Sàng lọc các cây thuốc Việt Nam có tác dụng ức chế Xanthin Oxidase in vitro

Khai thác nguồn tài nguyên sinh học từ dược liệu được sử dụng theo kinh nghiệm và sàng lọc tác dụng dược lý của dịch chiết từ các dược liệu này là hướng tiếp cận phát hiện và phát triển [r]

SÀNG LỌC CÁC CÂY THUỐC VIỆT NAM

CÓ TÁC D NG ỨC CHÉ XANTHTN OXIDASE IN VITRO

s v Nguyễn Thị Thu Hoài*; s v Trần Thị Bích Ngọc* ThS H ồng Thị Thanh Thảo*; DS Phạm Đức Vịnh* H ướng đẫn: TS Nguyễn Thùy Dư ng*

TÓM T T

Một đích tác dụng dược iý quan trọng thuốc điều trị gout ià xanthin oxidase, enzym then chốt đường tạo acid uric T m kiểm dược liệu có hiệu q tác dụng phụ từ liệu hướng tiếp cận phát ĩriển thuôc Tuy nhiên, Việt Nam, nghiên cứu theo hướng hạn chế

Mục tiêu nghiên cứu: Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro đĩa ƯV 96 giếng Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro đĩa u v 96 giếng mẫu sàng lọc

Đối tượng phương pháp nghiên cứu:

91 dịch chiết cao toàn phần 91 mẫu dược liệu, thuốc tỉnh miền Bắc miền Trung Việt Nam, có thơng tin tác dụng chống viêm, chống oxy hóa, ức ché xanthin oxidase, hạ acid uric, điều trị bệnh xương khớp Phương phảp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase đĩa u v 96 giếng đáy phẳng Costar 3635 (Corning) triển khai theo Noro Nguyễn Thị Thanh Mai, điều chỉnh cho phù họp vói điều kiện nghiên cứu

Kết nghiên cứu:

Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xaníhin oxidase in vitro đĩa ƯV 96 giếng với hoạt độ xanthin oxidase ưu 0,01 u/ml, thời điểm dừng phản ứng sau 30 phút, Km= 8,6 (7,6 ­ 10,2) ịiM; ICso allopurinol 0,15 (0,14­0,17) Mg/ml

Sàng lọc tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro 91 mẫu thực vật, liệu: Tại nồng độ 100 {ig/ml có 68 mẫu (74,7%) thừ thể lác đụng ức chế xanthin oxidase, 11 mẫu (12,1%) ức chế 50% Tại nồng độ 50 ịig/ml, có 38 mẫu thử (41,8%) ứ»ể tác dụng ức chế xanthin oxiđase, mẫu (2,2%) ức chế 50% Tại nồng độ to Hg/ml, 11 mẫu (12,1%) có tác đụng ức chế xanthin oxidase Đã xác định IC50của dược liệu tiềm Smiỉax p rfoliata Lour (thu hái vườn quốc gia Bạch Mã), Clinacanthus nutans (thu hái Sa Pa­Lào Cai), Homalom na occulta Lour schott (thu hái Ba V ­ Hà Nội), Archid nđron cỉy aria (Jack.), X.Niels (thu hái Quảng Trị) Mâu có khả ức chế xanthin oxidase in vitro mạnh Mán đ a (Archid ndron cly aria (Jack.), I Niels) với ĨC50là 15,6 Mg/ml

Kết luận:

Nghiên cứu tiến hành sàng lọc thuốc Việt Nam có tác dụng ức chể enzym xaníhin oxidase Kết cho thấy sổ thuốc, dược liệu có tiềm điều trị tăng acid uric máu điều trị bệnh gout, từ giứp cung cấp thêm chứng khoa học tiềm nguyên liệu sinh học Việt Nam, định hướng phát triển dược liệu hợp chất phân lập từ dược liệu thành íhuốc điều trị bệnh gout

*Từ khóa: Xanthin oxiđase; Tác đụng ức chể; Cây thuốc Việt Nam

Xanthine oxidase ỉnhibừory activity o f Vietnamese medicinal plants in vitro

Summary

Xanthine oxidase is the key enzym in biosynthesis pathway of acid uric, serves as an important pharmacological target for drugs used in management of gout Therefore, the search for nouvel xanthine oxidase inhibitors from alternative resources such as medicinal plants would be beneficial to combat gout In the word,there are many medicinal plants were screened through in vitro xanthine oxidase inhibitory activity However, in Vietnam, researches following this direction are still limited

Objectives:

“ Deploy assay of xanthine oxidase activity by using 96­well ƯV Microplate Costar 3635 (Corning) and Epoch Microplate Spectrophotometer (Biotek)

­ Identify in vitro x o inhibitory effects of extracts prepared from selected medicinal plants

Materials and methods:

Vietnamese medicinal plants used in this study were collected at the Northen anh Central provinces in Vietnam 91 extracts were prepared from 91 selected medicinal used in Vietnamese traditional medicine to treat gout and related symptoms as anti­inflammatory, antioxidant activities The x o inhibitory activity was assayed spectrophotometrically under aerobic conditions, based on the procedure reported by Noro t al and Mai Thanh Thi Nguyen with modification by using 96­well u v Microplate Costar 3635 (Coming)

Results:

Kinetic studies were done under our assay conditions with enzyme solution 0.01units/ml in 70mM phosphate buffer, pH 7.5, the assay mixture was incubated for 30 and the reaction was stopped by adding IN HCi The results are shown as Lineweaver­Burk plots and indicated Km for x o enzym = 8.6 (7.6­10.2) fiM

At 100 pg/ml, 68 of the extracts (74.7%) were demonstrated xanthine oxidase inhibitory activity, with 11 (12.1%) having greater than 50% inhibition At 50 Hg/ml, 38 (41.8%) of the extracts were active, with (2.2%) possessing more than 50% inhibition At 10 Hg/ml, 11 (12.1%) extracts exhibited inhibitory activity The MeOH extracts of Smilax p rfoliata Lour, (collected at Bach Ma National Park), Clinacanthus nutans (collected in Lao Cai province), Homalom na occulta Lour Schott (collected in Ha Noi), Archid ndron cly aria (Jack.), X Nieỉs (collected in Quang Tri

province) presented xanthin oxidase inhibitory activity with IC50 values less than 60 Jjg/ml The most active extract

was tghe MeOH extract of Archid ndron cly aria with an IC50 value of 15.6 pg/ml Conclusion:

We have carried out a systematic investigation of Vietnamese medicinal plants for x o inhibitory activity.The results indicate a number of medicinal plants that might be useful for the treatment of hyperuricemia and gout, providing more scientific evidences on potential of Vietnamese biological resources and to develop medicinal plants and bioactive compounds extracted from as alternative agents for treating gout

* Key words: Xanthin oxidase; Inhibitory activity; Medicinal plants I.Đ Ặ TV Ấ N Đ Ẻ

Một đích tác dụng dược lý quan trọng thuốc điều trị gout xanthin oxidase, enzym then chốt đường tạo acid uric Khai thác nguồn tài nguyên sinh học từ dược liệu sử dụng theo kinh nghiệm sàng lọc tác dụng dược lý dịch chiết từ dược liệu hướng tiếp cận phát phát triển thuốc phục vụ điều trị [6], Liên quan đến tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro, nhiều nghiên cứu sàng lọc từ nguồn dược liệu chất/nhóm họp chất phân lập từ dược liệu thực nhà khoa học giới [3, 5,93 Tuy nhiên, Việt Nam, nghiên cứu theo hướng cịn hạn chế Hiện có nghiên cửu Nguyễn Thị Thanh M c s , sàng lọc tác đụng ức chế xanthin oxidase in vitro 96 dược liệu thu hái từ tỉnh miền Nam Trang miền Nam (Phú Yên, Khánh Hòa, Lâm Đồng An Giang) [7] Việc nghiên cứu sàng lọc quy mô lớn để t m kiếm, phát dược liệu có hiệu hạ acid uric tốt cần thiết V vậy, nghiên cứu thực nhằm mục tiêu: Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro áp đụng để sàng lọc tác dạng cửa thực vật, liệu thu hải bắc Trung miền Bắc Việt Nam

n NGUYÊN VẬT LIỆU,ĐÓI TƯỢNG VÀPHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1 Dược liệu nghiên cứu

Các thuốc ỉựa chọn đưa vào nghiên cứu dựa kết rà sốt thơng tin tác dụng chống viêm, chống oxy hóa, ức chế xanthin oxidase, hạ acid uric, điều ữị bệnh xương khớp mẫu thực vật, dược Liệu từ nguồn sau:

­ Các thuốc đồng bào dân tộc Pako, Vân Kiều Quảng Trị dùng để phòng chữa bệnh liên quan đến tác dụng chống oxy hoá Các mẫu nghiên cứu PGS TS Ninh Khắc Bản, ThS Nguyễn Thế Cường ­ Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật ­ Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam xác định tên khoa học Mau tiêu lưu giữ Khoa Dược ­ ĐH Y Dược Huế

Chuẩn bị mẫu nghiên cứu : Các mẫu cấy sau xử lý chiết xuất methanol 100%, cất thu hồi dung mơi, sấy chân khơng, thu cao tồn phần Các cao hòa tan dimethyl sulfoxid (DMSO­Merck) để dung dịch gốc 10 mg/ml Sau đó, dung địch gốc pha loãng đệm thành nồng độ thích hợp

2.2 P hơong ph áp nghiên cứu

Phương pháp đánh giá tác đụng ức chế xanthin oxidase đĩa ƯV 96 giếng đáy phẳng Costar 3635 (Corning) triển khai theo Noro Nguyễn Thị Thanh Mai, điều chỉnh cho phù hợp với điều kiện nghiên cứu [7, 8]

Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro đĩa ƯV 96 giếng

­ Khảo sát động học enzym với xanthin oxidase (0,8ư/m g protein, mg protein/ml­ Sigma) hoạt độ khác đệm phosphat Vẽ đồ thị biểu diễn mối Hên quan thời gian phản ứng tạo thành acid uric, từ lựa chọn hoạt độ enzym, đồng thời lựa chọn thời gian dừng phản ứng thích hợp

­ Sử dụng nồng độ chất xanthin (Sigma) để xây đựng đồ thị Linewearver ­ Burk xanthin oxidase đĩa u v 96 giếng, biểu thị mối quan hệ tuyến tính l/ v 1/[S] ([S]: nồng độ chất V: tốc độ phản ứng)

­ Thẩm định phương pháp thông qua đánh giá tác dụng allopurinol (Sigma)

Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro đĩa u v 96 giếng cùa mẫu sàng lọc

Trong giếng chứng/đối chiểu/thử cho tương ứng gồm: 50 |il dung dịch đệm/aỉlopurinol/mẫu thử, 35 dung dịch đệm phosphat 70 mM, pH = ,5 ,30fil dung địch xanthin oxidase 0,01 u/ml ủ 15°c/15 phút, thêm 60ịil xanth n 150 |iM , ủ 25°C/30 phút Cho thêm 25 í­il HC1 ỈN để dừng phản ứng, đo độ hấp thụ 290 nm hệ thống ELISA gồm máy đọc khay (Biotek) máy ủ lắc khay (Awareness) Các mẫu trắng chứng, trắng đối chiếu, trắng thử tiến hành song song Thí nghiệm lặp lại lần, lần giếng

­ Đánh giá ảnh hưởng mẫu lên hoạt độ xanthin oxidase nồng độ 10 ­ 50 ­ 100 Ịig/ml, đo mật

độ quang, tính % ức chế: iQQchxmg (AODchứng = ODchứng ­ ODtrắng chứng;

AODthử = ODthử ­ ODtrắng thử)

­ Xác định IC50 dược liệu tiềm 2.3 Phương pháp xử lý số liệu

­ Giá trị AOD biểu diễn dạng M ± SD, so sánh giá trị trung b nh mẫu thử so vói chứng t­test Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê p<0,05

3.1 Kết triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthỉn oxidase in vitro đĩau v 96 gỉểsig

K t khảo sát động học nzym xanthỉn oxidas đĩa v 96 giểng Khảo sát tiến hành với hoạt độ enzym Kết biểu diễn h nh

OD

H nh Lượríg acid uric tạo thành (biểu diễn thông qua OD) theo thời gian với dung dịch enzym có hoạt độ khác

1UUU1U, uại util uạng, UIỈU uau nua UII uuiig J ­ 1/, pnui uau.KJnoại aọ U,UI u/mi, enzym noạt aọng tot, lương

acid uric tạo thành tuyến tính theo thời gian Sau 30 phút, phản ứng đạt tới trạng thái bão hòa với tất hoạt độ enzym Khi phản ứng ứng xảy nhanh mạnh, sai sổ lớn Do đó, hoạt độ xanthin oxidase 0,01u/mlvà đừng phản ứng phút thứ 30 lựa chọn cho thí nghiệm đề tài

Đồ thị Lin w arv r ­ Burk xanthin oxidas đĩa uv96 giếng

Kết xây dựng đồ thị Linewearver ­ Burk xanthin oxidase đĩa ƯV 96 giếng với đung dịch chất có nồng độ khác biểu diễn h nh

1/AOD 25 20 15 10 15

0 ­­­­­­­­ »­­­­­­.­­­­­ ,­­­­­­ ,­­­­­­ ,­­­­­­ T­­­­­­„ 1/[S3 OiM­1) y = 73,85x + 8,62

R2 = 0,996

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,01 0,12 0,14 0,16

* Kết thẩm định phư ng pháp thông qua đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidas in vitro aỉlopurinoỉ đĩa u v 96 giển:

Allopurinol chất chứng minh có tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase in vitro ỉn vivo Để thẩm định phương pháp, tiến hành thí nghiệm với allopurinoỉ nồng độ Dựa kết phân tích probit, nồng độ aHlopurinoỉ ức chế 50% hoạt động xanthin oxidase IC50=O,15 (0,14 ­ 0,17) lỉg/mỉ

3.2 Kết đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro đĩa u v 96 giếng mẫu sàng lọc Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro ỉ mẫu thực vật, dược liệu nồng độ 100|xg/ml, 50fig/ml Ỉ0|ig/ml Kết tr nh bày bảng (trong khuôn khổ báo cáo biểu diễn số liệu mẫu có tác dụng ức chế 50% nồng độ 100 Ịig/ml) Tại nồng độ 100fig/ml, 68 mẫu thử thể , tác dụng ức chế xanth n oxidase (p<0,05), chiếm 74,7% tổng số mẫu thử; mẫu ức chể 50% Tại nồng độ 50 ịig/ml, 38 mẫu thể tác đụng ức ché xanthin oxidase (p<0,05), chiếm 41,8% tổng số mẫu thử; mẫu ức ché 50% Tại nồng độ 10|ig/mJ, 11 mẫu có tác dụng ức chế xanthin oxidase (p<0,05); khơng có mẫu ức chế 50% mẫu có tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro mạnh nồng độ thực nghiệm (p<0,01) xác định là: Smilax p rfoliata Lour., Clinaccmthus nutans, Homalom na occulta Lour schott, Archid ndron cly arỉa (Jack.), I Niels

Bảng Ảnh hưởng mẫu cao lên hoạt độ xanthin oxidase in vỉtro nồng độ 100jig/ml, 50 |ig/ml, 10 |ig/ml

(Bảng đưa 1ỉ mẫu dược liệu ức chế > 50% hoạt độ xanthin oxidase nồng độ 100 ng/ml)

s r r Tên khoa học Nồng độ lỡ0ftg/m Nồng độ SO^ig/ml Nầng độ 10|ig/ml

AOD ĩ (%) AOD I(%) AOD ^ )

Các thuốc thu hái Vườn Quốc gia Bạch Mã - tỉnh Thừa Thiên Huế

1 Mosla dianth Maxim 0,091±0,044** 52,3 0,198±0,027 0,187±0,008* 8,7 Psychotria rubra Poir 0,086+0,03** 56,9 0,157+0,031** 30,7 0,206+0,028 5,3 Smilaxp rfoliata Lour 0,022+0,032** cC00 0,144±0,0i3** 36,4 0,Ỉ78±0,03** 18,2 Các thuốc thu hái Sapa - tỉnh Lào Cai

4 Chinacanthus nutans 0,051+0,035** 75,9 0,0984:0,027** 56,7 0,186±0,017** 23,9 Cynoglossum z ylanicum 0,091+0,045** 56,7 0,162±0,03** 28,2 0,202±0,022 9,5 Smiỉax bract ata Presl 0,Ỉ02±0,033** 51,4 0,165±0,02** 27 0,193+0,009* 9,2 Các thuốc thu hái Ba Vì - thành phố Hà Nội

1 Homaỉom na occulta Lour schott 0,086+0,036** 61,1 0,152±0,03I** 35,9 0,145+0,008** 23,6

8 Sambucusjavanica Reinw 0,099+0,027** 53,1 0,168±0,008** 24,4 0,204±0,018 Các thuốc thu hái Vườn quốc gia Phong Nha - Kẻ Bàng, tinh Quảng Bình

9 Lygodiumýỉ xuosum L Sw 0,093±0,029** 58,2 0,128±0,023** 48,6 0,226+0,023 4,5 10 Ps ud ranth mum palatỉý rum

Nees Radlk 0,106±0,025** 52,5 0,16±0S023** 31,1 0,226+0,041 1,8

Cácí'ây thuốc đồng bào dân tộc Pako - Vân Kiều Quảng Trị

3 K ế t q u ả x c đ ị n h I C 0c ủ a c c d ợ c l i ệ u t i ề m n ă n g

Bốn mẫu tiềm lựa chọn thiết lập dãy nồng độ khảo sát để xác định IC50 Kết tr nh bày bảng2

Bảng Nồng độ ức chế 50% hoạt độ xanthin oxidase mẫu tiềm

STT Tên thường gọi Tên khoa học IC50(pg/ml)

1

i Allnnnt­innl n 15ÍQ ­0 17^

2 Chồng chông Smiỉax p rfoliata Lour 49,3 (42,ỉ ­ 57,0)

3 Mán đỉa Archid ndron cly arìa (Jack.), I Niels 15,6 (14,4­17,4)

4 B m bịp Cỉinacanthus nutans 30,4 (21,7­36,6)

5 Thiên niên kiện Homalom na occulta Lour schott 58,1 (49,8­67,5)

Trong bốn mẫu thử, mán đỉa (Archid ndron cly aria (Jack.), I Niels) ỉà mẫu có khả ức chế xanthin oxidase vượt trội với IC50là 15,6 (14,4 ­17,4) fig/ml

IV BÀN LUẬN

Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro thông qua việc định lượng acid uric đo quang bựớc sóng 290 nm theo mồ tả Noro [8] phương pháp khả thi, thường dùng để sàng lọc liệu có tác dụng hạ acid uric [5, 7] Để phục vụ mục tiêu sàng lọc m ột số lượng lớn mẫu thử, đề tài triển khai đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro đĩa u v 96 giếng sử dụng hệ thống ELISA nhằm rót ngắn thời gian tiết kiệm chi phí Khi chuyển điều kiện nghiên cứu sang đĩa 96 giếng (thể tích giếng nhỏ), hoạt độ 0,0 1Ư/ml thể khả xúc tác tốt, lượng acid uric tạo tuyến tính theo thời gian phản ứng chắn đạt tới trạng thái bão hòa phút thứ 30 Đồ thị Lineweaver ­ Burk xây dựng xác định hệ số Kmcùa enzym từ 7,6 ­ 10,2 ịiM, nằm khoảng 5,32 ­ 13,8|iM, phù hợp với công bố trước [4] Phương pháp thẩm định thơng qua đánh giá tác dụng cùa allopurinol, thuốc ức chế xanthin oxidase in vitro in vivo Trong nghiên cứu này, allopurinol thể tác dụng ửc chế xanthin oxidase rõ rệt, ổn định với IC50là ,Ỉ5 (0,14 ­ 0,17) |ig/ml, tương đồng với nghiên cứu tác giả khác [7] Như vậy, phương pháp đă triển khai cho kết xác vâ phù hợp

­ Đã triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase ìn vitro đĩa u v 96 giếng với hoạt độ xanthin oxidase tối ưu 0,01 u/m l, thời điểm dừng phản ứng sau 30 phút, Km=8,6|iM (7,6 ­10,2) Bằng phương pháp xác định IC50cùa allopurinol 0,15 fig/ml (0,14 ­ 0,17)

­ Đã sàng lọc tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro 91 mẫu thực vật, liệu, xác định IC50của mẫu tiềm nhất, mán đỉa Archiđ ndron cly arỉa (Jack.), I Niels ức chế mạnh với IC50là

15,6ịig/ml (14,4 ­ 17,4)

TÀ I LIỆU TH AM KHẢO

1 Nguyễn Thị Hoài, Trịnh Thị Điệp, Đỗ Thị Thảo cộng sự, "Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa số thuốc đồng bào Pako ­ Vân Kiều Quảng Trị", Tạp chí Dược liệu, tập 17, số 1/2012, tr.8“13

2 Đỗ Tất Lọi (2005), Những thuẩc vồ vị thuốc Việt Nam, NXB Y học

3 Apaya K.L., Chichioco­Hernandez c (2011), “Xanthine oxidase inhibition of selected Phippine medicinal plants”, J M d Plants R s., 5, 289­292

4 Kadam R.S., Iyer K.R (2007), “Isolation of different animal liver xanthine oxidase containing fractions and determination of kinetic prameters for xanthine”, Indian Journal ofPharmac utical Sci nc s, 69(1), p 41­45

5 Kong L.D., Cai Y., Huang w w et a (2000), “Inhibition of xanthine oxidase by some Chinese medicinal plants used to treat gout”, J Ethnopharmacol., 73, 199­207

6 Newman D.J., Cragg G.M (2007), “Natural products as sources of new drugs over the last 25 years”, J Nat Prod., 70,461­477

7 Nguyen M T T, Awale Suresh, Tezuka Yasuhio et al (2004), “Xanthine oxidase inhibitory activiLy of Vietnamese Medicinal Plants”, Biological & Pharmac utical Bull tin, vol 27(9), p.1414­1421

8 Noro T et al (1983), “Inhibitors of xanthine oxidase from flowers and buds of Daphn g nkwa”, Ch m Pharm Bull, 31, p 3984­3987

9 Umamaheswari M., AsoKumar K., Somasundaram A et al (2007), “Xanthine oxidase inhibitory activity of some Indian medical plants”, J Ethnopharmacol., 109,547­551