Ở Việt Nam, cắn dịch chiết phân đoạn nhexan rễ Salacia cochinchin nsìs Lour, (đặt tến là PĐ) đã bước đầu được nghiên cứu và chứng minh tác đụng hạ glucose huyếí trên động vật thí nghiệm[r]
(1)TH M DÒ Cơ CHÉ HẠ GLUCOSE HUYẾT CỦA PHÂN ĐOẠN N-HEXAN RẺ CÂY CHÓC MÁU NAM TRÊN TẾ BÀO c VÂN C2C12
ThS Trần Thị Thùy Lỉnh*; ThS Nguyễn Thu Hằng* H ướng dẫn: TS Trần Thị Oanh**
TÓM TẮT
Đái tháo đường rối loạn chuyển hóa dẫn đến tăng glucose huyết, nhiều biến chứng xem vấn đề cấp bách thời đại Ở Việt Nam, cắn dịch chiết phân đoạn nhexan rễ Salacia cochinchin nsìs Lour, (đặt tến PĐ) bước đầu nghiên cứu chứng minh tác đụng hạ glucose huyếí động vật thí nghiệm số đích tác dụng cùa thuốc điều trị ĐTĐ đồng thời chiết tách xác định cấu trúc chất có pliân đoạn n hexan friedelan~3Pol (SCC1); Psiíosterol (SCC2) 21a,30~dihyđroxyfrjedelan3on (SCC3)
Mục tiêu nghiên cứu: Thăm dò khả gây độc tế bào C2C12của PĐ; Đánh giá tác dụng tãng thu nhận glucose íể bào vân C2C12của PĐ; Đánh giá tác dụng hoạt hóa AMPK chất chiết tách từ PĐ
Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu:
Tê bào C2C2được ủ với mẫu thử PĐ nồng độ 20,00 50,00 125,00 250,00 (ig/ml 48 giờ, xác định khả gây chết té bào C2Cí2 cùa PĐ so với lô chứng kỹ thuật định lượng MTT Đánh giá ảnh hưởng PĐ hai nồng độ 20,00 |Jg/ml 50,00 |ig/ml đến khả nãng thu nhận glucose vào tế bào cách ủ tế bào PĐ môi trường ủ chứa sẵn 8,0 M glucose, định lượng glucose cịn iại mơi trường phương pháp glucose oxiđase ủ tế bào vởi SCC1, SCC2 SCC3 hai nồng độ 20,00 |jg/mL 50,00 |ig/ml, đùng kỹ thuạt lai Western (Western blot) đánh giá khả làm tăng mức độ biểu pAMPK lô thử so với lô chứng
Kết quả:
PĐ nồng độ 125 Mg/ml 250 Mg/ml gây chết 21,82% 28,74% íé bào C2C12 PĐ 20,00 Mg/mỉ 50,00 ng/ml không gây chẹt tế bào C2C12, làm tãng thu nhận glucose vào tế bào C2C12 khơng có mặt insulin mơi trường ni không làm tăng thu nhận glucose vào tể bào C2CI2 có mặt insulin mơi trường Trong chất chiết tách từ PĐ có psitosterol (50,00 ug/ml) có tác dụng hoạt hóa AMPK, friedelan3pol 21a,30 dihydroxyfriedelan3on khơng có tácdụng
Kết luận:
Kết nghiên cứu cho thấy PĐ ảnh hưởng đến khả thu nhận glucose vào tế bào vân chủ yếu theo chê không phụ thuộc insulin PĐ có tác đụng kiểu insulin Kê£ thu tác dụng hoạt hóa AMPK cửa chât hóa học chiết tách từ PĐ phù hợp với kết nghiên cứu khác tiến hàiih Đây sở ban đầu việc đua Chóc máu Nam vào làm thuốc điều trị đái tháo đường
* Từ khóa: Rễ Chóc máu cam; Hạ glucose huyết; Tế bào vân
Probing the hypoglycemic mechanism o f n-hexane segm ent o f salacm cochinchinensis lour, roots xtract in C2C i2 m uscl c lls
Summary
Diabetes is a metabolic disorder leading to hyperglycemia and complications In Vietna, nhexane segment of
SalaciacochinchinnsisLour, roots extract (named PĐ) is studied demonstrating hypoglycaemic effect in rats and on somq targets of antidiabetic drugs Do Thi Nguyet Que et al extracted and determined the structures of substances from this segment They are friedelan3pol (SCC1); psitostero] (SCC2) and 21a,30đihyđroxyfrieđe an3on (SCC3)
Objective: Probe the C2C cytotoxicity of PĐ; Evaluate the increasing glucose uptake effect in C2C12 of PĐ Evaluate the AMPK activation effect of substances those are extracted from PĐ
* Dại học Dựợc Hà Nội
(2)Material and methods:
C2C12muscle cells were incubated with PĐ at various concentrations (20.00 50.00 125.00 250.00 ịig/mL) in 48h, cytotoxicity of PĐ was determined by MTT assay Effect of PĐ at concentrations of 20.00 |ig/mL and 50.00 (ig/mL on glucose uptaking of CzCiz was determined by incubating the cells with PĐ in environment containing 8,0M glucose, then quantify the amount of glucose remaining in the medium by using glucose oxidase Incubate the cells with SCC1; SCC2 or SCC3 at concentrations of 20.00 fig/mL and 50.00 fig/mL, evaluate ứie AMPK activation effect of substances by Western blot method
Results:
PĐ at concentrations of 125.00 |ig/mL and 250.00 jig/mL caused 21.82% and 28.74% C2C12death, respectively The amount of death cells in the lots that incubated with PĐ at concentrations of 20.00 fig/mL and 50.00 jig/mL were not different from stock lot PĐ at concentrations of 20.00 Mg/mL and50.0Ố|ig/mL increased the glucose uptaking of C2C12 with insulin absence in medium In three substances, only SCC2 at concentration of 50,00 |ig/mL effected on AMPK activation
Conclusion:
These experiments suggest that PĐ can affect to glucose uptake of C2Cj2 on the way that not depend on insulin or PĐ has effects similar to effects of insulin The results obtained on the effect of substances extracted from PĐ on AMPK activation consistent with results of other researches This will be the scientific basis of taking PĐ in the treatment of diabetes
* Key words: s alacia cochinchin nsis lour Roots; Hypoglycemia; Muscle cells I.Đ Ặ TV Ẩ N Đ
Đái tháo đường rối loạn chuyển hóa dẫn đến tăng glucose huyết, nhiều biến chứng xem vấn đề cấp bách thòi đại Đã có số thuốc điều trị đái tháo đường (ĐTĐ) hiệu nhiều hạn chế Một số loằi thuộc chi Salacia sử đụng để điều trị béo ph ĐTĐ số nước giói Ở Việt Nam, Salacia cochinchin nsis Lour (Chóc máu Nam) đồng bào Kata sử đụng để tiêu khát, chống viêm, Đỗ Thị Nguyệt Quế c s chứng minh tác dụng hạ glucose huyết dịch chiết methanol toàn phần phân đoạn n hexan rễ s cochinchỉn nsìs Lour, động vật thí nghiệm số đích tác dụng thuốc điều trị ĐTĐ, đồng thời chiết tách xác định cấu trúc chất có phân đoạn nhexan friedelan3Ị3ol; 21a,30~dihyđroxyfrieđelan3on psitosterol [2] Để tiếp tục t m hiểu ché tác dụng phân đoạn n hexan rễ Chóc máu Nam chất tách chiết từ phân đoạn chúng tơi thực nghiên cứu: “Thăm dị c ch ế tác dụng hạ đuờng huyểt phẫn đoạn n-h xan r ễ Ch c m áu Nam (PĐ) tế bào c vân C2C12” với mục tiêu:
Thăm dò khả nâng gây độc tể bào C2C cùa PĐ'
Đánh giá tác dụng tăng thu nhận glucos tế bào c vấn C2Cị2của PĐ - Đánh giá tác dụng hoạt h a A M PK chất chiết tách từ PB„ II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 2.1 Nguyên ỉiệu
Rễ Chóc máu Nam, tên khoa học s cochinchin sis Lour Mầu tiêu số 9694 lưu Phòng tiêu bản, Viện Dược liệu, cắn phân đoạn nhexan địch chiết methanol toàn phần rễ Chóc máu Nam (PĐ) Các chất chiết tách từ PĐ: frieđelan3poí (SCCi); Ị5sitosterol (SCC2); 21a,30dihydrox>friedeIan3on (SCC3)
(3)Thăm dò khả gây độc tế bào C2C12cửa PĐ
Sử dụng kỹ thuật định lượng MTT (MTT assay) [9] Gồm bước sau:
Hoạt hố ni cấy tế bào C2C12trong mơi trường DMEM bổ sung 10% huyết bò, penicillin lOOUI/mỉ; streptomycin 0,lmg/m l 37°c, 5% C cấ y chuyển vào đĩa 96 giếng Biệt hóa té bào huyết ngựa 5% 72
Chia giếng tế bào thành lô, lô giếng, ủ với PĐ (hòa tan DMSO) với nồng độ 20,00 50,00 125,00 250,00 |ig/ml 48 Tiến hành song song với giếng chứng (chỉ bổ sung DMSO) Thêm 20 MI đung dịch M TT (5 mg/ml) vào giếng, ủ Hút bỏ phần đung dịch thêm 200p,L ĐMSO, trộn để 15 phút Đo quang bước sóng 540 nm máy ELISA
Thí nghiệm lặp lại lần điều kiện So sánh mật độ quang lô ủ với PĐ lô chứng để đánh giá ảnh hưởng PĐ đến chức sống tế bào % gây chét tế bào PĐ so với lơ chứng tính theo cơng thức:
, 0 X (O P eM w ODth ) Q^chửng
Trong đó: X : Phần trăm tế bào chết lô thử so với lô chứng (%)
ODchứng: mật độ quang lô chứng; ODthừ: mật độ quang lô ủ mẫu thử Đánh giá ảnh hưởng PĐ đến khả thu nhận glucos tế bào C2C12
Các bước tiến hành: Hoạt hóa, ni cấy biệt hóa tế bào C2C12 (giống trên) Hòa tan PĐ vào DMSO Chia giếng tế bào thành lô, lô giếng:
Lô (lô chứng): bổ sung DMSO; Lô (lô insulin): ủ với insuiin 0,1 pM LÔ 2: ủ với PĐ nồng độ 20,00 *ig/ml; Lô 5: ủ PĐ 20,00 Ịig/ml; insulin 0,1 ịM Lô 3: ủ với PĐ nồng độ 50,00 Hg/mỉ; Lô 6: ù PĐ 50,00 ịig/ml; insulin 0,1 fiM
Tiến hành ủ tế bào với mẫu thử 37°c môi trường DMEM chứa mM glucóse 0,1% albumin bị Hút iop.1 môi trường giếng tế bào cho vào đĩa 96 giếng có chứa sẵn 200|iỉ glucose oxydase, trộn ủ tiếp 15 phút 37°c Đo quang bước sóng 492 nm So sánh mật độ quang lô ủ với mẫu thử với lô chứng để đánh giá tác dụng mẫu thử
Đánh giá tác đụng hoạt h a AM P K c h ầ chiết tách từ P B
Đánh giá khả hoạt hóa AMPK mẫu thử thông qua đánh giá mức độ biểu AMPK phosphory hóa phân tử threonin 172 (viết iắt pAMPK) kỹ íhuật Western blot Các bước tiến hành sau: Hoạt hóa, ni cấy biệt hóa tế bào C2Cị2trong đĩa giếng, ủ tế bào với mẫu thử SCC1 SCC2 SCC3 nồng độ 20,00 50,00 ng/ml Xác định mức độ biểu cùa pAMPK pactin (protein đối chứng) kỹ thuật Western blot [7]
Xử ly số liệu: s ố liệu xử lý thống kê theo phần mềm Microsoft Excel 2007 Sự khác có ý nghĩa thơng kê p<0,05 Kết thí nghiệm biểu thị bàng trị số trung b nh cộng/trừ độ Ịệch chuẩn (M ± SD)
in KẾT QUẢ NGHIÊN C Ư
3.1 Kết thăm dò khả gây độc tế bào C2C12của PĐ
Mật độ quang đo bước sóng 540 nm lơ tể bào ủ với PĐ sau ủ với MTT so với ỉô chứng sau:
(4)Bảng ỉ Giá trị mật độ quang lô tế bào sau ủ với MTT
Lô n Nồng độ ủ (Ịlg/ml) Giá trị mật độ quang % tế bào chết
Lô chứng - 0,51 ±0,04
Lô thử PĐ 20,00 [ig/mL 0,55 + 0,04
Lô thử PĐ 50,00 ịig/mL 0,55 + 0,12
Lô thử 3 PĐ 125,00 ịlgỉmL 0,40 ±0,09* 21,82
Lô thử PĐ 250,00 [ig/mL 0,37 ± 0,05** 28,74
*: p<0,05; **: p<0,01 so với lô chứng
Mật độ quang đo lô tế bào ủ với PĐ nồng độ 20,00 50,00 |i.g/ml không khác biệt so với lô chứng (p>0,05) Mật độ quang lơ tể bào ủ vói PĐ nồng độ 125,00 |Ag/mỉ 250,00 |ig/ml thấp rõ rệt so với lô chứng (p<0,05) với phần trăm tế bào chét tương ứng 21,82 28,74%
3.2 Ảnh hư ởng PĐ đến khả thu nhận glucose vào tế bào C2Ci2 Bảng Ảnh hưởng PĐ đến mức độ thu nhận glucose tế bào C2Cj2
Lô n Mẫu thử nồng độ iỉ mật độ quangGiá trị chửngp/lô insulinp/lô
Lô (lơ chứng) - 0,39 ± 0,03
LƠ PĐ 20 [ig/ml 0,32 ± 0,04 <0,05
Lố PĐ 50 |ig/mỉ 0,30 ±0,05 <0,01
Lô (ỉơ insulin) insulin 0,1 íiM 0,23 ± 0,03 <0,01
LÔ PĐ 20 ỊXg/ml+insulin 0,1 0,30 ± 0,07 <0,05 >0,05
LÔ 6 PĐ 50 |xg/ml+insulin 0,1 ịiM 0,28 ± 0,06 <0,05 >0,05 Giá trị mật độ quang đo lô tế bào ủ với insulin lô tế bào ủ với mẫu thử PĐ nồng độ 20,00 50,00 ng/rnL thấp đáng kể so với lô chứng (p<0,01) Giá trị mật độ quang lô tế bào ủ PĐ (ở hai nồng độ) insulin không khác biệt đáng kể so với lô tế bào ủ với insulin (p>0,05)
3.3 Tác dụng hoạt hóa A M PK chất chiết tách từ PĐ
Tê bào sau ủ với SC CÌ, SCC2, SCC3 nồng độ 20,00 50,00 Ịig/mL giờ, thu protein tiến hành western blot, h nh ảnh mức độ biểu cùa pAMPK Pactin (protein đối chứng) sau:
(3Actin: PAMPK
DMSO Metform SCC1 SCC2 SCC3 SCC1 vSCC2 SCC3
(5)Tỷ lệ mức độ biểu pAMPK so với Pactin số lần tăng mức độ biểu cùa pAMPK lô thử so với lô chứng sau:
Bảng Phần trăm mức độ biểu hiệnpAMPK so với pactin
Mầu pAMPK so vói pactin% mức độ biểu
Lô chứng 128,91 +59,05
SCC1 50fig/mi 122,51 ±89,74
SCC1 20|ig/ml 152,07 ±88,47
SCC2 50ịjg/mỉ 148,63 + 63,00*
SCC2 20|ig/ml 135,18 ± 85,01
SCC3 50|ig/ml 92,16 ±67,79 H nh 2, Số lần tăng biểu pAMPK lô ủ với mẫu thử so với lô chứng
*: p<0,05 so với lô chứng
Ở lô tể bào ủ với SCC2 (50 |ig/mL) mức độ biểu pAMPK tăng đáng kể so sánh với lô chứng (p<0,05) Số lần tăng mức độ biểu pAMPK so vói lơ chứng ỉà 1,15 lần Ở lô tế bào ủ với SCC2 (20,00 íig/ml), SCC1 SCC3, mức độ biểu pAMPK không khác so với lô chứng (p>0,05)
Trên gới số loài thuộc chi Salacia nghiên cứu sử dụng điều trị hỗ trợ điều trị ĐTĐ, béo ph Một số nghiên cứu gần chứng minh dịch chiết rễ số loài Saỉacia có tác dụng nhiều protein có vai trị quan trọng chuyển hóa glucose, lipid thể PPARs, agiucosiđase, aldose reductase lipase tụy Một số lồi thuộc chi chứng minh có tác dụng hạ glucose huyết in vivo s obỉonga, s chin nsis, [4, 8] Ở Việt Nam, s cochinchin nsis Lour (Chóc máu Nam) đồng bào Kata sử dụng để tiêu khát, chống viêm Từ phân đoạn nhexan rễ Chóc máu Nam thu hái từ vườn Quốc gia Bạch Mã, Thừa Thiên Huế, Đỗ Thị Nguyệt Quế c s phân lập friedelan3ị3ol, psitosteroỉ 21a,30~đihyđroxyfrieđelan~3on [2] Trịnh Thị Điệp cho thấy dịch chiết phân đoạn nhexan rễs.cochinchin nsis thu hái Nghệ An chứa psitosterol pristimerin [1] Đỗ Thị Nguyệt Quế vàcs (2009) đánh giá Eác dụng hạ glucose huyết cắn phân đoạn dịch chiết (ĩ hexan, cloroform, ethylacetat buthanol) rễ Chóc máu Nam cho thấy, chuột nhắt gây ĐTĐ streptozocin, cắn phân đoạn nhexan phân đoạn ethylacetat có tác đụng hạ glucose huyết, cắn phân đoạn nhexan có tác dụng mạnh (p<0,05) cắn phân đoạn nhexan có tác dụng hạ gỉucose huyết, hạ cholesterol toàn phần chuột ĐTĐ týp 2, làm giảm tỉnh kháng insulin chuột kháng insulin, ức chế hấp thu sucrose, ức chế aglucosidase, ức chế PTP1B, hoạt hóa AMPK khơng kích thích đảo tụy chuột tiết insulin [2]
(6)Trước tiến hành đánh giá tác dụng PĐ tế bào vân C2C J2, chóng tơi khảo sát khả gây độc mẫu thử dòng tế bào Kết cho thấy PĐ nồng độ 20,00 50,00 Ịig/ml không gây chết tế bào, PĐ (125 250 |ig/ml) gây chết 21,82 28,74% tế bào so với lô chứng (p<0,05) Trên sở kết kết hợp thông tin thu thập từ công bố Đỗ Thị Nguyệt Quế (2013) tác dụng hoạt hóa AMPK tế bào C2Ci2của PĐ (trong PĐ hoạt hóa AMPK, ức chế ACC hai nồng độ 20,00 50,00 |ỉg/mL),' lựa chọn nồng độ PĐ 20,00 50,00 jig/ml để đánh giá tác dụng khà thu nhận glucose vào tế bào C2Ci2
Để định lượng phần glucose thu nhận vào tế bào, sử dụng phương pháp đánh dấu đồng vị phóng xạ tế bào C2C12được ủ với mẫu thử mơi trường chứa glucose có gắn đồng vị phóng xạ (3H 14C) Định lượng glucose mang đồng vị phóng xạ tế bào máy đếm phóng xạ Phương pháp có độ xác cao, địi hỏi trang thiết bị an tồn phóng xạ chặt chẽ, chưa thực trường Đại học Dược Hà Nội Do đó, để đánh giá khả thu nhận gỉucose vào tế bào C2C12 lựa chọn phương pháp định lượng glucose thu nhận vào tế bào gián tiếp thông qua định lượng glucose cịn lại mơi trường ni cấy tế bào sau ủ tế bào vói glucose Kết nghiên cứu cho thấy, khơng có mặt insulin, lượng glucose mơi trường ni cấy tế bào có ủ với PĐ nồng độ 20,00 50,00 |ig/ml giảm đáng kể so với lô chứng (p<0,05) Như vậy, nồng độ thử, PĐ có tác dụng kích thích tê bào tăng thu nhận glucose Tác dụng tương tự tác dụng insulin Khi có thêm insulin, lượng glucose thu nhận vào tế bào vân khơng có khác biệt đáng kể so với lơ tế bào có insulin (p>0,05) Từ kết này, dự đốn ảnh hưởng cùa PĐ tr nh thu nhận glucose vào tế bào vân C2C12chù yếu theo đường khơng phụ thuộc insulin PĐ có tác dụng kiểu insuslin
Kết quà nghiên cứu Giróri MD c s (2009) cho thấy dịch chiết s.obỉonga làm tăng 50% Iựợng glucose thu nhận vào tế bào vân L6 tế bào mô mỡ 3T3, làm tăng 100% lượng GLƯT4, thức đẩy tr nh mã chất hoạt hóa GLƯT4 tăĩig vận chuyển GLƯT4 màng té bào L6 Mangiferin, chất có s oblonga, hoạt hóa AMPK mà khơng hoạt hóa protein kinase B (AKT) Tác đụng mangiferin lên tr nh thu nhận glucose bị có mặt GW9662 chất ức chế không hồi phục PPARỴ [ố] Trước ehưa có nghiên cứu cơng bố vai trò s.cochinchin nsis Lour, thu nhận glucose vào tế bào vân
(7)trong nghiên cứu công bố tạp chí có uy tín giới Kết cho thấy SCC2 (50,00 (Ig/ml) ỉàm tăng mức độ biểu pAMPK so với lô chứng (p<0,05), SCC1 SCC3 hai nồng độ 20,00 50,00 Ịig/ml khơng có tác đụng Kết tra cứu tài liệu tham khảo tác đụng hoạt hóa AMPK SC C lf SCC2 SCC3 tác dụng liên quan đến điều trị ĐTĐ khác cho thấy: psiỉosterol (SCC2) có tác dụng hoạt hóa AMPK gây bất hoạt ACC v gây giảm tổng hợp malonyl CoA, giảm tổng hợp acid béo tự kích thích sử dụng glucose gan, vân psitosterol làm giảm nồng độ triglycerid cholesterol tế bào vân L6, tác đụng giảm có mặt chất ức chế AMPK [6] Không t m thấy tài liệu tác dụng điều trị ĐTĐ frỉeđelan3pol (SCC1) 21oc,30dihydroxyfrieđelan3~ on (SCC3) Kết nghiên cứu giúp giải thích phần chế tác dụng hạ glucose huyết PĐ làm tăng thu nhận glucose vào tế bào vân, hoạt hóa AMPK Một ba chất chiết tách từ PĐ psitosterol có tác dụng hoạt hóa AMPK
V KẾT LUẬN
Cắn dịch chiết phân đoạn nhexan rễ Chóc máu nam s cochinchin nsis Lour (PĐ) nồng độ 125 250 Ịig/ml gây chét 21,82 28,74% tế bào C2C12 PĐ 20,00 50,00 Ịig/ml không gây chết tế bào PĐ (20,00 50,00 fig/ml) làm tăng thu nhận glucose vào tế bào vân C2C ị2 (p<0,05), khơng íàm tăng tác dụng insulin tế bào (p>0,05) Trong ba chất chiết tách đuợc từ PĐ, psitosterol (50,00 pg/ml) có tác dụng hoạt hóa AMPK, fr eđelan3pol 2ỉa,30dihydroxyfriedelan3on khơng có tác dụng
TÀI LIỆU THAM KHẢO
ỉ Trịnh Thị Điệp c s (2010), “Thành phần hóa học rễ lồi Chóc máu Việt (Salacia cochinchinensis L.}’\ Tạp chí hóa học, lập 48 (4B), tr 311314
2 Đô Thị Nguyệt Quế (2013), “Nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết rễ Chóc máu Nam(S.cochinchin nsỉs
Lour.) thực nghiệm”, Luận án Tiến sĩ dược học, tr 5578
3 Arie Gruzman et al (2009), “AMPK as a New Target for Antidiabetic Drugs: A Review on Metabolic Pharmacological and Chemical Considerations”, The review of diabetic studies, (1), pp 1336
4 Bhat B M et al (2012), “Antidiabetic and hypolipidemic effect of salacia oblonga in streptozotocin induced
diabetic rats”, Journal of clinical and diagnostic research, 2012 Dec; (10) pp 16851687
5 Bjoraholm M et al (2005), “Insulin signal transduction in human skeletal muscle: identifying the defects in type
n diabetes”, Biochemical Society Transactions 33, pp 354^357
6 Girón MD et al (2009), “S.oblonga extract increases glucose transporter 4mediated glucose uptake in L6 rat myotubes: role of mangiferin”, Clinical nutrition; 28(5), pp 565574
7 Scofield RH et al (2006), “Western blotting”, Methods 38(4), pp; 283293
8 Yoshino K et al (2009), “Antidiabetic activity of a leaf extract prepared fromSalacia reticulata in mice” Bioscience, biotechnology, and biochemistry 73(5), pp 10961104