Xây dựng quy trình công nghệ tạo chế phẩm vi sinh yếm khí sử dụng trong hệ thống xử lý nước thải sinh hoạt tại Trường đại học Nha Trang

Xây dựng quy trình công nghệ tạo chế phẩm vi sinh yếm khí sử dụng trong hệ thống xử lý nước thải sinh hoạt tại Trường đại học Nha Trang Xây dựng quy trình công nghệ tạo chế phẩm vi sinh yếm khí sử dụng trong hệ thống xử lý nước thải sinh hoạt tại Trường đại học Nha Trang luận văn tốt nghiệp thạc sĩ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI PHẠM THỊ LAN XÂY DỰNG QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ TẠO CHẾ PHẨM VI SINH YẾM KHÍ SỬ DỤNG TRONG HỆ THỐNG XỬ LÝ NƯỚC THẢI SINH HOẠT TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Chuyên ngành : Công nghệ sinh học LUẬN VĂN THẠC SĨ KĨ THUẬT NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS TS Trần Liên Hà TS Vũ Ngọc Bội Hà Nội – Năm 2013 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nước thải 1.1.1 Khái niệm nước thải .6 1.1.2 Nước thải sinh hoạt 1.1.2.1 Thành phần, tính chất, nguồn gốc nước thải sinh hoạt .7 1.1.2.2 Những thông số đánh giá mức độ ô nhiễm nước thải .11 1.2 Tổng quan việc sử dụng nước thải Trường Đại học Nha Trang 12 1.2.1 Đăc điểm nước thải sinh hoạt Trường Đại học Nha Trang 12 1.2.2 Quy trình xử lý nước thải Trường Đại học Nha Trang 15 1.2.2.1 Sơ đồ hệ thống xử lý nước thải trường Đại học Nha Trang 15 1.2.2.2 Thuyết minh quy trình 16 1.3 Một số phương pháp xử lý nước thải 17 1.3.1 Xử lý nước thải phương pháp học 17 1.3.2 Xử lý nước thải phương pháp hóa lý hóa học 18 1.3.3 Xử lý nước thải phương pháp sinh học .18 1.4 Vi sinh vật tham gia xử lý nước thải 22 1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình xử lý yếm khí 24 1.5.1 Ảnh hưởng nhiệt độ .24 1.5.2 Ảnh hưởng pH .25 1.5.3 Ảnh hưởng thời gian 25 1.5.4 Ảnh hưởng chất dinh dưỡng 26 1.5.5 Các độc tố .26 1.6 Các phương pháp xác định, phân loại vi sinh vật .26 1.6.1 Phân loại theo phương pháp truyền thống 26 1.6.1.1 Các phương pháp dựa đặc điểm hình thái 26 1.6.1.2 Các phương pháp dựa điều kiện nuôi cấy đặc điểm sinh lý 27 1.6.1.3 Các phương pháp dựa phản ứng sinh hóa 27 1.6.2 Phân loại theo phương pháp đại 27 1.7 Một số chế phẩm vi sinh 28 1.7.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 28 1.7.2 Tình hình nước 29 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1 Đối tượng, địa điểm thời gian nghiên cứu .31 2.2 Vật liệu dùng cho nghiên cứu .31 2.2.1 Hóa chất mơi trường 31 2.2.2 Dụng cụ, thiết bị 31 2.2.3 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 32 2.3 Phương pháp nghiên cứu 32 2.3.1 Phương pháp phân lập vi sinh vật 32 2.3.2 Phương pháp xác định hoạt tính enzym .33 2.3.3 Phương pháp thử hoạt tính catalaza .33 2.3.4 Phương pháp quan sát hình thái tế bào 33 2.3.5 Phương pháp xác định đường cong sinh trưởng 34 2.3.6 Phương pháp xác định khả sử dụng đường 34 2.3.7 Xác định khả thủy phân tinh bột 34 2.3.8 Xác định khả thuỷ phân gelatin 34 2.3.9 Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân loại 35 2.3.9.1 Phân loại theo phương pháp sinh hóa 35 2.3.9.2 Phân loại chủng vi khuẩn phương pháp sinh học phân tử .35 2.3.10 Xác định yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men 37 2.3.10.1 Ảnh hưởng pH 37 2.3.10.2 Ảnh hưởng nhiệt độ 38 2.3.10.3 Ảnh hưởng thời gian .38 2.3.10.4 Ảnh hưởng nguồn cacbon .38 2.3.10.5 Ảnh hưởng nguồn nitơ 38 2.3.10.6 Phương pháp tạo chế phẩm 38 2.3.10.7 Xác định số lượng vi sinh vật chế phẩm 38 2.3.10.8 Phương pháp xác định COD 39 2.3.10.9 Xác định BOD5 40 2.3.10.10 Kiểm tra khả xử lý nước thải chủng vi sinh vật 41 2.3.10.11 Phương pháp xử lý số liệu 41 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 3.1 Phân lập tuyển chọn .42 3.1.1 Phân lập 42 3.1.2 Tuyển chọn 42 3.2 Đặc điểm sinh học đặc điểm phân loại chủng vi sinh vật 44 3.2.1 Đặc điểm hình thái .45 3.2.2 Đặc điểm nuôi cấy 45 3.2.3 Đặc điểm sinh hóa chủng vi sinh vật 45 3.3 Xác định trình tự gen mã hóa 16S rRNA 46 3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men Bacillus subtilis H2.3 51 3.4.1 Ảnh hưởng nguồn nitơ 51 3.4.2 Ảnh hưởng nguồn cacbon khác đến tốc độ sinh trưởng hoạt tính enzym chủng Bacillus subtilis H2.3 52 3.4.3 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến tốc độ sinh trưởng hoạt tính enzym chủng Bacillus subtilis H2.3 52 3.4.4 Ảnh hưởng pH mơi trường đến tốc độ sinh trưởng hoạt tính enzym chủng Bacillus subtilis H2.3 53 3.5 Xây dựng quy trình tạo chế phẩm vi sinh yếm khí .54 3.5.1 Nhân giống bình tam giác 55 3.5.2 Nhân giống bình lên men (giống cấp 2) .55 3.5.3 Nghiên cứu thời gian bảo quản chế phẩm .56 3.6 Kiểm tra khả xử lý nước thải chủng 58 3.6.1 Sự biến động nhu cầu oxy hóa học 58 3.6.2 Sự biến động nhu cầu oxy sinh học .59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 MỞ ĐẦU Vai trò vi sinh vật lĩnh vực bảo vệ môi trường ứng dụng sản xuất ngày khẳng định Nếu cách 15 năm người Việt nam lần nghe đến chế phẩm vi sinh vật có tên gọi EM xuất xứ từ Nhật với hiệu vô lớn nhiều lĩnh vực sống thị trường nước xuất vô số sản phẩm vi sinh khác nhà khoa học sở nước nghiên cứu sản xuất Tuy nhiên chế phẩm sản xuất nước nhiều không đem lại kết mong muốn, chế phẩm ngoại nhập khơng kinh tế giá thành thường cao so với thu nhập người dân, chí nhiều nhà đầu tư sản xuất lớn, công ty lĩnh vực xử lý ô nhiễm môi trường nuôi trồng thủy sản Nguyên nhân khiến cho chế phẩm nước cạnh tranh là: - Thành phần loại vi sinh vật chế phẩm chưa thật đầy đủ, tập đoàn vi sinh vật chưa hoàn toàn thực chức khép kín q trình phân rã chất thải tự nhiên, ví dụ vi sinh vật kỵ khí cịn trọng chúng mắt xích quan trọng chu trình - Trong q trình sản xuất qui mơ lớn, chế phẩm sản xuất nước nhiều không ổn định thành phần loài vi sinh vật hoạt tính sinh học chúng, chất lượng không đảm bảo đến tay người tiêu dùng Bên cạnh cịn phải kể đến yếu tố cạnh tranh chủng vi sinh vật sử dụng chế phẩm ngoại nhập điều kiện môi trường Việt nam Để khắc phục hạn chế kể trên, việc chế tạo hoàn thiện sản phẩm sinh học nguồn vi sinh vật nước để thay chế phẩm ngoại nhập coi giải pháp Viện Công nghệ Sinh học Môi trường, ĐH Nha Trang phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật yếm khí có hoạt tính sinh học cao để làm sở cho việc phát triển ngành công nghệ sinh học Bên cạnh việc phân lập bảo quản chủng vi sinh vật có ích ngành cơng nghệ sinh học, Viện cịn có nhiệm vụ phát triển sinh phẩm để phục vụ cho nhu cầu sử dụng Trường, sở nuôi trồng thủy sản tỉnh địa phương lân cận Trường Đại học Nha Trang tiến hành đề tài: Xây dựng thử nghiệm phương án xử lý nước thải sinh hoạt để tái sử dụng trường đại học Nha Trang Đề tài thử nghiệm thành công hệ thống xử lý nước thải sinh hoạt Trường Đại học Nha Trang Tuy nghiên cứu xử lý nước thải sinh hoạt trường Đại học Nha Trang chưa tạo chế phẩm vi sinh để bổ sung vào hệ thống nước xử lý nước thải mà phải mua chế phẩm ngồi phí cho xử lý cao Vì việc nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh để bổ sung vào hệ thống xử lý nước thải Trường cần thiết, giúp nâng cao hiệu giảm chi phí q trình xử lý Tự sản xuất chế phẩm giúp chủ động xử lý hạ giá thành Dựa vào yêu cầu thực tiễn tơi thực đề tài: ”Xây dựng quy trình cơng nghệ tạo chế phẩm vi sinh yếm khí sử dụng hệ thống xử lý nước thải sinh hoạt Trường Đại học Nha Trang” Đề tài đặt với mục tiêu nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện qui trình sản xuất lên chế phẩm vi sinh yếm khí dùng xử lý nước thải Trường Đại học Nha Trang thông qua việc đánh giá tính ổn định tập đồn vi sinh vật chế phẩm hoạt tính chúng qua bước quy trình sản xuất Từ kết thu chúng tơi đưa quy trình sản xuất tối ưu chế phẩm vi sinh nghiên cứu Mục đích: Xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh yếm khí sử dụng hệ thống xử lý nước thải sinh hoạt Trường Đại học Nha Trang Để đạt mục tiêu mục đích trên, nội dung nghiên cứu bao gồm: - Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả xử lý nước thải - Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học, định danh số chủng vi sinh vật yếm khí có khả xử lý nước thải sinh hoạt - Tối ưu hóa điều kiện lên men - Xây dựng QTCN tạo chế phẩm vi sinh yếm khí dùng hệ thống xử lý nước thải sinh hoạt - Bước đầu phân tích tạo chế phẩm - Thử nghiệm tác dụng chế phẩm lên men nước thải sinh hoạt trường Đại học Nha Trang quy mơ phịng thí nghiệm Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi sinh vật dùng làm chế phẩm phân lập từ đất nhiều nơi như: Hịn Một, Hịn Mun, Hịn Tằm, Hồ cá Trí Ngun, Hòn Chồng, từ nước thải sinh hoạt Trường Đại học Nha Trang Chương TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nước thải 1.1.1 Khái niệm nước thải Nước thải nước dùng sinh hoạt, sản xuất chảy qua vùng đất ô nhiễm Phụ thuộc vào điều kiện hình thành, nước thải chia thành: nước thải sinh hoạt, nước công nghiệp, nước thải tự nhiên nước thải đô thị [11] Nước thải sinh hoạt Nước thải sinh hoạt nước thải từ khu dân cư, khu vực hoạt động thương mại, công sở, trường học hay sở khác Chúng chứa khoảng 58% chất hữu 42% chất khoáng Đặc điểm nước thải sinh hoạt hàm lượng cao chất hữu không bền sinh học (như cacbonhydrat, protein, mỡ), chất dinh dưỡng (photphat, nitơ), vi trùng, chất rắn mùi Nước thải công nghiệp (hay nước thải sản xuất) Nước thải công nghiệp nước thải từ nhà máy hoạt động sản xuất Trong q trình cơng nghệ nguồn nước thải phân thành: - Nước hình thành phản ứng hóa học (chúng bị ô nhiễm tác chất sản phẩm phản ứng) - Nước dạng ẩm tự liên kết nguyên liệu chất ban đầu, tách trình chế biến - Nước rửa nguyên liệu, sản phẩm, thiết bị - Nước hấp thụ, nước làm nguội Nước tự nhiên Nước mưa xem nước thải tự nhiên Ở thành phố đại, nước mưa thu gom hệ thống riêng Nước thải đô thị Nước thải đô thị thuật ngữ chung chất lỏng hệ thống cống thành phố Đó hỗn hợp loại nước thải kể Ơ nhiễm mơi trường nói chung nhiễm nước nói riêng khơng phải vấn đề riêng quốc gia mà vấn đề chung hầu giới Trong đó, số nước thải cơng nghiệp nước thải sinh hoạt có chứa hoạt chất hữu cơ, amoni, sắt hợp chất có khả bị oxy hóa khác chúng chất chủ yếu tạo nhu cầu oxy sinh hóa BOD nước thải Vì thế, xả nước thải cơng nghiệp nước thải sinh hoạt có chứa nồng độ BOD cao tiêu chuẩn cho phép nguồn tiếp nhận làm giảm lượng oxy hòa tan nguồn nước tạo môi trường yếm khí, làm cân sinh thái mơi trường nước [15] 1.1.2 Nước thải sinh hoạt 1.1.2.1 Thành phần, tính chất, nguồn gốc nước thải sinh hoạt Cùng với phát triển văn minh nhân loại, nhu cầu nước ngày tăng, lượng nước công nghiệp nước sinh hoạt thải ngày nhiều, gây ô nhiễm đáng kể đến nước mặt mơi trường Do nhiều vùng nước mặt bị nhiễm loại hợp chất hóa học loại vi sinh vật độc hại Nước thải chất lỏng thải sau trình sử dụng người bị thay đổi tính chất ban đầu chúng Nước thải đóng vai trị quan trọng gây nhiễm nước, phân loại sau: Phân loại theo xác định nguồn thải; Phân loại theo tác nhân ô nhiễm; Phân loại theo nguồn gốc phát sinh chúng Có thể nói nước thải hệ dị thể phức tạp, bao gồm nhiều chất tồn trạng thái khác Nếu nước thải công nghiệp chứa nhiều hóa chất vơ hữu nước thải sinh hoạt lại chứa nhiều chất dạng protein, hiđratcacbon, mỡ, chất thải, rác rưởi, chất hoạt động bề mặt hợp chất vô thường gặp đây: K+, Na+, Ca2+, M2+, Cl-, Ngoài nước thải sinh hoạt chứa vi khuẩn, virus, rong, rêu [15] Nước thải sinh hoạt nước thải bỏ sau sử dụng cho mục đích sinh hoạt cộng đồng: tắm, giặt giũ,tẩy rửa, vệ sinh cá nhân,… Chúng thường thải từ hộ, quan, trường học, bệnh viện, chợ, cơng trình cơng cộng khác Lượng nước thải sinh hoạt khu dân cư phụ thuộc vào dân số, vào tiêu chuẩn cấp nước đặc điểm hệ thống thoát nước Tiêu chuẩn cấp nước sinh hoạt cho khu dân cư phụ thuộc vào khả cung cấp nước nhà máy nước hay trạm cấp nước có Các trung tâm thị thường có tiêu chuẩn cấp nước cao so với vùng ngoại thành nơng thơn, lượng nước thải sinh hoạt tính đầu người có khác biệt thành thị nơng thơn Nước thải sinh hoạt trung tâm đô thị thường thoát hệ thống thoát nước dẫn sơng rạch, cịn vùng ngoại thành nơng thơn khơng có hệ thống nước nên nước thải thường tiêu thoát tự nhiên vào ao hồ thoát biện pháp tự thấm Thành phần đặc tính nước thải sinh hoạt Gồm loại: - Nước thải nhiễm bẩn chất tiết người từ phòng vệ sinh - Nước thải nhiễm bẩn chất thải sinh hoạt: cặn bã từ nhà bếp, chất rửa trôi, kể làm vệ sinh sàn nhà Nước thải sinh hoạt thường không xem cách phức tạp nguồn nước thải cơng nghiệp khơng có nhiều thành phần độc hại phenol, chất hữu độc hại Trong thiết kế trạm xử lý nước thải, thông số lượng chất rắn lơ lửng (suspended solids, SS) BOD5 thường sử dụng giới hạn Tổng chất rắn (total solids, TS) lấy theo hình 2.1 chừng 225l/người.ngđ xấp xỉ 800mg/l Lượng chất rắn lơ lửng lấy chừng 40% tổng lượng rắn, chừng 350 mg/l Trong số này, khoảng 200 mg/l lượng rắn lơ lửng lắng đọng chừng 60% sau khoảng để yên nước, lấy khỏi nước xử lý vật lý biện pháp lắng sơ cấp (primary settling) Phần cịn lại, khoảng 100 mg/l chất khơng thể lắng đọng dùng biện pháp xử lý hóa học sinh học để loại thải Hầu hết biện pháp xử lý thứ cấp (secondary treatment process) sinh học Phần lại cuối phần lớn vi chất vô chất rắn không lắng đọng được, muốn loại bỏ hoàn toàn phải dùng biện pháp xử lý triệt để Hình 1.1 Phân loại chất rắn nước thải loại vừa (Nguồn: Metcalf & Eddy, Wastewater Engineering, 1991) Nước thải sinh hoạt chứa nhiều chất hữu dễ bị phân huỷ sinh học, ngồi cịn có thành phần vơ cơ, vi sinh vật vi trùng gây bệnh nguy hiểm Chất hữu chứa nước thải bao gồm hợp chất protein (40 – 50%), hydrat cacbon (40 – 50%) Nồng độ chất hữu nước thải sinh hoạt dao động khoảng 150 – 450 mg/l theo trọng lượng khơ Có khoảng 20 – 40% chất hữu khó bị phân huỷ sinh học Ở khu dân cư đông đúc, điều kiện vệ sinh thấp kém, nước thải sinh hoạt không xử lý thích đáng nguồn gây nhiễm môi trường nghiêm trọng [11] Hệ enzyme Bacillus subtilis phong phú đa dạng gồm protease [6], amylase [7], lucoamylase, glucanase, cellulase, dextranase, pectinase [5] Bacillus subtilis ứng dụng nhiều ngành công nghiệp đặc biệt công nghiệp sản xuất enzyme protease, amylase [1] Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu ứng dụng Bacillus subtilis chế biến thực phẩm, xử lý ô nhiễm môi trường, chế phẩm vi sinh, sản xuât probiotic, [3] 3.4 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến khả sinh trưởng phát triển chủng Bacillus subtilis H2.3 Khả sinh trưởng phát triển vi khuẩn chịu tác động mạnh điều kiện sinh trưởng thời gian, nhiệt độ, pH môi trường nuôi cấy việc xác định yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh trưởng vi khuẩn quan trọng 3.4.1 Ảnh hưởng nguồn nitơ Nitơ thành phần quan trọng nhu cầu dinh dưỡng vi sinh vật Nguồn nitơ chúng sử dụng phải có sẵn mơi trường Nguồn nitơ thích hợp cho phát triển vi sinh vật peptone cao nấm men Nguồn nitơ cần cho tổng hợp enzyme Để nghiên cứu ảnh hưởng nguồn nitơ sinh trưởng sinh tổng hợp enzym chủng Bacillus subtilis H2.3, tiến hành thử với nguồn nitơ khác Cao nấm men 5g, pepton 10g, bột đậu tương (BĐT) 10g, (NH4)2SO4 2g, NaNO3 4g 2.5 OD 620nm (A) Cao men Pepton 1.5 BĐT (NH4)2SO4 NaNO3 0.5 0h 12h 24h 36h 48h 60h Thời gian Hình 3.7 Ảnh hưởng nguồn nito đến tốc độ sinh trưởng chủng Bacillus subtilis H2.3 Qua đồ thị (hình 3.7) ta thấy chủng B subtilis H2.3 sinh trưởng mạnh mơi trường có nguồn nito hữu bột đậu tương (BĐT), peptone, cao men nguồn 51 nitơ vô (NH4)2SO4 Nhưng lựa chọn nguồn nito cho nghiên cứu BĐT có tính kinh tế dễ tìm so với nguồn nitơ khác 3.4.2 Ảnh hưởng nguồn cacbon Cacbon nguồn cung cấp lượng cho hoạt động sống vi sinh vật nguồn cacbon môi trường nuôi cấy hợp chất chứa cacbon như: tinh bột, đường,… phụ thuộc vào khả phân giải đường loại vi sinh vật Chủng Bacillus subtilis H2.3 nuôi cấy môi trường LB chọn (sử dụng nguồn cacbon rỉ đường), nguồn cacbon khác sử dụng là: tinh bột, glucoza, lactoza, dextrin, saccaroza ngơ Kết trình bày bảng 3.8 OD 620nm (A) 2.5 Tinh bột Glucoza Rỉ đường 1.5 Saccaroza Ngô 0.5 0h 12h 24h 36h 48h 60h Thời gian Hình 3.8 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến tốc độ sinh trưởng chủng Bacillus subtilis H2.3 Chủng Bacillus subtilis sinh trưởng sinh tổng hợp enzyme mạnh mơi trường có nguồn cacbon là: rỉ đường, tinh bột, glucoza Trong nguồn cacbon mơi trường có nguồn cacbon rỉ đường tốt cho khả sinh trưởng sinh tổng hợp enzym OD 620 nm đạt cao 2,30 Vậy mơi trường có nguồn cacbon rỉ đường lựa chọn làm mơi trường lên men cho chủng này, giá thành rẻ mà khả sinh tổng hợp enzym lại mạnh 3.4.3 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy Nhiệt độ thông số quan trọng, ảnh hưởng đến hoạt tính sinh enzym Để đánh giá mức độ ảnh hưởng nhiệt độ đến, phát triển hoạt tính enzym chủng nghiên cứu ta tiến hành bố trí thí nghiệm ni cấy tĩnh chủng Bacillus subtilis H2.3 52 môi trường LB lỏng (bổ sung 1% gelatin, 1% tinh bột 1% CMC), với tỉ lệ tiếp giống 10% với mốc nhiệt độ: 25; 30; 35; 40; 450C Ở mốc nhiệt độ xác định vi khuẩn có phát triển hay khơng nhờ vào việc đo độ đục canh trường máy đo OD bước sóng 620 nm xác định đường kính phân giải enzyme môi trường gelatin, CMC, tinh bột Kết thể hình 3.9 OD 620nm (A) 2.5 25oC 30oC 35oC 1.5 40oC 45oC 0.5 0h 12h 24h 36h 48h 60h Thời gian Hình 3.9 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng chủng Bacillus subtilis H2.3 Từ kết hình 3.9 cho thấy chủng B subtilis H2.3 phát triển tốt khoảng nhiệt độ từ 30 - 35oC, thời gian từ 36 - 48h OD 620 nm đạt giá trị cao 2,30 30oC sau 36h nuôi cấy Kết phù hợp với nghiên cứu Panuwan cộng (2002) [18], Kebabcı Özgür (2010) [13], Rampersad cộng (1998) [19] Theo tác giả này, khả sinh protease celullase mạnh chủng vi khuẩn thuộc chi Bacilus nuôi cấy nhiệt độ 30 – 37oC Như vậy, nhiệt độ thích hợp cho khả sinh trưởng hoạt tính phân giải enzyme chủng Bacillus subtilis H2.3 300C 3.4.4 Ảnh hưởng pH môi trường pH môi trường ảnh hưởng mạnh đến khả sinh trưởng, tác động sâu sắc đến trình trao đổi chất vi sinh vật Bên cạnh đó, hoạt tính enzym phụ thuộc vào pH mơi trường Vì việc xác định khoảng pH thích hợp để ni cấy vi sinh 53 vật cần thiết Để lựa chọn pH môi trường ban đầu tối ưu cho chủng, tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy môi trường LB, với tỉ lệ tiếp giống 10% Chủng nuôi cấy tĩnh nhiệt độ tối ưu 300C điều kiện khơng có oxy mơi trường LB (có bổ sung 1% gelatin, 1% tinh bột 1% CMC) giá trị pH môi trường khác (5, 6, 7, 8, 9) Kết ảnh hưởng pH ban đầu đến sinh trưởng phát triển chủng Bacillus subtilis H2.3 thể Hình 3.10 2.5 pH OD 620nm(A) pH 1.5 pH pH pH 0.5 0h 12h 24h 36h Thời gian 48h 60h Hình 3.10 Ảnh hưởng pH mơi trường đến khả sinh trưởng chủng Bacillus subtilis H2.3 Kết cho thấy, chủng B subtilis H2.3 có khả sinh trưởng mơi trường có pH dao động từ – 8, nhiên khả sinh trưởng chủng vi khuẩn mơi trường có pH khác khác nhau, OD 620 nm đạt cao 2,32 Chủng B subtilis H2.3 có khả sinh trưởng tốt mơi trường có pH = Theo nghiên cứu Panuwan cộng (2002) [18] chủng B subtilis, mật độ quang học đạt cực đại môi trường có pH=7 với giá trị OD đo 2,82 [18] Sự khác biệt chủng B subtilis ni cấy mơi trường hiếu khí khác mơi trường khác đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn 54 3.5 Xây dựng quy trình tạo chế phẩm vi sinh yếm khí Từ kết nghiên cứu đặc điểm sinh học, đặc điểm phân loại, yếu tố ảnh hưởng lên sinh trưởng sinh học tổng hợp loại enzym hỗn hợp chủng vi khuẩn cho thấy: sử dụng chủng tuyển chọn để nhân giống sản xuất chế phẩm vi sinh vật yếm khí bổ sung vào hệ thống xử lý nước thải Trường Đại học Nha Trang Chế phẩm vi sinh yếm khí sản xuất từ chủng: Bacillus subtilis H2.3 Ưu điểm chủng có nhiệt độ sinh trưởng sinh tổng hợp tốt loại o enzym từ 30 - 40 C, phù hợp với nhiệt độ bể xử lý nước thải pH ban đầu thích hợp cho sinh trưởng sinh tổng hợp enzym từ - Chúng sinh trưởng dễ dàng nguồn chất rẻ tiền ngô, tinh bột, rỉ đường bột đậu tương Nghiên cứu điều kiện lên men, nhằm đưa quy trình nhân giống sản xuất chế phẩm vi sinh yếm khí phù hợp với điều kiện Trường ta 3.5.1 Nhân giống bình tam giác Các chủng giống trước cấy vào bình tam giác cấy lại ống thạch đứng cho phát triển tốt sau cấy vào bình tam giác, nuôi cấy tĩnh từ 36 - 48 o 35 C 3.5.2 Nhân giống bình lên men (giống cấp 2) Sau nhân giống chủng vi khuẩn bình tam giác mọc tốt bổ sung từ - 10% hỗn hợp chủng vi khuẩn vào hai bình lên men, ni cấy tĩnh o điều kiện khơng có oxy ni nhiệt độ từ 30 - 35 C Kết phân tích số lượng vi khuẩn lớn từ 36 - 48h Vì vậy, thời gian làm giống cấp hai hỗn hợp chủng vi khuẩn bình lên men tốt 36- 48h Đây thời gian chủng vi sinh vật sinh trưởng tốt để thu dịch lên men, chuyển hóa dịch, xử lý ổn định hoạt tính men – cố định vi sinh vật, tạo men dịch thể 55 Bảng 3.6 Sự sinh trưởng hỗn hợp vi khuẩn bình lên men 10 lít Thời gian, h Mật độ tế bào vi khuẩn (OD, λ = 620 nm) Số lượng vi sinh vật (CFU/ml) 0.145 3.3*102 12 0.981 2.5*104 24 1.98 4.2*109 36 2.32 6.7*1010 48 2.28 6.5*1010 60 2.04 7.3*109 72 1.783 4.3*109 3.5.3 Nghiên cứu thời gian bảo quản chế phẩm Kết nghiên cứu thành phần số lượng nhóm vi sinh vật chế phẩm vi sinh yếm khí bảo quản can nhựa, nơi thống mát, nhiệt độ phịng Kết trình bày bảng 3.6 Bảng 3.7 Số lượng tế bào chủng vi sinh vật theo thời gian bảo quản Chủng Bacillus subtilis H2.3 Số lượng tế bào vi sinh vật (x 107CFU/ml) theo thời gian (tuần) 6650 310 10 9,2 Từ bảng cho thấy số lượng giống khởi động chủng lúc ban đầu theo bảng 3.5 cao (4.2*109- 6.5*1010) Số lượng giảm dần qua thời gian bảo quản điều kiện bình thường Sau tuần, số lượng tế bào hầu hết chủng giảm cịn 106-107 giống khởi động, nguồn dinh dưỡng khống ban đầu có giới hạn nên làm giảm số lượng tế bào Từ cho thấy, để sản xuất, xử lý có hiệu nên dùng giống khởi động vòng tháng Từ kết nghiên cứu chúng tơi tóm tắt đưa quy trình nhân giống sản xuất chế phẩm vi sinh yếm khí sử dụng hệ thống xử lý nước thải Trường Đại học Nha Trang Qua nhiều lần thí nghiệm chúng tơi rút kết luận, để chế phẩm đảm bảo chất lượng tốt, không sử dụng chế phẩm làm giống lên men sản xuất chế phẩm tiếp, sử 56 dụng hiệu suất xử lý nước thải giảm Chủng vi khuẩn Hoạt hóa Mơi trường thạch nghiên cứu Chủng hoạt hóa Nhân giống 30-350C, 36 – 48h Môi trường nhân giống I Giống cấp I Nhân giống 30-350C, 48h Môi trường nhân giống II Giống cấp II Hỗn hợp giống Lên men Chuyển hóa dịch Dịch lên men Kiểm tra vi sinh vật Sử dụng Bảo quản (nơi khơ mát) Đóng chai Men dịch thể Hình 3.11 Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh yếm khí từ chủng Bacillus subtilis H2.3 57 3.6 Kiểm tra khả xử lý nước thải chủng Chuyển 0,5ml chế phẩm xử lý nước thải vào bình tam giác 500ml có chứa 200ml nước thải sinh hoạt Trường Đại học Nha Trang có khử trùng không khử trùng nuôi cấy tĩnh điều kiện 350C Kiểm tra số COD, BOD, hàm lượng NH4+, nitrit, nitrat, mật độ sinh khối thời điểm 24h, 48h… Chế phẩm thử nghiệm nước thải sinh hoạt Trường Đại học Nha Trang Các thí nghiệm bố trí sau: - Chế phẩm vi sinh yếm khí với nước thải chưa trùng (kí hiệu: C0) - Chế phẩm vi sinh yếm khí với nước thải trùng 1atm (kí hiệu: C) - Đối chứng: nước thải chưa trùng (ĐC) Các thí nghiệm tiến hành điều kiện 350C, nuôi cấy tĩnh 3.6.1 Sự biến động nhu cầu oxy hóa học Nhu cầu oxy hóa học lượng oxy cần thiết để oxy hóa hồn tồn chất hữu phần nhỏ chất vơ dễ bị oxy hóa nước thải Chỉ số cao chứng tỏ mức độ ô nhiễm nước thải lớn Sử dụng chế phẩm để xử lý nước thải sinh hoạt, kết thể hình 3.12 COD (mg/l) 350 300 C0 250 C 200 ĐC 150 100 50 0 Thời gian (ngày) Hình 3.12 Sự thay đổi số COD theo thời gian Qua hình 3.15 ta thấy chủng vi sinh vật có khả oxy hóa hợp chất hữu nói chung tốt Khi bổ sung chế phẩm vào trình xử lý nhanh triệt 58 để không bổ sung chế phẩm Sau ngày xử lý, hiệu suất xử lý COD mẫu bổ sung chế phẩm không trùng nước thải là: 83,5%, trùng nước thải là: 79,8% mẫu xử lý tự nhiên là: 20,5% 3.6.2 Sự biến động nhu cầu oxy sinh học Nhu cầu oxy sinh học lượng oxy cần thiết cho vi khuẩn sống hoạt động để oxy hóa chất hữu có nước thải Như số lớn chứng tỏ độ ô nhiễm cao Chỉ số BOD sau ngày xử lý thể bảng 3.13 BOD (mg/l) 300 250 C0 C 200 ĐC 150 100 50 0 Thời gian (ngày) Hình 3.13 Sự thay đổi số BOD theo thời gian Ta thấy giống số COD, BOD giảm nhiều lần bổ sung chế phẩm Sau ngày xử lý, hiệu suất xử lý BOD mẫu bổ sung chế phẩm vi sinh yếm khí khi khơng trùng nước thải là: 86%, trùng nước thải 84,4% với mẫu tự nhiên 19,6% 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã phân lập 30 chủng vi khuẩn yếm khí từ mẫu đất, nước thải Trong 30 chủng vi khuẩn yếm khí có 10 chủng có hoạt tính enzym mạnh, chọn chủng có hoạt tính mạnh nhất, có khả sinh loại enzyme ngoại bào: protease, amylase, cellulose Dựa kết nghiên cứu đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh lý sinh hóa, trình tự 16S rDNA, chủng H2.3, M1.3 xác định Bacillus subtilis H2.3, Lactobacillus casei M1.3 Lựa chọn chủng Bacillus subtilis H2.3 để nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh Đã xác định điều kiện ni cấy thích hợp cho sinh trưởng khả phân giải enzym chủng là: pH từ – 8, nhiệt độ từ 30 – 350C, thời gian từ 36 – 48h, nguồn cacbon rỉ đường Đã xây dựng quy trình tạo chế phẩm vi sinh yếm khí xử lý nước thải sinh hoạt Chế phẩm chế tạo hỗn hợp loại vi khuẩn với nguồn cacbon rỉ đường Đã nghiên cứu thời gian bảo quản chế phẩm tốt tháng, điều kiện thường Thử nghiệm chế phẩm xử lý nước thải sinh hoạt Trường Đại học Nha Trang quy mơ phịng thí nghiệm (dung tích 200ml) Kết sau ngày xử lý nước thải sinh hoạt chế phẩm vi sinh yếm khí hiệu suất xử lý COD 83,5%, BOD 86% KIẾN NGHỊ Nghiên cứu sử dụng nguyên liệu rẻ tiền cho trình lên men xốp nhằm giảm chi phí sản xuất Thử nghiệm sản xuất chế phẩm dạng bột quy mô lớn, thay chế phẩm nhập ngoại 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Kiều Hữu Ảnh, Giáo trình vi sinh vật học cơng nghiệp, Nhà xuất Khoa Học Kỹ Thuật (1999) Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thượng Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến, Công nghệ enzyme, Nhà xuất Nông Nghiệp TP.HCM (1998) Hoàng Kim Cơ, Trần Hữu Uyển, Kỹ thuật môi trường Nhà xuất KHKT Hà Nội (2001) Công nghệ vi sinh vật hữu hiệu EM (effective microorganisms), Trung tâm phát triển công nghệ Việt-Nhật (2004) Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Thị Thanh Hiền, Phạm Thị Trân Châu, Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật (1978) Nguyễn Lân Dũng, Thực hành vi sinh vật học, Nhà xuất đại học Hà Nội (1983) Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến Phạm Văn Tỵ, Vi sinh vật học, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật (2005) Vũ Minh Đức, Hóa học vi sinh vật, Nhà xuất Xây Dựng (2011) Tran Lien Ha, Dang Ngoc Sam Isolation and selection Bacillus for polluted lake water treatment Proceeding of the 20 scientific confernce Hanoi University of Technology 55-58 (2006) 10 Nguyen Thi Thanh, Tran Lien Ha Isolation denitrification bacteria for using in polluted lake water treatment Proceeding of the 20 scientific confernce Hanoi University of Technology 243-246 (2006) 11 Tran Lien Ha Strategies for waste treatment in small and medium enterprises and micro-enterprises in agriculture sector Proccedings of workshop "Enhance Proccedings of workshop "Enhance capacity of small and medium enterprises in agricultural setor of APEC economic" December 2007 12 Nguyễn Đức Lượng, Giáo trình thí nghiệm công nghệ sinh học 61 13 Nguyễn Xuân Nguyên, Phạm Hồng Hải, Lý thuyết mơ hình q trình xử lý nước thải phương pháp sinh học, Nhà xuất Khoa học kĩ thuật Hà Nội (2003) 14 TrầnVăn Nhân, Ngơ Thị Nga, Giáo trình Cơng nghệ xử lý nước thải, Nhà xuất khoa học kĩ thuật (2002) 15 Lương Đức Phẩm, Công nghệ vi sinh vật, Nhà xuất Nông Nghiệp (1998) 16 Lương Đức Phẩm, Công nghệ xử lý nước thải biện pháp sinh học Nhà xuất Hà Nội (2007) 17 Nguyễn Thị Sơn, Trần Lệ Minh, Tài liệu hướng dẫn thí nghiêm – tập 4, Nhà xuất Bách Khoa Hà Nội 18 Lâm Vĩnh Sơn, Bài giảng Kỹ thuật xử lý nước thải, Đại học Kỹ thuật Công nghệ Tp.HCM (2007) 19 Ngơ Tự Thành, Nghiên cứu hoạt tính enzym ngoai bào số chủng Bacillus phân lâp khả ứng dụng xử lý nước thải Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ 25 tr.101-106 20 ( 2009) Nguyễn Văn Thọ, Thiết kế chế tạo mơ hình nghiên cứu hệ thống thiết bị xử lý nước thải sinh hoạt cho khu tập thể trường Đại Học Nha Trang Luận văn tốt nghiệp Trường Đại học Nha Trang (2009) 21 Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, Nhà xuất giáo dục (2002) 22 Lê Ngọc Tú, Lê Văn Chứ, Phạm Trân Châu, Nguyễn lân Dũng, Enzym vi sinh vật, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Tài liệu tiếng Anh 23 A Hammed, T Keshavarz, C.S Evan, Effect of dissolved oxygen tension and pH on the production of extracellular protease from a new isolate of Bacillus subtilis K2, for use in leather processing, J Chem Technol Biotechnol 74 (1999) 24 Andretta, C.W.S., R.M Rosa, E.C Tondo, C.C Gaylarde and J.A.P Henriques 2004 Identification and molecular characterization of a Bacillus subtilis IS13 strain 62 involved in the biodegradation of 4,5,6-trichloroguaiacol Chemosphere 55: 631639 25 Araya, M., Morelli, L., Reid, G., Sanders, M.E., and Stanton, C., Joint FAO/WHO Working Group Report on Guidelines for the evaluation of probiotic in food London Ontario ftp://ftp.fao.org/es/esn/food/wgreport2.pdf (2002) 26 Arici M., Bilgin B., Sagdic O., Ozdemir C Some Characteristics of Lactobacillus Isolates from Infant Feaces Food Microbiology, 21, pp 19-24 (2004) 27 Harry P Rappaport, “A Bacillus subtilis Proteinase”, The Journal of Biological Chemistry, Vol 240, No.1 (1965) 28 Hugenholtz, P., Goebel, B., Pace, N Impact of culture-independent studies on the merging phylogenetic view of bacterial diversity Journal of Bacteriology 180: 4765-4774 (1998) 29 H Outtrup, T.S Jorgensen ST, The importance of Bacillus species in the production of industrial Berkeley R, Heyndrickx M, Logan N, De Vos P (eds), Applications and systematics of Bacillus and relatives, Blackwell publishing, UK, 2002, pp 206218 30 Kebabcı Özgür and Cihangir Nilüfer (2010), Isolation of protease producing novel Bacillus subtilis Journal of Biotechnology Vol 10( 7), pp 1160-1164 31 Kimura M A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences J Mol Evol 111-120 (1980) 32 Kozaki M., Uchimura T & Okada S Experimental manual of lactic acid bacteria Asakurasyoten, Tokyo, Japan (1992) 33 M Schallmey, A Singh, P.O.Ward, Developments in the use of Bacillus species for industrial production, Can J Microbiol (2004) 34 Mishra V., Prasad D.N Application of In Vitro Methods for Selection of Lactobacillus casei Strains as Potential Probiotics International Journal of Food Microbiology 103, pp 109-115 (2005) 63 35 Ljupka Arsova Anaerobic digestion of food waste: Current status, problems and an alternative product Research sponsored by WTERT, Colombia university ((2010) 36 Susan B L Cellulose degradation in anaerobic environments Microbiol 49, pp: 399-426 (1995) 37 Rampersad K., Goldstone L A., and Tivchev G N., , Study of methods for the cultivation of anaerobic Water SA Vol 24 No (1998) 38 Panuwan Chantawannakula, Characterization of proteases of Bacillus subtilis strain 38 isolated from traditionally fermented soybean in Northern Thailand Science Asia 28 (2002) : 241-245 39 Saitou N and Nei M The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees Mol Biol Evol 4: 406-425 (1987) 40 Sakiyama, Y., Nguyen, K N T., Nguyen, M G., Miyadoh, S., Duong, V H & Ando, K Kineosporia babensis sp nov., isolated from plant litter in Vietnam Int J Syst Evol Microbiol 59: 550-554 (2009) 41 Sharmin, F and Rahman, M 2007 Isolation and characterization of protease producing Bacillus strain FS-1 Agricultural Engineering International: the CIGR Ejournal Vol IX April, 2007 42 Spencer J.F.T., de Spencer A.L.R.Public Health Microbiology – Methods and Protocols Methods in Molecular Biology, vol 268, Humana Press Inc., Totowa, New Jersey, USA (2004) 43 Thompson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F & Higgins D.G The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tool Nucleic Acids Res 25: 4876-4882 (1997) 44 R Gupta, Q.K Beg, P.Lorenz, Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial Appl Microbiol Biotechnol 59(2002) 45 Walter P Hammes and Christian Hertel The genera Lactobacillus and arnobacterium.Dworkin W., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer K.-H & Stackebrandt E (ed.) The Prokaryotes: an Evolving electronic resource for the microbiological community Springer-Verlag, New York (2000) 64 Trang web 46 http://www.elmhurst.edu/~chm/vchembook/547cellulose.html 47 http://www.scribd.com/doc/92107263/khoa-luan-minh 48 www.yeumoitruong.com 49 http://www.scribd.com/doc/47413614/3/KHAI-NI%E1%BB%86MV%E1%BB%80-CELLULASE-VA-ENDO-%CE%B2-1-4-GLUCANASE 65 ... thành công hệ thống xử lý nước thải sinh hoạt Trường Đại học Nha Trang 1.2.2 Quy trình xử lý nước thải Trường Đại học Nha Trang 1.2.2.1 Sơ đồ hệ thống xử lý nước thải trường Đại học Nha Trang. .. tái sử dụng trường đại học Nha Trang Đề tài thử nghiệm thành công hệ thống xử lý nước thải sinh hoạt Trường Đại học Nha Trang Tuy nghiên cứu xử lý nước thải sinh hoạt trường Đại học Nha Trang. .. QTCN tạo chế phẩm vi sinh yếm khí dùng hệ thống xử lý nước thải sinh hoạt - Bước đầu phân tích tạo chế phẩm - Thử nghiệm tác dụng chế phẩm lên men nước thải sinh hoạt trường Đại học Nha Trang quy