Nghiên cứu tách chiết độc tố conopeptide từ ốc nón conus bandanus và đánh giá sơ bộ thành phần của độc tố

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nghiên cứu tách chiết độc tố conopeptide từ ốc nón Conus bandanus đánh giá sơ thành phần độc tố Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Bảo Sinh viên thực hiện: Trần Thị Thu Thỏa Mã số sinh viên: 56131848 Khánh Hòa – 2018 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nghiên cứu tách chiết độc tố conopeptide từ ốc nón Conus bandanus đánh giá sơ thành phần độc tố GVHD: TS Nguyễn Bảo SVTH: Trần Thị Thu Thỏa MSSV: 56131848 Khánh Hòa, tháng 07/2018 LỜI CẢM ƠN Qua thời gian nghiên cứu thực tập phòng thí nghiệm Trường Đại Học Nha Trang, em hồn thành đồ án tốt nghiệp Để hoàn thành đồ án này, nổ lực thân em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến giúp đỡ tận tình q Thầy bạn bè Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường đại học Nha Trang, Khoa Cơng Nghệ Thực Phẩm, Phịng thực hành cơng nghệ chế biến, Phịng thí nghiệm cơng nghệ cao tạo điều kiện thuận lợi hỗ trợ cho em trình học tập thực nghiên cứu Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới giảng viên TS Nguyễn Bảo tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện tốt động viên em suốt trình thực đề tài nghiên cứu Trong q trình thực đề tài khơng tránh khỏi sai sót, em mong nhận đóng góp từ q Thầy Cơ Em xin chân thành cảm ơn! Khánh Hòa, tháng 07 năm 2018 Sinh viên thực Trần Thị Thu Thỏa i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC HÌNH iv DANH MỤC BẢNG .vi KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vii ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan ốc nón 1.1.1 Đặc điểm hình thái cấu tạo ốc nón 1.1.2 Đặc điểm sinh thái phân bố .5 1.1.3 Chế độ ăn phương thức săn mồi .5 1.2 Tổng quan tuyến nọc độc độc tố 1.2.1 Tuyến nọc độc .8 1.2.2 Độc tố ốc nón 10 1.2.3 Phân loại độc tố 11 1.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) .16 1.4 Phương pháp phổ khối MALDI-TOF MS 18 1.5 Tình hình nghiên cứu độc tố .19 1.5.1 Nghiên cứu giới 19 1.5.2 Nghiên cứu nước 20 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .22 2.1 Đối tượng nghiên cứu phương pháp thu mẫu 22 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22 2.1.2 Hóa chất 22 2.1.3 Dụng cụ thiết bị 22 2.1.4 Thu mẫu 23 2.2 Phương pháp nghiên cứu 23 ii 2.2.1 Sơ đồ tổng quát nghiên cứu 23 2.2.2 Bố trí thí nghiệm tách chiết độc tố thô 24 2.2.3 Khảo sát phân vùng sơ nọc độc thơ RP-HPLC 28 2.2.4 Phân tích khối phổ phân vùng độc tố MALDI-TOF MS .28 2.2.5 Phương pháp khử peptide 29 2.3 Xác định hàm lượng protein độc tố thô theo phương pháp Bradford 29 2.4 Xử lý số liệu 31 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Kết khảo sát thông số ly tâm công đoạn tách độc tố 32 3.2 Kết khảo sát thông số lực ly tâm cho công đoạn siêu lọc 32 3.3 Kết sắc ký đồ pha đảo nọc độc thô C bandanus 33 3.4 Kết phân tích phổ khối nọc độc thô phân vùng 34 3.4.1 Kết phân tích MALDI-TOF MS phân vùng Z1 dạng tự nhiên dạng khử 34 3.4.2 Kết phân tích MALDI-TOF MS phân vùng Z2 dạng tự nhiên dạng khử 36 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 iii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình dạng bên ngồi ốc nón Conus bandanus Hình 1.2 Các phận ốc nón Hình 1.3 Cách săn mồi dạng móc câu ốc nón Conus Hình 1.4 Cách săn mồi dạng lưới Hình 1.5 Ốc nón ăn nhuyễn thể .7 Hình 1.6 Ốc nón ăn giun biển Hình 1.7 Cấu tạo kitin loài ăn cá Hình 1.8 Cấu tạo kirtin loài ăn nhuyễn thể .10 Hình 1.9 Cấu tọ kitin loài ăn giun biển 10 Hình 1.11 Các phương pháp tách tinh sắc ký (1) Tương tác kỵ nước; (2) Pha đảo; (3) Trao đổi ion; (4) Lọc gel; (5) Ái lực 18 Hình 12 Sơ đồ minh họa hoạt động hệ MALDI-TOF 19 Hình 2.1 Vỏ ốc nón C bandanus 22 Hình 2.2 Tuyến nọc độc ốc nón C bandanus 22 Hình 2.3 Sơ đồ tổng quát nghiên cứu phân tích thành phần conopeptide từ nọc độc ốc nón C bandanus 23 Hình 2.4 Sơ đồ tách chiết .24 Hình 2.5 Khảo sát lực ly tâm cơng đoạn tách chiết độc tố 25 Hình 2.6 Khảo sát thời gian ly tâm công đoạn tách chiết độc tố 26 Hình 2.7 Công đoạn cut-off ống Amicon 0.5 ml .27 Hình 2.8 Khảo sát lực ly tâm công đoạn siêu lọc .27 Hình 2.9 Hệ thống sắc ký lỏng cao áp Shimadzu LC-class 10 28 Hình 2.10 Hình bên trái thiết bị phân tích MALDI-TOF/TOF MS hình bên phải sơ đồ hóa chế hoạt động máy 29 Hình 2.11 Đồ thị đường chuẩn phương pháp Bradford 30 Hình 3.1 Sắc ký đồ pha đảo (RP-HPLC) nọc độc thơ ốc nón C bandanus qua cột Vydac C18 (300 Å, 5µm, 4.6 mm, 250mm) với tốc độ dịng ml.phút-1 33 Hình 3.2 Phổ khối [M+H]+của nọc độc thơ ốc nón C bandanus 34 iv Hình 3.3 Phổ khối [M+H]+ phân vùng Z1 từ 25-33 phút sắc ký đồ với (A) dạng tự nhiên, (B) dạng khử 35 Hình 3.4 Phổ khối [M+H]+ phân vùng Z2 từ 33-39 phút sắc ký đồ với (A) dạng tự nhiên, (B) dạng khử 36 Hình 3.5 Phổ khối [M+H]+ phân vùng Z3 từ 39-44 phút sắc ký đồ với (A) dạng tự nhiên, (B) dạng khử 37 Hình 3.6 Phổ khối [M+H]+ phân vùng Z4 từ 44-53 phút sắc ký đồ với (A) dạng tự nhiên, (B) dạng khử 38 v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Bộ khung cysteine Conoserver 13 Bảng 1.2 Các đại diện conopeptide giai đoạn thử nghiệm lâm sàng 15 Bảng 2.1 Nồng độ abumin khác để dụng đường chuẩn 30 Bảng 3.1 Bảng mô tả trạng thái dịch ly tâm công đoạn tách độc tố với lực ly tâm khác thời gian 10 phút 32 Bảng 3.2 Bảng mô tả trạng thái dịch ly tâm công đoạn tách độc tố khoảng thời gian khác 3500 xg 32 Bảng 3.3 Bảng mô tả lượng dịch thu hồi công đoạn cut-off với lực ly tâm khác 10 phút 32 Bảng 3.4 Khối lượng phân tử phân vùng độc tố ốc nón C bandanus 39 vi KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT S-S: disulfide LC: Phương pháp sắc ký lỏng (Liquid chromatography) RP-HPLC: Phương pháp sắc ký lỏng pha đảo (Reversed Phase - HighPerformance Liquid Chromatography) MALDI: Matrix assisted laser desorption/-ionization TOF: Thời gian bay (Time of flight) MS: Khối phổ (Mass spectrometry) KLPT: Khối lượng phân tử vii ĐẶT VẤN ĐỀ Tính cấp thiết đề tài Vùng biển Việt Nam có khoảng 11000 lồi sinh vật biển, có 692 lồi thực vật phù du, 657 lồi động vật phù du, 94 loài thực vật ngập mặn, 653 loài rong biển, 6377 loài động vật đáy lớn (trong có 2523 lồi thân mềm, 1647 lồi giáp xác, 714 loài ruột khoang, 734 loài giun đốt, 384 loài da gai nhiều nhóm sinh vật khác), khoảng 2109 lồi cá biển, có 779 lồi cá rạn san hô Với số liệu trên, nhà chuyên môn nước đánh giá biển Việt Nam trung tâm đa dạng sinh vật biển giới Trong đó, ốc nón nguồn lợi hải sản có mức độ phong phú thành phần loài theo báo cáo Hylleberg Kilburn (2003), vùng biển Việt Nam có khoảng 76 lồi ốc nón Chúng phân bổ chủ yếu vùng ven biển, quanh đảo thuộc vùng biển miền Trung: Lý Sơn (Quảng Ngãi), Cù Lao Chàm (Quảng Nam), Sông Cầu (Phú Yên), Hòn Lớn (Vân Phong-Khánh Hòa), vịnh Nha Trang (Khánh Hịa) Vỏ ốc nón có màu sắc sặc sỡ với hoa văn đẹp mắt nên ưa chuộng để làm đồ mỹ nghệ, đồ trang sức, đồ lưu niệm thịt ốc nguồn cung cấp dinh dưỡng dồi Chính dẫn đến tình trạng khai thác mức làm cạn kiệt nguồn tài nguyên [1] Ngoài giá trị mặt thẩm mỹ dinh dưỡng, ốc nón cịn mang lại lợi ích vô to lớn lĩnh vực y dược Bởi lồi sử dụng nọc độc để tự vệ săn mồi Tùy vào loại thức ăn chúng động vật thân mềm, cá, sâu biển hay số lồi ốc nón khác mà tạo hàng nghìn peptide độc có hoạt tính sinh học khác Tuy nhiên, theo thống kê Lewis cộng (2012), có khoảng 0,1% conopeptide biết rõ dược tính tiềm điều trị bệnh nan y từ nguồn dược này[2] Trong có ω-conotoxin MVIIA thương mại hóa với tên Ziconotide (SNX-111; Prialt) sản phẩm tổng hợp từ độc tố ốc nón Conus magus Ziconotide có tác dụng giảm đau cho đau dội mãn tính, sản phẩm sử dụng cách tiêm trực tiếp vào não tủy để giảm đau (được FDA phê duyệt vào tháng 12/2004) Vì ứng dụng cần thiết nên cần tập trung nghiên cứu conopeptide lồi ốc nón tiềm để khai thác hoạt tính y học từ nguồn độc dược Đây Kiểm tra hàm lượng protein độc tố thô sau cut-off Cho ml dịch hòa tan độc tố vào ống nghiệm, cho thêm ml thuốc thử Bradford, vortex ủ 10 phút nhiệt độ phòng Sau ủ mang mẫu so màu máy đo quang phổ có bước sóng 595nm Đọc giá trị mật độ quang, dựa vào đường chuẩn để xác định hàm lượng protein mẫu 2.4 Xử lý số liệu  Phân tích phổ khối MS conopeptide phần mềm Data Explorer® v4.9 (Applied Biosystems)  Dữ liệu thô phổ khối lượng xuất phần mền Excel 2013 Microsoft Office 31 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết khảo sát thông số ly tâm công đoạn tách độc tố Từ bảng mô tả trạng thái dịch ly tâm cho lực ly tâm bảng 3.1 bảng mô tả trạng thái thời gian ly tâm bảng 3.2, ta thấy lực ly tâm cao thời gian ly tâm kéo dài chất lượng dịch độc tố thô tốt Bảng 3.1 Bảng mô tả trạng thái dịch ly tâm công đoạn tách độc tố với lực ly tâm khác thời gian 10 phút Lực ly tâm 3000 xg Mô tả Trắng đục, có huyền phù, cặn bám khơng đáy ống 3500 xg 4000 xg Trắng, đục, khơng có huyền phù, cặn bám đáy ống Trắng, đục, khơng có huyền phù, cặn bám đáy ống Bảng 3.2 Bảng mô tả trạng thái dịch ly tâm công đoạn tách độc tố khoảng thời gian khác 3.500 xg Thời gian phút 10 phút 15 phút Mô tả Trắng đục, huyền phù vừa phải, cặn bám không đáy ống Trắng đục, khơng có huyền phù, cặn bám đáy ống Trắng đục, khơng có huyền phù, cặn bám đáy ống Tuy nhiên mục đích việc khảo sát chế độ ly tâm tìm lực ly tâm phù hợp, thời gian ly tâm phù hợp loại bỏ bã rắn dịch chiết độc tố nhắm tiết kiệm thời gian lượng Ly tâm 3500 xg/10 phút cho chất lượng dịch sau ly tâm tương đương ly tâm 4000 xg/10 phút 3500 xg/15 phút Vậy thông số ly tâm phù hợp cho công đoạn ly tâm tách độc tố 3500 xg/10 phút 3.2 Kết khảo sát thông số lực ly tâm cho công đoạn siêu lọc Từ bảng mô tả ta thấy lượng dịch thu hồi tỷ lệ thuận với lực ly tâm Ở lực ly tâm cao 13000 xg lượng dịch thu hồi cao Tuy nhiên so sánh lực ly tâm 12000 xg 13000 xg, lượng dịch thu hồi tăng không đáng kể Bảng 3.3 Bảng mô tả lượng dịch thu hồi công đoạn siêu lọc với lực ly tâm khác 10 phút Lực ly tâm Mô tả lượng dịch thu hồi Hiệu suất thu hồi 10000 xg 11000 xg 12000 xg 13000 xg ~ 0.16 ml ~ 0.2 ml ~ 0.28 ml ~ 0.3 ml 40% 50% 70% 75% 32 (từ 70% lên 75%), so sánh 12000 xg với 11000 xg ta thấy lượng dich tăng lên cao (từ 50% lên 70%) Vậy ta chọn lực ly tâm 12000 xg vòng 10 phút với 5% B (trong 0.4 ml dịch cho vào ống Amicon) phù hợp tránh nguy rạn nứt ống siêu lọc 3.3 Kết sắc ký đồ pha đảo nọc độc thô C bandanus Từ kết xác định nồng độ protein nọc độc thơ qua xử lí (0,255 µg/µl phương pháp Bradford), tiến hành thực phân đoạn theo vùng hệ thống sắc ký hệ thống Shimadzu LC-class 10, với thể tích tiêm mẫu 1ml Cách thực mô tả chi tiết phần phương pháp Sắc ký đồ pha đảo nọc độc ốc nón C bandanus thể hình 3.1 Chương trình gradient chạy 10-60 phút với 0-56% B thể đường chéo sắc ký đồ (hình 3.1) Mẫu nọc độc thô phân đoạn theo phân vùng theo thời gian tín hiệu hấp thụ peak bước sóng 220 nm, cụ thể Z0 (từ 15-23 phút), Z1 (từ 25-33 phút), Z2 (từ 33-39), Z3 (từ 39-44 phút), Z4 (từ 44-53 phút) Hình 3.1 Sắc ký đồ pha đảo (RP-HPLC) nọc độc thô ốc nón C bandanus cột Vydac C18 (300 Å, 5µm, 4.6 mm, 250mm) với tốc độ dịng ml.phút-1 33 3.4 Kết phân tích phổ khối nọc độc thô phân vùng Phổ khối MALDI-TOF MS nọc độc thô phân vùng kiểm tra thủ công cách cẩn thận để xác định diện hợp chất có chất peptide/protein Hình 3.2 thể phổ khối [M+H]+ MALDI-TOF MS nọc độc thơ ốc nón C bandanus Hình 3.2 Phổ khối [M+H] +của nọc độc thơ ốc nón C bandanus Trong phổ khối [M+H]+ nọc độc thô xuất tín hiệu phân tử 1679.72 trội, nhiên chứa phân tử với m/z 1681.73, 1664.68, 2766.25 Vậy, phân tử có khối lượng phân tử (KLPT) xác tự nhiên 1678.72 Da, 1680.72 Da, 1663.67 Da, 2765.24 Da (do phân tử tích điện proton H+ nên với số điện tích z=1) Phân tích phổ khối MALDI-TOF MS phân vùng phân vùng nước, Z0, Z1, Z2, Z3, Z4 (Hình 3.1) Trong phân vùng nước (0-10 phút) phân vùng Z0 (15-23 phút) kết phân tích khối phổ khơng ghi nhận diện phân tử peptide (kết khơng trình bày đây) Phổ khối [M+H]+ MALDI-TOF MS phân vùng Z1, Z2, Z3, Z4 hình 3.3, 3.4, 3.5, 3.6 3.4.1 Kết phân tích MALDI-TOF MS phân vùng Z1 dạng tự nhiên dạng khử Phân tích phổ khối [M+H]+ MALDI-TOF MS phân vùng Z1 từ 25-33 phút, dạng tự nhiên (hình 3.3A) Trong phổ ta thấy xuất tín hiệu cao 34 với m/z 1855.69 , bên cạnh xuất nhiều tín hiệu nhỏ có [M+H]+ với m/z 1452.57, 1855.69, 1858.69 Hình 3.3 Phổ khối [M+H] + phân vùng Z1 từ 25-33 phút sắc ký đồ với (A) dạng tự nhiên, (B) dạng khử Sau phân tích hai phổ khối phân vùng Z1 phổ khối nguyên độc tố thô Ta thấy phổ khối nọc độc thơ (hình 3.2) 60 phút số tín hiệu ta quan sát phổ khối phân vùng Z1 dạng tự nhiên (hình 3.3A) chiếm phút 60 phút nguyên độc tố thô số lượng conopeptide quan sát nhiều so với phổ nguyên độc tố thô Số liệu thống kê bảng 3.3 Như qua phân tích so sánh phổ khối phân vùng Z1 dạng tự nhiên với phổ khối nọc độc thô, số phân tử phân vùng Z1 tìm nhiều nọc độc thơ Từ ta thấy nhiều tín hiệu phân tử khơng phát phương pháp MALDI phân tích hỗn hợp có thành phần phức tạp Phổ khối [M+H]+ phân vùng Z1 (hình 3.3) hai dạng tự nhiên (A) khử (B) tiến hành phân tích Ta thấy dạng tự nhiên (A) có phân tử bật có KLPT [M+H]+ với m/z 1855.69 đối chiếu với dạng khử (B) 1859.61 Dạng khử phân tử có dịch chuyển KLPT Da Ở phổ này, ta thấy khơng có phân tử có chênh lệch mà cịn có thêm ba phân tử Dạng tự nhiên (A) phân tử có khối lượng [M+H]+ với m/z 1452.57, 1696.67, 2044.71 đối chiếu với dạng khử (B) 1456.53, 1702.63, 2048.63 Việc so sánh KLPT dạng tự nhiên 35 dạng khử giúp ta phát số lượng cysteine phân tử peptide, từ cho phép đốn chúng thuộc khung cysteine định bảng 1.1 3.4.2 Kết phân tích MALDI-TOF MS phân vùng Z2 dạng tự nhiên dạng khử Hình 3.4 Phổ khối [M+H] + phân vùng Z2 từ 33-39 phút sắc ký đồ với (A) dạng tự nhiên, (B) dạng khử Phổ khối [M+H]+ MALDI-TOF MS phân vùng Z2 từ 33-39 phút, từ 2633% B dạng tự nhiên (hình 3.4A) Trong phổ khối ta khơng thấy xuất tín hiệu trội, nhiên qua kiểm tra xuất tín hiệu có KLPT [M+H]+ với m/z 1680.69, 1971.61, 3108.31 Sau phân tích hai phổ khối dạng tự nhiên hai phân vùng Z1 (hình 3.3A) Z2 (hình 3.4A), ta thấy hai phân vùng có khác biệt Ở phân vùng Z1 xuất tín hiệu bật phân vùng Z2 khơng có tín hiệu bật, tín hiệu chồng lấn lên Qua phân tích, phân vùng Z2 có nhiều phân tử phát phân vùng Z1, đồng nghĩa số phân tử kỵ nước tăng lên theo thời gian đưa mẫu vào Phổ khối [M+H]+ phân vùng Z2 (hình 3.4) dạng tự nhiên (A) khử (B) phân tích ta thấy dạng tự nhiên (A) phân tử có KLPT [M+H]+ với m/z 1369.61 đối chiếu với dạng khử (B) 1373.56 Hai phân tử có dịch chuyển KLPT [M+H]+ với m/z Ở phổ khối này, ta thấy khơng có phân tử có dịch chuyển mà cịn có thêm hai phân tử Ở dạng tự nhiên phân tử KLPT [M+H]+ với m/z 1413.64, 1096.41 dạng khử 1417.59, 1100,38 Ở phổ khơng có chênh lệch KLPT Da mà cịn có chênh lệch KLPT 6, Da 36 Sáu phân tử chênh lệch dạng tự nhiên (A) 1664.70, 1680.69, 1774.57, 1861.69, 2086.80, 3108.31 dạng khử (B) 1670.62, 1686.62, 1780.50, 1867.57, 2092.87, 3114.16 Một phân tử chênh lệch Da dạng tự nhiên (A) 1997.64 dạng khử (B) 2005.82 Tóm lại hai dạng phổ khối phân vùng Z2 ta tìm có phân tử chênh lệch KLPT Da Có phân tử chênh lệch KLPT Da phân tử chênh lệch KLPT Da Kết phân tích MALDI-TOF MS phân vùng Z3 dạng tự nhiên dạng khử Phân tích phổ khối [M+H]+ MALDI-TOF MS phân vùng Z3 từ 39-44 phút, dạng tự nhiên (hình 3.5A) Trong phổ ta thấy xuất tín hiệu bật với m/z 1679.69, nhiên chứa phân tử khác với m/z 1854.49, 3006.17 Hai phổ khối dạng tự nhiên hai phân vùng Z2 (hình 3.4A) Z3 (hình 3.5A), ta thấy hai phân vùng có khác biệt, phân vùng Z2 khơng có xuất tín hiệu bật, phân vùng Z3 có xuất tín hiệu bật (giống phân vùng Z1 nọc độc thơ) Hình 3.5 Phổ khối [M+H] + phân vùng Z3 từ 39-44 phút sắc ký đồ với (A) dạng tự nhiên, (B) dạng khử Với phân tử có cường độ tín hiệu phổ khối [M+H]+ 1679.69 Da bật dạng tự nhiên (A) có KLPT dạng khử (B) với m/z 1685.5 Sự chênh lệch KLPT với Da, ta có kết luận phân tử có cysteine Ngồi ra, phân vùng Z3 cịn có năm phân tử có chênh lệch Da dạng tự nhiên với m/z 1744.59, 1854.49, 2766.17, 2948.15, 3006.17 dạng khử 1750.38, 1860.28, 2771.83, 2953.79, 3011.79 Một 37 phân tử chênh lệch Da dạng tự nhiên (A) với m/z 1695.68 dạng khử (B) với m/z 1701.49 Tóm lại, phân vùng Z3 phát phân tử peptide có chứa cystein peptide chứa cystein Kết phân tích MALDI-TOF MS phân vùng Z4 dạng tự nhiên dạng khử Phổ khối [M+H]+ MALDI-TOF MS phân vùng Z4 từ 44-53 phút, phát phân tử có tín hiệu bật với m/z 2744.04 2823.95 Tuy nhiên phân vùng Z4 chứa phân tử khác với [M+H]+ 2023.80 Da, 2744.04 Da, 2823.96 Da Tín hiệu vùng Z4 vùng Z3 nhiều, điều ngược với số lượng peak phân vùng Z4 thị sắc ký đồ (hình 3.1) Có thể giải thích phân vùng số lượng phân tử kỵ nước nhiều, xảy tượng che tín hiệu nên kết phổ khối phân vùng Z4 hạn chế Hình 3.6 Phổ khối [M+H] + phân vùng Z4 từ 44-53 phút sắc ký đồ với (A) dạng tự nhiên, (B) dạng khử Phân tích phổ khối [M+H]+ phân vùng Z4 (hình 3.6) dạng tự nhiên (A) dạng khử (B), ta thấy dạng tự nhiên (A) có phân tử với m/z 1679.66 tương đương dạng khử (B) 1685.49 Sự chênh lệch KLPT dạng Da Ở phổ này, ta thấy khơng có phân tử có chênh lệch mà cịn có phân tử peptide khác có chênh lệch Da dạng tự nhiên dạng khử với khối lượng Cụ thể dạng tự nhiên với m/z 2023.80, 2110.83, 2744.04, 2823.95 tương ứng với KLPT dạng khử với m/z 2029.58, 2116.61, 2749.79, 2829.68 Tóm lại, phân vùng 38 Z4, phát peptide có cysteine Điều có nghĩa có liên kết S-S phân tử Bảng 3.4 thể kết KLPT phân tử peptide phát phân vùng độc tố ốc nón C bandanus Phân vùng Z1, Z2, Z3, Z4 phát 8, 11, 10 peptide Bảng 3.4: KLPT phân vùng độc tố ốc nón C bandanus STT 10 11 Phân vùng Z1 (Da) 1147.59 1451.56 1695.66 1838.68 1854.68 1857.68 1892.61 2238.19 Phân vùng Z2 (Da) 1368.60 1651.60 1663.69 1679.69 1719.58 1773.57 1860.68 1970.60 1996.60 2012.60 3107.30 39 Phân vùng Z3 (Da) 1678.68 1743.58 2820.95 2822.95 1795.48 1853.49 2765.16 3005.16 3019.18 3332.48 Phân vùng Z4 (Da) 1678.65 2022.79 2743.03 2822.94 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN Kết luận  Từ kết nghiên cứu khảo sát điều kiện chiết độc tố thô ốc nón C bandanus đưa số kết luận sau:  Ở công đoạn ly tâm tách độc tố C bandanus, điều kiện phù hợp công đoạn lực ly tâm 3500 xg, 10 phút  Ở công đoạn siêu lọc (cut-off 10 kDa) với lực ly tâm 12000 xg 10 phút lực phù hợp cho việc sàng lọc độc tố C bandanus  Phân đoạn peptide kỹ thuật sắc ký lỏng pha đảo Mẫu nọc độc thô phân đoạn theo phân vùng với thời gian lưu,cụ thể:  Z0 từ 15-23 phút  Z1 từ 25-33 phút  Z2 từ 33-39 phút  Z3 từ 39-44 phút  Z4 từ 44-53 phút  Phân tích sơ phân đoạn peptide phương pháp MALDI-TOF MS  Số lượng KLPT xác định qua phân tích phổ khối [M+H]+ MALDI- TOF MS nọc độc thô 6, phân vùng Z1 8, phân vùng Z2 11, phân vùng Z3 10, phân vùng Z4  Phân tích so sánh phổ khối MALDI-TOF MS phân vùng dạng tự nhiên dạng khử, kết tổng hợp sau: - phân tử có cysteine - 22 phân tử có cysteine - phân tử có cystein Đề xuất ý kiến  Quan sát sắc ký đồ phân vùng Z4 ta thấy có nhiều peak chồng lấn nhau, phân vùng phân tích phổ khối MALDI-TOF MS xuất tín hiệu tượng giải thích tín hiệu bị che Cịn phân vùng Z2 xuất 40 nhiều tín hiệu tạp, gây nhiễu q trình phân tích Vì cần phải tiến hành phân đoạn nhỏ theo thời gian giúp q trình phân tích dễ dàng  Kiểm tra hoạt tính độc tố động vật 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Hylleberg, J and R Kilburn Marine molluscs of Vietnam: annotations, voucher material, and species in need of verification in Tropical Marine Mollusc Programme (TMMP) 2003 Lewis, R.J., et al., Conus venom peptide pharmacology Pharmacological reviews, 2012 64(2): p 259-298 Hoàng Thị Lý, Nghiên cứu mối quan hệ loài ốc cối (Conus spp.) vùng biển Nam Trung Bộ, Việt Nam dựa thị phân tử gen 16S DNA ty thể (16S mt DNA) 2011, Đại học Nha Trang Kohn, A., Maximal species richness in Conus: diversity, diet and habitat on reefs of northeast Papua New Guinea Coral Reefs, 2001 20(1): p 25-38 Ngô Thị Anh Khôi, Khảo sát thành phần độc tính tuyến độc tố ba loài ốc cối Conus stritatus, Conus textile Conus vexillum 2012, Đại học Nha trang Kantor, Y., How much can Conus swallow? Observations on molluscivorous species Journal of Molluscan Studies, 2007 73(2): p 123-127 Bingham, J.-P., E Mitsunaga, and Z.L Bergeron, Drugs from slugs—Past, present and future perspectives of ω-conotoxin research Chemico-biological interactions, 2010 183(1): p 1-18 Nguyễn Phương Anh, Nghiên cứu tách chiết độc tố conotoxin từ ba loài ốc cối conus striatus, conus textile, conus vexillum bước đầu khảo sát thành phần độc tố sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 2010, Đại học Nha Trang Nguyễn Lương Hiếu Hịa, Nghiên cứu thành phần, cấu trúc, độc tính tuyến nọc độc ba loài ốc cối 2011, Đại học Nha Trang 10 Franklin, J.B., et al., Radular morphology of conus (gastropoda: caenogastropoda: conidae) from India Molluscan Research, 2007 27(3): p 111-122 11 Haddad Junior, V., P Neto, and V.J Cobo, Venomous mollusks: the risks of human accidents by conus snails (gastropoda: conidae) in Brazil Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 2006 39(5): p 498-500 42 12 Terlau, H and B.M Olivera, Conus venoms: a rich source of novel ion channel-targeted peptides Physiological reviews, 2004 84(1): p 41-68 13 Olivera, B.M., et al., Peptide neurotoxins from fish-hunting cone snails Science, 1985 230(4732): p 1338-1343 14 Olivera, B.M., L.J Cruz, and D Yoshikami, Effects of Conus peptides on the behavior of mice Current opinion in neurobiology, 1999 9(6): p 772-777 15 Kaas, Q., et al., ConoServer, a database for conopeptide sequences and structures Bioinformatics, 2007 24(3): p 445-446 16 Cruz, L.J., et al., Conus venoms: a rich source of neuroactive peptides Journal of Toxicology: Toxin Reviews, 1985 4(2): p 107-132 17 Halai, R., The story of alpha-conotoxins, Vc1 and RgIA, on their journey to becoming therapeutics 2009 18 Becker, S and H Terlau, Toxins from cone snails: properties, applications and biotechnological production Applied microbiology and biotechnology, 2008 79(1): p 1-9 19 Olivera, B.M., et al., Neuronal calcium channel antagonists Discrimination between calcium channel subtypes using omega.-conotoxin from Conus magus venom Biochemistry, 1987 26(8): p 2086-2090 20 Hillyard, D.R., et al., A molluskivorous Conus toxin: conserved frameworks in conotoxins Biochemistry, 1989 28(1): p 358-361 21 Woppmann, A., J Ramachandran, and G.P Miljanich, Calcium channel subtypes in rat brain: biochemical characterization of the high-affinity receptors for omega-conopeptides SNX-230 (synthetic MVIIC), SNX-183 (SVIB), and SNX-111 (MVIIA) Mol Cell Neurosci, 1994 5(4): p 350-7 22 Wang, C.Z., et al., A novel conotoxin from Conus striatus, mu-SIIIA, selectively blocking rat tetrodotoxin-resistant sodium channels Toxicon, 2006 47(1): p 122-32 23 Ekberg, J., et al., muO-conotoxin MrVIB selectively blocks Nav1.8 sensory neuron specific sodium channels and chronic pain behavior without motor deficits Proc Natl Acad Sci U S A, 2006 103(45): p 17030-5 43 24 Shon, K.J., et al., kappa-Conotoxin PVIIA is a peptide inhibiting the shaker K+ channel J Biol Chem, 1998 273(1): p 33-8 25 Brust, A., et al., chi-Conopeptide pharmacophore development: toward a novel class of norepinephrine transporter inhibitor (Xen2174) for pain J Med Chem, 2009 52(22): p 6991-7002 26 Satkunanathan, N., et al., Alpha-conotoxin Vc1.1 alleviates neuropathic pain and accelerates functional recovery of injured neurones Brain Res, 2005 1059(2): p 149-58 27 Sharpe, I.A., et al., Two new classes of conopeptides inhibit the alpha1adrenoceptor and noradrenaline transporter Nat Neurosci, 2001 4(9): p 9027 28 Donevan, S.D and R.T McCabe, Conantokin G is an NR2B-selective competitive antagonist ofN-methyl-d-aspartate receptors Molecular pharmacology, 2000 58(3): p 614-623 29 Craig, A.G., et al., Contulakin-G, an O-glycosylated invertebrate neurotensin J Biol Chem, 1999 274(20): p 13752-9 30 Hansson, K., et al., The First γ-Carboxyglutamic Acid-containing Contryphan A SELECTIVE L-TYPE CALCIUM ION CHANNEL BLOCKER ISOLATED FROM THE VENOM OF CONUS MARMOREUS Journal of Biological Chemistry, 2004 279(31): p 32453-32463 31 Rivera-Ortiz, J.A., H Cano, and F Marí, Intraspecies variability and conopeptide profiling of the injected venom of Conus ermineus Peptides, 2011 32(2): p 306-316 32 Stöcklin, R and K Rose, Proteomic Analysis of the Venom of Conus consors 33 Dutertre, S., et al., Deep venomics reveals the mechanism for expanded peptide diversity in cone snail venom Molecular & Cellular Proteomics, 2013 12(2): p 312-329 34 Echterbille, J., et al., Discovery and characterization of EIIB, a new αconotoxin from Conus ermineus venom by nAChRs affinity capture monitored by MALDI-TOF/TOF mass spectrometry Toxicon, 2017 130: p 1-10 44 35 Đặng Th Bình, et al., Di truyền quần thể lồi Conus textile linnaeus, 1758 vùng biển Nam Trung Bộ, Việt Nam 2011 36 Ngô Đăng Nghĩa, et al., Độc tố ốc cối ven biển miền Trung Việt Nam: cấu tạo tuyến độc tố đặc trưng số lượng conopeptid Khoa học -Công nghệ Thủy sản - Đại học Nha Trang, 2012 37 Nguyễn Bảo, et al., PHÂN TÍCH PEPTIDE TRONG NỌC ĐỘC CỦA ỐC NÓN CONUS MARMOREUS Ở VÙNG BIỂN KHÁNH HỒ BẰNG LC MALDI-TOF MS Khoa học -Cơng nghệ Thủy sản - Đại học Nha Trang, 2018 45 ... ? ?Nghiên cứu tách chiết độc tố conopeptide từ ốc nón Conus bandanus đánh giá sơ thành phần độc tố? ?? Mục tiêu đề tài Đánh giá sơ thành phần độc tố Nội dung nghiên cứu  Khảo sát điều kiện chiết độc. .. KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nghiên cứu tách chiết độc tố conopeptide từ ốc nón Conus bandanus đánh giá sơ thành phần độc tố GVHD: TS Nguyễn Bảo... 2.2 Tuyến nọc độc ốc nón C bandanus 22 Hình 2.3 Sơ đồ tổng quát nghiên cứu phân tích thành phần conopeptide từ nọc độc ốc nón C bandanus 23 Hình 2.4 Sơ đồ tách chiết