Đang tải... (xem toàn văn)
Thời điểm đầu của các trường hợp PBC có triệu chứng thường chỉ hiện diện kháng thể dưới type AMA- M2 (đôi khi kết hợp với AMA-M9), trong khi các trường hợp tiến triển và các hội chứng p[r]
(1)QUY TRÌNH
N.525 QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG THỂ KHÁNG TY LẠP THỂ (AMA-M2) I NGUYÊN LÝ
Xét nghiệm dựa phản ứng miễn dịch gắn enzyme gián bước sau:
Các kháng thể có mặt mẫu dương tính gắn với kháng nguyên phủ bề mặt hai giếng phản ứng, hình thành phức hợp kháng nguyên-kháng thể Sau ủ, bước rửa loại bỏ phân tử không gắn gắn không đặc hiệu Tiếp đó, chất cộng hợp enzyme bổ sung gắn với phức hợp kháng nguyên - kháng thể cố định Sau ủ, bước rửa thứ hai loại bỏ chất cộng hợp không gắn Cơ chất enzyme tiếp tục thêm vào giếng, trình thủy phân tạo màu diễn thời gian ủ Cường độ màu xanh dương tạo tỉ lệ thuận với nồng độ phức hợp kháng nguyên-kháng thể đo phương pháp quang học bước sóng 650 nm hệ thống xét nghiệm miễn dịch ELISA (Enzymelinked immunosorbant assay)
II CHUẨN BỊ
1 Cán thực hiện: 01 bác sĩ 01 cán đại học 01 kỹ thuật viên chuyên ngành Hóa sinh
2 Phương tiện, hóa chất:
Phương tiện: máy xét nghiệm miễn dịch Alegria- hãng ORGENTEC/ Germany Thuốc thử sẵn sàng sử dụng:
Bộ xét nghiệm định lượng AMA-M2 sau:
Thanh thử Alegria gồm giếng chứa thành phần sau:
Giếng + Giếng trống khơng phủ (để pha lỗng mẫu)
Giếng + Được phủ kháng nguyên (giếng phản ứng) Giếng Mẫu chứng, màu vàng, chứa kháng thể đặc
hiệu, PBS, BSA, chất tẩy, chất bảo quản natri azide 0,09% ProClin 300 0,05% Giếng Chất cộng hợp enzyme, màu đỏ nhạt, chứa
(2)Giếng Dung dịch pha loãng mẫu, màu vàng, chứa PBS, BSA, chất tẩy, chất bảo quản natri azide 0,09% ProClin 300 0,05%
Giếng Cơ chất TMB, suốt, chứa 3,3’, 5,5’- Tetramethylbenzidin
Kháng nguyên type M2 ty thể (PDC-E2, BCOADC-E2, OGDC-E2) có độ tinh cao phủ sẵn vi giếng
Mã sản phẩm mã vạch: AMA-M2
- Ngồi cịn dung dịch hệ thống như:
+ Wash (1x20mL): Dung dịch rửa, chứa TRIS, detergent, chất bảo quản natri azide 0,09% (50x)
+ System fluid (1x2,5mL): Dung dịch hệ thống chứa acid (1000x)
- Bộ xét nghiệm cần bảo quản bóng tối điều kiện 2-8°C Khơng để hóa chất tiếp xúc với nhiệt, mặt trời ánh sáng mạnh suốt trình bảo quản sử dụng Bảo quản thử Alegria (đậy kín khơ ráo) túi có khóa cung cấp Dung dịch Wash Buffer System Fluid sau pha loãng ổn định tối thiểu 30 ngày bảo quản 2-8°C
Dụng cụ khác: + Máy vortex; Pipet 10 μL; + Ống đong thể tích 1000 mL 2500 mL + Nước cất nước khử ion
3 Người bệnh: Người bệnh giải thích tư vấn trước thực XN, tốt nhịn ăn sáng lấy máu vào buổi sáng
4 Phiếu xét nghiệm: có đầy đủ thông tin bệnh nhân bao gồm họ tên, tuổi, khoa phịng, chẩn đốn, tình trạng mẫu, tên BS định, ngày định, ngày lấy mẫu, loại thuốc sử dụng (nếu có)…
III CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
1 Lấy mẫu bệnh phẩm xử lý mẫu:
(3)- Bệnh phẩm nhận từ khoa lâm sàng phận lấy mẫu phòng khám Nhân viên nhận mẫu lấy thông tin bệnh nhân từ phần mềm quản lý Bệnh viện, in dán barcode vào ống bệnh phẩm, sau cho ly tâm 4000 vịng phút trước tiến hành kỹ thuật
Bệnh phẩm lưu 2-8°C vòng ngày -20°C vòng tháng Bảo quản chất chuẩn, QC sau hoàn nguyên nhiệt độ -20°C, tiến hành chạy phải để nhiệt độ phòng (20- 25°C) rã đơng hồn tồn lắc trước tiến hành xét nghiệm
2 Tiến hành kỹ thuật
Máy xét nghiệm, hóa chất chuẩn trước thực phân tích Việc chuẩn xét nghiệm định lượng AMA-M2 hiệu chuẩn thay đổi lơ hóa chất Kiểm tra chất lượng nằm giới hạn cho phép Thông thường chạy nội kiểm (QC) mức ngày: mức bình thường khơng bình thường Đối chiếu với luật kiểm tra chất lượng đạt tiến hành phân tích mẫu
Thanh thử Alegria Test Strips với công nghệ SMC sử dụng với thiết bị chẩn đốn Alegria Để có thơng tin chi tiết quy trình vận hành thiết bị, tham khảo tài liệu hướng dẫn sử dụng thiết bị
(1) Bóc miếng dán phủ giếng trống từ đến thử Alegria Test Strips Khơng bóc phần dán phủ có in mã vạch, phủ giếng từ đến
(2) Hút 10 μL mẫu không pha loãng vào đáy giếng (3) Đặt thử vào khay SysTray
(4) Đặt khay SysTray vào vị trí thiết bị Alegria bắt đầu chạy Tất bước sau thực tự động Xét nghiệm chạy hoàn tất thiết bị bắt đầu in kết Định kỳ: Chuẩn lại chạy mức QC sau thay lô thuốc thử sau bảo dưỡng, sửa chữa máy cố, thay trang thiết bị phân tích quan trọng Ghi lại kết vào bảng theo dõi kết chuẩn máy xét nghiệm
Đưa bệnh phẩm vào phân tích theo protocol máy Khi có kết phân tích đối chiếu với phiếu xét nghiệm, trả, lưu kết vào hệ thống mạng, in phiếu kết xét nghiệm trả kết cho người bệnh thời gian quy định
IV NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
1 Giá trị tham chiếu: Bình thường: AMA-M2: < 10 IU/mL 2 Ý nghĩa lâm sàng
(4)Những type AMA khác liên quan đến bệnh bệnh collagen (AMA-M5), lupus ban đỏ thuốc viêm gan (AMA-M3A AMA-M6)
Các kháng thể đặc hiệu kháng ti thể không đồng thuộc type M2 trực tiếp kháng ba protein liên quan phức hợp alpha-keto acid dehydrogenase nằm màng ti thể Các epitop chủ yếu công nhận nằm tiểu đơn vị E2 protein X phức hợp pyruvate dehydrogenase (PDC) Thêm vào đó, tự kháng thể kháng AMA-M2 cịn nhận diện tiểu đơn vị (E1a E1b) phức hợp PDC tiểu đơn vị E2 số phức hợp đa enzyme khác phức hợp 2-oxo-glutarat dehydrogenase (OGDC) phức hợp 2-oxo acid dehydrogenase mạch nhánh (BCOADC)
Sử dụng lớp tế bào HEp2 miễn dịch huỳnh quang gián tiếp phát tự kháng thể kháng AMA-M2 có đặc điểm: đốm mịn tế bào chất, hình ảnh huỳnh quang ngưng tụ quanh nhân Để chẩn đoán phân biệt xơ gan mật nguyên phát, việc xác định AMA-M2 khuyến cáo độ nhạy độ đặc hiệu cao Ở bệnh nhân mắc bệnh tự miễn khác, việc xác định kháng thể kháng AMA cho phép sàng lọc sớm xuất kháng thể type M2 M9 có mối liên hệ với tiến triển và/hoặc liên quan đến PBC
Nhóm type AMA giúp phân loại tính miễn dịch tiên lượng bệnh xơ gan mật Thời điểm đầu trường hợp PBC có triệu chứng thường diện kháng thể type AMA-M2 (đôi kết hợp với AMA-M9), trường hợp tiến triển hội chứng phối hợp với viêm gan cấp mạn tính (CAH) thấy xuất kháng thể type AMA-M2, -M4 -M8
V NHỮNG SAI SĨT VÀ XỬ TRÍ
Sử dụng bệnh phẩm máu toàn phần thu thập kỹ thuật phê duyệt, tránh gây vỡ hồng cầu
Mẫu huyết dùng cho xét nghiệm phải không bị vỡ hồng cầu Tránh sử dụng mẫu vỡ hồng cầu mẫu nhiễm mỡ, nhiên, mẫu không gây nhiễu xét nghiệm Tránh lặp lại bước làm đông rã đông mẫu huyết huyết tương làm giảm hoạt tính kháng thể