Ứng dụng quá trình lên men malolactic cải thiện chất lượng rượu vang nho

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -   - NGUYỄN TRUNG HẬU ỨNG DỤNG QUÁ TRÌNH LÊN MEN MALOLACTIC CẢI THIỆN CHẤT LƯỢNG RƯỢU VANG NHO Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Mã số : 60.42.80 LUẬN VĂN THẠC SĨ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 01/2010 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HỒ XÃ HỘI CHỦ NGHIÃ VIỆT NAM KHOA CƠNG NGHỆ HÓA HỌC Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc -oOo Tp HCM, ngày tháng năm NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: NGUYỄN TRUNG HẬU Giới tính: Nam Ngày, tháng, năm sinh: 21/ 02/ 1981 Nơi sinh: Vĩnh Long Chuyên ngành: Công nghệ sinh học MSHV: 03107697 Khoá (Năm trúng tuyển): 2007 1- TÊN ĐỀ TÀI: Ứng dụng trình lên men malolactic cải thiện chất lượng rượu vang nho 2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN: Thực theo mục tiêu nghiên cứu, thiết lập thí nghiệm tối ưu thu chế phẩm cố định tiến hành lên men malolactic rượu vang nho Nội dung nghiên cứu bao gồm:  Tuyển chọn chủng Oenococcus oeni thích nghi lên men malolactic  Khảo sát trình cố định tế bào vi khuẩn Oenococcus oeni lên phức chất mang Alginate-Bacterial cellulose  Ứng dụng chế phẩm cố định lên men malolactic theo phương pháp chu kỳ 3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: tháng 6/2009 4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: tháng 01/2010 5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG TS NGUYỄN THỊ BÍCH HỒNG Nội dung đề cương Luận văn thạc sĩ Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua CB HƯỚNG DẪN (Họ tên chữ ký) CN BỘ MÔN QL CHUYÊN NGÀNH (Họ tên chữ ký) KHOA QL CHUYÊN NGÀNH (Họ tên chữ ký) CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh Cán hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THUÝ HƯƠNG TS NGUYỄN THỊ BÍCH HỒNG Cán chấm nhận xét 1: Cán chấm nhận xét 2: - Luận văn thạc sĩ bảo vệ HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ngày …… tháng …… năm …… LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan nghiên cứu hồn tồn riêng Những kết nghiên cứu hồn tồn chưa cơng bố tác giả khác NGUYỄN TRUNG HẬU LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cảm ơn q thầy trường Đại học Bách Khoa Thành Phố Hồ Chí Minh, đặc biệt, quí thầy khoa Cơng nghệ Hố học Bộ môn Công nghệ Sinh học, tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn cô - Tiến sĩ Nguyễn Thuý Hương, theo sát hướng dẫn, bảo, đồng thời tận tình giúp đỡ tơi suốt thời gian thực luận văn suốt trình tơi học tập trường Xin chân thành cảm ơn - Tiến sĩ Nguyễn Thị Bích Hồng, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt thời gian thực luận văn Xin chân thành cảm ơn quan chức năng, trung tâm, phòng ban, sở sản xuất liên quan, nhiệt tình hỗ trợ giúp đỡ để tơi hoàn thành tốt nội dung đề luận văn Xin chân thành cảm ơn gia đình, bè bạn, anh chị em đồng nghiệp động viên, giúp đỡ thời gian học tập q trình tơi thực luận văn Xin chân thành cảm ơn Tp Hồ Chí Minh, tháng 01 năm 2010 NGUYỄN TRUNG HẬU TÓM TẮT Đề tài “Ứng dụng trình lên men malolactic cải thiện chất lượng rượu vang nho” Học viên thực hiện: Nguyễn Trung Hậu, Trường Đại học Bách Khoa Tp.HCM, tháng 01 năm 2010 Cán hướng dẫn: TS Nguyễn Thuý Hương TS Nguyễn Thị Bích Hồng Đề tài thu kết sau: Đã tuyển chọn chủng vi khuẩn Oenococcus oeni thích hợp lên men malolactic Chủng Oenococcus oeni O1 chủng chịu điều kiện cực đoan, có khả sinh trưởng phát triển tốt mơi trường có nồng độ cồn cao 14% (v/v), độ pH thấp 2,5, phù hợp sử dụng cho trình lên men malolactic rượu vang nho Trong chất mang khảo sát: chất mang truyền thống Alginate, chất mang Bacterial Cellulose (BC) phức chất mang Alginate Bacterial Cellulose (A - BC), phức chất mang A - BC phát huy nhiều ưu điểm hai loại chất mang: chất mang Alginate, chất mang BC, chế phẩm cố định tốt chất mang khảo sát Điều kiện cố định tế bào vi khuẩn Oenococcus oeni phức chất mang Alginate - Bacterial Cellulose (A – BC) là: - Nồng độ Alginate:3% - Mật độ tế bào Oenococcus oeni đưa vào cố định: 109 tế bào/ml - BC hấp phụ dịch giống Alginate - Oenococcus oeni máy lắc tròn, tốc độ lắc: 200 vòng/phút, với thời gian lắc: 30 phút - Bổ sung chất hỗ trợ gel CaCl2, nồng độ: 2% - Thời gian ủ: ngày - Nhiệt độ ủ: 30oC Chế phẩm cố định thu gồm thông số sau: - Cấu trúc: trơn, mềm, rắn - Mật độ vi khuẩn cố định được: 8,6.109 tế bào/g - Mật độ vi khuẩn bề mặt chất mang: 4,8.104 tế bào/cm2 - Mật độ vi khuẩn bên chất mang: 4,2.104 tế bào/cm2 Bên cạnh đó, chất mang BC cho thấy nhiều ưu hẳn chất mang truyền thống Alginate kỹ thuật cố định tế bào vi khuẩn Oenococcus oeni Hiệu ứng dụng chế phẩm cố định tế bào vi khuẩn Oenococcus oeni phức chất mang A – BC trình lên men malolactic cao: tái sử dụng 12 lần mà đảm bảo hoạt tính sinh học lúc ban đầu SUMMARY My thesis: “The Study of applying of malolactic fermentation to improve the quality of grape wine” Nguyen Trung Hau, Ho Chi Minh city University of Technology, January, 2010 Supervisor: Nguyen Thuy Huong, Ph.D Nguyen Thi Bich Hong, Ph.D The results are given as follows: In the experienced strains, selected Oenococcus oeni strain has good effects on malolactic fermentation Oenococcus oeni O1 is capable of surviving in extreme conditions, growing and developing well in environments with high alcohol concentration (14%), a low pH (2.5), suitable for malolactic fermentation in grape wine In three carriers: Alginate (A), Bacterial Cellulose (BC) and Alginate - Bacterial Cellulose (A - BC), couple carrier A – BC shows the good characteristics of both of Alginate and BC and is the best immobilization product Conditions to immobilize bacterial cell in A – BC compound: - Alginate concentration: 3% - Cell density: 109CFU/ml - BC absorbs Alginate – Oenococcus oeni suspension by revolution machine, speed: 200 revolutions/1minute, time: 30 minutes - Adding CaCl2: 2% - Incubation time: days - Incubation temperature: 300C Achieved immobilization products include parameters: - Structures: smooth, solid - Immobilized cell density: 8,6 109 CFU/g - Cell density in the externals of the carrier: 4,8.10 CFU/cm2 - Cell density in the internals of the carrier: 4,2.10 CFU/ cm2 Beside that, BC carrier shows more advantaged than traditional carrier – Alginate in immobilization of Oenococcus oeni cells In the malolactic fermentation, the using of cell immobilization product, A-BC carrier, is fairly good The carrier can be reused 12 times with a warranty of biological activity Luận Văn Thạc Sĩ Trang i MỤC LỤC TRANG CHƯƠNG MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 2.1 RƯỢU VANG 2.2 LÊN MEN RƯỢU VANG 2.3 LÊN MEN MALOLACTIC 2.3.1 Khái niệm lên men malolactic 2.3.2 Các hình thức lên men malolactic chủ yếu .7 2.3.2.1 Lên men malolactic tự phát rượu vang 2.3.2.2 Lên men malolactic giống vi khuẩn chủng .9 2.3.3 Tác nhân vi sinh vật lên men malolactic .11 2.3.3.1 Oenococcus oeni 11 2.3.3.2 Các tác nhân khác .14 2.3.4 Những biến đổi diễn trình lên men malolactic 16 2.3.4.1 Những biến đổi sinh học 16 2.3.4.2 Các biến đổi hoá học hoá sinh 19 2.3.4.3 Biến đổi cảm quan 24 2.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men malolactic .26 2.4 CỐ ĐỊNH TẾ BÀO VI SINH VẬT 28 2.4.1 Một số khái niệm cố định tế bào 28 2.4.2 Tế bào cố định 29 2.4.3 Một số tiêu đánh giá hiệu trình cố định .29 2.4.4 Ưu nhược điểm tế bào cố định so với tế bào tự 30 Nguyễn Trung Hậu Bảng 1.1 Thành phần dịch nho rượu vang thơng thường Hợp chất Nước Đường (fructose, glucose, saccharose) Alcohols (ethanol, hàm lượng vết terpenes, glycerols rượu bậc cao) Acid hữu (tartaric, malic, lactic, succinic, oxalic,…) Khống (potassium, calcium, sodium, magnesium, iron,…) Phenols (các flavonoid: chất màu hay nonflavonoid: cinnamic acid, vanillin) Các hợp chất chứa nitơ (protein, amino acid, humin, amide, ammonia,…) Các hợp chất hương (các ester: ethyl caproate, ethyl butyrate,…) TỔNG % Trong dịch nho % Trong rượu vang 75,0 86,0 22,0 0,3 0,1 11,2 0,9 0,6 0,5 0,5 0,3 0,3 0,2 0,1 Vết Vết 100,0 100,0 [54] Tác nhân trình lên men rượu Tác nhân q trình lên men rượu chủng nấm men Saccharomyces Saccharomyces vi sinh vật đơn bào, kích thước từ 2,5 - 10µm x 4,5 - 21µm, sinh sản chủ yếu theo cách nảy chồi, có khả hình thành bào tử, sống kỵ khí khơng bắt buộc đặc biệt lên men nhiều loại đường khác Trong công nghiệp sản xuất rượu vang, chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces ellipsoideus thường sử dụng nhờ có đặc tính lên men mạnh mẽ tạo sản phẩm chứa đến 18 - 20% etanol Ngoài ra, chủng Saccharomyces betieus, Saccharomyces oviformis, Saccharomyces torulopsis Saccharomyces boyanus sử dụng sản xuất rượu vang số nơi giới [3, 9, 13, 27] Hình 2.1 Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae [55] Trong môi trường có oxy, Saccharomyces cerevisiae tổng hợp lượng đường hơ hấp hiếu khí, chuyển hố đường thành nước CO2, sinh khối phát triển mạnh Trong môi trường khơng có oxy, Saccharomyces cerevisiae tổng hợp lượng q trình lên men cồn, chuyển hố đường thành ethanol, lượng sinh thấp, đủ để trì sống, sinh khối khơng phát triển [4] Nhờ đặc điểm ưu việt này, Saccharomyces cerevisiae thoả mãn gần hầu hết yêu cầu bắt buộc cần có chủng vi sinh sử dụng lên men sản xuất rượu vang Cụ thể:  Đặc tính lên men - Thích nghi với trình lên men nhanh - Tốc độ sử dụng chất tốc độ tạo thành sản phẩm cao - Khả chịu cồn cao - Khả chịu áp suất thẩm thấu cao - Sinh khối tạo thành vừa phải  Đặc tính cơng nghệ - Ổn định mặt di truyền - Khả chịu sulphite cao, đồng thời, liên kết với sulphite - Ít tạo bọt, có khả kết bơng, kết lắng cặn nhanh - Nhu cầu nitơ thấp  Các tính chất hương vị - Tạo thành sulphite, DMS, thiol, acid dễ bay hơi, rượu bậc cao - Giải phóng nhiều tiền chất hương glycosylate - Hoạt tính esterate thấp  Các đặc tính trao đổi chất có liên quan đến sức khoẻ người - Tạo thành sulphite, biogenic amine, ethyl carbamate (urea) [27] Sơ lược lịch sử phát số nghiên cứu lên men malolactic Năm 1837, Freiherr von Babo phát lên men lần hai vang non xảy số tượng như: tăng nhiệt độ, tạo thêm CO2, có biến đổi rõ rệt độ đục rượu vang Vào năm 1866, trình nghiên cứu hư hỏng rượu vang, Louis Pasteur tách vi khuẩn có rượu ơng cho vi sinh vật nguyên nhân chủ yếu gây hư hỏng rượu hay làm giảm chất lượng rượu Sau đó, vào năm 1891, Hermann Muller-Thurgau chứng minh giảm bớt acid rượu vang liên quan đến tạo thành acid tartaric vi sinh vật gây Đến năm 1913, Muller-Thurgau Osterwalder phát diện vi khuẩn tạo acid lactic rượu vang giải thích chuyển hố acid malic thành acid lactic, giải phóng CO2 theo phương trình: C4H6O5 = C3H6O3 + CO2 Hiện tượng khử acid sinh học sau đươc gọi tượng lên men malolactic Từ đó, nhiều nhà khoa học tiến hành nghiên cứu, tìm hiểu tác nhân gây lên men malolactic Hiện nay, tác nhân hay loài vi sinh vật định danh trình lên men malolactic người chấp nhận khuyến khích sử dụng trình lên men phụ khơng thể thiếu sản xuất rượu vang [, 16, 21, 22, 51] Trong trình sản xuất rượu vang, lên men malolactic tiến hành sau giai đoạn lên men Dịch sau lên men rượu (lên men chính) lắng cặn, sau đó, chuyển sang bồn lên men tiếp theo, lên men malolactic Những nghiên cứu gần cho thấy rượu vang lên men malolactic từ chủng giống cho chất lượng cao hẳn loại vang không trải qua trình này, đặc biệt, loại vang có thành phần acid cao sản xuất xứ lạnh Đức, Pháp miền đông nước Mỹ Quá trình giúp cải thiện đáng kể chất lượng rượu vang, cụ thể:  Giảm độ chua cho rượu vang: di-acid (acid malic) chuyển thành mono-acid (acid lactic) Điều giúp giảm độ acid tăng độ pH cho vang, nhờ đó, vang vị chua gắt acid malic trở nên có vị dịu hơn, hài hồ hơn, hấp dẫn  Tăng tính ổn định sinh học cho rượu vang: phát triển vi khuẩn làm nghèo nguồn dinh dưỡng môi trường loại khỏi môi trường hai acid hữu quan trọng acid malic acid citric để đảm bảo giảm tối thiểu q trình lên men chậm vi khuẩn lactic bảo quản vang chai phát triển cách tự phát vi sinh vật không mong muốn gây nên hư hỏng cho vang  Tăng tổ hợp thơm cho rượu vang: hợp chất diacetyl, acetoin 2,3-butanediol tạo từ q trình chuyển hố acid citric vi khuẩn hợp phần tạo nên hương thơm cho vang Đồng thời, thành phần khác hương vị tăng như: acid bay hơi, diethyl succinate, số ester bay hơi, ethylacetate, n-propanol, 2butanol, n-hexanol, ethyl lactate, 2,3 butanediol Ngoài ra, số thành phần khác tăng nhẹ như: 3-methyl-n-butylaxetate, n-hexyl axetate, 2-phenylethyl-axetate 2-ethyl-n-hexanoate [16, 31, 32, 53]  Ngồi ra, q trình lên men malolactic thực cách chủ động đưa vi khuẩn Oenococcus oeni vào dịch vang non giúp rút ngắn thời gian tàng trữ vang đáng kể Hầu hết loại vang đỏ khoảng 20% rượu vang trắng giới phải trải qua trình lên men malolactic nhằm cải thiện chất lượng rượu Đối với q trình lên men rượu vang khơng có q trình lên men malolactic hay q trình khơng kiểm sốt chặt chẽ sau thời gian đóng chai bảo quản thường xảy tượng bị đục dịch vang hay đơi hình thành cặn lắng, sủi bọt nhẹ, có kèm theo mùi lạ Vì vậy, trình lên men malolactic thực cách có kiểm sốt rủi ro loại trừ Tuy nhiên, lên men malolactic thích hợp cho sản xuất loại rượu vang có độ pH thấp Hầu hết loại rượu vang đỏ giới sản xuất thơng qua q trình lên men malolactic thành phần vang chứa hàm lượng acid malic cao Đặc biệt, hàm lượng acid malic nho tuỳ thuộc vào giống nho, điều kiện trồng trọt thời tiết Ngoài ra, số loại rượu vang sản xuất từ loại trái khác nho mâm xơi, anh đào…, hay loại có hàm lượng acid malic khơng cao khơng cần thực q trình lên men malolactic Khi đó, q trình lên men malolactic làm giảm hương vị đặc trưng có loại dịch loại vang Vì vậy, sản xuất loại rượu vang cần lưu ý đến vấn đề kiểm sốt q trình lên men malolactic [16, 38, 47] Kỹ thuật cố định tế bào Kỹ thuật cố định tế bào chia thành bốn nhóm chính: a Cố định bề mặt chất mang  Nguyên tắc: Tế bào vi sinh vật bề mặt chất mang tương tác với trộn lẫn huyền phù tế bào vi sinh vật vào dung dịch chất mang Khi đó, tế bào vi sinh vật cố định bề mặt chất mang chủ yếu nhờ vào lực hấp phụ, lực liên kết tĩnh điện liên kết cộng hóa trị màng tế bào bề mặt chất mang Yêu cầu chất mang dùng để cố định tế bào vi sinh vật phương pháp hấp phụ phải chất với bề mặt có cấu trúc xốp có chứa nhiều nhóm chức hố học khác [1, 36]  Một số chất mang điển hình: - Vật liệu cellulose: DEAE- cellulose, gỗ, mùn cưa…, - Vật liệu vô cơ: sứ xốp, thủy tinh xốp, số oxide kim loại: oxide kẽm, titan…, - Các vật liệu cellulose, thủy tinh tiền xử lý với polycation, chitosan…, để tăng cường khả hấp phụ [52]  Phương pháp thực hiện: có 03 phương pháp chủ yếu - Phương pháp cổ điển: ngâm chất mang dung dịch huyền phù vi sinh vật Vi sinh vật tự động kết lắng liên kết với chất mang thông qua việc hấp phụ lên bề mặt chất mang - Phương pháp cổ điển có cải tiến: sử dụng cánh khuấy, cánh khuấy giúp tế bào vi sinh vật chất mang phân bố khắp dung dịch Diện tích tiếp xúc chất mang vi sinh vật đạt cực đại, hiệu suất gắn cải thiện đáng kể - Phương pháp bơm canh trường vi sinh vật qua cột chứa chất mang: dịng canh trường hồi lưu nhằm nâng cao hiệu suất gắn tế bào vào chất mang [1, 56]  Ưu nhược điểm:  Ưu điểm: - Dễ thực hiện, giá thành thấp, điều kiện ơn hịa - Diện tích tiếp xúc tế bào cố định chất mang lớn so với kỹ thuật khác  Nhược điểm: - Cường độ liên kiết tế bào bề mặt cố định hay bề dày lớp liên kết thay đổi khoảng rộng khó xác định - Khơng có lớp ngăn cách tế bào môi trường dung dịch nên việc tế bào bị tách phân bố trở lại môi trường điều tránh khỏi Vì vậy, tồn hệ cân tế bào hấp phụ tự - Q trình khó điều khiển nên hiệu suất thường không cao [52] b Nhốt khung mạng xốp  Nguyên tắc: Các tế bào đưa vào bên khung mạng xốp để ngăn cản tế bào khuếch tán vào môi trường xung quanh mà cho phép vận chuyển chất dinh dưỡng trình trao đổi chất diễn [52]  Cấu trúc chất mang: Chủ yếu dạng cấu trúc gel polymer như: - Ion gel: hình thành khung gel cách tạo liên kết ion chất mang đa điện tích dung dịch đa điện trái dấu - Covalent gel: có cấu trúc mạng lưới dày bên chất mang Mạng lưới hình thành cách tạo liên kết cộng hoá trị phân tử polymer - Non – covalent gel: khung gel lịng chất mang hình thành cách tạo loại liên kết khác liên kết cộng hoá trị phân tử polymer - Cryogel: khung gel để giữ tế bào vi sinh vật hình thành nhiệt độ thấp [52]  Các chất mang điển hình: Gồm loại gel aginates, α-carrageenan, agar, chitosan, polygalaturonic acid, mạng polymer khác gelatin, collagen, polyvinyl alcohol, polyacrylamide… [52]  Ưu nhược điểm:  Ưu điểm: - Hiệu suất cố định mật độ tế bào màng chắn cao hẳn phương pháp khác - Không kén chọn loại tế bào vi sinh vật cố định - Các màng chắn loại polymer loại gel thường trơ hóa học, ứng dụng nhiều mơi trường khác - Kích thước lỗ xốp, cấu trúc bên chất mang dễ điều chỉnh, hạn chế lượng tế bào khuếch tán  Nhược điểm: - Trong số điều kiện, hoạt động sinh trưởng tế bào có khả phá hủy hệ thống màng chắn bao bọc - Các tế bào vi sinh vật phân bố không đều, tế bào nằm gần bề mặt màng chắn có khả tiếp xúc tốt với chất - Các chất có phân tử lượng thấp khuếch tán nhanh chóng đến tế bào vi sinh vật, nên phương pháp không thích hợp với mơi trường có chất có phân tử lượng lớn [52] c Cố định nhờ keo tụ tế bào  Nguyên tắc: Các tế bào kết hợp gia tăng kích thước, tạo thành khối tế bào, giúp dễ dàng sử dụng bình phản ứng Có thể keo tụ tự nhiên keo tụ nhân tạo cách tạo thành liên kết ngang Sự keo tụ tế bào việc tế bào kết chùm lại với thành đơn vị lớn tế bào keo tụ nhân tạo với nhờ liên kết ngang [52]  Ưu nhược điểm:  Ưu điểm: - Đơn giản, dễ thực - Khơng ảnh hưởng đến q trình truyền khối  Nhược điểm: - Do khơng có màng chắn tế bào dung dịch tế bào dễ bị tách ra, làm tăng hàm lượng tế bào tự dung dịch [52] d Nhốt tế bào phương pháp học bên màng chắn  Nguyên tắc: Kỹ thuật thường sử dụng loại màng lọc membrane dạng vi xốp cố định kĩ thuật vi bao [52]  Ưu nhược điểm:  Ưu điểm: - Canh trường lên men không bị lẫn tế bào, sản phẩm không cần lọc hay tinh  Nhược điểm: - Hiệu truyền khối - Màng bị bẩn chất hấp phụ lên bề mặt màng - Màng bị hỏng sinh khối tăng nhiều [52] Hình 4.1 Các kỹ thuật để cố định tế bào [52] Vật liệu cố định tế bào Trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật, yếu tố quan trọng định đến việc lựa chọn phương pháp tính hiệu q trình cố định vật liệu cố định hay gọi chất mang [8, 52] Cùng với phát triển nhiều ngành khoa học kỹ thuật, ngày có nhiều loại vật liệu polymer (tự nhiên, bán tổng hợp, tổng hợp) đưa vào nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật, đó, việc lựa chọn vật liệu cố định hay chất mang thích hợp với điều kiện cố định với tế bào vi sinh vật cần cố định thực dễ dàng Tuy nhiên, vật liệu dùng làm chất mang lựa chọn cần thỏa mãn yêu cầu sau: - Phù hợp với hình dạng thiết bị phản ứng sinh học - Có độ bền lý, hố sinh học cao - Giá thành chất mang thấp - Quá trình cố định tế bào dễ tiến hành điều khiển, mức độ tạp nhiễm thấp - Đảm bảo suất sản xuất tế bào cố định cao thời gian dài - Phải tách riêng tế bào với môi trường tạo khuếch tán dễ dàng cho chất dinh dưỡng vào chất mang - Khơng có ảnh hưởng đến hoạt động tế bào - Phải dễ sử dụng quy trình cố định - Trong trường hợp tế bào sinh trưởng vật liệu phải có khả co giản để chứa tế bào - Có thể tái sử dụng nhiều lần - Phải an toàn cho người cho môi trường [8, 48] Bảng 5.1 Một số loại chất mang kỹ thuật cố định tế bào [52] Dạng vật liệu Chất mang điển hình Vơ tự nhiên Cát, kizelghur, kaolin, bentonit, than hoạt tính, … Vô tổng hợp Hữu tự nhiên Silicat, silicagel, thuỷ tinh (sợi, hạt, bản…), oxyde hydroxyde titan, nhôm, sắt, … Chitin, chitosan, cellulose, dextran, collagen, … DEAE – cellulose, CM – cellulose, cellofan, DEAE – Polymer tổng hợp sephadex, polyetylen, polypropylen, polyvinyl alcohol, polyvinyl chloride, polysterol, dẫn xuất acid poly acrylic, … Dạng hỗn hợp Polyetylen – albumin, polyetylen – collagen, cellulose – polyetylenimin, polysterol – albumin, … Bảng 5.2 Ưu – nhược điểm số loại chất mang [52] Nhóm chất mang Polymer tổng Ưu điểm hợp Bền học, độ trương cao (polyacrylamide, có khả cố định tế polyvinyl alcohol ) bào tốt Là sản phẩm tự nhiên, Polymer sinh học phong phú, rẻ tiền, dễ kiếm, (alginate, chitosan) có khả phân huỷ sinh học Chất mang vô Độ bền lý cao, khả (than hoạt silicagel) tính, tái sử dụng tốt, phong phú, rẻ tiền, trơ mặt hố học Nhược điểm Giá thành cao, khơng tương hợp sinh học có nguy huỷ hoại mơi trường Kém bền lý, độ trương thấp, không đồng Không tương hợp sinh học  Ảnh hưởng thành phần alginate điều kiện tạo gel đến độ bền gel trình lên men  Ảnh hưởng khối lượng phân tử Năm 1986, Anders Johansen James M Flink nghiên cứu ảnh hưởng khối lượng phân tử alginate thơng qua thí nghiệm với loại alginate có độ nhớt khác nhau, kết cho thấy khối lượng phân tử có ảnh hưởng đến tốc độ lên men, tốc độ lên men nhìn chung giảm tăng khối lượng phân tử alginate Trong đó, độ bền gel (được đo khả chống chịu lực nén ép) tăng đáng kể tăng độ nhớt từ 70cP (độ nhớt đại lượng đặc trưng cho khối lượng phân tử alginate), độ nhớt tăng cao (250 - 600cP) độ bền gel tăng [52] Kazuaki cộng (1995) nghiên cứu ảnh hưởng độ nhớt đến khả khuếch tán glucose kết cho thấy khả khuếch tán glucose không phụ thuộc vào độ nhớt Trong trình xử lý nhiệt, độ nhớt alginate giảm giảm mức độ polymer hóa phân tử alginate Như vậy, việc tiệt trùng alginate không ảnh hưởng bất lợi đến khả khuếch tán glucose [68]  Ảnh hưởng tỷ lệ G/M Tỷ lệ G/M phần mol L-guluronic acid D-mannuronic acid, biểu thị thành phần alginate Khi tỷ lệ G/M giảm làm tốc độ lên men tăng, khơng đáng kể, đồng thời, độ bền gel giảm, ion hóa trị calcium, barium, strontium ưu tiên liên kết vào block G block M block MG Do đó, alginate có hàm lượng G lớn tạo thành gel xốp, giữ độ cứng vững thời gian dài Trong suốt trình tạo liên kết với Ca2+, loại alginate không bị phhồng nở hay co rút, giữ hình dạng tốt Thêm vào đó, alginate có hàm lượng G cao cản trở sinh trưởng tế bào nấm men sau cố định.Trái lại, alginate có hàm lượng M cao tạo thành gel mềm xốp dễ bị phân rã so với gel giàu G [52]  Ảnh hưởng nồng độ alginate Tăng nồng độ alginate khoảng – 10% làm giảm tốc độ lên men làm giảm khuếch tán lại làm tăng độ bền gel Theo nhiều nhà nghiên cứu, nồng độ alginate thích hợp để cố định nấm men - 3% [52, 68]  Ảnh hưởng pH tạo gel Theo Kazuaki cộng (1995), pH dung dịch alginate thích hợp cho trình tạo gel từ - Nằm khoảng này, khả khuếch tán glucose độ bền gel giảm Nguyên nhân pH thấp hay cao làm thay đổi hình dạng phân tử alginate [68]  Ảnh hưởng nhiệt độ tạo gel Nhiệt độ thích hợp cho trình tạo gel nhiệt độ 298OK Theo Kazuaki cộng (1995), nhiệt độ tạo gel 298 oK, khả khuếch tán glucose gần không đổi, tăng nhiệt độ 300oK khả khuếch tán glucose giảm nhanh Độ bền gel gần không đổi nhiệt độ tạo gel 298oK, giảm nhanh tăng nhiệt độ 300oK [68]  Ảnh hưởng mật độ tế bào hạt Để đánh giá ảnh hưởng mật độ tế bào, Anders Johansen James M Flink (1986) tiến hành thí nghiệm với mật độ tế bào 0,5% 10% (tương ứng với 2.108 4.109 tế bào/ g gel) Kết cho thấy mật độ tế bào ban đầu cao, tốc độ lên men/ g hạt cao suất/ tế bào thấp so với mật độ tế bào ban đầu thấp Đó có mặt lớp bề mặt tế bào hoạt hóa sát bề mặt hạt gel Lớp tế bào làm ngăn cản khuếch tán chất vào sản phẩm xuyên qua mạng gel, tế bào bên gần bị bất hoạt Trong trường hợp này, suất/ tế bào thấp mật độ tế bào cao tế bào nằm bên lớp bề mặt tính vào mật độ tế bào không tham gia vào trình tạo thành sản phẩm [52, 68, 77]  Ảnh hưởng tỷ lệ S/V Diện tích bề mặt riêng (diện tích bề mặt/ thể tích) yếu tố quan trọng suất lên men/g hạt Khi tỷ lệ S/V cao suất cao Đối với tỷ lệ S/V định, hình dạng gel không ảnh hưởng đến tốc độ lên men tế bào [52] LÝ LỊCH TRÍCH NGANG Họ tên: NGUYỄN TRUNG HẬU Ngày, tháng, năm sinh: 21 – 02 – 1981 Nơi sinh: Vĩnh Long Địa liên lạc: 1003/6 đường Bình Gỉa, Phường Rạch Dừa, Thành phố Vũng Tàu, tỉnh Bà Rịa -Vũng Tàu Quá trình đào tạo: Năm 2005, tốt nghiệp Đại học chuyên ngành Cơng nghệ sinh học, hệ quy Trường Đại học Mở Bán Cơng Thành phố Hồ Chí Minh Năm 2007, học Cao học chuyên ngành Công nghệ sinh học, hệ quy Trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh Q trình cơng tác: Năm 2003, nhân viên thức cơng ty liên doanh Hải Thành Kotobuki, Quận 1, Thành phố Hồ Chí Minh Năm 2007, làm việc công ty TNHH Thương mại Phú Sang, Quận Tân Phú, Thành phố Hồ Chí Minh Năm 2008, làm việc Phịng thí nghiệm trọng điểm Phía Nam công nghệ tế bào thực vật - Viện sinh học nhiệt đới Tp.HCM ... với trình cấy nấm men, suốt trình lên men rượu, vào khoảng kết thúc trình lên men rượu hay sau trình lên men rượu) , nhằm chắn trình lên men malolactic có xảy thời gian hồn tất q trình lên men malolactic. .. nghiên cứu đề tài ? ?Ứng dụng trình lên men malolactic cải thiện chất lượng rượu vang nho? ?? Nội dung đề tài: Tuyển chọn chủng Oenococcus oeni thích nghi lên men malolactic Khảo sát trình cố định tế... lên men malolactic kiểm soát chất lượng cảm quan rượu vang, ổn định hương vị vang, ổn định chất lượng vi sinh vang làm giảm bớt nhiều hư hỏng sau cho vang [16] Trên giới, ứng dụng trình lên men