Xác định các gen đích trực tiếp của microRNA 144 trong tế bào chondrocyte

Xác định gen đích trực tiếp microRNA -144 Trong tế bào chondrocyte Lê Thị Trúc Linh 2020 MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH THƠNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU INFORMATION ON RESEARCH RESULTS PHẦN I PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực nghiên cứu (Trong nước) 1.2 Lý nghiên cứu tính cấp thiết đề tài 17 PHẦN 19 MỤC TIÊU, ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, CÁCH TIẾP CẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 20 2.2 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 20 2.3 Cách tiếp cận 20 2.4 Phương pháp nghiên cứu 20 2.4.1 Phương pháp chọn ứng cử viên tham gia cung cấp mẫu cho nghiên cứu 20 2.4.2 Phương pháp tách tế bào chondrocyte từ khớp gối bệnh nhân bị thoái hóa khớp 22 2.4.3 Phương pháp ni cấy tế bào 22 2.4.4 Phương pháp kích hoạt tế bào với yếu tố tăng trưởng IL-1 22 2.4.5 Phương pháp chuyển microRNA mimic inhibitor vào tế bào chondorocyte 22 2.4.6 Phương pháp sinh học phân tử 23 2.4.6.1 Tạo dòng 23 2.4.6.2 Gây đột biến vùng lõi miR-144 25 2.4.6.3 Giải trình tự 25 2.4.6.4 Tách chiết RNA 25 2.4.6.5 Tổng hợp cDNA 26 2.4.6.6 Phản ứng Real-time RT PCR 27 2.4.6.7 Phân tích liệu phản ứng real-time PCR 28 2.4.6.8 Western Blot 28 2.4.6.9 Phương pháp luciferase assay 30 2.4.6.10 Phương pháp whole genome array 31 PHẦN 32 NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32 3.1 Nội dung 1: Phân tích liệu Whole genome array 33 Thực phản ứng gain and loss of function cho miR-144-3p tế bào chondrocyte 33 3.2 Nội dung 2: Thực nghiệm chứng minh gene đích trực tiếp miR-144 realtime PCR 38 3.3 Nội dung 3: Chứng minh số gene đích trực tiếp miRNA-144 luciferase assay 40 3.4 Nội dung 4: Mối tương quan Nrf2 miRNA-144 bệnh thoái hóa khớp 43 3.5 Nội dung 5: Chức miRNA-144 IL-1/p65 signalling 45 3.6 Nội dung 6: Cơ chế tăng cường hoạt động miRNA-144 đường truyền tín p65 signalling 51 PHẦN 55 THẢO LUẬN 55 4.1 Tổng kết kết nghiên cứu 56 4.2 Thảo luận 56 4.2.1 Sự gia tăng biểu miRNA-144 dẫn tới thối hóa khớp 56 4.2.2 Con đường truyền tín hiệu IL-1/p65 miRNA-144 57 4.2.3 Nrf2 bệnh thối hóa khớp 58 PHẦN 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 5.1 Kết luận 60 5.2 Kiến nghị 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC HÌNH Hình 1: Sự biểu miR-144-3p tế bào tăng biểu ức chế biểu (thực nghiệm gain-and loss of funtion) 33 Hình 2: Thí nghiệm Gain- loss-function 35 Hình 3: Các phân tử mRNA đích tiềm miRNA 144 xuất nhiều mRNA giảm tăng biểu tế bào chuyển gene miRNA 144 mimic miRNA 144 inhibitor 37 Hình 4: Một số gene đích trực tiếp miRNA-144 kiểm tra qRT-PCR 39 Hình 5: Vùng 3’UTR gene NRF2 có vị trí nhận biết miRNA-144 -3p subclone vào vector pmiRGLO 40 Hình 6: Tạo vector pmiRGO-NRF2 3’UTR mutant 41 Hình 7: Luciferase assay cho thấy Nrf2 đích trực tiếp miR-144 42 Hình 8: Nrf2 đích trực tiếp miR-144 mức độ protein 43 Hình 9: Biểu miRNA-144 Nrf2 xương bị tổn thương xương bình thường người bệnh thối hóa khớp 44 Hình 10: Sự biểu miRNA-144 tăng với IL-1 45 Hình 11: p65 p50 tương tác với vùng promoter pri-miRNA-144 46 Hình 12: miRNA-144 tăng cường hoạt tính đường truyền tín hiệu p65 47 Hình 13: MiRNA-144 tăng cường mức độ biểu MMP13 48 Hình 14: miRNA-144 tăng cường hoạt động protein liên quan đường truyền tín hiệu p65 tác động IL-1 49 Hình 15: MicroRNA 144 dẫn đến gia tăng hàm lượng p-p65 nhân tác động IL-1 50 Hình 16: siRNA Nrf2 làm ức chế biểu Nrf2 52 Hình 17: MMP13 tăng cường biểu tác động IL-1 Nrf2 bị ức chế 53 Hình 18: Sự ức chế Nrf2 dẫn đến tăng cường hoạt động p65 tác động IL-1 54 Hình 19: Cơ chế điều hịa positive feed back loop miRNA-144 đường truyền tín hiệu IL-1/p65 signalling 56 PHẦN I PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực nghiên cứu (Trong ngồi nước) Có 100 loại bệnh khớp thối hóa khớp (Osteoarthritis) phổ biến chiếm 50% Thối hóa khớp (THK) nguyên nhân thứ tư gây tàn phế người đến năm 2020 vấn đế ý tế quan tâm quy mơ lớn hệ bệnh THK thường xảy người cao tuổi bệnh bắt đầu phát triển sớm chấn thương chứng béo phì Với tình hình tuổi thọ dân số ngày tăng Việt Nam, gánh nặng thối hóa khớp cơng đồng gia tăng đáng kể THK bao gồm thay đổi xảy tồn khớp tất mơ khớp bị ảnh hưởng bao gồm sụn, xương sụn, dịch khớp, bao hoạt dịch khớp [1] Về mặt bệnh lý, thay đổi bất thường xảy bao gồm phần sụn hai đầu xương mịn dần, sơ hóa phần màng dịch khớp, hình thành gai xương (xảy hai đầu xương cọ sát vào phần sụn hai đầu xương bị hao mịn hồn tồn), xương sụn trở nên dày (hiện tượng hóa ngà) [1, 2] Những thay đổi kết hàng loạt kiện chưa hiểu rõ ràng Sụn cấu tạo gồm hai thành phần chondrocytes, tế bào có sụn, lớp đệm ngoại bào (Extracellular matrix-ECM) tạo chondrocytes [2, 3] ECM gồm thành phần nước, collagen proteoglycan[3] Các chấn thương, yếu tố sinh hóa, dẫn dẫn đến q trình trao đổi chất tế bào chondrocyte thay đổi [1-3] Khi tế bào tăng cường tổng hợp enzyme tiêu hủy ECM bao gồm matrix metalloproteinase (MMPs) [3-5] aggrecanase (ADAMTS family)[3, 6, 7] Sự tăng cường tổng hợp enzyme kết cần đường đồng hóa dị hóa chondrocytes kích thích hàng loạt cytokines nhân tố phát triển TGFβ, BMPs, IGF-1, TNF-α, IL-1β, Wnt3a [3, 8-14] Trong thối hóa khớp, bất thường hàng loạt đường truyền tín hiệu liên quan đến q trình đồng hóa TGFβ signaling[8], Wnt signaling[9-11] hay q trình dị hóa NFκβ signaling [12-14] chứng minh MicroRNA (miR) nhóm RNA có kích thước từ 20 đến 25 nucleotide, có chức điều hòa biểu gene cách gắn đặc hiệu với trình tự mRNA đích [15, 16] Có khoảng 4552 miRNAs tìm thấy tế bào người (miRbase: www.mirbase.org, 2014) miRNA dự đốn điều hịa vài gene đích [17, 18] Các chương trình bioinformatics dự đốn 50% gene mã hóa người điều hịa miRNA [19, 20] Năm 1981, phân tử miRNA đầu tiên, lin-4, phát tuyến trùng Caenorhabditis elegans [21] Đến đầu năm 1990s, Ambros Ruvkun chứng minh lin-4 điều khiển bước quan trọng chu trình phát triển C.elegans thông qua ức chế lin-14[21-23] Hai nhà khoa học chứng minh vùng 3’UTR lin-14 có chứa nhiều trình tự bổ xung (mặc dù khơng hoàn toàn) với lin-4 cho lin-4 gắn lên trình tự dẫn đến ức chế trình dịch mã lin-14 Sau đó, phân tử miRNA thứ hai tìm thấy C.elegans, let-7[24] Sau khái niệm miRNA sử dụng cho loài cấp cao trình tự let-7 bảo tồn người ruồi giấm Năm 2001, thuật ngữ “microRNA” sử dụng chung cho nhóm phân tử nhỏ, khơng mã hóa có chức điều hịa biểu gene Hiện tại, nhiều miRNA tìm thấy người tìm kiếm đích tác động trực tiếp miRNA mối quan tâm hàng đầu Hầu hết miRNA biết nằm vùng intron gene mã hóa cho protein, nhiên có số miRNA nằm vùng exons vùng khơng mã hóa cho mRNA [25] Mặc dù chức chức miRNA mRNA khác biệt, chứng cho thấy chế điều hòa phiên mã hai phân tử có nhiều điểm tương đồng[26] MicroRNA tạo từ nhiều bước: Đầu tiên, miRNAs phiên mã phức hợp RNA polymerase II [27], sau gắn mũ (capped), gắn poly A [28] Q trình phiên mã tạo phân từ miRNA sở (primary miRNA), có mang cấu trúc kẹp tóc [26, 29] Sau đó, Drosha (một loại RNAse II) Drosha cofactor, DGCR8 cắt vùng cấu trúc kẹp tóc miRNA – sở để tạo tiền miRNA (precursor miRNA), có kích thước khoảng 70-100 nucleotide [30, 31] Cả trình thực nhân Tiếp theo, tiền miRNA vận chuyển qua màng nhân đến tương bào cytosol nhờ Exportin-5 [32] Sau đó, Dicer (một loại RNAse III) cắt tiền miRNA thành phân tử RNA mạch đơi có kích thước ngắn [33, 34] Phân tử RNA mạch đơi có mạch đơn miRNA, mạch cịn lại mang trình tự bổ sung với trình tự miRNA Sau tháo xoắn Helicase từ RNA mạch đơi, miRNA tương tác với phức hợp RISCs có chứa protein Arganaute (Ago-2) gắn lên vùng 3’ không mã hóa (3’UTR) mRNA, dẫn đến ức chế trình phiên mã dịch mã, trình tự bổ sung lại bị loại bỏ [35, 36] Việc gắn miRNA lên mRNA phụ thuộc nhiều vào trình tự từ nucleotide đến đầu 5’ phân từ miRNA hay gọi “seed sequence”[19] MicroRNA điều hịa biểu mRNA chủ yếu thơng qua vùng 3’UTR Tuy nhiên, vùng khác mRNA 5’UTR vùng mã hóa chứng minh [37] Đặc biệt, miRNA gắn lên vùng mã hóa có hiệu ức chế dịch mã vùng khác Bên cạnh vị trí vùng seed site, số lượng seed site, cấu trúc mRNA, khoảng cách seed site ảnh hưởng đến khả ức chế biểu gene miRNA [38] Sự liên quan miRNA với THK tổng hợp chi tiết từ nghiên cứu sàng lọc thay đổi miRNAs THK, nghiên cứu sử dụng mơ hình chuột chuyển gene, chuột đột biến loại miRNA định, mối liên quan miRNA đến trình hình thành phát triển xương hay tượng liên quan đến THK [39] Trong đó, số nghiên cứu tiêu biểu liệt kê đưới Cụ thể, biểu bất thường miRNA liên quan đến bệnh THK chứng minh thông qua nghiên cứu so sánh mức độ biểu miRNA bệnh nhân THK người bình thường [40-42]: Khi sàng lọc 365 miRNAs, Illopoulos cộng tìm thấy 16 miRNAs, miRNAs tăng miRNA giảm biểu mô sụn bệnh nhân THK Trong số 16 miRNAs, số miRNA chứng minh có liên quan đến chứng béo phì viêm: miR-9 ức chế biểu MMP13; miR-9, miR-98, miR-146 ức chế biểu TNF- miRNA-22, chứng minh có mức độ biểu liên quan đến khối lượng thể, có đích trực tiếp PPARA BMP-7 mức độ phiên mã dịch mã Khi tăng biểu miR-22 ức chế PPARA BMP-7 siRNA, mức độ IL-1 MMP-13 tăng [40] Những kết cho thấy biểu bất thường miRNA có tác động đến THK Bên cạnh đó, cơng trình nghiên cứu Jones cộng tìm thấy 17 miRNAs có mức độ biểu thay đổi nhiều lần mô sụn bệnh nhân THK sàng lọc 157 miRNAs [41] Tương đồng với số liệu Illopoulos cộng [40], thay đổi biểu miR-9, miR-98 miR-146 nhấn mạnh Tăng biểu miRNA dẫn đến ức chế tác động IL-1b lên TNF-a tăng hoăc giảm lượng miR-9 dẫn đến thay đổi lượng MMP-13 [41] Ngoài ra, thực sàng lọc 732 miRNAs tế bào chondrocytes phân lập từ bệnh nhân THK, Prado cộng thấy miRNAs có thay đổi miR483-5p tăng miR-149-3p, miR-582-3p, miR-1227, miR-634, miR-576-5p, miR-641 10 giảm biểu THK Những miRNAs dự đoán điều khiển số đường truyền tín hiệu quan trọng mơ sụn TGF-β, Wnt, Erb mTOR [42] Những nghiên cứu vai trò miR-140 bệnh THK khẳng định miRNA có liên quan bệnh THK: Mức độ miR-140 mô sụn bệnh nhân THK giảm so sánh với đối tượng người bình thường [43, 44] Đồng thời, tế bào chondrocyte phân lập từ mô sụn THK, lượng miR-140 giảm [44] Chuột thiếu vùng trình tự miR-140 sớm phát triển THK có mơ sụn sớm bị thối hóa bình thường kích thích chuột phát triển THK [45] Ngược lại, chuột chuyển gene mang vùng trình tự miR-140 có vùng mơ sụn bị thối hóa bình thường [46] Điều chứng tỏ mức độ miR-140 phải trì mức độ định tế bào, tăng hay giảm miR-140 có liên quan đến THK Các nghiên cứu miR-27 cho thấy họ miRNA có liên quan đến THK Trong đó, lượng miR-27a giảm tế bào chondrocyte phân lập từ bệnh nhân THK [44] Sự giảm mức độ miR-27a chứng minh có liên quan đến biến đổi bất thường mô mỡ xuất chứng béo phì [47] MMP-13 IGFBP-5 đích gián tiếp miR-27a [44] Tương tự, miR-27b giảm biểu THK có đích trực tiếp MMP13 [48] Đặc biệt, chúng tơi chứng minh vai trị họ miR-29 THK [49] Họ miR29 bao gồm miR-29a, b c có vùng “seed site” giống số chức thành viên trùng lắp MicroRNA- 29b tăng biểu mô hình chuột bị kích thích mắc bệnh THK bệnh nhân THK [49] Nguyên nhân biến đổi bất thường họ miR-29 TKH chứng minh có liên quan đến đường truyền tín hiệu P38, đường truyền tín hiệu quan trọng THK Ngồi ra, vai trò họ miRNA-29 xác định: họ miR-29 ức chế ba đường truyền tín hiệu TGFβ, NFκβ, WNT Đồng thời, nguyên nhân việc ức chế miR-29 tác động trực tiếp lên gene thuộc đường truyền tín hiệu WNT [49] Ở người, miR-144 nằm chromosome 17 Các miRNA nằm gần miR-144 (