Các triệu chứng lâm sàng đi kèm với sự xuất hiện các tự kháng thể đặc hiệu có khả năng phát hiện được trong máu bệnh nhân bị APS.. Các tự kháng thể này gắn với phospholipid như cardioli[r]
(1)QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG THỂ KHÁNG PHOSPHOLIPID IgG I NGUYÊN LÝ
Xét nghiệm dựa phản ứng miễn dịch gắn enzyme gián bước sau: Các kháng thể có mặt mẫu dương tính gắn với kháng nguyên phủ bề mặt hai giếng phản ứng, hình thành phức hợp kháng nguyên- kháng thể Sau ủ, bước rửa loại bỏ phân tử không gắn gắn khơng đặc hiệu Tiếp đó, chất cộng hợp enzyme bổ sung gắn với phức hợp kháng nguyên - kháng thể cố định Sau ủ, bước rửa thứ hai loại bỏ chất cộng hợp không gắn Cơ chất enzyme tiếp tục thêm vào giếng, trình thủy phân tạo màu diễn thời gian ủ Cường độ màu xanh dương tạo tỉ lệ thuận với nồng độ phức hợp kháng nguyên-kháng thể đo phương pháp quang học bước sóng 650 nm hệ thống xét nghiệm miễn dịch ELISA (Enzymelinked immunosorbant assay)
II CHUẨN BỊ
1 Cán thực hiện:
bác sĩ 01 cán đại học 01 kỹ thuật viên chuyên ngành Hóa sinh 2 Phương tiện, hóa chất:
Phương tiện xét nghiệm: máy xét nghiệm miễn dịch Alegria- hãng ORGENTEC/ Germany Thuốc thử sẵn sàng sử dụng:
Bộ xét nghiệm định lượng kháng thể kháng phospholipid IgG sau: Thanh thử Alegria gồm giếng chứa thành phần sau:
Giếng + Giếng trống (để pha loãng mẫu) Giếng + Phủ kháng nguyên (giếng phản ứng)
Giếng Mẫu chứng, màu vàng, chứa kháng thể đặc hiệu, PBS, BSA (albumin huyết bò), chất tẩy, chất bảo quản natri azide 0,09%
Giếng
ProClin 300 0,05%
Chất cộng hợp enzyme, màu đỏ nhạt, chứa kháng thể kháng IgG người, gắn HRP; PBS, BSA, chất tẩy, chất bảo quản ProClin 300 0,05%
(2)Giếng Cơ chất TMB, trong, chứa 3,3’, 5,5’- Tetramethylbenzidin
Hỗn hợp cardiolipin, phosphatidyl serin, phosphatidyl inositol, phosphatidic acid beta-2-Glycoprotein I người có độ tinh cao gắn sẵn vi giếng
Sản phẩm mã hóa: PL Screen IgG
- Ngồi cịn dung dịch thống như:
+ Wash (1x20mL): Dung dịch rửa, chứa TRIS, detergent, chất bảo quản natri azide 0,09% (50x)
+ System fluid (1x2,5mL): Dung dịch hệ thống chứa acid (1000x)
- Bộ xét nghiệm cần bảo quản bóng tối điều kiện 2-8°C Khơng để hóa chất tiếp xúc với nhiệt, mặt trời ánh sáng mạnh suốt trình bảo quản sử dụng Bảo quản thử Alegria (đậy kín khơ ráo) túi có khóa cung cấp Dung dịch Wash Buffer System Fluid sau pha loãng ổn định tối thiểu 30 ngày bảo quản 2-8°C
Dụng cụ khác: + Máy Vortex; Pipet 10 μL; + Ống đong thể tích 1000 mL 2500 mL + Nước cất nước khử ion
3 Người bệnh: Người bệnh giải thích tư vấn trước thực XN, tốt nhịn ăn sáng lấy máu vào buổi sáng
4 Phiếu xét nghiệm: có đầy đủ thơng tin bệnh nhân bao gồm họ tên, tuổi, khoa phòng, chẩn đốn, tình trạng mẫu, tên BS định, ngày định, ngày lấy mẫu, loại thuốc sử dụng (nếu có)…
III CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
1.Lấy mẫu bệnh phẩm xử lý mẫu:
Bệnh phẩm phải lấy kỹ thuật vào ống xét nghiệm tiêu chuẩn Sử dụng ống không chống đơng (ống serum) sử dụng ống có chất chống đông Li-Heparine, EDTA
- Bệnh phẩm nhận từ khoa lâm sàng phận lấy mẫu phịng khám Nhân viên nhận mẫu lấy thơng tin bệnh nhân từ phần mềm quản lý Bệnh viện, in dán barcode vào ống bệnh phẩm, sau cho ly tâm 4000 vòng phút trước tiến hành kỹ thuật
(3)Bảo quản chất chuẩn, QC sau hoàn nguyên nhiệt độ -20°C, tiến hành chạy phải để nhiệt độ phịng (20- 25°C) rã đơng hồn tồn lắc trước tiến hành xét nghiệm
2 Tiến hành kỹ thuật
Máy xét nghiệm, hóa chất chuẩn trước thực phân tích Việc chuẩn xét nghiệm định lượng Anti- Phospholipid IgG hiệu chuẩn thay đổi lơ hóa chất Kiểm tra chất lượng nằm giới hạn cho phép Thông thường chạy nội kiểm (QC) mức ngày: mức bình thường khơng bình thường Đối chiếu với luật kiểm tra chất lượng đạt tiến hành phân tích mẫu
Thanh thử Alegria Test Strips với công nghệ SMC sử dụng với thiết bị chẩn đốn Alegria Để có thơng tin chi tiết quy trình vận hành thiết bị, tham khảo tài liệu hướng dẫn sử dụng thiết bị
Bóc miếng dán phủ giếng trống từ đến thử Alegria Test Strips Khơng bóc phần dán phủ có in mã vạch, phủ giếng từ đến
(2) Hút 10 μL mẫu khơng pha lỗng vào đáy giếng (4) Đặt thử vào khay SysTray
(5) Đặt khay SysTray vào vị trí thiết bị Alegria bắt đầu chạy Tất bước sau thực tự động Xét nghiệm chạy hoàn tất thiết bị bắt đầu in kết Định kỳ: Chuẩn lại chạy mức QC sau thay lô thuốc thử sau bảo dưỡng, sửa chữa máy cố, thay trang thiết bị phân tích quan trọng Ghi lại kết vào bảng theo dõi kết chuẩn máy xét nghiệm
Đưa bệnh phẩm vào phân tích theo protocol máy Khi có kết phân tích đối chiếu với phiếu xét nghiệm, trả, lưu kết vào hệ thống mạng, in phiếu kết xét nghiệm trả kết cho người bệnh thời gian quy định
IV NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
1 Giá trị tham chiếu: Bình thường: Anti- Phospholipid IgG: < 10 GPL- U/mL 2 Ý nghĩa lâm sàng:
(4)bệnh sinh bệnh tự miễn từ tìm hiểu giá trị chẩn đoán tiên lượng kháng thể quan trọng thực hành lâm sàng nghiên cứu chuyên ngành dị ứng miễn dịch lâm sàng
Hội chứng kháng phospholipid (APS, hội chứng Hughes) bệnh tự miễn hệ thống gây tình trạng huyết khối, sảy thai liên tiếp thai chết lưu Các triệu chứng lâm sàng kèm với xuất tự kháng thể đặc hiệu có khả phát máu bệnh nhân bị APS Các tự kháng thể gắn với phospholipid cardiolipin với protein gắn phospholipid beta-2-glycoprotein I
Triệu chứng lâm sàng APS không đủ đặc hiệu để đưa chẩn đốn xác định Do đó, kết xét nghiệm đóng vai trị quan trọng chẩn đốn bệnh Ủy ban khoa học chuẩn hóa hiệp hội quốc tế huyết khối cầm máu định nghĩa tiêu chí lâm sàng thơng số xét nghiệm mang tính chẩn đốn “Tiêu chí Sapporo việc phân loại hội chứng kháng phospholipid”, xuất năm 1999 Tài liệu chỉnh sửa tái năm 2006 2012 Các thông số xét nghiệm bao gồm:
+ Phát chất kháng đông lupus (LA) huyết tương tăng gấp hai lần vòng 12 tuần
+ Tăng hiệu giá kháng thể kháng cardiolipin (IgG và/hoặc IgM) Cần xác định hiệu giá kháng thể hai thời điểm cách 12 tuần, sử dụng xét nghiệm ELISA chuẩn hóa để phát kháng thể kháng cardiolipin phụ thuộc beta-2-glycoprotein
+ Tăng hiệu giá kháng thể kháng beta-2-glycoprotein I (IgG và/hoặc IgM) Cần xác định hiệu giá kháng thể hai thời điểm cách 12 tuần, sử dụng xét nghiệm ELISA chuẩn hóa
APS chẩn đốn xác định đảm bảo đáp ứng tiêu chí lâm sàng tiêu chí xét nghiệm
V NHỮNG SAI SĨT VÀ XỬ TRÍ
Sử dụng bệnh phẩm máu toàn phần thu thập kỹ thuật phê duyệt, tránh gây vỡ hồng cầu
Mẫu huyết dùng cho xét nghiệm phải không bị vỡ hồng cầu Tránh sử dụng mẫu vỡ hồng cầu mẫu nhiễm mỡ, nhiên, mẫu không gây nhiễu xét nghiệm Tránh lặp lại bước làm đông rã đông mẫu huyết huyết tương làm giảm hoạt tính kháng thể