu san hô thủy tức Millepora có tham gia với hoạt tính cao enzyme delta-4 desaturase trình sinh tổng hợp axit béo đa nối đôi C22

Hình 1.4 Sự sử dụng axit béo chìa khóa sinh tổng hợp phospholipid mẫu san hô thủy tức Millepora thu thập vùng biển Việt

So sánh hàm lượng lớp chất lipid san hô mềm san hô thủy tức mẫu thu thập vùng biển Nha Trang thời gian khác thực tác giả Nguyễn Bá Kiên cộng sự: mẫu san hô mềm

Sinularia brassica, Sinularia flexibilis, mẫu thủy tức Millepora dichotoma,

Millepora platyphylla cho thấy khác biệt đặc trưng riêng Hàm

lượng lipid tổng hai lồi san hơ mềm Sinularia brassica, Sinularia

flexibilis cao hàm lượng lipid tổng mẫu san hô cứng Millepora

dichotoma, Millepora platyphylla Các lớp chất mẫu san hô mềm

là lipid phân cực (PL), monoankyldiacylglycerol (MADAG), hydrocacbon sáp (HW) Trong đó, mẫu thủy tức lớp chất PL, triacylglycerol (TG), MADAG HW Lớp chất diacylglycerol (DG) có mặt lồi san hơ mềm Sinularia flexibilis khơng xuất lồi san hơ khác nghiên cứu [26]

Cho đến nay, nhà khoa học quan tâm nhiều đến san hô thủy tức Millepora Tuy nhiên nghiên cứu thành phần lipid san hơ thủy tức cịn mới, số liệu lipid loài thuộc Millepora cịn chưa đáng kể để hiểu rõ trình sinh tổng hợp vận chuyển lipid Do đó, lĩnh vực cịn nhiều tiềm để nghiên cứu sâu tương lai

1.2.GIỚI THIỆU VÀ Ý NGHĨA CỦA LIPID VÀ AXIT BÉO 1.2.1. Giới thiệu lipid axit béo

Lipid axit béo dẫn xuất axyl chúng, sáp (este axit béo rượu mạch thẳng), este sterol, triacylglycerol, monoalkyldiacylglycerol, axit béo tự do, glycolipid, sphingolipid, phospholipid phosphonolipid [5], chúng kết hợp với carbohydrate protein để tạo thành thành phần chủ yếu tất tế bào thực vật động vật Lipid không tan nước mà hịa tan dung mơi hữu (ete, clofom, benzen, ete petrol, toluen…) Lipid hợp chất cấu tạo quan trọng màng sinh học, nguồn cung cấp lượng (37,6.106 J/kg), nguồn cung

Dựa vào thành phần cấu tạo chia lipid thành nhóm:

 Lipid đơn giản: ete rượu axit béo:  Triacylglycerol

 Sáp (cerid)  Sterol

 Lipid phức tạp: phân tử chúng ngồi axit béo, rượu cịn thành phần khác axit phosphoric, bazơ nitơ, đường Nhóm bao gồm nhóm nhỏ sau:

 Glycerophospholipid: phân tử có glixerin, axit béo axit phosphoric Gốc axit phosphoric este hóa với aminalcol cholin, etanolamin, serin, inozitol

 Glyceroglucolipid: phân tử ngồi glixerin axit béo cịn có mono oligosacarit kết hợp với glixerin qua liên kết glucozit

 Sphingoglucolipid: phân tử cấu tạo tử sphingozin, axit béo đường

 Sphingophospholipid: phân tử cấu tạo tử aminalcolsphingozin, axit béo axit phosphoric

phần cấu tạo lipid phân cực lipid phức tạp khác, axit béo thành phần quan trọng màng tế bào, có tác dụng ảnh hưởng đến tính lưu động màng chức protein màng thông qua tác động lên môi trường màng

Trong sinh vật biển có đa dạng loại axit béo loại axit béo thường gặp có số lượng nguyên tử cacbon từ C-12 đến C-30, có dạng có đặc trưng sinh vật biển mà chưa gặp cạn, ví dụ lồi hải miên có nguyên tử cacbon mạch dài lên tới C-24 đến C-30, cịn lồi sinh vật biển khác có nguyên tử cacbon từ C-12 đến C-24 Trong thành phần lipid sinh vật biển chứa lượng đáng kể axit béo đa nối đôi (Polyunsaturated Fatty Acids - PUFAs) Nhóm axit béo Omega3 đa nối đơi thuộc nhóm axit béo có nối đối vị trí số tính từ nhóm metyl cuối mạch cacbon Đây nhóm chất với cấu trúc phân tử đặc biệt có hoạt tính sinh học cao, nên có ứng dụng rộng thực tiễn

1.2.2 Ý nghĩa việc nghiên cứu lipid, axit béo

Thành phần lipid, axit béo phản ánh đặc điểm dinh dưỡng

Việc nghiên cứu thành phần lipid, axit béo để xác định mối liên kết dinh dưỡng hữu hiệu lồi sinh vật biển khó khăn hoạt động nghiên cứu quan sát Khái niệm chất đánh dấu dinh dưỡng lipid, axit béo dựa sở nguồn dinh dưỡng ban đầu có chứa lipid axit béo tín hiệu đặc trưng, chúng truyền sang sinh vật tiêu thụ vào chuỗi thức ăn, dù bị biến đổi bước chúng trì với số lượng đáng kể Ví dụ, lồi san hơ vùng biển sâu thường khơng có vi sinh vật cộng sinh zooxanthellae sử dụng động thực vật phù du làm nguồn thức ăn chính, ngược lại san hơ vùng nước nông thường sử dụng dưỡng chất nhận từ vi sinh vật cộng sinh

nhà khoa học xác định xem đối tượng sinh vật có thích nghi với môi trường sống trước thay đổi thiên nhiên

Thành phần lipid, axit béo phân loại sinh thái

Ngoài phần lớn lipid axit béo sinh vật đưa vào thể thông qua đường dinh dưỡng, mức độ đáng kể, thành phần lipid, axit béo quy định khả di truyền loài để sinh tổng hợp lên số axit béo định Do vậy, axit béo sử dụng cơng cụ hữu hiệu phân loại hóa học nhóm khác nhau, hệ cộng sinh khác nhau; góp phần vào nghiên cứu q trình sinh tổng hợp diễn thể loài sinh vật

Thành phần lipid, axit béo phản ánh sức khỏe quần thể rạn san hô

Khi điều kiện sống môi trường bất lợi, nhiệt độ nước biển tăng lên, xảy tượng trắng hóa rạn san hơ Chúng bị trắng hóa phần (cịn khả phục hồi) hồn tồn (khơng khả phục hồi) So sánh lipid rạn san hô khỏe mạnh rạn san hô bị trắng hóa, nhà nghiên cứu nhận thấy, rạn san hơ bị tẩy trắng hồn tồn tới 75% tổng hàm lượng axit béo không no đa nối đôi, đặc biệt axit béo đặc trưng vi sinh vật cộng sinh zooxanthellae, điều thể vắng mặt chúng đối tượng san hơ bị trắng hóa

CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU

Các mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla thu thập 12 tháng liên tục vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa (bảng 2.1) Mẫu định tên PGS TS Hoàng Xuân Bền cộng Viện Hải Dương học – Nha Trang

Các mẫu thu thập phương pháp lặn Mẫu sau thu vận chuyển nước biển thiết bị có mái che, nhằm tránh tiếp xúc nhiều với ánh nắng mặt trời ln trì nhiệt độ ổn định Sau trình thu mẫu, mẫu đem phịng thí nghiệm 1h, loại bỏ tạp/cặn bẩn thực chiết lipid tổng bảo quản nhiệt độ -18ºC Mẫu lưu giữ tiêu Viện Hải dương học – Nha Trang

Bảng 2.1 Các mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla nghiên cứu

TT

Ký hiệu mẫu

Thời gian

thu mẫu Ảnh mẫu

1 Mp.1

2 Mp.2

Tháng 2/2020

3 Mp.3

Tháng 3/2020

4 Mp.4

5 Mp.5

Tháng 5/2020

6 Mp.6

Tháng 6/2019

7 Mp.7

8 Mp.8

Tháng 8/2019

9 Mp.9

Tháng 9/2019

10 Mp.10

11 Mp.11

Tháng 11/2019

12 Mp.12

2.2.SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU CHUNG

2.3.PHƯƠNG PHÁP

2.3.1 Phương pháp chiết lipid tổng

Chiết lipid tổng theo phương pháp Folch J.F [27] – phương pháp sử dụng thường quy cho san hơ phịng thí nghiệm Hóa sinh hữu – Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên

Mẫu tươi san hô thủy tức Millepora platyphylla rửa sạch, thấm khô nước chụp ảnh tiêu Mẫu cắt nhỏ đến kích thước thích hợp Chiết mẫu hệ dung môi CHCl3:MeOH tỉ lệ 2:1 (v:v) (1 kg mẫu tươi

dùng lit hỗn hợp dung môi) để 4oC, chiết lặp lần Bổ sung lit H

2O

lit CHCl3 để toàn dịch chiết phân lớp Lớp lipid (bên dưới) thu

hồi làm khan Na2SO4 3h, lọc bỏ muối, dịch chiết thu cô

2.3.2 Phương pháp xác định thành phần hàm lượng lớp chất lipid

Phân tích định lượng sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng chương trình phân tích hình ảnh Sorbfil TLC Videodensitometer DV (Krasnodar, LB Nga) [28]

Lipid tổng được chấm mỏng chiều silicagel (6 x cm), chạy hệ dung mơi n-hexane:Et2O:CH3COOH (80:20:1, v:v:v), hình

bằng H2SO4/MeOH 10% Sấy mỏng nhiệt độ 2000C thời gian 15

phút, scan trê n máy Epson Perfection 2400 PHOTO (Nagano, Nhật Bản), với độ phân giải theo kích thước tiêu chuẩn Phần trăm lớp chất lipid tổng xác định dựa đo diện tích cường độ màu chương trình phân tích hình ảnh Sorbfil TLC Videodensitometer DV (Krasnodar, LB Nga)

2.3.3 Phương pháp xác định thành phần hàm lượng lớp chất phospholipid

Phân tích định tính lớp chất phospholipid: lớp chất

phospholipid xác định sắc ký lớp mỏng chiều mỏng Sorbfil (6 cm x cm, Sorbfil, Krasnodar, LB Nga), với hệ thứ A: CHCl3:MeOH:C6H6:28%NH4OH (70:30:5:1, theo thể tích), chạy xong sấy

khơ, tiếp tục chạy hệ dung môi B:

CHCl3:MeOH:(CH3)2CO:CH3COOH:H2O (70:30:5:5:2, theo thể tích) Sau

khi sấy khơ, hình với thuốc thử ninhydrin 0,2% BuOH 100°C, xác định lớp chất PE, PS, CAEP Tiếp theo sử dụng thuốc thử molybdate xác định lớp chất PC, PI

Phân tích định lượng lớp chất phospholipid: lipid tổng phân

tích mỏng Sorbfil (10 cm x 10 cm, , Krasnodar, LB Nga); với hệ dung mơi CHCl3:MeOH:C6H6:28%NH4OH (70:30:5:1, theo thể tích),

hình với thuốc thử H2SO4/MeOH 5% nhiệt độ 200°C Bản mỏng thu

phospholipid xác định dựa đo diện tích cường độ màu chương trình phân tích hình ảnh Sorbfil TLC Videodensitometer DV, Krasnodar, LB Nga [28]

2.3.4 Phương pháp xác định thành phần hàm lượng axit béo Axit béo methyl hóa sang dạng methyl ester tác nhân H2SO4/MeOH 2%, nhiệt độ 80°C vòng 2h, để nguội tới nhiệt độ phòng,

bổ sung thêm ml H2O ml n-hexane để phân lớp, thu lớp dung mơi phía

trên, làm khan Na2SO4, lọc bỏ muối cất loại dung mơi Hỗn hợp thu

được hịa tan n-hexane, tinh hỗn hợp methyl ester axit béo mỏng điều chế với hệ dung môi n-hexane:Et2O (90:10, v:v) Hỗn hợp

CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 HÀM LƯỢNG LIPID TỔNG TRONG CÁC MẪU SAN HÔ THỦY

TỨC MILLEPORA PLATYPHYLLA

Hàm lượng lipid tổng xác định phần trăm khối lượng lipid thu so với khối lượng mẫu tươi/khô ban đầu Kết hàm lượng lipid tổng mẫu Millepora platyphylla nghiên cứu thu thập 12 tháng năm trình bày bảng 3.1

Bảng 3.1 Hàm lượng lipid tổng mẫu san hô thủy tức Millepora

platyphylla được nghiên cứu

Tháng Kí hiệu mẫu Hàm lượng tươi (%) Hàm lượng Khô (%)

Nhiệt độ(oC) Mp.1 0,39  0,02 0,48  0,04 25,3 Mp.2 0,36  0,03 0,45  0,01 25,3 Mp.3 0,38  0,03 0,47  0,02 28,0 Mp.4 0,41  0,05 0,5  0,03 28,3 Mp.5 0,41  0,04 0,51  0,05 28,1 Mp.6 0,51  0,05 0,63  0,06 28,5 Mp.7 0,32  0,02 0,4  0,04 28,4 Mp.8 0,44  0,02 0,54  0,03 28,5 Mp.9 0,32  0,04 0,41  0,02 28,3 10 Mp.10 0,25  0,03 0,31  0,03 26,5 11 Mp.11 0,25  0,03 0,30  0,02 25,7 12 Mp.12 0,21  0,02 0,26  0,01 25,4

tăng tháng mùa hè giảm vào tháng mùa đông Hàm lượng lipid tổng cao đạt mẫu Mp.6 thu vào tháng thấp mẫu Mp.12 thu vào tháng 12 Hàm lượng lipid tổng tính trọng lượng khơ trọng lượng tươi có tỉ lệ thuận với Tỉ lệ hàm lượng lipid tổng/ trọng lượng khô hàm lượng lipid tổng / trọng lượng tươi 12 tháng khơng có q nhiều chênh lệch, dao động khoảng từ 1,22 đến 1,25 (biểu đồ 3.1)

Biểu đồ 3.1 Tỉ lệ hàm lượng lipid tổng tính trọng lượng khơ / hàm lượng lipid tổng trọng lượng tươi mẫu san hô thủy tức Millepora

platyphylla

của hàm lượng lipid tổng mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla

trong 12 tháng

3.2 THÀNH PHẦN VÀ HÀM LƯỢNG CÁC LỚP CHẤT LIPID CỦA CÁC MẪU SAN HÔ THỦY TỨC MILLEPORA PLATYPHYLLA

Trong lipid tổng mẫu nghiên cứu có mặt đầy đủ lớp chất lipid tương tự đối tượng san hô: lớp chất lipid cấu trúc lipid phân cực (PL), sterol (ST); lớp chất lipid dự trữ triacylglycerol (TAG), monoalkyldiacylglycerol (MADAG), sáp (W); axit béo tự FFA Hình ảnh lớp chất lipid mỏng chiều sau scan với độ phân giải kích thước tiêu chuẩn phân tích phần mềm chương trình phân tích hình ảnh Sorbfil TLC Videodensitometer DV (Krasnodar, LB Nga) (hình 3.1)

Hình 3.1 Sắc kí đồ phân tích hàm lượng lớp chất lipid chương trình phân tích hình ảnh Sorbfil TLC Videodensitometer DV (Krasnodar, LB Nga)

axit béo tự Ngồi ra, kết phân tích cho thấy 12 tháng hàm lượng lớp chất lipid lipid tổng có thay đổi định

Bảng 3.2 Thành phần lớp chất lipid lipid tổng mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla

Mẫu Hàm lượng lớp chất lipid (%)

Nhiệt độ nước

biển

PL ST FFA TAG MADAG W Khác

Mp.1 17,610,21 9,230,06 1,610,02 30,600,63 19,310,38 19,870,15 1,760,02 25,3

Mp.2 17,110,15 8,010,03 1,370,02 27,580,28 20,360,35 24,210,25 1,360,01 25,3

Mp.3 17,280,40 7,660,01 1,380,02 27,880,12 20,920,44 24,670,42 - 28,0

Mp.4 16,350,10 7,780,09 1,330,03 31,290,69 21,140,25 22,120,35 - 28,3

Mp.5 11,070,08 7,460,07 1,230,00 32,130,28 22,520,32 24,200,06 1,380,01 28,1

Mp.6 12,690,07 7,000,09 1,210,01 30,420,56 22,180,51 24,780,18 1,720,01 28,2

Mp.7 12,080,17 7,150,02 1,020,02 31,680,49 22,780,33 25,000,35 0,290,02 28,4

Mp.8 14,060,12 6,810,09 1,140,03 34,300,21 22,080,28 21,610,24 - 28,5

Mp.9 14,180,05 7,240,01 1,150,02 32,560,65 20,220,44 22,840,35 1,110,01 28,3

Mp.10 14,030,06 7,290,06 1,550,02 35,320,28 22,570,21 18,650,22 0,590,00 26,5

Mp.11 18,840,92 9,230,06 1,330,01 29,070,37 20,930,23 18,880,31 1,720,01 25,7

Mp.12 18,920,31 9,860,07 1,530,02 29,910,96 18,410,20 19,660,33 1,710,00 25,4

TB 15,35 7,89 1,32 31,12 21,12 22,21

Trong số lớp chất lipid lipid tổng mẫu san hô thủy tức

Millepora platyphylla, lớp chất axit béo chiếm tỉ lệ nhỏ không đáng kể, tất

cả 12 tháng 2% lipid tổng Hàm lượng có xu giảm tháng mùa hè, giá trị thấp mẫu Mp.7 (1,02%0,02) (biểu đồ 3.2) Hàm lượng lớp chất axit béo tự lipid tổng mẫu san hô/san hô thủy tức thông thường <5% Sự tăng bất thường hàm lượng axit béo tự thành phần lipid tổng mẫu san hô dẫn đến giả thiết thiếu xác quy trình thu – bảo quản – vận chuyển – tách chiết, khiến trình thủy phân có điều kiện xảy giải phóng thêm axit béo tự từ lớp chất khác, khiến hàm lượng lớp chất tăng cao Vì vậy, phân tích thành phần lớp chất lipid, ln cần ý tới hàm lượng lớp chất [32]

Biểu đồ 3.2 Hàm lượng lớp chất axit béo tự (FFA) lipid tổng mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla

Cũng giống lớp chất FFA, hàm lượng lớp chất sterol lipid phân cực có xu hướng thay đổi theo mùa, giảm vào tháng mùa hè tăng vào tháng mùa đông

được vào mùa hè có hàm lượng ST thấp mẫu thu vào mùa đông không đáng kể Mẫu thu tháng 11 đến tháng có hàm lượng ST đo cao (9,230,06 – 9,86%0,07), mẫu thu thập vào tháng có hàm lượng lớp chất thấp 12 tháng (6,81%0,09) (biểu đồ 3.3)

Biểu đồ 3.3 Hàm lượng lớp chất sterol (ST) lipid phân cực (PL) lipid tổng mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla

Sự khác biệt hàm lượng lớp chất lipid phân cực (PL) tháng 5-10 tháng 11-4 rõ ràng so với lớp chất sterol (ST) Hàm lượng trung bình lớp chất PL mẫu Mp.5 đến Mp.10 13,02% giá trị mẫu Mp.11 đến Mp.4 17,69% Hàm lượng PL thấp ghi nhận lipid tổng mẫu Mp.5 (11,07%0,08), có sụt giảm hàm lượng tháng tháng (16,35% 0,10 11,07%0,08) Hàm lượng PL cao lipid tổng mẫu thu tháng 11, 12 (18,84%0,92 18,92%0,31) (biểu đồ 3.3)

2 lớp chất monoalkyldiacylglycerol (MADAG) sáp (W) chiếm hàm lượng đáng kể lipid tổng lồi san hơ thủy tức Millepora

khơng nhiều chênh lệch (21,12% 22,21%), ngồi đặc điểm biến động hàm lượng hai lớp chất 12 tháng có điểm tương đồng Sự thay đổi theo mùa rõ rệt, ngược lại với lớp chất phân tích trên, hàm lượng lớp chất có xu hướng giảm tháng mùa đông tăng tháng mùa hè (biểu đồ 3.4)

Biểu đồ 3.4 Hàm lượng lớp chất monoalkyldiacylglycerol (MADAG) sáp (W) lipid tổng mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla

Lớp chất TAG chiếm hàm lượng cao lipid tổng mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla Hàm lượng trung bình 12 tháng lên tới

31,12%, không quan sát khác biệt theo mùa cách rõ ràng 12 tháng, xét trung bình hàm lượng lipid tổng từ tháng đến tháng 10 cao từ tháng 11 tới tháng Hàm lượng lớp chất TAG đạt cao lipid tổng mẫu thu tháng 10 (35,32%0,28) thấp lipid tổng mẫu thu tháng (27,58%0,28) Có giảm đột ngột hàm lượng lớp chất TAG mẫu tháng 10 tháng 11 (35,32%0,28 29,07%0,37) (biểu đồ 3.5)

Biểu đồ 3.5 Hàm lượng lớp chấttriacylglycerol (TAG) lipid tổng mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla

sinh vật cộng sinh zooxanthellae gây chết rạn san hơ, đó, hàm lượng PL đối tượng sinh vật có thay đổi đáng kể [33, 34] Điều lý giải lớp chất PL lớp chất có biến động lớn 12 tháng với số tỉ lệ giá trị cao / thấp hàm lượng 1,71 cao số lớp chất lipid

Millepora platyphylla sinh sản hữu tính theo mùa; theo số tài liệu

nghiên cứu, thời kỳ sinh sản vào tháng - Đài Loan, từ tháng đến tháng Barbados, từ tháng đến tháng Curaỗao [11] Khụng cú d liu v lipid ca vật liệu sinh sản loài Millepora; nhiên, số báo cáo vai trò lipid sinh sản san hơ lồi Cnidarian khác vật liệu sinh sản chúng giàu lipid, hầu hết W TAG [35, 36] Sự trưởng thành giải phóng vật liệu sinh sản kèm với tiêu hao lượng sụt giảm lipid dự trữ [37], đặc biệt W TAG, ngồi tính ổn định thành phần số lượng màng phospholipid lớp chất PL trình hình thành tái sinh quần thể có ảnh hưởng định tới hàm lượng lớp chất lipid Chúng giả định sụt giảm W vào tháng 9-10, TAG vào tháng 10-11 gia tăng hàm lượng PL tháng 11-12, kèm với trình trưởng thành sinh sản Millepora platyphylla

3.3 THÀNH PHẦN VÀ HÀM LƯỢNG CÁC LỚP CHẤT PHOSPHOLIPID CỦA CÁC MẪU SAN HÔ THỦY TỨC MILLEPORA PLATYPHYLLA

phosphatidylserine (PS), phosphatidylinositol (PI), phosphonolipid ceramide aminoethylphosphonate (CAEP)

Hình ảnh lớp chất phospholipid phân tích phần mềm Sorbfil TLC Videodensitometer DV thể hình 3.2

Hình 3.2 Sắc kí đồ phân tích hàm lượng lớp chất phospholipid chương trình Sorbfil TLC Videodensitometer DV (Krasnodar, LB Nga)

Bảng 3.3 Thành phần lớp chất phospholipid mẫu san hô thủy tức

Millepora platyphylla

Ký hiệu mẫu

Hàm lượng lớp chất phospholipid (%)

Nhiệt độ nước biển

PI PS CAEP PC PE

Mp.1 6,280,02 7,990,01 17,640,25 35,100,32 32,990,29 25,3

Mp.2 5,340,02 5,250,03 17,360,21 37,430,03 34,620,32 25,3

Mp.3 4,980,03 5,330,02 20,390,16 37,150,51 32,160,36 28

Mp.4 4,040,01 5,740,05 19,250,23 40,040,63 30,930,20 28,3

Mp.5 4,140,04 5,850,08 18,160,22 40,140,16 31,710,23 28,1

Mp.6 4,500,02 6,080,06 18,080,12 39,570,47 31,770,30 28,2

Mp.7 5,700,02 6,010,02 16,890,28 39,380,39 32,020,22 28,4

Mp.8 5,250,03 5,920,04 18,030,10 37,440,53 33,360,39 28,5

Mp.9 5,550,01 5,290,02 16,360,36 38,910,23 33,890,12 28,3

Mp.10 5,730,03 5,510,02 16,480,13 39,240,15 33,040,27 26,5

Mp.11 6,040,06 8,850,06 19,490,15 34,430,36 31,190,28 25,7

Mp.12 6,750,04 7,390,03 19,690,12 34,700,12 31,470,18 25,4

Chú thích: PI – phosphatidylinositol, PS – phosphatidylserine, CAEP – ceramide aminoethylphosphonate, PC – phosphatidylchonline, PE – phosphatidylethanolamine

2 lớp chất phospholipid PI PS chiếm tỉ lệ nhỏ thành phần phospholipid mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla Hàm lượng

8,85%0,06, giá trị trung bình 12 tháng 5,36% 6,27% Nhìn chung thành phần ổn định, có chút tăng nhẹ vào tháng 11,12,1 (biểu đồ 3.6)

Biểu đồ 3.6 Hàm lượng lớp chất phosphatidylinositol (PI) phosphatidylserine (PS) tổng phospholipid mẫu san hô thủy tức

Millepora platyphylla

Ceramide aminoethylphosphonate (CAEP) cấu trúc shingolipid điển hình – hợp chất lipid phân cực đặc trưng đối tượng thuộc ngành động vật ruột khoang Trong thành phần phospholipid san hô thủy

tức Millepora platyphylla, CAEP chiếm tỉ lệ đáng kể, hàm lượng

Biểu đồ 3.7 Hàm lượng lớp chất ceramide aminoethylphosphonate (CAEP) tổng phospholipid mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla

Lớp chất phosphatidylchonline (PC) phosphatidylethanolamine (PE) lớp chất có tỉ lệ cao thành phần phospholipid mẫu Millepora

platyphylla Hàm lượng PC dao động khoảng 34,43%0,36 đến

Biểu đồ 3.8 Hàm lượng lớp chất phosphatidylchonline (PC)

phosphatidylethanolamine (PE) tổng phospholipid mẫu san hô thủy

tức Millepora platyphylla

Trong nghiên cứu thực trước các nhà khoa học, cho thấy phospholipid đối tượng san hô/san hô thủy tức thành phần nhạy cảm với thay đổi thơng số mơi trường Ví dụ ảnh hưởng thay đổi nhiệt độ cách đột ngột, thành phần lớp chất phospholipid san hơ có thay đổi đáng kể [38] Tuy nhiên kết nghiên cứu này, thấy biến động hàm lượng lớp chất phospholipid có mặt mẫu san hô thủy tức Millepora

platyphylla không đáng kể 12 tháng, nghĩa thay đổi mơi

trường năm có ảnh hưởng không nhiều lớp chất phospholipid

mẫu Millepora platyphylla thu Qua đánh giá ổn định

3.4 THÀNH PHẦN VÀ HÀM LƯỢNG CÁC AXIT BÉO CỦA CÁC MẪU SAN HÔ THỦY TỨC MILLEPORA PLATYPHYLLA

Axit béo có mặt hầu hết lớp chất lipid tổng MADAG, TAG, ST, FFA, PL Axit béo sau chuyển hóa thành dạng methyl ester đưa vào phân tích GC, GCMS để xác định thành phần hàm lượng (hình 3.3)

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0

-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5

5.0uV(x10,000) Chromatogram

1 /1 :0 2/ /1 :0 4/ 5/ /D M A 7/ /1 :0 /1 :1 n -7 /1 / /1 / /P h y t / /1 :1 /D M A -1 :0 / / / /1 :1 n -9 2 / / /1 :2 n -6 /1 :3 n -6 /1 :3 n -3 /1 :4 n -3 /2 :0 /2 :1 n -9 / /2 :4 n -6 /2 :4 n -3 3 /2 :5 n -3 / /2 :4 n

-6 36

/2 :5 n -6 /2 :5 n -3 /2 :6 n -3

Hình 3.3 Phổ GC methyl ester axit béo lipid tổng mẫu san hô thủy

tức Millepora platyphylla Mp.1

Trong thành phần axit béo mẫu nghiên cứu, tổng cộng 22 axit béo nhận dạng bao gồm axit béo từ C12 tới C22, nhiều axit béo C18, C20 C22, số C12, C14, C16 C17 Một số axit béo chiếm hàm lượng cao 22:6n-3, 18:0, 16:0, 22:5n-6, 22:4n-6 Ngồi axit béo nhận dạng cịn có phần nhỏ axit béo khơng xác định (khác) hàm lượng thấp nên không thu thông tin phân mảnh phổ GC-MS Kết thu thành phần hàm lượng axit béo lipid tổng mẫu san hô thủy tức Millepora

Bảng 3.4 Thành phần hàm lượng axit béo lipid tổng mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla (%)

TT Axit béo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

15 20:1n-9 1,580,01 1,520,02 0,800,05 0,640,00 0,710,02 0,500,03 0,360,02 0,380,02 0,520,03 0,810,03 0,910,03 1,550,02 16 20:4n-6 0,620,03 0,390,02 0,540,04 0,930,03 0,690,05 1,260,01 0,610,02 0,850,05 1,140,08 1,110,05 0,540,02 0,340,02 17 20:4n-3 0,100,01 0,100,01 0,080,00 0,080,00 0,080,01 0,090,01 0,080,01 0,080,01 0,090,01 0,140,01 0,070,01 0,070,01 18 20:5n-3 2,200,03 1,570,01 0,960,05 1,260,02 1,180,02 0,770,05 0,700,03 0,940,02 0,830,02 2,980,01 1,580,05 1,210,05 19 22:4n-6 3,570,02 3,680,03 3,520,01 3,300,04 2,850,02 3,070,03 2,670,01 2,990,01 3,010,03 3,380,04 3,940,01 4,550,01 20 22:5n-6 7,500,12 7,030,13 6,550,12 6,650,16 6,220,18 6,130,15 5,590,29 5,780,38 6,010,12 6,990,24 8,330,27 8,390,04 21 22:5n-3 0,750,05 0,910,08 1,100,08 1,080,05 0,960,06 0,920,05 0,910,05 1,090,09 0,960,04 0,820,003 0,700,03 0,810,03 22 22:6n-3 34,060,13 35,450,12 36,450,85 36,520,34 40,700,25 36,180,37 36,600,54 38,420,15 36,910,68 36,840,14 34,560,55 30,210,24

Khác 0,39 2,79 1,47 1,41 0,90 0,39 0,00 1,86 7,46 8,22 3,87 1,70

DMA 1,89 1,66 2,04 1,57 1,44 1,06 0,55 0,46 7,47 1,08 0,52 1,36

Axb no 34,57 36,20 39,57 39,78 38,31 42,62 45,92 40,15 29,49 27,99 35,38 39,22

Axb

không no 63,15 59,35 56,92 57,24 59,34 55,94 53,54 57,52 55,59 62,71 60,24 57,72

n-3 40,95 41,49 41,13 41,05 44,65 39,70 39,90 42,39 40,41 43,37 40,63 36,48

n-6 13,68 11,87 11,06 11,62 10,56 11,59 9,33 10,41 10,91 12,96 14,47 14,41

n-9 4,74 5,03 3,95 3,45 3,19 3,75 3,50 3,51 3,20 3,26 3,16 5,02

Trong tất tháng khảo sát, tổng axit béo, hàm lượng axit béo không no chiếm ưu so với axit béo no Trong 12 tháng, hàm lượng axit béo no dao động từ 27,99 – 45,92%, hàm lượng axit béo không no dao động từ 53,54 – 63,15% Ở hầu hết tháng, hàm lượng axit béo no khơng no có chênh lệch đáng kể, khoảng cách thu hẹp tháng mùa hè tăng cao tháng mùa đông Sự chênh lệch hàm lượng axit béo no axit béo không no cao mẫu san hô thủy tức thu thập vào tháng 10, với giá trị 29,49% 62,71% (biểu đồ 3.9)

Biểu đồ 3.9 Hàm lượng axit béo no axit béo không no lipid tổng mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla

Thành phần axit béo no mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla

Biểu đồ 3.10 Hàm lượng axit béo 14:0, 16:0, 18:0, 20:0 lipid tổng mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla

Trong thành phần axit béo không no, axit béo n-7 n-9 chiếm hàm lượng nhỏ, hàm lượng axit béo n-7 dao động từ 0,10-2,90%, hàm lượng axit béo n-9 dao động từ 3,16 – 5,03% Thành phần chủ yếu axit béo không no mẫu san hô thủy tức Millepora

platyphylla axit béo n-3 n-6 Hàm lượng họ axit béo

Biểu đồ 3.11 Tỉ lệ hàm lượng axit béo n-3/n-6 thành phần axit béo mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla

Trong thành phần axit béo không no đa nối đôi mẫu san hô thủy tức

Millepora platyphylla, dễ dàng quan sát thấy so với lipid san hơ

lồi san hơ thủy tức vùng biển lạnh, lipid Millepora platyphylla có hàm lượng thấp axit béo 20:4n-6 20:5n-3, hàm lượng cao axit béo 22:6n-3, chứa hàm lượng đáng kể axit béo 22:5n-6 (biểu đồ 3.12) [39] Thành phần axit béo sử dụng rộng rãi để xác định thay đổi thành phần nguồn thức ăn san hô [40] Sinh vật phù du, nguồn thức ăn Cnidarian, nguồn cung cấp axit béo 20:5n-3 để sinh tổng hợp axit béo 22:6n-3 [41] Hàm lượng axit béo 22:6n-3 mẫu

Millepora platyphylla cao tháng (40,70%0,25) cao

Biểu đồ 3.12 Hàm lượng axit béo 20:4n-6, 20:5n-3, 22:5n-6, 22:6n-3 thành phần axit béo mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla

Khi nguồn thức ăn bên ngày giảm, tầm quan trọng vi sinh vật cộng sinh zooxanthellae – sinh tổng hợp chất hữu thơng qua q trình quang hợp vận chuyển chúng đến vật chủ [42], có xu hướng tăng lên M platyphylla Axit béo 18:4n-3 chất thị cho có mặt vi sinh vật cộng sinh zooxanthellae [8], hàm lượng 18:4n-3 phản ánh số lượng vi sinh vật cộng sinh nội bào [21]

Kết phân tích cho thấy, thời kỳ mùa đơng, hàm lượng axit béo 18:4n-3 san hô thủy tức M platyphylla tăng gấp đôi, điều cho thấy gia tăng số lượng và/hoặc suất vi tảo cộng sinh zooxanthellae (biểu đồ 3.13)

Qua đó, cho chế độ dinh dưỡng dị dưỡng chiếm ưu lồi san hơ thủy tức Millepora platyphylla vào mùa hè, vai trò nguồn thức ăn tự dưỡng tăng lên tháng mùa đơng Do đó, thực nghiên cứu biến động hàng năm thành phần hàm lượng lớp chất lipid, bao gồm lipid cấu trúc lipid dự trữ, thành phần hàm lượng axit béo, mang đến thông tin biến động nguồn lượng, sinh sản dinh dưỡng san hô thủy tức Millepora

CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận:

Đã thực nghiên cứu lipid mẫu san hô thủy tức Millepora

platyphylla được thu thập 12 tháng liên tục vùng biển Nha Trang,

Khánh Hòa

1 Đã xác định hàm lượng lipid tổng mẫu san hô thủy tức

Millepora platyphylla 12 tháng Hàm lượng lipid tổng tính trọng

lượng tươi dao động từ 0,210,02 đến 0,51%0,05, hàm lượng tính trọng lượng khô dao dộng từ 0,260,01 đến 0,63%0,06 Hàm lượng lipid tổng có xu tăng tháng mùa hè giảm vào tháng mùa đông Tỉ lệ hàm lượng lipid tổng tính trọng lượng khơ hàm lượng lipid tổng tính trọng lượng tươi 12 tháng khơng có q nhiều chênh lệch, dao động khoảng từ 1,22 đến 1,25

(35,32%0,28 29,07%0,37), Sự thay đổi hàm lượng lipid tổng, lớp chất lipid lipid tổng liên quan tới thay đổi môi trường sống nhiệt độ nước xạ mặt trời theo mùa, trình trưởng thành sinh sản san hô thủy tức Millepora platyphylla

3 Đã xác định thành phần hàm lượng lớp chất phospholipid (phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylchonline (PC), phosphatidylserine (PS), phosphatidylinositol (PI), phosphonolipid ceramide aminoethylphosphonate (CAEP)) lipid tổng mẫu

Millepora platyphylla trong 12 tháng Hàm lượng lớp chất PI dao động

khoảng từ 4,040,01 – 6,75%0,04, hàm lượng lớp chất PS: 5,250,03 – 8,85%0,06, CAEP: 16,36%0,36 – 20,39%0,16, lớp chất PC PE chiếm tỉ lệ cao nhất, hàm lượng PC dao động khoảng 34,430,36 – 40,14%0,16, hàm lượng PE dao động từ 30,930,20 – 33,89%0,12 tổng phospholipid Các lớp chất phospholipid biến động hàm lượng 12 tháng

4 Tổng cộng 22 axit béo nhận dạng từ C12 tới C22, nhiều axit béo C18, C20 C22 Trong tất 12 tháng, hàm lượng axit béo không no chiếm ưu so với axit béo no, hàm lượng chênh lệch nhiều mẫu Mp10 Trong thành phần axit béo no, hai axit béo 16:0 18:0 chiếm thành phần Trong thành phần axit béo khơng no, axit béo n-3 n-6 thành phần Lipid Millepora platyphylla có hàm lượng thấp axit béo 20:4n-6 20:5n-3, hàm lượng cao 22:6n-3, chứa hàm lượng đáng kể axit béo 22:5n-6 Dựa tăng/giảm axit béo 22:6n-3 18:4n-3 theo mùa, giả định chế độ dinh dưỡng dị dưỡng chiếm ưu lồi san hơ thủy tức Millepora platyphylla vào mùa hè, vai trò nguồn thức ăn tự dưỡng tăng lên tháng mùa đơng lồi san hơ thủy tức Millepora platyphylla

tức Millepora platyphylla nói riêng lồi san hơ/san hơ thủy tức khác nói chung

Kiến nghị:

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 http://bachkhoatoanthu.vass.gov.vn/noidung/tudien/Lists/GiaiNghia/View _Detail.aspx?ItemID=6877

2 Cartwright, P., & Nawrocki, A M, 2010, Character Evolution in Hydrozoa (phylum Cnidaria), Integrative and Comparative Biology, 50(3), pp 456–472

3 Christopher C Parrish, 2013, Lipids in marine ecosystem, ISRN

Oceanography, Article pp 1-16

4 Panadda Phattanawasin, Uthai Sotanaphun, 2011, A Comparison of Image Analysis Software for Quantitative TLC of Ceftriaxone Sodium,

Silpakorn U Science & Tech Journal, (1), pp 7-13

5 Phạm Quốc Long Châu Văn Minh, 2005, Lipid axit axit béo hoạt tính sinh học có nguồn gốc thiên nhiên, NXB Khoa học kĩ thuật.

6 Stromgren.T, 1976, Skeleton growth of the hydrocoral Millepora complanata Lamarck in relation to light, Limnology and Oceanography, 21(1), pp 156-160

7 Witman, 1988, Effects of Predation by the Fireworm Hermodice Carunculata on Milleporid Hydrocorals, Bulletin of Marine Science,

42(3), pp 446–458

8 Abe, N., 1938, Feeding behaviour and the nematocysts of Fungia and 15 other species of corals, Palao Tropical Biology Station Studies, 1, pp 469-521

9 De Kruijf, H A M., 1975, General morphology and behaviour of gastrozooids in two species of Millepora (Milleporina, Coelenterata)

Marine Behaviour and Physiology, 3, pp 181-192

10 Lewis, J B., 1992a, Heterotrophy in corals: Zooplankton predation by the hydrocoral Millepora complanata, Marine Ecology Progress Series, 90, pp 251-256

11 Lewis, J B.,2006, Biology and Ecology of the Hydrocoral Millepora on

12 Stimson, J., Sakai, K and Sembali, H., 2002, Interspecific comparison of the symbiotic relationship in corals with high and low rates of bleaching-induced mortality, Coral Reefs, 21, pp 409–421

13 Glynn PW, 1973, Aspects of the ecology of coral reefs in the western Atlantic region In: Jones OA, Endean R (eds) Biology and geology of coral reefs, Biology Academic Press, New York, 2, pp 271-324

14 Randall JE, 1967, Food habits of reef fishes of the West Indies Stud Trop Oceanogr, 5, pp 665- 847

15 Bourmaud, C A.-F., Leung, J K L., Bollard, S., & Gravier-Bonnet, N., 2013, Mass spawning events, seasonality and reproductive features in Milleporids (Cnidaria, Hydrozoa) from Reunion Island, Marine Ecology,

34, pp 14-24

16 Boschma H, 1948, The species problem in Millepora, Zool Verh Leiden, 1, pp 3–115

17 ScoYn, T., et al., 1980, Calcium carbonate budget of a fringing reef on

the west coast of Barbados, Bull Mar Sci, 30, pp 475-508

18 Shinn EA, Hudson JH, Robbin DM, Ridz B, 1981, Spurs and Grooves revisited: construction versus erosion Looe Key Reef, Florida, Proc 4th Int Coral Reef Symp,1 , 475–483

19 Lewis, J B., 1991a, Testing the coral fragment size-dependent hypothesis for the calcareous hydrozoan Millepora complanata Marine

Ecology Progress Series, 70, pp 101-104

20 Shiomi, K., Hosaka, M., Yanaike, N., Yamanaka, H., & Kikuchi, T, 1989, Partial characterization of venoms from two species of fire corals Millepora platyphylla and Millepora dichotoma, NIPPON

SUISANGAKKAISHI, 55(2), pp 357-362

21 Abramovitch-Gottlib, L., Geresh, S., & Vago, R, 2006, Biofabricated Marine Hydrozoan: A Bioactive Crystalline Material Promoting Ossification of Mesenchymal Stem Cells. Tissue Engineering, 12(4), pp 729–739

fire corals Millepora alcicornis and Millepora complanata (Cnidaria: Hydrozoa). Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical

Diseases, 18(1), pp 109–115

23 Imbs A.B., Latyshev N.A., 2010, Distribution of lipids and fatty acids in corals by their taxonomic position and presence of zooxanthellae,

Marine ecology progress series; pp 409, 65-75

24 A B Imbs, 2013, Fatty acids and other lipids of corals: Composition, distribution, and biosynthesis; Russian Journal of Marine Biology; 39(I3), pp 153–168

25 Imbs, A B., Dang, L P T., & Nguyen, K B, 2019, Comparative lipidomic analysis of phospholipids of hydrocorals and corals from tropical and cold-water regions Plos one, 14(4), e0215759

26 Nguyễn Bá Kiên, Trịnh Thị Thu Hương, Lưu Văn Huyền, Nguyễn Thành Vinh, Trần Duy Phong, Đặng Thị Minh Tuyết, Nguyễn Thị Nga, Đặng Thị Phương Ly, Phạm Quốc Long, 2019, Nghiên cứu thành phần, hàm lượng lipid tổng lớp chất lipit số lồi san hơ lửa (thủy tức) san hô mềm vùng biển Nha Trang Việt Nam, Tạp chí

Khoa học Cơng nghệ Biển, 19(1), tr 87–91

27 Folch J F., Lees M, Sloane Stanley G H (1957), A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissue; J Biol Chem., 226, pp 497–509

28 Uthai S Panadda P (2011), A Comparison of Image Analysis Software for Quantitative TLCof Ceftriaxone Sodium, Silpakorn U Science &

Tech J.,5(1), pp 7-13

29 Andrey B I., Ly P T D., Viacheslav G R., Vasily I S., 2015, Fatty acid, lipid class, and phospholipid molecular species composition of the soft coral Xenia sp., Lipids, 50(6), pp 575-589

30 Oku, H., Yamashiro, H., Onaga, K., et al., 2003, Seasonal changes in the content and composition of lipids in the coral Goniastrea aspera, Coral

31 Nha Trang Sea Temperature, Global Sea Temperature https://www.seatemperature.org/asia/vietnam/nhatrang.htm Accessed February 10, 2020

32 Đặng Thị Phương Ly, 2016, Nghiên cứu thành phần lipid dạng

phân tử phospholipid từ số loài san hô mềm Việt Nam - Luận

án Tiến sỹ Học viện Khoa học công nghệ - Viện HLKHCN VN 33 Rodrigues, L.J., Grottoli, A.G., and Pease, T.K., 2008, Lipid class

composition of bleached and recovering Porites compressa Dana, 1846 and Montipora capitata Dana, 1846 corals from Hawaii, J Exp Mar

Biol Ecol., 358, pp 136–143

34 Imbs, A.B and Yakovleva, I.M., 2012, Dynamics of lipid and fatty acid composition of shallow-water corals under thermal stress: an experimental approach, Coral Reefs, 31, pp 41–53

35 Arai, T., Kato, M., Heyward, A., et al., 1993, Lipid composi-tion of positively buoyant eggs of reef building corals, Coral Reefs, 12, pp 71-75

36 Figueiredo, J., Baird, A.H., Cohen, M.F., et al., 2012, Onto-genetic change in the lipid and fatty acid composition of scleractinian coral larvae, Coral Reefs, 31, pp 613–619

37 Viladrich, N., Bramanti, L., Tsounis, G., et al., 2016, Varia-tion in lipid and free fatty acid content during spawning in two temperate octocorals with different reproductive strategies: surface versus internal brooder,

Coral Reefs, 35, pp 1033–1045

38 Sikorskaya, T.V., Ermolenko, E.V., and Imbs, A.B., 2020, Effect of experimental thermal stress on lipidomes of the soft coral Sinularia sp and its symbiotic dinoflagellates, J Exp Mar Biol Ecol., 524, art ID 151295

40 Rocker, M.M., Francis, D.S., Fabricius, K.E., et al., 2019, Temporal and spatial variation in fatty acid composi-tion in Acropora tenuis corals along water quality gradi-ents on the Great Barrier Reef, Australia,

Coral Reefs, 38, pp 215

41 Dalsgaard, J., St John, M., Kattner, G., et al., 2003, Fatty acid trophic markers in the pelagic marine environ-ment, Adv Mar Biol., 46, pp 225–340

PHỤ LỤC

Hình ảnh phân tích thành phần lớp chất lipid phần mềm Sorbfil TLC Videodensitometer DV (Krasnodar, LB Nga)

Mẫu Sắc kí đồ Sorbfil TLC

Mp.1

Mp.3

Mp.4

Mp.6

Mp.7

Mp.9

Mp.10

PHỤ LỤC

Hình ảnh phân tích thành phần lớp chất phospholipid phần

mềm Sorbfil TLC Videodensitometer DV (Krasnodar, LB Nga)

Mẫu Sắc kí đồ Sorbfil TLC

Mp.1

Mp.3

Mp.4

Mp.6

Mp.7

Mp.9

Mp.10

PHỤ LỤC

Phổ GC methyl ester axit béo lipid tổng mẫu san hô thủy tức Millepora platyphylla

Mp.1

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0

-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5

5.0uV(x10,000) Chromatogram

1 /1 :0 2/ /1 :0

4/ 5/6

/D M A 7/ /1 :0 /1 :1 n -7

/ 11

/

1

2

/

3

/ 14

/P h y t / /1 :1 /D M A -1 :0 / / / /1 :1 n -9 2 / / /1 :2 n -6 /1 :3 n -6 /1 :3 n -3 /1 :4 n -3 /2 :0 /2 :1 n -9 / /2 :4 n -6 /2 :4 n -3 3 /2 :5 n -3 / /2 :4 n

-6 36

Mp.2

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0

-1.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0

10.0uV(x10,000) Chromatogram

1 /1 :0 2/ /1 :0 4/ 5/ 6/ 7/ 8/ /D M A / 1 /1 :0 / /1 :1 n -7 / /

/ 17

/P h y t / / /1 :1 / 2 / /1 :0 /1 :1 n -9 /1 :1 n -7 / / /1 :2 n -6

/ 30

/1 :3 n -6

/ 32/1

8 :3 n -3 3 /1 :4 n -3 /2 :0

/ 36

/2 :1 n -9 /

/ 39

/ /2 :4 n -6 /2 :4 n -3 /2 :5 n -3 /2 :0 4 /2 :1 / /2 :4 n

-6 47

Mp.3

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0

-1.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0

10.0uV(x10,000) Chromatogram

1 /1 :0 2/ /1 :0 4/ 5/ 6/ /1 :0 8/ /1 :1 n -7 / 1 / /P h y t / /1 :1 /1 :0 /1 :1 n -9 /1 :1 n -7 / /1 :2 n -6 /1 :3 n -6 /1 :3 n -3 2 /1 :4 n -3 /2 :0 / /2 :1 n -9 / / / /2 :4 n -6 /2 :4 n -3 /2 :5 n -3 /2 :0 3 /2 :1

/ 35

Mp.4

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0

-1.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0

10.0uV(x10,000) Chromatogram

1 /1 :0 /1 :0 3/ 4/ 5/ 6/ /1 :0 8/ /1 :1 n -7 /1 /

/ 13

/P h y t / / /1 :1 /1 :0 /1 :1 n -9 /1 :1 n -7 /1 :2 n -6

/ 22

/1 :3 n -6 /1 :3 n -3 /1 :4 n -3 /2 :0 / /2 :1 n -9 / /

/ 31

/2 :4 n -6 /2 :4 n -3 3 /2 :5 n -3 /2 :0 /2

:1 36

Mp.5

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0

-1.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0

10.0uV(x10,000) Chromatogram

1 /1 :0 /1 :0 3/ 4/ 5/ 6/ /1 :0 8/ /1 :1 n -7

/ 11

/

1

2

/ 13

/P h y t

/ 15

/ /1 /1 :1 / /1 :0 /1 :1 n -9 /1 :1 n -7 2 /1 :2 n -6

/ 24

/1 :3 n -6 /1 :3 n -3 /1 :4 n -3 /2 :0 / /2 :1 n -9 / / /2 :4 n -6 3 /2 :4 n -3 /2 :5 n -3 /2 :0 /2

:1 37

Mp.6

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0

-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5

5.0uV(x10,000) Chromatogram

1 /1 :0 /1 :0 3/ 4/ 5/ 6/ /1 :0 8/9 /1 :1 n -7

/ 11

/P h y t / /1 :1 /1 :0 /1 :1 n -9 /1 :1 n -7 / /1 :2 n -6 / /1 :3 n -6 /1 :3 n -3 2 /1 :4 n -3 /2 :0

/ 25/2

0 :1 n -9

/ 27/2

Mp.7

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0

-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5

5.0uV(x10,000) Chromatogram

1 /1 :0 /1 :0

3/ 5/ 4/

6 /1 :0 7/8 /1 :1 n -7 9/ / 1 /P h y

t 12

/ / /1 :1 /1 :0 /1 :1 n -9 /1 :1 n -7 /1 :2 n -6 /1 :3 n -6 /1 :3 n -3 /1 :4 n -3 2 /2 :0 /2 :1 n -9 /2 :4 n -6 /2 :4 n -3 /2 :5 n -3 /2 :0 /2

:1 29/2

2

:4

n

-6 30

Mp.8

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0

-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5

5.0uV(x10,000) Chromatogram

1 /1 :0 /1 :0 3/ 4/ 5/ /1 :0 7/8 /1 :1 n -7 9/ /P h y t 1 / /1 :1 / /1 :0 /1 :1 n -9 /1 :1 n -7 /1 :2 n -6 / /1 :3 n -6 /1 :3 n -3 /1 :4 n -3 2 /2 :0

/ 24/2

0 :1 n -9

/ 26/2

Mp.9

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0

-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5

5.0uV(x10,000) Chromatogram

1 /1 :0 /1 :0 3/ 4/ 5/ 6/ /1 :0 8/9 /1 :1 n -7 / 1 / /P h y

t 13

/ / /1 :1 /1 :0 /1 :1 n -9 /1 :1 n -7 /1 :2 n -6 /1 :3 n -6 /1 :3 n -3 2 /1 :4 n -3 /2 :0 /2 :1 n -9 /

/ 27

/2 :4 n -6 /2 :5 n -3 /2 :0 /2

:1 31

Mp.10

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0

-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5

5.0uV(x10,000) Chromatogram

1 /1 :0 /1 :0 3/ 4/ 5/ 6/ /1 :0 /1 :1 n -7 9/ / 1 /1

/ 13

/P h y t /1 / /1 :1 / / /1 :0 /1 :1 n -9 /1 :1 n -7 2 /1 :2 n -6 /2 /1 :3 n -6 /1 :3 n -3 /1 :4 n -3 /2 :0

/ 29/2

0 :1 n -9 / / / 3 /2 :4 n -6 /2 :4 n

-3 35

/2 :5 n -3 /2 :0 / /2 :4 n

-6 39

Mp.11

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0

-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5

5.0uV(x10,000) Chromatogram

1 /1 :0 /1 :0 3/ 4/ 5/ 6/ /D M A 8/ /1 :0 /1 :1 n -7 1 / /

/ 14

/P h y t / /1 :1 / /D M A -1 :0 / / /1 :0 2 /1 :1 n -9 /1 :1 n -7 / /1 :2 n -6

/ 27

Mp.12

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0

-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5

5.0uV(x10,000) Chromatogram

1 /1 :0 /1 :0 3/ 4/ 5/ 6/ 7/ /D M A /1 :0 /1 :1 n -7 1

/ 12

/ /

/ 15/P

h y t / /1 :1 /D M A -1 :0

/ 20

1