Phân lập và nuôi trồng giống nấm linh chi trong điều kiện bán tự nhiên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ HÀ MY Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ NUÔI TRỒNG GIỐNG NẤM LINH CHI TRONG ĐIỀU KIỆN BÁN TỰ NHIÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Lớp: K47-CNSH Khoa: CNSH-CNTP Khóa học: 2015-2019 Người hướng dẫn: ThS Vi Đại Lâm Thái Nguyên – năm 2020 i LỜI CẢM ƠN Lời em xin chân thành cảm ơn Ban Chủ Nhiệm khoa CNSHCNTP, toàn thể thầy cô giáo khoa CNSH-CNTP giảng dạy, hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm để em có kiến thức ngày hôm Mặc dù cố gắng thực đề tài để hoàn thành cách hoàn chỉnh Nhưng cá nhân em chưa đủ kinh nghiệm công tác nghiên cứu, hạn chế thời gian kiến thức chuyên môn nên tránh khỏi thiếu sót định mà thân chưa thấy Vì vậy, em mong nhận góp ý q thầy, giáo bạn sinh viên để khóa luận em hồn chỉnh Em xin chân thành cảm ơn ! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2020 Sinh viên Nguyễn Thị Hà My ii DANH MỤC HÌNH Hình 1: Thể nấm Linh chi Hình Ni cấy mơ thể nấm Linh chi mơi trường PDA 25 Hình Nuôi cấy hệ sợi tăm 26 Hình Ni cấy mô thể nấm Linh chi 26 Hình Sự phát triển sợi nấm Linh chi môi trường YEPD bổ sung muối 27 Hình Sản xuất meo nấm chất 29 Hình Đánh giá ảnh hưởng tỉ lệ mùn cưa phối trộn với chất thóc sản xuất meo nấm 30 Hình Sản xuất thể 31 Hình Bịch nấm khử trùng theo phương pháp Tyndall 32 Hình 10 Bịch nấm Linh chi cấy vị trí miệng túi 32 iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC HÌNH ii MỤC LỤC iii Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.3.1 Ý nghĩa khoa học đề tài 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan nấm linh chi 2.1.1 Phân loại 2.1.2 Đặc điểm sinh học 2.1.3 Công dụng nấm Linh chi 2.1.4 Cách phân lập giống nấm từ thể 11 2.1.5 Các nguồn cacbon, nito, vitamin 14 2.1.6 Các điều kiện thích hợp ni cấy nấm Linh chi 15 2.1.7 Các hình thức ni trồng 15 2.2 Tình hình nghiên cứu nấm giới nước 16 2.2.1 Tình hình nghiên cứu giới 16 2.2.2 Tình hình nghiên cứu nước 18 Phần ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1 Đối tượng nghiên cứu phạm vi nghiên cứu 20 3.2 Nội dung nghiên cứu 20 iv 3.3 Phương pháp nghiên cứu 20 3.3.1 Nội dung 1: Phân lập giống nấm Linh chi 20 3.3.2 Nội dung 2: Sản xuất meo nấm 22 3.3.3 Nội dung 3: Sản xuất thể nấm linh chi 23 Phần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1 Phân lập giống nấm Linh chi 25 4.2 Sản xuất meo nấm 28 4.3 Sản xuất thể nấm Linh chi 31 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 5.1 Kết luận 34 5.2 Kiến nghị 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Việt Nam nước có khí hậu nhiệt đới, nắng ẩm mưa nhiều, thuận lợi cho loài nấm phát triển Tùy vào loại nấm mà mục đích sử dụng khác nhau, sử dụng làm nấm ăn hay làm nấm dược liệu Nấm Linh Chi (Ganoderma lucidum) lồi dược liệu q có từ lâu đời Linh chi vị thuốc ghi tập sách “Thần nông thảo” viết cách khoảng 2000 năm Lý Thời Trân, tác giả “Bản thảo cương mục” tiếng giới, giới thiệu vị Linh chi với khoảng 2000 từ loại linh chi khác nhau: Thanh chi, Hồng chi, Hoàng chi, Bạch chi, Hắc chi Tử chi [1] Loài nấm q có khả nâng cao tính miễn dịch thể, có tác dụng định hệ thần kinh trung ương, hệ hô hấp, hệ tim mạch, hệ tiêu hóa, hệ tiết, giúp tăng tuổi thọ Ngồi cịn có tác dụng bệnh gan, cao huyết áp, suy nhược thần kinh, giảm bạch cầu Nấm Linh Chi hỗ trợ cho việc điều trị ung thư, thấp khớp, đau thận, đau dày, tiểu đường, đau nửa đầu [2] Giá thành nấm Linh chi cao dẫn tới việc nhiều người dân chưa có khả sử dụng loại nấm dược liệu có giá trị Đặc biệt người có thu nhập thấp bệnh nhân ung thư vốn cạn kiệt kinh tế chi phí tốn q trình điều trị bệnh Vì vậy, việc mở rộng quy mơ trồng nấm đơn giản hóa kỹ thuật để phố biến phương pháp nuôi trồng tới người dân việc làm cần thiết Hiện nấm Linh chi nuôi trồng với nhiều hình thức lán trại với bịch mùn cưa thân gỗ Gần nhiều nước giới phát triển hình thức ni trồng nấm Linh chi bán tự nhiên nhà lưới Các khối chất có sợi nấm Linh chi phát triển tốt vùi luống đất có bổ sung thành phần dinh dưỡng Hình thức ni cấy cho kích thước thể to hơn, sản phẩm nấm thu tương tự với sản phẩm nấm thu hái tự nhiên Tuy nhiên hình thức nuôi cấy chưa phổ biến Việt Nam Xuất phát từ giá trị dược liệu kinh tế nấm Linh chi nhu cầu thực tế xã hội, đề tài: “Phân lập nuôi trồng nấm Linh chi điều kiện bán tự nhiên” thực nhằm khai thác tiềm vốn có loại nấm dược liệu 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Nuôi trồng nấm Linh chi điều kiện ngồi trời, khơng sử dụng hệ thống lán trại Bước đầu xây dựng quần thể nấm Linh chi có tương tác với hệ sinh thái mơi trường, có giá trị cảnh quan dược liệu 1.2.2 Mục tiêu cụ thể - Phân lập giống nấm Linh chi - Nhân giống nấm sản xuất ngun liệu: Thóc, mùn cưa, tăm bơng - Sản xuất thể nấm Linh chi, sử dụng lớp đất che phủ 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.3.1 Ý nghĩa khoa học đề tài Đề tài phát triển quy trình ni trồng nấm Linh chi mới, dễ chăm sóc, dễ sử dụng, thân thiện với môi trường tự nhiên 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài - Nâng cao chất lượng sống cho người dân, giá trị dinh dưỡng từ nấm mang lại tốt cho sức khỏe người - Định hướng cho người dân hướng tới mơ hình ni trồng lớn hơn, đa dạng hơn, có ý nghĩa kinh tế - Phát triển thị trường cho loại giống nấm (hay meo nấm) thương mại, tăng thu nhập cho người sản xuất Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan nấm linh chi 2.1.1 Phân loại Nấm linh chi có tên khoa học: Ganoderma lucidum ((Leyss sx Fr.) Karst) (Hình 1) Hình 1: Thể nấm Linh chi Phân loại học: - Ngành: Eumycota - Lớp: Hymenomycetes - Bộ: Ganodermatales - Họ: Ganodermataceea - Chi: Ganoderma Linh chi vị thuốc ghi tập sách “Thần nông thảo” viết cách khoảng 2000 năm Lý Thời Trân, tác giả “Bản thảo cương mục” tiếng giới (Lần in năm 1595), giới thiệu vị Linh chi với khoảng 2000 từ loại Linh chi mang màu sắc tên khác nhau: Thanh chi (Linh chi màu xanh), hồng chi (màu hồng) cịn gọi xích chi, đơn chi, hồng chi (cịn gọi kim chi) màu vàng, bạch chi (con gọi ngọc chi) màu trắng, hắc chi (còn gọi huyền chi) màu đen, tử chi – Linh chi màu tím Tuy có ghi sách cổ người thấy, sử dụng, nên Linh chi từ lâu thuộc loại thuốc quí hiếm, có vua chúa, người giàu có để sử dụng [2] 2.1.2 Đặc điểm sinh học Về thực vật, người ta xác định nấm Linh chi loại cỏ, mà loại nấm hóa gỗ có cuống dài ngắn, mũ nấm có dạng hình thận, có dạng hình trịn hay hay quạt Cuống thường cắm khơng mũ nấm mà cắm lệch sang phía mũ Hình trụ trịn hay dẹt phân nhánh cuống cuống có màu khác tùy theo lồi, loài đỏ thay đổi từ nâm đến đỏ vàng, đỏ cam, mặt bóng lống đánh vecni, mặt mũ có vân đồng tâm Thụ tầng màu trằng ngà, già ngả màu nâu vàng, mang nhiều lỗ nhỏ li ti ống thụ tầng mang tử Bào tử lồi xích chi hình trứng, bao bọc lớp màng, màng ngồi nhẵn, khơng màu, màng màu gỉ sắt, lơc nảy mầm có hình gai nhọn Tồn nấm gồm sợi nấm khơng màu sáng, đường kính 1-3mm, có phân nhánh Cấu tạo sợi nấm Nấm Linh chi nấm ăn có cấu tạo chủ yếu hệ sợi nấm Các sợi nấm ăn có dạng ống trịn, đường kính khoảng 2-4 micromet Các ống có vách ngăn ngang Sợi nấm gọi khuẩn ty Hệ sợi nấm gọi khuẩn ty thể (mycelium) Khoảng cách hai vách ngăn ngang gọi tế bào Trong tế bào sợi nấm quan sát kính hiển vi quang học (phóng đại 10001500 lần) kính hiển vi điện tử thấy rõ bào quan Tế bào nấm có đặc trưng riêng, khác biệt với tế bào thực vật, động vật Trước hết thành phần thành tế bào Dưới kính hiển vi điện tử quan sát thấy thành tế bào cấu tạo nhiều lớp Nếu thành tế bào thực vật cấụ tạo chủ yếu xenluloza thành tế bào nhũng nhóm nấm khác lại cấu tạo thành phần khác Các nấm ăn nấm Linh chi có thành tế bào cấu tạo chủ yếu kitin-glucan Tế bào nấm khơng có đời sống độc lập sợi nấm tế bào có vách ngăn có lỗ thủng Ở số loại nấm nấm túi có lỗ vách ngăn, lỗ có đuờng kính khoảng 0,1-0,2 µm Ở nấm Linh chi hay nấm đảm nói chung, lỗ thơng vách ngăn có cấu tạo phức tạp - lỗ có gờ cao hai phía lỗ cịn có nắp đậy Trên nắp đậy có nhiều lỗ nhỏ với đường kính khoảng 0,09-0,18 µm Thơng qua lỗ vách ngăn nắp đậy vách ngăn, chất nguyên sinh di chuyển dễ dàng sợi nấm Ngay nhân tế bào có thắt nhỏ lại để chui qua lỗ này, sợi nấm trở thành ống sống Ở đầu sợi nấm, nơi thực trình tăng trưởng, chất nguyên sinh thường tập trung dày đặc Có cấp sợi nấm, sợi nấm cấp (sơ sinh), sợi nấm cấp hai (thứ sinh) sợi nấm cấp ba (tam sinh) Sợi nấm cấp lúc đầu khơng có vách ngăn có nhiều nhân, tạo vách ngăn phân thành tế bào đơn nhân sợi nấm Sợi nấm cấp hai tạo thành phối trộn hai sợi nấm cấp Khi nguyên sinh chất hai sợi nấm khác dấu trộn với (chất phối plasmogamy) Hai nhân đứng riêng rẽ làm cho tế bào có hai nhân Người ta gọi sợi nấm loại sợi nấm song nhân Sợi nấm cấp ba sợi nấm cấp hai phát triển thành Các sợi nấm liên kết lại chặt chẽ với tạo thành nấm (quả thể) [1], [2] Thể nấm Quả nấm hay thể (fruit body) quan sinh sản, tức quan sinh bào tử loại nấm bậc cao Đó phần thu hái để ăn loại nấm ăn, hay phần thu hái để làm dược liệu nấm Linh chi Quả nấm nấm đảm gọi đảm (basidiocarp) nấm nấm túi gọi túi (ascocarp) Tuỳ loại nấm mà nấm có hình thái cấu tạo, màu sắc, kích thước khơng giống Phần nấm mũ nấm (pileus, cap) Mũ 22 3.3.2 Nội dung 2: Sản xuất meo nấm Thí nghiệm 1: Đánh giá ảnh hưởng loại chất tới khả sinh trưởng nấm Linh chi Thí nghiệm tiến hành loại chất khác gồm hỗn hợp thóc CaCO3, hỗn hợp mùn cưa cám, hỗn hợp thóc mùn cưa Sản xuất meo nấm từ hỗn hợp thóc bột CaCO3: Cân lượng thóc cần dùng, đem rửa với nước để loại bỏ bụi bẩn hạt lép Ngâm thóc với nước khoảng 12 tiếng Cho thóc vào nồi tiến hành luộc đến vỏ hạt thóc nứt Vớt thóc để khơ 20 - 30 phút cho bay bớt hàm lượng nước Bổ sung 1% bột CaCO3, trộn cho vào túi nilon Hấp khử trùng 1210C áp suất 1atm Từ môi trường agar cấy mảnh thạch chứa sợi nấm vào túi thóc Ni cấy điều kiện ánh sáng, nhiệt độ phòng, theo dõi theo chu kỳ ngày Sản xuất meo nấm từ hỗn hợp mùn cưa cám: Lấy lượng mùn cưa đủ dùng, tưới nước để tạo độ ẩm Bổ sung 5% cám gạo, trộn cho vào túi nilon Hấp khử trùng 1210C áp suất 1atm Từ môi trường agar cấy mảnh thạch chứa sợi nấm vào túi thóc Ni cấy điều kiện ánh sáng, nhiệt độ phòng, theo dõi theo chu kỳ ngày Sản xuất meo nấm từ hỗn hợp thóc mùn cưa: Cân lượng thóc cần dùng, đem rửa với nước để loại bỏ bụi bẩn hạt lép Ngâm thóc với nước khoảng Cho thóc vào nồi tiến hành luộc đến vỏ hạt thóc nứt Vớt thóc để khơ 20 - 30 phút cho bay bớt hàm lượng nước Bổ sung 10% mùn cưa, trộn Cho hỗn hợp thóc mùn cưa vào túi nilon lượng vừa đủ, hấp khử trùng 1210C áp suất 1atm Từ môi trường agar cấy mảnh thạch chứa sợi nấm vào túi thóc Ni cấy điều kiện ánh sáng, nhiệt độ phòng, theo dõi theo chu kỳ ngày 23 Thí nghiệm 2: Đánh giá ảnh hưởng loại giống cấy Chuẩn bị hỗn hợp thóc bổ sung 10% mùn cưa, trộn đều, hấp khử trùng 1210C áp suất 1atm Sử dụng hai loại giống gồm giống nấm môi trường agar giống nấm mọc tăm cấy vào túi chất Ni cấy điều kiện ánh sáng, nhiệt độ phòng, theo dõi theo chu kỳ ngày Thí nghiệm 3: Đánh giá ảnh hưởng tỉ lệ mùn cưa phối trộn với chất thóc sản xuất meo nấm Cân lượng thóc cần dùng, đem rửa với nước để loại bỏ bụi bẩn hạt lép Ngâm thóc với nước khoảng Cho thóc vào nồi tiến hành luộc đến vỏ hạt thóc nứt Vớt thóc để khơ 20 - 30 phút cho bay bớt hàm lượng nước Bổ sung 0%, 5%, 10%, 15% 20% mùn cưa, trộn Cho hỗn hợp thóc mùn cưa vào túi nilon lượng vừa đủ, hấp khử trùng 1210C áp suất 1atm Hơ kẹp lửa đèn cồn, để nguội Từ môi trường nuôi cấy hệ sợi tăm bông, cấy tăm bơng vào mặt đối diện túi thóc Buộc miệng túi nuôi cấy điều kiện ánh sáng yếu 3.3.3 Nội dung 3: Sản xuất thể nấm Linh chi Thí nghiệm 1: Sản xuất thể nấm Linh chi sử dụng lớp đất che phủ Nguyên liệu sản xuất thể nghiên cứu mùn cưa thân gỗ keo Các đoạn gỗ keo đường kính khoảng 10 cm trở lên cắt thành đoạn ngắn khoảng 20-30 cm, ngâm nước 12 giờ, để nước, hấp khử trùng 1210C áp suất 1atm Cấy giống cấp với số lượng xấp xỉ 2-3 thìa giống/1 bịch nấm Ni cấy nhiệt độ phịng, khơng có ánh sáng Khi sợi nấm lan phủ kín chất, loại bỏ túi bóng, chuyển vào khay đất ẩm, có lỗ nước Phần đầu khối gỗ keo để hở lên mặt đất Ni cấy bóng cây, tưới nước đẫm không để bề mặt đất bị khô Với chất mùn cưa, phối trộn cám tỉ lệ 5%, hấp khử trùng 1210C áp suất 1atm Cấy giống cấp với số lượng xấp xỉ 2-3 thìa 24 giống/1 bịch nấm Những bịch mùn cưa có sợi nấm bao phủ tồn bề mặt chất, dùng dao rạch đường dài thân bịch Vùi xuống đất tưới đẫm nước thường xun hình thành thể nấm Thí nghiệm 2: Sản xuất thể nấm Linh chi sử dụng lớp đất trộn với mùn cưa che phủ Sử dụng bịch mùn cưa mà sợi nấm bao phủ toàn bề mặt, dùng dao rạch đường dài thân bịch Phối trộn đất với 10% mùn cưa, bịch nấm vùi xuống hỗn hợp tươi đẫm nước thường xuyên hình thành thể nấm Thí nghiệm 3: Thử nghiệm phương pháp khử trùng Tyndall Để tìm kiếm hình thức khử trùng bịch nấm thích hợp khối gỗ keo hấp khử trùng theo phương pháp Tyndall, cụ thể: Các khối gỗ keo có khích thước khoảng 20-30cm chiều dài, 15-30mm chiều rộng, ngâm nước qua đêm khử trùng 2-3 lần nhiệt độ 1000C Mỗi lần cách 24 Cấy giống nấm Linh chi chất thóc Theo dõi sinh trưởng phát triển sợi nấm Thí nghiệm 4: Thử nghiệm phương pháp cấy giống Các khối gỗ keo có kích thước khoảng 20-30cm chiều dài, 15-30mm chiều rộng, ngâm nước qua đêm khử trùng 2-3 lần nhiệt độ 1000C Mỗi lần cách 24 Cấy giống nấm chất thóc theo hai hình thức: Hình thức thứ nhất: Cấy cho giông nấm phân bố đầu bịch nấm Hình thức thứ hai: Cấy giống phần miệng túi Điều kiện nuôi cấy ánh sáng, nhiệt độ phòng Theo dõi thời gian sợi nấm lan phủ toàn chất 25 Phần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Phân lập giống nấm Linh chi 4.1.1 Đánh giá ảnh hưởng loại môi trường nuôi cấy khác tới khả phát triển mảnh mô thể nấm Linh chi Thí nghiệm tiến hành loại mơi trường khác gồm môi trường PDA (Potato dextrose agar), môi trường YEPD (Yeast extract peptone dextrose) môi trường PDA tăm bông, kết sau: Trên môi trường PDA, sau ngày ni cấy quan sát thấy sợi nấm mọc từ mảnh mơ (Hình 2) Sau 10 ngày nuôi cấy sợi nấm phủ kín bề mặt đĩa petri Sợi nấm có màu trắng đồng khơng lẫn mốc xanh, vàng, Hình Nuôi cấy mô thể nấm Linh chi môi trường PDA Trên chất tăm bông, mảnh mô thể nấm phát triển tốt, sau ngày nuôi cấy quan sát thấy sợi nấm mọc từ mảnh mô (hình 3A) Sau 10 ngày ni cấy sợi nấm bao phủ tồn khối tăm bơng (hình 3B) 26 A Sau ngày nuôi cấy B Sau 10 ngày ni cấy Hình Ni cấy hệ sợi tăm Trên môi trường YEPD, sau ngày nuôi cấy quan sát thấy sợi nấm mọc từ mảnh mô Sau 10 ngày nuôi cấy sợi nấm phủ kín bề mặt đĩa petri (Hình 4A 4B) Sợi nấm có màu trắng đồng khơng lẫn mốc xanh, vàng, A Sau ngày nuôi cấy B Sau 10 ngày ni cấy Hình Ni cấy mơ thể nấm Linh chi 4.1.2 Đánh giá ảnh hưởng nồng độ muối ăn (NaCl) tới khả phát triển mốc xanh môi trường phân lập nấm Linh chi Để đánh giá ảnh hưởng nồng độ NaCl tới sinh trưởng vi sinh vật lây nhiễm, điển hình phổ biến nấm mốc xanh, mẫu nấm mốc xanh thu nhận từ bịch nấm lây nhiễm cấy lên môi trường YEPD 27 bổ sung nồng độ NaCl 1%, 2%, 3%, 4%, 5% Kết cho thấy nồng độ NaCl 1%, 2%, 3%, 4%, nấm mốc xanh phát triển bình thường, khơng có dấu hiệu bị ức chế Trên môi trường YEPD bổ sung nồng độ NaCl 5% nấm mốc xanh có dấu hiệu phát triển chậm Điều cho thấy hạn chế phần lây nhiễm việc bổ sung thành phần có khả ức chế phát triển nấm hoang dại Tuy nhiên thành phần bổ sung cần đảm bảo không ức chế phát triển nấm Linh chi Các nồng độ NaCl cao tiếp tục thử nghiệm tương lai 4.1.3 Đánh giá ảnh hưởng nồng độ muối ăn (NaCl) tới khả phát triển sợi nấm Linh chi Để đánh giá ảnh hưởng nồng độ muối ăn (NaCl) tới khả phát triển sợi nấm Linh chi, giống nấm Linh chi nuôi cấy môi trường YEPD bổ sung nồng độ NaCl 1%, 2%, 3%, 4%, 5% Kết sau: Ở nồng độ NaCl 1% 2% sợi nấm phát triển tốt, sợi nấm mọc trắng Ở nồng độ NaCl 3%, 4% sợi nấm phát triển dần khơng phát triển nồng độ NaCl 5% (Hình 5) 3% 4% 5% Hình Sự phát triển sợi nấm Linh chi môi trường YEPD bổ sung NaCl 28 Từ kết cho thấy, nồng độ NaCl có ảnh hưởng tới sợi nấm Linh chi theo tỉ lệ định Trong môi trường nuôi cấy điều kiện thí nghiệm nồng độ NaCl khơng nên vượt 3% Khi sử dụng NaCl yếu tố nhằm hạn chế lây nhiễm bịch nấm Vị trí phun dung dịch NaCl nên tránh vị trí cấy giống để tránh ảnh hưởng tiêu cực tới phát triển meo nấm 4.2 Sản xuất meo nấm 4.2.1 Đánh giá ảnh hưởng loại chất tới khả sinh trưởng nấm Linh chi Thí nghiệm tiến hành loại chất khác gồm hỗn hợp thóc CaCO3, hỗn hợp mùn cưa cám, hỗn hợp thóc mùn cưa, kết sau: Trên chất thóc, phối trộn 1% CaCO3 theo công thức Nguyễn Lân Dũng cộng [2] Sau 3-4 ngày, sợi nấm phát triển từ mảnh mơ với màu sắc hình thái đặc trưng Tuy nhiên tới phần túi chất, tốc độ nấm phát triển chậm, xuất mùi chua thóc phần đáy túi có độ ẩm cao Các giọt nước đọng thành túi làm thóc bị nát, gây dính sợi nấm Tỉ lệ giống bị hỏng cao, lên tới 100% Điều trình chuẩn bị ngun liệu, thóc bị luộc q nát q trình phơi thóc chưa đạt độ ẩm thích hợp Việc yêu cầu kinh nghiệm tích lũy thời gian lâu dài Trên chất mùn cưa bổ sung 5% cám chất hỗn hợp thóc bổ sung 10% mùn cưa sau khoảng ngày nuôi cấy, sợi nấm phát triển mạnh từ mảnh mô Sợi nấm có màu trắng, mùi thơm nhẹ Sợi nấm mọc dày Không xuất màu bất thường màu mốc xanh, mốc vàng, mốc đen Trên chất mùn cưa bổ sung 5% cám, sợi nấm bao phủ khoảng 80% túi chất sau 40 ngày ni cấy (Hình 6A), tỉ lệ bịch thành công 100% Như thời gian sản xuất meo nấm theo phương pháp có tỉ lệ thành công cao, 29 nhiên thời gian sản xuất lâu dài Vì cần có phương pháp cải tiến thích hợp Với chất hỗn hợp thóc bổ sung 10% mùn cưa, sợi nấm mọc kín sau khoảng 25-30 ngày ni (Hình 6B) Kết phù hợp với phương pháp sản xuất meo giống Nguyễn Lân Dũng cộng Mùn cưa có khả hút ẩm, nhờ giảm thiểu nguy chua hỏng thóc nguyên liệu Phương pháp áp dụng cho người chưa có nhiều kinh nghiệm trình sản xuất meo giống Dù vậy, mùn cưa chứa chất dinh dưỡng, tỉ lệ mùn cưa cần tối ưu hóa để đảm bảo chất lượng giống nấm sản xuất tương lai A Sợi nấm phát triển hỗn hợp B Sợi nấm phát triển hỗn hợp mùn cưa, cám sau 40 ngày ni cấy thóc, mùn cưa sau 30 ngày ni cấy Hình Sản xuất meo nấm chất 4.2.2 Đánh giá ảnh hưởng loại giống cấy Để đánh giá ảnh hưởng loại giống cấy Hai loại giống gồm giống nấm môi trường agar giống nấm mọc tăm thử nghiệm Với giống cấy từ môi trường agar, sợi nấm lan phủ kín túi chất khoảng thời gian 25-30 ngày Trên túi chất cấy tăm bông, thời gian lan phủ kín sợi nấm khoảng 15 ngày Với giống tăm sợi nấm cấy dọc theo bịch nấm nhờ lan phủ bịch chất vị trí đáy túi 30 miệng túi Nhờ rút ngắn thời gian lan phủ chất Từ kết giống nấm cấy tăm sử dụng cho nghiên cứu 4.2.3 Đánh giá ảnh hưởng tỉ lệ mùn cưa phối trộn với chất thóc sản xuất meo nấm Để đánh giá ảnh hưởng tỉ lệ mùn cưa phối trộn với chất thóc sản xuất meo nấm Phối trộn thóc mùn cưa với tỉ lệ 0% 5%, 10%, 15% 20% Kết sau: Sau 2-4 ngày nuôi cấy, quan sát thấy sợi nấm bắt đầu mọc từ que tăm bơng (Hình 7A) Sợi nấm mọc lan kín bịch thóc 15 ngày ni cấy (Hình 7B) Sự phát triển sợi nấm Linh chi tỷ lệ cho kết không khác biệt thời gian lan phủ chất Vì vậy, để khai thác tốt nguồn dinh dưỡng thóc cho giống nấm đồng thời khai thác tốt vai trò hút ẩm mùn cưa, tỉ lệ mùn cưa 5% lựa chọn để sản xuất meo nấm với giống cấy tăm bơng, có chất thóc A Sau ngày ni cấy A Sau 15 ngày ni cấy Hình Đánh giá ảnh hưởng tỉ lệ mùn cưa phối trộn với chất thóc sản xuất meo nấm 31 4.3 Sản xuất thể nấm Linh chi Để sản xuất thể nấm Linh chi, bịch mùn cưa thân gỗ keo cấy giống nuôi cấy khay/túi đất ẩm Kết cho thấy sau khoảng 15 ngày, thể bịch mùn cưa nhú qua lớp đất mỏng (Hình 8A) Thể có hình dạng màu sắc đặc trưng nấm Linh chi, thể bịch mùn có kích thước nhỏ khối lượng chất thử nghiệm hạn chế (nhỏ 1kg) So sánh bịch nấm phủ đất với bịch nấm không phủ đất, thể bịch nấm có lớp đất phủ có thời gian tăng trưởng dài hơn, thể có kích thước lớn (Hình 8B) Với bịch nấm phủ hỗn hợp đất mùn cưa (Thí nghiệm 2), sau 3-4 tuần quan sát thấy mầm thể nhú lên lớp đất bao phủ Tuy nhiên thời gian có giới hạn nên chưa tạo thành thể hồn chỉnh Vì cần tiếp tục theo dõi đánh giá A Sản xuất thể B.Sản xuất thể bịch vùi xuống đất nấm phủ đất khơng phủ đất Hình Sản xuất thể Để tìm kiếm phương án khử trùng thích hợp đơn giản, phương pháp Tyndall thử nghiệm bịch mùn cưa gỗ keo Kết quả, sau tuần nuôi cấy không xuất giống nấm mốc xanh, mốc đen Sợi nấm phát triển tốt, che phủ 50% diện tích chất (Hình 9) 32 Hình Bịch nấm khử trùng theo phương pháp Tyndall Để thử nghiệm hình thức cấy thích hợp bịch nấm cấy theo hai hình thức: Cấy phía cấy phía khối chất Kết cho thấy bịch nấm cấy từ phía có thời gian lan phủ nhanh sau tuần nuôi cấy lan phủ phần lớp diện tích bề mặt chất (Hình 9) Trong bịch nấm cấy diện tích miệng túi có tốc độ lan phủ chất chậm Ở vị trí khơng có sợi nấm bao phủ, loại nấm mốc nhiễm xuất làm giảm chất lượng bịch nấm(Hình 10) Hình 10 Bịch nấm Linh chi cấy vị trí miệng túi 33 Những kết thử nghiệm cho thấy q trình ni trồng nấm ni trồng điều kiện thiết bị đơn giản với nhiệt độ khoảng 1000C Tuy nhiên cần kết hợp nhiêu kỹ thuật, phương pháp nuôi trồng phù hợp để có kết tốt 34 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Đã phân lập giống nấm Linh chi từ thể phương pháp nuôi cấy mảnh mô Đã nuôi cấy thành công giống nấm sau phân lập tăm bông, giúp giảm thời gian sản xuất meo nấm từ khoảng 25-30 ngày xuống khoảng 1415 ngày Đã sản xuất thành cơng meo nấm chất thóc phối trộn với mùn cưa chất mùn cưa phối trộn với cám Đã sản xuất thành công thể nấm Linh chi sử dụng lớp đất che phủ 5.2 Kiến nghị Tiếp tục tối ưu hóa quy trình nuôi cấy nấm Linh chi với lớp đất che phủ Đánh giá ảnh hưởng ức chế nồng độ muối tới phát triển sợi nấm mốc lây nhiễm bịch chất nấm Linh chi Tách chiết dược chất nấm Linh chi nuôi trồng bán tự nhiên so sánh với mẫu nấm thu nhận môi trường tự nhiên môi trường lán trại 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Tiếng Việt Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam Nhà xuất Y học Nguyễn Lân Dũng (2001), Công nghệ trồng nấm, Tập Nhà xuất Nông nghiệp Hà Nội Vi Đại Lâm, Nguyễn Xuân Vũ, Đinh Văn Thiện, Nguyễn Thị Trang, Vũ Đình Hợi, Bùi Thanh Ngọc (2018), Phân lập sản xuất thử nghiệm giống nấm da báo trường Đại học Nơng Lâm Thái Ngun, Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ ĐHTN, 180(04): 117 - 121 Tiếng Anh Ahmet Unlu, Erdinc Nayir, Onder Kirca, Mustafa Ozdogan (2016) Ganoderma Lucidum (Reishi Mushroom) and Cancer, J BUON, Jul-Aug, 21(4):792-798.] Chi H.J Kao, Amalini C Jesuthasan, Karen S Bishop, Marcus P Glucina, Lynnette R Ferguson (2013), Anticancer activities of Ganoderma lucidum: active ingredients and pathways, Functional Foods in Health and Disease; 3(2):48-65 Kent H McKnight ( 1987) Peterson field guides-Mushroom, Library of Congress cataloging in publication data Wong Shu Sing (2003), Red Reishi, World Health Publishing Inc 36 XÁC NHẬN ĐÃ SỬA CHỮA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG ………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………… Thái Nguyên ngày… tháng….năm… Người nhận xét phản biện Người hướng dẫn (chữ ký ghi rõ họ tên) chữ ký ghi rõ họ tên) ... Nội dung 1: Phân lập giống nấm Linh chi - Nội dung 2: Sản xuất meo nấm - Nội dung 3: Sản xuất thể nấm Linh chi 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Nội dung 1: Phân lập giống nấm Linh chi Thí nghiệm... lập nuôi trồng nấm Linh chi điều kiện bán tự nhiên? ?? thực nhằm khai thác tiềm vốn có loại nấm dược liệu 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Ni trồng nấm Linh chi điều kiện ngồi trời,... 1: Phân lập giống nấm Linh chi 20 3.3.2 Nội dung 2: Sản xuất meo nấm 22 3.3.3 Nội dung 3: Sản xuất thể nấm linh chi 23 Phần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1 Phân lập giống nấm