anthracis và Y, pestis có độc lực được bất hoạt, tách chiết DNA, rồi pha loãng nhiểu bậc trong nước khừ ion đề tạo các nồng độ DNA giảm dần, tìm độ loãng thấp nhất phát hiệ[r]
(1)NGHIÊN CỨU TẠO PANEL DNA DÙNG KIỀM ĐỊNH KIT PCR CHẨN ĐOÁN VI KHUẦN THAN VÀ DỊCH HẠCH
Trần Danh K hớ i1, TS Nguyễn Thái Sơn2, TS Lê Thu Hồng2 1 Trưởng Đại học Kỹ th u ậ t Y tế Hải Dương;
2 Học viện Quân y TÓM TẮT
Nghiên cứu tiến hành tạo panel DNA dùng kiểm định kít PCR đa mồi chẩn đoàn VI khuẩn than dịch hạch DNA tách chiết từ chửng than dịch hạch lưu giữ Học viện Quân y; chủng vi khuẩn E coli, B cereus đặt mua công ty Microbiologies (Mỹ), k ế t ‘tạo panel chứng Ơương DNA của than dịch hạch, panel DNA chứng âm với loài vi khuần gần mặt di truyền B cereus E coli để kiểm tra phản ứng chéo đảnh giá độ đặc hiệu cùa phản ứng Ngưỡng phất cửa phẩn ứng xác định mức 92fg/ụl với DNA từ vi khuẩn than; 131fg/ụl với DNA từ VI khuẩn dịch hạch Độ nhậy kít khi kiểm định đạt 100% với cặp gen đích vrrÁ, pagA, capA vi khuẩn than ypo2088, plã, cafa cùa vi khuần dịch hạch Độ đặc hiệu kít kiểm định đạt 100% với cặp gen đích pagA, capA vi khuẩn than ypo2088, pla, cafa vi khuẩn dịch hạch, riêng cặp gen vrrA vi khuẩn than bắt dương tính 100% với nhiễm sắc thể B.cereus.
Từ khóa: Panel DNA, Bacillus anthracis, Yersinia pestis, multiplex PCR. SUMMARY
RESEARCH AND CREATE DNA PANELS EXAMINING THE QUANLITY OF PCR KITS FOR BACILLUS ANTHRACIS AND YERSINIA PESTIS DIAGNOSTICS
This study was conducted to create DNA panels fo r examining the quality o f PCR-based for Bacillus anthracis and Yersinis pestis diagnostics DNA was extracted from B anthracis and Y pestis, which were kept at the Military Medical University Echerichia coii and Bacillus cereus were obtained from Microbiologics inc (USA) This study has created the DNA positive control panels for B anthracis and Y pestis A negative control DNA panel was created from B cereus and E coll, the two closely related bacteria to B anthracis and Y pestis to check for cross-reactivity in assessing the specificity o f PCR diagnosis B anthracis and Y pestis The results revealed that the lowest detectable levẹl o f the reaction was 92fg/l with DNA from B anthracis and 131fg/l with DNA from Y pestis The sensitivity o f the tested kits was 100% with targeted genes (vrrA, pagA, capA fo r B anthracis and ypo2088, pla, cafA fo r Ỵ pestis) Five targeted genes (pagA, capA forB anthracis and ypo2088, pla, cafA for Y pestis) showed specificity o f 100% fo r B.cereus chromosomes, except the targeted gene vrrA showed specificity
o f 100% fo r chromosome DNA o f B anthracis.
Keyw ords: Panel DNA, Bacillus anthracis, Yersinia pestis, multiplex PCR.
ĐẶT VẮN ĐỀ chần đoán tác nhân B anthracis, Y pestis
Việc ứng dụng công nghệ sinh học phân tử vào ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u chẩn đoán mầm bệnh la xu hướng phồ biến Chủng v i khuẩn nghiên cứu
trên giới Với vi khuẩn nguy hiểm, nguy Các chủng Bacillus anthracis Yersina pestis khủng bố B anthracis Y pestis việc ứng dụng iưu giữ Học viện Quân y xác định có sinh học phân ìử kít PCR, multiplex PCR đủ plasmid chứa gen độc chủng vi khuẩn chẩn đoán để đáp ứng kịp thời nhu cầu thực đối chứng (Echerlchia colí7 Bacillus cereus) đặt tiễn vấn đề thời sự, quan trọng [2,3] Một số mua từ cong ty Microbiologies (Mỹ),
sở nghiên cửu phát triển kit PCR, Chủng B anthracis B cereus nuôi cấy multiplex PCR chẩn đoán B anthracis Y pestis Để xác định card api 50CH BioMérieux thử đảm bảo chất lượng, kít phải kiểm định nghiệm độc ỉực động vật (chuột nhắt trắng), sau với tiêu chí quan trọng là: độ nhạy, độ đặc hiệu đỏ sử dụng kỹ thuật nhân gen PCR xác đỉnh mang độ ổn định [4,6] Mẫu chuẩn dùng kiểm định có gen đích VrrẦ chromosome, gen độc iực pagA, thể ỉim danh mục WHO NIBSC capA plasmid pOX1, pOX2Ĩ
(National Institute for Biological Standards and Chủng E coli ATCC 25922 nuôi cấy xác Control) Tuy nhiên B anthracis Y pestis vi định card Api 32E BioMérieux Chùng Y pesíis khuẩn nguy hiểm khơng có sẵn nên nhóm nghiên ni cấy xác định card GN46 Vitek -cứu phải tiến hành tạo mẫu chuẩn theo hướng dẫn BioMérieux, sau sử dụng kỹ thuật nhân gen PCR WHO quy chuẩn quốc gia thực hành an tồn xác định mang gen đích ypo2088 trên sinh học phịng thí nghiệm [1] Xuất phát từ chromosome, gen độc lực pla, cafa plasmid yêu cầu trên, tiến hành đề tài độc vi khuẫn
(2)mã sổ 2013.75.58
3 Phương pháp tạo panel mẫu đánh giá độ nhậy đặc hiệu kit PCR
Tiến hành tạo paneị mẫu chuẩn theo hướng dẫn WHO NIBSC [7, 8] phương pháp thực nghiệm íabo có đối chửng với bước cụ thể sau:
- Tách chiểt DNA từ chủng vi khuẫn nghiên cứu theo quy trinh
- Định lượng, đo độ tinh cùa DNA máy Nano-òrop
- Tạo pane! ngưỡng phát hiện: chủng B anthracis Y, pestis có độc lực bất hoạt, tách chiết DNA, pha loãng nhiểu bậc nước khừ ion đề tạo nồng độ DNA giảm dần, tìm độ lỗng thấp phát kit mPCR
- Tạo panel độ nhạy: Panel độ nhạy thiết kế gồm panel độ nhạy với B Anthracis panel độ nhạy với Y pestis Trong nghiên cứu này, pane! thiết kế gồm 100 mẫu thành 10 hàng, hàng chứa 10 mẫu DNA tách chiết tinh Nồng độ DNA hàng {đánh giá độ ỉặp), hàng cỏ nồng độ tháp ngưởng phát hiẹn
- Tạo panel độ đặc hiệu: Chủng vi khuẩn B cereus (làm mẫu kiểm tra phản ứng chéo với B anthracis) E coli (làm mẫu kiểm íra phản ứng chéo với Y pestis) thực theo cách tương tự
Đánh giá độ nhậy đặc hiệu kit thử nghiệm theo nguyên tắc sau:
Kít PCR thử nghiệm
Panel mẫu*
(+) (-)
Kết (+) Dương tính thật a Dương tính giả b Kếí (-) Âm íính già c Ầm tính thật d (‘ Panel mâu bao gồm panel độ nhậy^ + paneĩ độ đặc hiệu)
a đ
Se = — T— x 100% Sp = ——— X 0 %
a + c K b + d
Đ ộ n h y Đ ộ đ ặ c h iệ u
4 Cốc kỹ thuật cụ thể
Tách chiet DMA: B anthracis Y pestis thu hoạch với nồng độ đạt 106vk/ml Bất hoạt nhiệt ướt 1210C/15 phút, nuôi cấy kiểm tra để đảm bảo kề bào tử bị tiêu diệt [5] Huyền dịch vi khuần tách chiết thường auy cùa kft QIAamp DNA mini kit, DMA tách chiểt điỵ ợ c kịể»T> tra riÁnn độ \/A độ tinh bảo quản -2 °c Tồn quy trình thực phịng an toàn sinh học cùa Trung tâm Nghiên cứu ửng dụng Sinh - Y - Dược học, Học viện Quân y
Tạo panel DNA ngưỡng phát hiện: DNA cùa B anthracis, Y pestis, đo nồng độ DNA, pha loãng dần nước khử ion để tạo nồng đô DNA giảm dần
Tạo panei DNA độ nhạy: thiết kế gồm panel riêng biệt: pane! với B anthracis, Y pestis Panel thiết kế gồm 100 mẫu xắp thành 10x10 mẫu DNA tách chiết vả tinh Nồng độ DNA hàng có giá trị (nhằm đánh giá độ lặp) Hàng cuối có nồng độ thấp có gíá trị đủng bang ngưỡng phát Ị7, 8]
Tạo panel DNA độ đặc hiệu: Chủng vỉ khuẩn B cereus (kiểm íra phản ứng chéo với B anthracis) E coli (kiểm tra phan ứng chéo với Y pestis) DNA chủng tách tinh sạch; nồng độ DNA có giá trị cao ngưỡng phát kít thử nghiệm
Kiểm định ngưỡng phát hiện: PCR toàn mẫu thử panel ngưỡng phát hiện, xác định nồng độ DNA thấp mà kết quà kít PCR cịn xác định gen đặc trưng B anthracis Y Pestis/kểt đương tính rõ
Kiểm định độ nhậy: Tiến hành PCR với DNA B anthracis Y pestis (100 mẫu) paneí độ nhậy, lập bảng tính kết [4, 6]
Kiềm định độ đặc hiệu: Tiến hành PCR với DNA B, cereuss É coli (100 mẫu) pane! độ ổặc hiệu, lập bảng tính kết [4 ,6]
KẾT QUẢ NGHIÊN cứu VÀ BÀN LUẬN
1 Kết tạo panel DNA cho kiểm định kit chẩn đoán B anthracis Y pesỉis
Két quà tạo panel DNA xác định ngừỡng phát B anthracỉs
Pha loãng' DNA từ mẫu B1 (24ng/jjl) đến B60 (0,00Ĩ038ng/MÌ)
stt Mã số gốc Mã sổ panel Nông độ ng/ụl Mã số gốc Mã số panel Nòng độ ng/ụl Mã số gốc Mã số pane! Nồng độ ng/ụl
BA1 B1 24 BB1 B2 21.6 BC1 B3 19.44
BA2 B4 12 BB2 B5 10.8 BC2 B6 9.72
BA3 B7 6 BB3 B8 5.4 BC3 B9 4.86
BA19 B55 0.000092 BB19 B56 0.000083 BB19 B57 0.000074
(3)Mầu có nồng độ DNA thấp cịn cho khả phát B55 Tiếp tục tiến hành kiểm tra tân với mẫu B55 B56 (hỉnh 2) Mau B56 cho băng 751bpmờ
Tiến hành kiểm tra thêm lần với với mẫu B54 có nồng độ DNA cao
(-) Mk ổ 10
Hình Ảnh chụp điện di mẫu - mẫu B55 mẫu 10 B54
Tiến hành lạo panel DNA ngưỡng bao gồm 10 hàng, hàng 10 mẫu nồng độ 92fg/|jl
Panel DNA xác định ngưỡng phát Y pesíis
Bảng Pha loãng DNA tách chiét từ Y pestis
A ÂSÍ _ Ẳ ^ ỉ ũ ft I „ i ' Ị T” T
stĩ Mã số gốc
Mã số
panel Nồng độ ng/jji Mã số Gốc
Mã số panel
Nòng độ nq/pl
Mã số gốc
Mã số panel
Nồng độ ng/ụl
YA1 Y1 21,25 YB1 Y2 19,125 YC1 Y3 17,2125
YA2 Y4 10,625 YB2 Y5 9,5625 YC2 Y6 8,60625
YA3 Y7 5,3125 VB3 Y8 4,78125 YC3 Y9 4,303125
YA20 Y58 0,000042 YB20 Y59 0,000037 YC20 Y60 0,000033
(-) BỔO B Ỉ9 B58 Mfi B5? B5Ố B55 B54 B53 BS2 B51
7M
2Ì Ĩ
Hình Ành chụp điện dỉ xác định ngưỡng phát B anthracis (mẫu 51 *60)
<■> Mk ố ỳ 10
_ỉđ/.l 212 t f , m 4
Hình Ánh chụp điện tii mẫu - íà B56 mẫu ~ 10 B55 (DNA B anthracis)
Nồng độ DNA Y pesíis có dải nồng độ DNA từ Y1 (21,25ng/|ji) đến Y60 (0,000033ng/MÍ) PCR kiểm ỉra Y60-Y51 xác định ngưỡng phát
Hình Ảnh chụp điện di ngưỡng phát Y pestis (Y60 Y51)
C-) 5 llií fi 7 8 9 10 ' tiýuA, rt/VMV
Vi/fK'.-■ -, OV'"V "V V■ : ^ ■ ■ ' rịSặ' fewfe ■' : HMTf
Vo' -hmW ẠMÀạ «N«pR'«mìm ?nbp„<afl ';VẳíwỀ ' ' ■àéĩiỳ^Ị .Sp*s6^“éi-ịý 1Ữ3&9 tprtow
Hình Ảnh chụp điện di mẫu 1-5 lả Y55 mẫu - Y54
Mẫu có nồng độ DNA thấp cho khả phát Y54 Tiếp tục tiến hành kiểm tra lần với mẫu Y54 Y55 (hình 5) Mầu Y55 khơng cho phát đầy đủ gen đặc trưng cùa Y pestis Tiến hành kiềm tra thêm lần với mẫu Y54 lần với mẫu Y53, kết thể (hình 6) đây:
Hình Ảnh chụp điện di mẫu 1-5 ià Y54 mẫu “ 10 mẫu Y53
(4)Panel DNA kiểm định độ nhạy với B anthracis
Mau BN1 BN2 BN3 BN4 BN5 BN6 BN7 BN8 BN9 BN10
o m 732 659 593 366 330 296 183 165 148 92
Mâu gốc B40 B41 B42 B43 B44 B45 B46 B47 B48 B49
Panel DNA kiểm định độ nhạy với Y pestis
Mầu YN1 YN2 YN3 YN4 YN5 YN6 YN7 YN8 YN9 YN10
( W ) 1051 648 584 525 324 292 263 162 146 131
Mau qốc Y39 Y40 Y41 Y42 Y43 Y44 Y45 Y46 Y47 Y48
Mỗi nồng độ tạo 10 ống X 10 nồng độ = 100 mẫu cho panel kiếm định độ nhạy
Panel DNA độ đặc hiệu đối vói B anthracis
DNA B ceréus, loài gần mặt truyền chọn làm pane! DNA độ đặc hiệu đế kiềm định phan ứng chéo Ổổỉ VỚI B anthracis DNA B cereus pha loãng tạo thành 10 ống X 10 nồng độ = 100 ống tub cho panel kiểm định độ đặc hiệu theo nguyên lý
Panel DNA kiềm định độ đặc hiệu Y pestis
DNA E coli, loài gần mặt di truyền rấí phổ biển ngồi môi trường chọn làm panel DNA độ đặc hiệu để kiểm định phan ứng chéo Y pestis DNA E c o li pha loãng tạo thành 10 ống X 10 nồng độ = 100 tub cho panei kiềm định độ đặc hiệu theọ nguyên lý
2 Kết qua sử dụng panel DMA kiềm định kỉt PCR đa mồi xác định nhanh đồng thời vi khuẩn than dịch hạch cửa đê tài cấp Bộ QP, mã sổ 2013.75.58
2.1 Kết kiểm định độ nhạy cùa kít
mPCR đối với' B anthracis
Tiến hành kiểm tra khả phát B anthracis kít PCR 100 mẫu cua panel độ nhạy với B anthracis bảng ổây:
Bảng Kiểm định độ nhạy kít PCR với B anthracỉs trẽn panel
Kít mPCR BaYp
Panel DNA độ nhạy chấn đoán B anthracis
Gene vrrA Gene capA Gene pagA {+) Í-) (+> (-) (+) í-ì
Kễt 100 0 100 0 100
Tống số 100 100 100
Tỷ lệ 100% I 0% 100% I 0% 100% I 0% gen đặc trưng B anthracis
1» ì ĩ 12 u 15 16 n JK
_ - _ _ _ _ _ _
I I W O ^ W — — Ị—— — — — — — — «
ÌIV 20 i l ỉ ỉ Ì A S5 M k <-) J« X
T T T <r T t T ""*— r T
2« 29 Jl> 31 i l » * .15 J6 2 k p
212 bp
Hình Kiểm tra mPCR panel độ nhạy với vỉ khuẩn B anthracis ỉrên gei agarose 1,2%
2.2 Kết kiểm định độ nhạy kít mPCR đối vơi Y pestis
Tiến hành PCR kiểm tra khả phát Y pestis cùa kít mPCR 100 mẫu panel độ nhạy với Y pestis bảng đây:
Bảng Kiểm định độ nhạy kít PCR với Y pestis panel
Panel DNA độ nhạy chân đốn Y pestis Kít PCR BaYp Gene /po Gene pla Gene caf1 (+) Í-) (+) I (-> (+) (-)
Kết 100 100 I 100 0
Tống số 100 100 100
Tỳ lệ 100% 0% 100% ị 0% 100% 0% gen đặc trưng độc lực Y pestis
2.3 Kết kiểm định độ đặc hiệu cùa kít
mPCR đối vói B anthracis
Tiến hành kiểm tra độ đặc hiệu kít mPCR 100 mẫu panel độ đặc hiệu tạo từ vi khuẩn Bacillus cereus có cấu trúc gần lồi với B anthracis Kết 100% mẫu không xuất gen đặc trưng capA, pagA B anthracis 100% mẫu cho dương tính với gen vrrA Điều chứng tỏ mổi di truyền rát gần loài B anthracis B cereus
Bảng Kiểm định độ đặc hiệu kít PCR với B anthracis panel
Kít mPCR BaYp
Panel DNA độ đặc hiệu chấn đoán B anỉhracis
Gene vrrA Gene capA Gene pagA (+ì (-) (+) (-) (+> (-)
Kết 100 0 0 100 0 100
Tỷ lệ 100% 0% 0% 100% 0% 100%
Hình Kiểm định độ đặc hiệu với B anthracis kít mPCR-BaYp ỉrên panel đặc hiệu
(5)chúng tơi nhận thấy cho dương tính với cặp mồi phát gen vrrA mà khơng có xuất cùa gen độc iực plasmid (của B anthracis) thi có íhể khẳng đính trịng mẫu thử nghiệm có mặt nhóm vi khuan Bacillus spp, khơng thề khẳng định vi khuẩn than (gây bệnh than - Anthrax) Ket minh chứng cho yêu cầu phải kiềm định panel mau với tất kit thương mại trước đưa thị trường yêu cầu WHO NIBSC [7, 8]
2.4 Kết kiểm định độ đặc hiệu cùa kít
mPCR Y pestis
Tiến hành kiểm tra độ đặc hiệu kít BaYp - mPCR 100 mẫu panel độ đặc hiệu với Y pesíỉs tạo íừ vỉ khuẩn E coli ATCC 25922 có cấu trúc gần lồi với Y pestis Kết 100% mẫu không xuất gen đặc trưng Y pestis
' 2 s 6 8 0 10 M
Hình Kiềm định độ đặc hiệu với Y pestis cùa kít mPCR-BaYp panel đặc hiệu
Kết kiểm định cho thấy cặp mồi chẩn đốn Y pestis khơng bắt cặp chéo với gen vi khuẩn E coii Vi khuẩn E coỉi Y pestis vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae, trực khuẩn gram âm có nhiều tính chất tương đồng, E cl lại có mặt rộng rãi mơi trường đất, nước thể người động vật Giả định đặt ỉổ chức khủng bố chuyển thông tin di truyền iừ Y pestis sang loài vỉ khuẩn khác gần gũi với người (như E coli) thỉ hậu lây nhiễm khó lường Trong hồn cảnh đó, giá trị panel mẫu nhóm thiết kế chế tạo kiểm định nghiên cứu với kit mPCR đa mồi cho phép phân biệt chùng Y pestis thật hay chùng E
coli tích hợp thêm gen độc lưc KẾT LUẬN
Đã chế tạo panel DNA kiểm định ngưỡng phát hiện, độ nhậy độ đặc hiệu kít PCR
chẩn đoán V! khuẳn than dịch hạch.
Để khẳng định ià lồi B anthracis có độc lực kít PCR phải dương tính đồng thời gen chromosome (vrrA) hai gen độc lực capA, pagA
Đề khẳng định Y pestis cồ độc lực cac kit PCR phải ch? dương tính đồng thời gen chromosome (ypo2088) hai gen độc íực pla, caf1
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Bộ Y tế (2012), "Ban hành quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia thực hành An toàn sinh học phịng xét nghiệm" Thơng tư 25/2012 - BYT
2 Nguyễn Thái Sơn (2006), "Chẩn đoán số tác nhân sinh học nguy cao tráng khủng bố" Hội íhảo nghiên cứu phòng chống vũ hạt nhân, sinh học, hỏahọc(NBÒ) Tr: 127-136
3 Nguyễn Thái Sơn (2015), “Nghiên cứu chế tạo kit PCR đa mồi xác định nhanh đồng thời hai tác nhân vi khuẩn than dịch hạch” Báo cáo tổng kết nhiệm vụ cấp Bộ quốc phong Mã sổ: 2013.75.58
4 Abdul G L and Anthony M c (2008), "Clinical tests: sensitivity and specificity Continuing Education in Anaesthesia, Critical Care & Pain j Volume 8 Number 6 2008
5 Fasanelia, A., s Losito, R Adone, et (2003), "PCR assay to detect Bacillus anthracis spores in heat- treated specimens" J Clin Microbiol 41(2): p 896-9
e Jekel J et al (2011), "Sensitivity, specificity, Predictive Values and Likelihood Ratios” J Clinical Epidemiology 2011.1228: p 37 -54
7 NIBSC (2014) Genetic Reference materials in the diagnostics National Institute for Biological Standards and Control, Biological Reference Materials
8 World Health Organization (2004) Recommendations for the preparation, characterization and establishment of international and other biological reference standards WHO Technical Report Series No 932
TÌNH TRẠNG NHIỄM HUMAN PAPILLOMAVIRUS TRÊN MỘT SỐ LOẠI UNG THƯ SINH DỤC
Phạm Thị Tâm (Thạc sĩ, Bộ môn Vi sinh Trường Đại học Y dược HảĩPhòng)
Ts Nguyễn Hùng Cường (Bộ môn Vi sinh, Trường Đ ại học Y dược Hải Phòng)
PGS.TS Phạm Văn Hán (Bộ môn Y tế công cộng, Trường Đ ại học Y ơuiỵc Hải Phòng)
d s Hiroshi Ichimura (khoa Y, Đại học Kanazawa Nhật Bản)
GS.TS Phạm VãQ Thức
(Bộ môn Sinh Ịý bệnh- Dị ứng-Miễn dịch, Ttrường Đại học Y dược Hải Phịng)
TĨM TẮT