Thông tin tóm tắt về những đóng góp mới của luận án tiến sĩ: Nghiên cứu tạo oligochitosan – silica nano và khảo sát tính kích kháng bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. gây hại cây ớt (Capsicum frutescens L.).

Để phòng trừ một số loại nấm gây hại cho cây trồng người ta đã sử dụng nhiều loại thuốc hóa học, tuy nhiên khi sử dụng với liều lượng cao trong thời gian dài đã làm mất cân bằng quần t[r]

(1)

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -

PHẠM ĐÌNH DŨNG

NGHIÊN CỨU TẠO OLIGOCHITOSAN - SILICA NANO VÀ KHẢO SÁT TÍNH KÍCH KHÁNG BỆNH THÁN THƯ DO NẤM

Colletotrichum spp GÂY HẠI CÂY ỚT (Capsicum frutescens L.)

LUẬN ÁN TIẾN SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

(2)

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -

PHẠM ĐÌNH DŨNG

NGHIÊN CỨU TẠO OLIGOCHITOSAN - SILICA NANO VÀ KHẢO SÁT TÍNH KÍCH KHÁNG BỆNH THÁN THƯ DO NẤM

Colletotrichum spp GÂY HẠI CÂY ỚT (Capsicum frutescens L.)

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 42 02 01

LUẬN ÁN TIẾN SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS NGUYỄN TIẾN THẮNG PGS TS BÙI VĂN LỆ

(3)

Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu chúng tơi, số liệu kết nghiên cứu nêu luận án trung thực, khách quan, nghiêm túc chưa cơng bố cơng trình khác Những tài liệu tham khảo có nguồn gốc rõ ràng Nếu có sai sót, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm

Nghiên cứu sinh

(4)

i

MỤC LỤC

Trang LỜI CAM ĐOAN

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH x

TĨM TẮT xii

SUMMARY xiv

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Giới thiệu chung ớt

1.2 Sơ lược nấm Colletotrichum spp bệnh thán thư ớt 6

1.2.1 Giới thiệu chung nấm Colletotrichum spp

1.2.2 Bệnh thán thư ớt (Chilli anthracnose) biện pháp phòng trừ

1.3 Tổng quan chế kháng kích kháng bệnh thực vật 15

1.3.1 Cơ chế kháng bệnh thực vật 15

1.3.2 Chất kích kháng bệnh (elicitor) thực vật 17

1.4 Chitin/Chitosan Silic kích kháng bệnh trồng 19

1.4.1 Vai trị chitin/chitosan kích kháng bệnh 19

1.4.2 Vai trị Silic kích kháng bệnh 22

1.5 Chế tạo oligochitosan, nano silica ứng dụng kích kháng bệnh 25

1.5.1 Chế tạo oligochitosan 25

1.5.2 Chế tạo nano silica 27

1.5.3 Chế tạo oligochitosan-silica nano 28

1.5.4 Ứng dụng vật liệu nano nông nghiệp 30

CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2.1 Nội dung nghiên cứu 35

(5)

2.2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 35

2.2.2 Điều kiện thực nghiên cứu 36

2.3 Vật liệu nghiên cứu 38

2.4 Phương pháp nghiên cứu 39

2.4.1 Nội dung Phân lập, khảo sát khả gây bệnh mẫu phân lập định danh loài nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư ớt 39

2.4.2 Nội dung Hồn thiện cơng nghệ tạo oligochitosan-silica nano 50

2.4.3 Nội dung Đánh giá khả kích kháng bệnh thán thư nấm C gloeosporioides C truncatum gây oligochitosan-silica nano ớt thiên điều kiện phịng thí nghiệm 55

2.4.4 Nội dung Đánh giá khả kích kháng bệnh thán thư nấm C gloeosporioides C truncatum gây oligochitosan-silica nano ớt thiên trồng điều kiện nhà màng đồng ruộng 58

2.2.5 Xử lý số liệu 60

CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 61

3.1 Phân lập, khảo sát khả gây bệnh định danh loài nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư ớt thiên (Capsicum frutescens L.) 61

3.1.1 Phân lập định danh hình thái mẫu nấm gây bệnh thán thư 61

3.1.2 Khả gây bệnh mẫu nấm Colletotrichum spp phân lập điều kiện phịng thí nghiệm nhà màng 64

3.2 Hồn thiện cơng nghệ tạo oligochitosan-silica nano 74

3.2.1 Điều chế oligochitosan có trọng lượng phân tử thấp phương pháp xác định liều lượng chiếu xạ tia gamma Co-60 kết hợp với H2O2 75

3.2.2 Điều chế hạt nano silica từ nguồn vỏ trấu 84

3.2.3 Điều chế hỗn hợp oligochitosan-silica nano 87

3.3 Khả kích kháng bệnh thán thư nấm Colletotrichum gloeosporioides C truncatum gây oligochitosan-silica nano ớt trồng điều kiện phịng thí nghiệm 92

(6)

3.3.2 Đánh giá khả kích kháng bệnh thán thư nấm C gloeosporioides C truncatum gây ớt 94 3.4 Khả kích kháng bệnh thán thư nấm Colletotrichum gloeosporioides C

truncatum gây oligochitosan-silica nano ớt trồng điều kiện nhà

(7)

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ABA Abscisic acid

AATCC American Association of Textile Chemists and Colorists (Hiệp hội nhà hoá học ngành dệt may nhà phối màu)

ACT Partial actin AUX Auxin

BR Brassinosteroid CAL Calmodulin

CHS Chalcone synthase CHI Chalcone isomerase

CEBiP Chitin elicitor binding protein, motif lysine hay LYM CERK1 Chitin elicitor receptor kinase

CK Cytokinin

COS Chitin oligosaccharide CTS Chitosan

Da Dalton

DP Độ polymer hóa

ĐC Đối chứng

ĐĐA Độ deacetyl hóa

ETI Effector-triggered-immunity

EDX Energy Dispersive X-ray (phổ tán xắc nặng lượng tia X)

ET Ethylen

(8)

FT-IR Fourier-transform infrared (Phổ hồng ngoại biến đổi fourier) FW Fresh Weight

GA Gibberellic acid

GPC Gel permeation chromatography

GPDH Glyceraldehyde -3- phosphate dehydrogenase GS Glutamine synthetase

HEC HydroxyEthylCellulose IR Infrared (phổ hồng ngoại) ITS Internal Transcribed spacer ISR Induced Systemic Resistance JA Jasmonic acid

KLPT Khối lượng phân tử hay Mw LAR Localized Acquired Resistance MAPKK Mitogen activated ptotein kinase Mw Molecular weight hay KLPT NSLN Ngày sau lây nhiễm

NSXL Ngày sau xử lý NST Ngày sau trồng

PCR Polymerase Chain Reaction PDA Potato Dextrose Agar

PAL Phenylalanine ammonia lyase

PAMP Pathogen-Associated Molecular Patterns PTI PAMP triggered immunity

(9)

ROS Reactive oxygen species

SOD2 Partial manganese superoxide dismutase SAR Systemic Acquired Resistance

SA Salicylic acid

SDS Sodium dedecyl sulfate

SEM Scanning electron microscopy (kính hiển vi điện tử quét)

TEM Transmission electron microscopy (kính hiển vi điện tử truyền qua) TF Transcription factor

TLB Tỷ lệ bệnh TUB2 β-tubulin

UV-Vis Ultraviolet-visible

(10)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư ớt số quốc gia [17] 10 Bảng 1.1 Nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư ớt số quốc gia (tiếp

theo) [17] 11

Bảng 2.1 Nhiệt độ ẩm độ không khí nhà màng thời gian thí nghiệm 37

Bảng 2.2 Đặc tính lý hóa đất khu thí nghiệm 38

Bảng 2.3 Đặc điểm khí hậu thời tiết Thành phố Hồ Chí Minh thời gian thí nghiệm 38

Bảng 2.4 Danh sách mẫu bệnh thu thập đề tài 40

Bảng 2.5 Thông tin mồi sử dụng nghiên cứu 48

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng PCR 49

Bảng 3.1 Tình hình bệnh điều kiện gây vết thương (%) 65

Bảng 3.3 Tình hình bệnh trái điều kiện khơng gây vết thương (%) 68

Bảng 3.4 Tỷ lệ bệnh sau lây nhiễm điều kiện nhà màng (%) 70

Bảng 3.5 Chỉ số bệnh sau lây nhiễm điều kiện nhà màng (%) 71

Bảng 3.6 Kết định danh loài Colletotrichum spp dựa vào trình tự vùng gen 73 Bảng 3.7 Sự suy giảm KLPT chitosan dung dịch 4% có khơng có H2O2 theo liều xạ 75

Bảng 3.8 Độ ĐĐA% số đa phân tán (PI) chitosan theo liều xạ 76

Bảng 3.9 KLPT (Mw), PI ĐĐA chitosan dung dịch 2%/H2O2 0,5% theo liều xạ 78

Bảng 3.10 Ảnh hưởng phân đoạn oligochitosan khác nồng độ 0,01% đến phát triển Colletotrichum spp môi trường PDA 80

(11)

Bảng 3.15 Hiệu suất tạo nano silica từ vỏ trấu xử lý với HCl 5% 85 Bảng 3.16 Ảnh hưởng oligochitosan, silica nano oligochitosan-silica nano đến

mức độ bệnh thán thư nấm C gloeosporioides C truncatum gây điều kiện phòng thí nghiệm 92

Bảng 3.17 Ảnh hưởng oligochitosan, silica nano oligochitosan-silica nano đến

hoạt tính chitinase (U/mg protein) điều kiện phịng thí nghiệm 96

Bảng 3.18 Ảnh hưởng oligochitosan, silica nano oligochitosan-silica nano đến

hoạt tính β 1,3-glucanase (µmol/h/mg protein) điều kiện phịng thí nghiệm 97

capsidiol (µg/g FW) điều kiện phịng thí nghiệm 99

salicylic acid (ng/g FW) điều kiện phịng thí nghiệm 101

jasmonic acid (ng/g FW) điều kiện phịng thí nghiệm 103

tỷ lệ nhiễm bệnh thán thư (%) ớt điều kiện nhà màng 107

các yếu tố cấu thành suất suất ớt điều kiện nhà màng 112

tỷ lệ nhiễm bệnh số bệnh thán thư (%) ớt trồng điều kiện nhà màng 116

các yếu tố cấu thành suất suất ớt điều kiện nhà màng 118

tỷ lệ nhiễm bệnh thán thư (%) ớt trồng đồng ruộng 122

(12)

các yếu tố cấu thành suất suất ớt trồng đồng ruộng 125

tỷ lệ nhiễm bệnh số bệnh thán thư (%) ớt trồng đồng ruộng 130

(13)

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cây ớt: hình thái (A) giống trồng (B) tỷ lệ diện tích trồng (C) [1] 5

Hình 1.2 Chu trình gây bệnh nấm Colletotrichum spp thực vật (A, B) phân loại nấm (C) [5]

Hình 1.3 Các giai đoạn lây nhiễm nấm Colletotrichum ớt (A, B) [17] 12

Hình 1.4 Cơ chế kháng bệnh nấm thực vật (A) chế kích kháng chitin (B) [36] 18

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học chitin chitosan (DP > 50%) [42] 20

Hình 2.1 Sơ đồ thể liên quan nội dung nghiên cứu đề tài 35

Hình 2.2 Kiểu nhà màng thơng gió cố định sử dụng làm thí nghiệm 36

Các thí nghiệm nhà màng tiến hành từ tháng 03 – 09/2017 Cây ớt trồng bầu giá thể 70% mụn xơ dừa + 20% phân trùn quế + 10% tro trấu 37

Hình 2.3 Mẫu trái mẫu dùng để lây nhiễm mẫu phân lập nấm Colletotrichum 43

Hình 2.4 Thang phân cấp bệnh trái ớt (QCVN 01-160:2014/BNNPTNT) 44

Hình 2.5 Thí nghiệm khả kích kháng nấm C gloeosporioides C truncatum phịng thí nghiệm 55

Hình 3.1 Triệu chứng bệnh thán thư trái (A - C), (D) thân (D) ớt tự nhiên 61

Hình 3.4 Điện di sản phẩm khuếch đại PCR mẫu phân lập Colletotrichum spp 72

Hình 3.6 Phổ hồng ngoại (IR) nhiễu xạ tia X (XRD) mẫu chitosan (a) phân đoạn oligochitosan 7,7 kDa (b); 4,6 kDa (c) 2,5 kDa (d) 79

Hình 3.7 Nano silica chế tạo từ vỏ trấu: xử lý với nước (a), HCl 5% (b) 10% (c) 85 Hình 3.8 Hình chụp TEM (A, B); phân bố kích thước hạt đo phương pháp tán xạ laser (C); giản đồ XRD (D) EDX (E) hạt nano silica điều chế 86

(14)

Hình 3.10 Ảnh hưởng oligochitosan, silica nano oligochitosan-silica nano đến

hoạt tính chitinase điều kiện phịng thí nghiệm 95

Hình 3.11 Ảnh hưởng oligochitosan, silica nano oligochitosan-silica nano đến

hoạt tính β 1,3- glucanase điều kiện phịng thí nghiệm 98

capsidiol phịng thí nghiệm 100

salicylic acid phịng thí nghiệm 102

(15)

xii

TÓM TẮT

Đề tài “Nghiên cứu tạo oligochitosan-silica nano khảo sát tính kích kháng bệnh thán thư nấm Colletotrichum spp gây hại ớt (Capsicum

frutescens L.)” thực từ 2014 đến 2018 Thành phố Hồ Chí Minh

Nghiên cứu thực nhằm mục tiêu (1) phân lập, khảo sát khả gây bệnh và định danh loài nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư ớt thiên; (2) tạo oligochitosan-silica nano sở phân đoạn chitosan có trọng lượng phân từ thấp với hạt nano silica có độ ổn định hiệu kích kháng cao bệnh thán thư ớt (3) xác định khả kiểm soát bệnh thán thư nấm C

gloeosporioides C truncatum gây ớt điều kiện phịng thí nghiệm,

nhà màng đồng ruộng oligochitosan-silica nano tạo

Đề tài gồm bốn nội dung thực tuần tự: (1) phân lập, khảo sát khả gây bệnh mẫu phân lặp định danh hình thái, sinh học phân tử loài nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư nấm ớt thiên (Capsicum frutescens L.); (2) hồn thiện cơng nghệ tạo oligochitosan-silica nano; (3) đánh giá khả kích kháng bệnh thán thư nấm Colletotrichum

gloeosporioides C truncatum gây ớt điều kiện phịng thí nghiệm

của oligochitosan-silica nano tạo (4) đánh giá khả kích kháng bệnh thán thư nấm C gloeosporioides C truncatum gây oligochitosan-silica nano ớt trồng điều kiện nhà màng đồng

(16)

ghi nhận Trong điều kiện nhà màng ruộng sản xuất hiệu kích kháng nấm

C gloeosporioides C truncatum đạt tốt phun oligochitosan 25 ppm

nano silica 50 - 100 ppm oligochitosan-silica nano 50 ppm

Về tính luận án: đề tài (1) hoàn thiện quy trình sản xuất oligochitosan-silica nano ứng dụng sản xuất quy mô công nghiệp: (a) tạo oligochitosan có khối lượng phân tử nhỏ (7,7 kDa, 4,6 kDa 2,5 kDa) phương pháp chiếu xạ dung dịch 4% chitosan/0,5% H2O2 dung dịch 2%

chitosan/0,5% H2O2; (b) tạo vật liệu nano silica có độ tinh khiết cao phương pháp

thiêu kết vỏ trấu xử lý loại bỏ thành phần khoáng (c) tạo oligochitosan-silica nano bền pH gần trung tính (pH ~ 7,5); (2) ứng dụng oligochitosan-oligochitosan-silica nano tạo kích kháng bệnh thán thư nấm C gloeosporioides C truncatum ớt thiên trồng Thành phố Hồ Chí Minh

(17)

SUMMARY

The project of “Study to produce oligochitosan-silica nano and investigate the induced systemic resistance against anthracnose disease caused by Colletotrichum spp on hot chilli (Capsicum frutescens L.)” was carried out from 2014 to 2018 at Ho Chi Minh City The objectives of the study were: (1) identify the pathogenicity potential and classificate at species level of Colletotrichum spp isolated from hot chilli in Vietnam; (2) produce stable oligochitosan-silica nano, which potentially highly induced effectively the systemic resistance against anthranose disease on hot chilli, based on the combination of low molecular weight chitosan with nano silica; and (3) detect the potential control the anthracnose disease caused by C gloeosporioides and

C truncatum on hot chilli in vitro, greenhouse and opened-field conditions of

oligochitosan-silica nano created

Four contents done sequentially were involved in the study: (1) isolate, investigate the pathogenicity potential of isolates and classificate at species level isolated fungus Colletotrichum spp causing anthracnose disease on hot chilli (Capsicum frutescens L.) based on mophorlogy and molecular characteristics; (2) re-complete the technology to produce oligochitosan-silica nano; (3) evaluate the induced systemic resistance (ISR) potential against anthranose disease caused by C

gloeosporioides and C truncatum on hot chilli in in vitro condition of

oligochitosan-silica nano created; (4) investigate the induced systemic resistance (ISR) potential against anthranose disease caused by C gloeosporioides and C truncatum on hot chilli cultivated in greenhouse and opened-field conditions of oligochitosan-silica nano produced

Twenty fungus isolates causing anthranose disease on hot chilli were isolated and scientific classificated to species based on the mophorlogy characteristics according to Sutton (1992) and DNA analysis Most of isolates belonged to C gloeosporioides

C truncatum Low molecular weight oligochitosan fragments (7.7 kDa; 4.6 kDa and

(18)

husk; succesfully created oligochitosan-silica nano, which stable at pH 7.5 when combined with HEC (1%) Some special characteristics of oligochitosan, nano silica and oligochitosan-silica nano were recorded In greenhouse and opened-field conditions, the high efficiencies of ISR potential against C gloeosporioides C

truncatum were recorded when oligochitosan 25 ppm, nano silica 50 – 100 ppm and

oligochitosan-silica nano 50 ppm sprayed

The scientific and practical significance: (1) the practical technologies for creating oligochitosan-silica nano in industry production were re-completed; (a) low molecular weight oligochitosan fragments (7.7 kDa; 4.6 kDa and 2.5 kDa) were created by irradiation method on to the solution of 4% chitosan/0.5% H2O2 and 2%

chitosan/0.5% H2O2; (b) highly pure nano silica particles were produced by firing

husk after treated to eliminate mineral components and (c) oligochitosan-silica nano stabling at pH ~ 7.5 was produces; (2) applying oligochitosan-silica created to induce the systemic resistance against the anthranose disease caused by C gloeosporioides

(19)

MỞ ĐẦU

Tính cấp thiết đề tài

Ớt (Capsicum sp.) gia vị trồng vùng nhiệt đới, tiêu thụ khắp giới có giá trị kinh tế cao Tuy nhiên, dịch bệnh nấm, virus vi khuẩn gây ớt vấn đề gây trở ngại lớn đến hiệu sản xuất Trong loại bệnh ớt, bệnh nấm bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng làm tổn thất từ 10 - 80% sản lượng ớt Việt Nam nước giới Ấn Độ, Thái Lan, Hàn Quốc Các loại bệnh nấm thường gặp ớt bệnh héo (Rhizoctonia

solani), bệnh thán thư (Colletotrichum spp.), bệnh mốc xám (Botrytis cinerea), bệnh

héo vàng (Fusarium oxysporum), bệnh sương mai (Phythopthora capsici), bệnh thán thư nấm Colletotrichum spp gây bệnh phổ biến gây thiệt hại nghiêm trọng ớt Bệnh thán thư ớt nấm Colletotrichum spp gây ra, nấm gây hại cành, lá, hoa trái, gây thiệt hại làm giảm suất 70 - 80%

Hiện nay, nhiều loại thuốc hóa học sử dụng để phòng trừ loại nấm gây hại cho trồng, nhiên việc sử dụng với liều lượng cao thời gian dài làm cân quần thể vi sinh vật có ích đất, tạo điều kiện để nấm bệnh lồi trùng có hại cho trồng trở nên kháng thuốc Dư lượng thuốc bảo vệ thực vật sản phẩm nông nghiệp đất làm ô nhiễm nguồn nước ngầm, môi trường gây tác hại nghiêm trọng sức khỏe người vật nuôi Biện pháp trồng giống chống chịu bệnh bị hạn chế suất độ ổn định giống không cao Biện pháp sinh học sử dụng chất kích kháng thực vật (elicitor) giúp kích hoạt chế đề kháng bệnh trồng xu hướng phát triển nông nghiệp xanh áp dụng rộng rãi giới với mục đích giảm thiểu tối đa việc sử dụng hóa chất độc hại sử dụng giống chuyển gen

(20)

nấm làm tăng khả chống chịu bệnh đa số loài thực vật, giúp tiết số enzyme, hoạt chất chống lại xâm nhập nấm, vi khuẩn gây bệnh; kích thích tăng trưởng phát triển trồng [39] Oligochitosan tạo có khối lượng phân tử lớn từ 100 kDa đến 30 kDa theo công nghệ cũ dẫn đến khó điều chỉnh khối lượng phân tử sản xuất quy mơ lớn Vì cần tạo oligochitosan có khối lượng phân tử nhỏ phương pháp chiếu xạ thích hợp ứng dụng nơng nghiệp Hồn thiện quy trình sản xuất oligochitosan ứng dụng sản xuất quy mô công nghiệp, sản phẩm tạo thành có độ tinh khiết, ổn định cao dễ dàng điều chỉnh khối lượng phân tử sản xuất Kết hợp hai loại vật liệu có hiệu ứng kích kháng để chế tạo vật liệu lai ứng dụng nông nghiệp

Xuất phát từ lý đề tài ‘Nghiên cứu tạo oligochitosan-silica nano và khảo sát tính kích kháng bệnh thán thư nấm Colletotrichum spp gây hại cây ớt (Capsicum frutescens L.)’ thực

Mục tiêu nghiên cứu luận án

- Phân lập, khảo sát khả gây bệnh định danh loài nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư ớt thiên;

- Tạo oligochitosan-silica nano sở phân đoạn chitosan có trọng lượng phân từ thấp với hạt nano silica có độ ổn định hiệu kích kháng cao bệnh thán thư ớt;

- Xác định khả kiểm soát bệnh thán thư nấm C gloeosporioides và C truncatum gây ớt điều kiện phòng thí nghiệm, nhà màng ngồi đồng ruộng oligochitosan-silica nano tạo

Nội dung nghiên cứu luận án Luận án gồm nội dung sau:

(21)

- Nội dung 2: Hoàn thiện công nghệ tạo oligochitosan-silica nano

- Nội dung 3: Đánh giá khả kích kháng bệnh thán thư nấm

Colletotrichum gloeosporioides C truncatum gây oligochitosan-silica nano

tạo ớt điều kiện phịng thí nghiệm

- Nội dung 4: Đánh giá khả kích kháng bệnh thán thư nấm C

gloeosporioides C truncatum gây oligochitosan-silica nano tạo

cây ớt trồng điều kiện nhà màng đồng

Phạm vi nghiên cứu luận án

Luận án tiến hành từ năm 2014 đến năm 2018 Thành phố Hồ Chí Minh thực ba địa điểm: Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao; Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học Môi trường – trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Trung tâm Nghiên cứu Triển khai Công nghệ Bức xạ (VINAGAMMA)

Luận án tập trung phân lập, khảo sát khả gây bệnh mẫu phân lặp, định danh hình thái, đặc điểm phân tử loài nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư ớt; Hồn thiện cơng nghệ tạo oligochitosan-silica nano đánh giá khả kích kháng oligochitosan-silica nano tạo bệnh thán thư ớt thiên (Capsicum frutescens L.)

Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài

- Về lý luận: Nghiên cứu luận án đóng góp thêm vào hiểu biết khoa học nấm gây bệnh đa dạng phức hợp loài nấm gây bệnh ớt, tỷ lệ phối trộn oligochitosan nano silica, độ pH thích hợp để thu hỗn hợp oligochitosan-silica nano có độ ổn định cao; khả kích kháng chế phẩm phun ớt giúp tăng cường khả chống chịu với nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư ớt

(22)

được hiệu kích kháng bệnh thán thư nấm Colletotrichum spp gây ớt oligochitosan-silica nano, oligochitosan nano silica đơn lẻ điều kiện phịng thí nghiệm, nhà màng ngồi đồng ruộng

Về tính luận án

- Hồn thiện quy trình sản xuất oligochitosan-silica nano ứng dụng sản xuất quy mơ cơng nghiệp:

+ Tạo oligochitosan có khối lượng phân tử nhỏ (7,7; 4,6 2,5 kDa) phương pháp chiếu xạ dung dịch 4% chitosan/0,5% H2O2 dung dịch 2%

chitosan/0,5% H2O2;

+ Tạo vật liệu nano silica có độ tinh khiết cao phương pháp thiêu kết vỏ trấu xử lý loại bỏ thành phần khoáng

+ Tạo oligochitosan-silica nano bền pH gần trung tính (pH ~ 7,5)

- Ứng dụng oligochitosan-silica nano tạo kích kháng bệnh thán thư nấm

C gloeosporioides C truncatum ớt thiên trồng Thành phố Hồ Chí

(23)

CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung ớt

Cây ớt (Capsicum sp.) thuộc họ cà (Solanaceae) có nguồn gốc từ Châu Mỹ, có dạng bụi nhỏ, thường cao 60 - 80 cm cao đến m; thân nhẵn, có nhiều cành; Lá mọc so le, hình thn dài, đầu nhọn; Hoa mọc đơn độc kẽ (Hình 1.1A) Ớt dễ trồng, khơng kén đất thích hợp với nhiều vùng sinh thái Trong vỏ trái ớt có chứa alkaloid capsaicin [1]

Hình 1.1 Cây ớt: hình thái (A) giống trồng (B) tỷ lệ diện tích trồng (C) [1]

Cây ớt địi hỏi khí hậu ấm áp độ ẩm cao cho tăng trưởng thời tiết khơ q trình trưởng thành Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng phát triển ớt từ 18 – 30oC Nhiệt độ cao 32oC thấp 15oC tăng trưởng

kém hoa dễ rụng Chi (genus) ớt có khoảng 25 - 30 lồi có năm loài (Capsicum frutescens L., C annuum L., C chinense Jacq, C pubescens Keep C

baccatum L.) hóa canh tác (Hình 1.1B) Hiện nay, C frutescens L

(24)

Cây ớt thường trồng dạng năm, thu hoạch nhiều lần Cây ớt trồng với mục đích lấy trái tươi ớt khơ (bột ớt) [1, 2] Ớt có giá trị dinh dưỡng, y học, kinh tế; mang lại nguồn thu nhập đáng kể cho người trồng Ngồi cơng dụng cung cấp vị cay cho thực phẩm, ớt cung cấp chất acid ascorbic (vitamin C), carotenoid (tiền vitamin A), tocopherol (vitamin E), capsaicinoid flavonoid có tác dụng tốt cho sức khỏe người [3] Ớt sử dụng ngành công nghiệp dược phẩm, mỹ phẩm, thực phẩm Ớt nguồn giá trị xuất nhiều nước giới với tổng diện tích trồng chiếm 1,9 triệu ha, Ấn Độ chiếm 38% sản lượng với 1,4 triệu Việt Nam sản lượng ớt chiếm khoảng 2% sản lượng giới (Hình 1.1C) [4]

Trong giai đoạn 2010 - 2018, ớt trồng ngày nhiều Việt Nam Năm 2010, diện tích, suất sản lượng ớt loại Việt Nam 44.300 ha, 2.379 kg/ha 105.400 tấn, đến 2018, diện tích, suất sản lượng ớt loại Việt Nam 107.392 ha, 2.446 kg/ha 262.658 Các vùng chuyên canh ớt Việt Nam Quỳnh Phụ (Thái Bình), Đại Lộc (Quảng Nam), Phù Mỹ, Phù Cát (Bình Định), Bố Trạch (Quảng Bình), Châu Đốc (An Giang), Thanh Bình (Đồng Tháp), Tiền Giang, Long An, Lâm Đồng, Vĩnh Phúc, Thái Bình, Nam Định số tỉnh thành khác

1.2 Sơ lược nấm Colletotrichum spp bệnh thán thư ớt

1.2.1 Giới thiệu chung nấm Colletotrichum spp

Colletotrichum spp thuộc giới Fungi, ngành Ascomycota, lớp

Sordarriomycetes, Phyllachorales, họ Phyllachoraceae Đặc điểm nhận dạng hình thái chi Colletotrichum hình thành giai đoạn sinh sản hữu tính Nấm

Colletotrichum spp có sợi nấm nội sinh, mảnh, phân nhánh, khơng màu, có vách ngăn,

(25)

đĩa phẳng, mặt sau có cấu trúc phấn mịn, cụm cuống bào tử gồm lớp chất nền, bề mặt sản sinh cuống bào tử suốt Colletotrichum spp sinh trưởng phát triển hình thành bào tử thuận lợi môi trường PDA (Phụ lục 1) Khối bào tử màu hồng nhạt hình thành cành bào tử phân sinh Sự xâm nhiễm ban đầu loài nấm Colletotrichum spp có liên quan đến tiếp xúc bào tử bề mặt trồng, nảy mầm bào tử, hình thành giác bám, xâm nhập vào biểu bì cây, phát triển xâm nhiễm vào mơ sản sinh hình thành đĩa cành bào tử phân sinh Các loài Colletotrichum spp sản sinh hạch nấm nhỏ để tồn trạng thái bảo tồn ngưng hoạt động đất mùa đông gặp điều kiện bất lợi hạch nhỏ sống sót nhiều năm [5,6,7]

Bệnh nấm Colletotrichum spp phổ biến trồng (cây hoa kiểng, rau ăn ăn quả) Theo xếp hạng Tạp chí Bệnh học thực vật phân tử (2012), nấm Colletotrichum spp., gây bệnh thán thư, xếp vị trí thứ 10 loại nấm gây bệnh hàng đầu, làm ảnh hưởng nghiêm trọng tới sinh trưởng, phát triển và suất nhiều loại trồng có giá trị có múi, ớt (Capsicum sp.), đậu tương (Glycine max (L.) Merr.), cà chua (Solanum lycopesicum) Bệnh thán thư các loại trái bơ (Persea americana), ổi (Psidium guajava L.), đu đủ (Carica papaya L.), xoài (Mangifera indica L ) chanh dây (Passiflora incarnata L.) xác định được nguyên nhân gây C gloeosporioides chuối (Musa L.) C

musae Ở vùng cận nhiệt đới ôn đới, tác nhân gây bệnh loại trái nho

(Vitis vinifera L.), táo (Malus domestica), đào (Prunus persica) kiwi (Actinidia

(26)

Hình 1.2 Chu trình gây bệnh nấm Colletotrichum spp thực vật (A, B)

phân loại nấm (C) [5]

Định danh nấm Colletotrichum spp dựa phân tích phân tử ngày phổ biến dẫn tới nhiều thay đổi phân loại loài thuộc chi (Cannon cộng sự, 2012) [5] Các nghiên cứu cho thấy, C gloeosporioides C acutatum thực chất phức hợp loài (special complex), C gloeosporioides gồm 22 lồi khác C acutatum gồm 31 lồi khác Do xác định loài

Colletotrichum spp dựa đặc điểm hình thái thường thời gian nên kỹ thuật

phân tử áp dụng Nhiều cặp mồi chuyên biệt thiết kế để phát loài Colletotrichum spp gây hại ớt Nguyễn Duy Hưng cộng (2018) phân tích định danh dựa đặc điểm hình thái giải trình tự vùng Internal Transcribed Spacer (ITS) vùng liên gen gen apn2 MAT1-2-1 (ApMat) mẫu

Colletotrichum spp gây bệnh thán thư ớt Đồng Sơng Hồng, loài C truncatum, C fructicola, C gloeosporioides sensu stricto, C aeschynomenes, C siamense xác định [9] Gardes Bruns (1993) ứng dụng phân tích trình tự

ADN để phân loại cấp lồi, nhận diện biến đổi vùng ITS1 (Internal transcribed Bào tử nang phát triển

(27)

spacer 1) rDNA sáu loài chi Colletotrichum phát hiện tượng đa hình vùng loài C gloeosporioides từ ký chủ khác [10] Weir cộng (2012) nghiên cứu xây dựng di truyền cho 156 mẫu phân lập Colletotrichum spp từ nhiều vùng giới Các vùng gen nhóm tác giả sử dụng GPDH (Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase), ACT (Partial actin), TUB2 (β-tubulin), ITS (Internal transcribed spacer) CAL (Calmodulin) Phân tích dựa trình tự gen phân mẫu phân lập Colletotrichum spp thành chín phức hợp lồi với 119 lồi Colletotrichum spp phân lập (Hình 1.2C) [5]

Do tính chất đa dạng phức tạp nấm Colletotrichum spp., vùng gen

như GS (Glutamine synthetase), CHS (Chalcone synthase), HIS (Histone), ApMat (gene kiểu Mating) dùng để xác định độ tương đồng phân tích di truyền của nấm Colletotrichum spp Các nghiên cứu Liu cộng (2016) dựa vào 88 loài Colletotrichum spp phân lập từ mẫu trái ớt bị thối Tứ Xuyên (Trung Quốc) phát thêm loài mới, mô tả C sichuanensis dựa trình tự vùng gen GPDH, ACT, TUB2, ITS2 CAL [11] De Silva (2016) ghi nhận có 45 loài nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư ớt ở Úc Phức hợp loài C acutatum xác định sáu vùng gen ITS, GAPDH, ACT, CHS1, TUB2 HIS3 Phức hợp loài C gloeosporioides xác định bốn vùng gen ITS, TUB2, ApMat GS Phân tích phát sinh lồi ghi nhận có bốn lồi Colletotrichum spp gồm C siamene, C simmondsii, C queenslandicum C

truncatum [12] Hiện hệ thống phân loại chi Colletotrichum phân chia thành

11 nhóm phức hợp với 190 lồi Colletotrichum sp [13] Sử dụng kết hợp phương pháp định danh phương pháp giải trình tự gen nhận diện đặc điểm hình thái đánh giá phương pháp thích hợp để hướng đến việc nghiên cứu phức tạp loài nấm Colletotrichum spp [13,14,15, 16]

1.2.2 Bệnh thán thư ớt (Chilli anthracnose) biện pháp phòng trừ

(28)

Ở tất loài Colletotrichum spp., thời điểm đầu công phát triển trình lây nhiễm giống Bào tử nấm tập trung gắn chặt bề mặt mô bệnh Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử nảy mầm hình thành giác bám, từ sợi nấm xâm nhập vào biểu bì mơ, phát triển xâm chiếm mơ bệnh Sau hình thành đĩa cành bào tử nấm (Hình 1.3) [17]

Bảng 1.1 Nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư ớt số quốc gia [17]

Quốc gia Tên loài Tài liệu tham khảo

Australia C brisbanense Damm cộng sự, 2009 Brazil C boninense Tozze Massola, 2009 India C capsici, C acutatum Ranathunge cộng sự, 2012;

Saxena cộng sự, 2014 Indonesia C acutatum

C gloeosporioides

C nymphaeae, C capsici

Damm cộng sự, 2009 Voorrips cộng sự, 2004

Korea C acutatum

C gloeosporioides

C coccodes, C dematium

Park Kim, 1992

Mexico C capsici Damm cộng sự, 2009

New Zealand C kartsii,

C novae-zelandiae C nigrum, C coccodes

(29)

Bảng 1.1 Nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư ớt số quốc gia (tiếp

theo) [17]

Quốc gia Chủng loài Tài liệu Tham khảo

Papua New C capsici Pearson cộng sự, 1984 Guinea C gloeosporioides

Sri Lanka C acutatum Damm cộng sự, 2012a Taiwan C acutatum, C capsici

C gloeosporioides

Manandhar cộng sự, 1995

Thailand C acutatum, C capsici C gloeosporioides C siamense, C scovillei, C asianum

Than cộng sự, 2008; Damm cộng sự, 2009; Phoulivong cộng sự, 2012; Weir cộng sự, 2012

United States C capsici

C gloeosporioides

C acutatum, C coccodes

Harp cộng sự, 2008

Vietnam C acutatum, C capsici C.gloeosporioides, C.nigrum

Don cộng sự, 2007

Zimbabwe C nymphaeae Damm cộng sự, 2009

(30)

nâu đen, bệnh phát triển nặng làm bị chết dần bệnh có trái trái ít, chất lượng Bệnh hai loại nấm C nigrum C capsici gây Hai loại nấm thường song song phá hại làm trái ớt bị thối nhanh chóng Bào tử phân sinh hai loại nấm nảy mầm nước sau giờ, nhiệt độ thích hợp cho nấm gây bệnh 28 – 30oC Bệnh phát triển mạnh điều kiện nhiệt độ cao, ẩm độ cao Bào

tử phát tán nhờ gió nhờ trùng Bào tử phân sinh có sức sống cao, điều kiện khơ, bị vùi đất nảy mầm vào vụ sau [18,19]

Hình 1.3 Các giai đoạn lây nhiễm nấm Colletotrichum ớt (A, B) [17]

(31)

pháp canh tác dùng vi sinh vật có lợi cho trổng, hay nano sinh học [20,21] Vì là đối tượng gây hại nghiêm trọng nhiều loại trồng nên nấm Colletotrichum spp nghiên cứu nhiều giới Bệnh thán thư ớt chứng minh bị gây ra nhiều loài nấm Colletotrichum spp bao gồm C acutatum, C capsici, C gloeosporioides C coccodes [22] Các biện pháp sinh học áp dụng sử dụng hỗn hợp dịch chiết thực vật hay lồi nấm có khả kiểm sốt hay có khả đối kháng với nấm bệnh [23,24]

Việc tìm kiếm hoạt chất thân thiện với mơi trường, có khả kháng nấm để làm nguyên liệu tạo chế phẩm diệt nấm phục vụ cho nông nghiệp phát triển bền vững vấn đề cấp thiết, cần tiến hành Một biện pháp phòng trừ nấm nghiên cứu thực sớm Việt Nam ứng dụng vi sinh vật đối kháng nấm bệnh đạt thành tựu sau: i) Sử dụng vi sinh vật đối kháng nấm sinh vật chức sản xuất phân bón hữu vi sinh; ii) Tạo chế phẩm lên men xốp sử dụng nhóm nấm

Trichoderma sp để phịng trừ nấm gây bệnh trồng, nhiên tác dụng phòng trừ

bệnh chúng cho hiệu chậm [25]

(32)

kéo dài ức chế chiều dài ống mầm, hình thành đĩa áp, phản ứng phát sáng sớm hiệu kéo dài, tích tụ callose kéo dài, tích tụ polyphenol sớm làm gia tăng diện tích vùng tích tụ polyphenol [26]

Nguyễn Thụy Đan Huyền cộng (2013) sử dụng oligochitosan chất kháng nấm tự nhiên để kiểm soát bệnh thán thư hại ớt C gloeosporioides gây Quan sát kính hiển vi sau 20 xử lý cho thấy oligochitosan 0,05% ức chế hoàn toàn nảy mầm bào tử C gloeosporioides Ngâm trái ớt oligochitosan có tác dụng ức chế đường kính vết bệnh thán thư trái ớt Một số tiêu sinh lý, sinh hóa trái ớt bị giảm so với mẫu không lây bệnh nhân tạo bảo quản oligochitosan sau ngày [27]

Lê Thanh Long cộng (2015) khảo sát khả kháng nấm C

acutatum L2 gây bệnh thán thư hại trái cà chua sau thu hoạch nano chitosan

điều kiện in vitro in vivo Kết nghiên cứu chứng minh nano chitosan có khả ức chế nảy mầm bào tử C acutatum L2 hạn chế sinh trưởng phát triển nấm Hiệu lực ức chế 50% 90% đường kính tản nấm, sinh khối khơ đạt tương ứng với nồng độ nanochitosan 0,75 g/L 1,53 g/L, 0,46 g/L 1,1 g/L Nồng độ nanochitosan 1,6 g/L ức chế hoàn toàn sinh trưởng, phát triển

C acutatum L2 Ở điều kiện in vivo, nano chitosan có khả hạn chế phát triển

gây bệnh C acutatum L2 trái cà chua, sau 10 ngày, nồng độ g/L có khả ức chế 76% phát triển đường kính vết bệnh, giá trị MIC50 đạt nồng độ nanochitosan 1,14g/L [28]

Trong xu hướng sản xuất nơng nghiệp hữu cơ, kiểm sốt bệnh thán thư

Trichoderma spp giải pháp nhận nhiều quan tâm nhà nghiên

cứu Kết nghiên cứu Trần Ngọc Hùng Nguyễn Thị Liên Thương (2016) cho thấy C truncatum C acutatum tác nhân gây bệnh thán thư phổ biến trên ớt Bình Dương Trong số 16 loài Trichoderma spp phân lập từ khu vực trồng rau màu Bình Dương, ba loài T koningii T2.2, T koningii T4 T

koningii T5.1 có khả đối kháng tốt với loài Colletotrichum spp phân

(33)

phòng trừ nấm khác Kết nghiên cứu cho thấy tı́nh khả thi việc ứng dụng chế phẩm từ bào tử nấm Trichoderma spp việc phòng trừ bệnh thán thư ớt [29]

1.3 Tổng quan chế kháng kích kháng bệnh thực vật

1.3.1 Cơ chế kháng bệnh thực vật

Có hai chế kháng bệnh thực vật: chế thuộc cấu trúc mô học chế thuộc sinh hóa học [30]

1.3.1.1 Cơ chế kháng bệnh thuộc cấu trúc mô học

Cơ chế kháng bệnh mặt mô học, tùy thuộc vào cách xâm nhập nấm gây bệnh Tạo lớp vách tế bào chung quanh vết thương để bao vây ngăn cản xâm nhập nấm có tính ký sinh yếu, xâm nhập qua vết thương Rắn hóa vách tế bào cách lignin hóa vách tế bào bị nấm xâm nhiễm Hình thành papillae (vách dầy) bên đĩa áp để ngăn cản xâm nhập nấm gây bệnh Tích tụ hợp chất phenol dẫn đến phản ứng tự chết tế bào để cô lập nấm gây bệnh [31]

1.3.1.2 Cơ chế kháng bệnh thuộc sinh hóa học

(34)

chuyển hóa chất béo nsLTPs, AMPs, thionins Vai trị protein tóm lược sau: PR-2 (β-1,3-glucanase) phân hủy vách tế bào vi sinh vật thành β-1,3 glucan β-1,6 glucan Enzyme β-1,3-glucanase chitinase có tác động hỗ trợ làm tăng hiệu phân hủy vách tế bào mầm bệnh

Bên cạnh loạt enzyme khác hình thành tế bào bị nấm bệnh xâm nhiễm đóng vai trị chuyển hóa chất độc mầm bệnh tiết trung hịa độc tính chất tế bào tiết phản ứng lại mầm bệnh Các chất nồng cao gây hại cho tế bào Trong có hai enzyme PAL (phenylalanine ammonia lyase) peroxidase: enzyme PAL có vai trị thúc đẩy sinh tổng hợp hợp chất polyphenol, chất quan trọng chống bệnh trồng; enzyme peroxidase có vai trị khử H2O2 phối hợp với PAL lignin hóa

vách tế bào bị công, ngăn cản học lan xa nấm gây bệnh H2O2 tích tụ

trong tế bào với nhiệm vụ oxy hóa chất độc nấm tiết ra, Oxy hóa polyphenol làm giảm độc tế bào Tuy nhiên, H2O2 nồng độ cao lại gây hại

cho tế bào, cần peroxidase có mặt làm giảm bớt tính độc H2O2 tế bào ký

chủ [30,32]

(35)

resistance) Trong phức jasmonoyl-Isoleucine (JA - Ile) tín hiệu tạo ISR khởi động đáp ứng phụ thuộc JA Khi tiểu đơn vị MED8, MED16 MED25 phức trung gian tương tác với số yếu tố phiên mã kiểm soát biểu gen liên quan JA [33] Sự kết hợp hệ thống tín hiệu kích thích đáp ứng kháng bệnh thực vật cho phép thực vật có nhiều lựa chọn để có chiến lược chiến thuật phát triển phản ứng phòng vệ đối tượng gây bệnh khác Ngược lại yếu tố gây bệnh tìm cách thích nghi với hệ thống tín hiệu nói để tạo thích nghi đặc hiệu thực vật chủ [34]

1.3.2 Chất kích kháng bệnh (elicitor) thực vật

Trong thể thực vật tồn gen kháng (resistant genes - R genes) gen điều khiển phản ứng đáp trả ảnh hưởng môi trường Khi yếu tố bất lợi (nấm, vi khuẩn, virus, côn trùng, tia UV) tác động đến thực vật sau thời gian kích hoạt gen kháng Tính kháng phát huy chậm dẫn đến tình trạng trồng giảm khả sinh trưởng phát triển Vì cần có biện pháp kích thích gen kháng hoạt động sớm Gần số chất phát có vai trị này, gọi chất kích kháng (elicitors) Khi xử lý chất kích kháng trực tiếp hạt giống, cây, rễ cho vào đất, chế kháng trồng “đánh thức” giúp trồng kháng lại xâm nhiễm mầm bệnh hay hạn chế tổn thương tác động từ yếu tố môi trường Các chế bao gồm: Quá trình làm dày thành (vách) tế bào; Sản sinh chất có hại mầm bệnh; Phản ứng siêu mẫn cảm tế bào để cô lập mầm bệnh [35]

(36)

Hình 1.4 Cơ chế kháng bệnh nấm thực vật (A) chế kích kháng

của chitin (B) [36]

(37)

Chúng thường phân tử từ cấu tạo vách tế bào (glucan, chitin, flagellin vi khuẩn hay lipopolysaccharide (LPS), hay chất xâm nhập công tác nhân gây bệnh Một vài elicitor có chức chưa rõ

Trong tương tác gây bệnh thực vật, elicitor cảm ứng sản xuất enzyme phân hủy vách tế bào, phóng thích phân đoạn pectic, oligogalacturonides (OGAs) đóng vai trị nội elicitor Các elicitor virus hay trùng acid béo amino acid liên hợp (Fatty acid Amino acid Conjugates) dẫn tới hình thành hợp chất bay dẫn dụ hay hoạt hóa gen kháng trùng Các elicitor hóa học hoạt hóa tính kháng bao gồm việc tích lũy phytoalexin Các elicitor tác nhân phi sinh học (abiotic) ion kim loại hợp chất vô hay chất chuyển hóa từ sinh vật khác chất hóa học phóng thích từ vị trí cơng hay tích lũy hệ thống bệnh hay côn trùng gây [36, 37]

1.4 Chitin/Chitosan Silic kích kháng bệnh trồng

Chitin Silic (Si) hai nguồn nguyên liệu phổ biến chiếm tỷ trọng sinh khối lớn trái đất cellulose [38,40] Các nghiên cứu thực vật cho thấy chitin/chitosan Silic có vai trị kích kháng bệnh thực vật có liên quan đến elicitor tác nhân ion kim loại hợp chất hữu [39,41]

1.4.1 Vai trò chitin/chitosan kích kháng bệnh

Chitin cấu thành xương loài động vật chân đốt bao gồm lồi trùng động vật giáp xác Ngồi ra, chitin cịn tìm thấy thành tế bào nhiều loại vi khuẩn, nấm, tảo sinh vật đơn bào khác [38]

(38)

poly-electrolyte dung dịch Đây sản phẩm tự nhiên, khơng độc, an tồn với mơi trường sử dụng rộng rãi [42]

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học chitin chitosan (DP > 50%) [42]

Các khảo sát chitin phân đoạn thủy phân cho thấy chúng có khả tác động trực tiếp chống lại tác nhân gây bệnh nấm Oomycete thông qua chế gia tăng khả đề kháng dựa theo đường PTI (PAMP triggered Immunity), giúp tiết chất kháng lại xâm nhập mầm bệnh [34,37] Bên cạnh đó, chitin xâm nhập vào mơ cây, thường kết dính quanh vị trí xâm nhập có ba tác động chính: Thứ lập hàng rào cách ly vị trí xâm nhập để tránh mầm bệnh lây lan bảo vệ tế bào khỏe mạnh khác Tại vị trí cách ly, nhận biết để kích thích phản ứng nhạy cảm giúp tiết oxygen hoạt hóa (Reactive oxygen species, ROS) để giúp tăng cường thành tế bào báo động cho tế bào bên cạnh Chitin có điện tích dương có khả bám chặt vào màng sinh học, chitin cung cấp khả làm lành vết thương nhanh chóng có tổn hại học hay mầm bệnh cơng Chitin chất có khả kích hoạt chế phòng thủ cây, chitin tiếp xúc với mơ thực vật kích thích tiết enzyme bảo vệ chitinase, glucanase, protein kháng bệnh hay hợp chất phytoalexin để từ tiêu diệt mầm bệnh kích kháng trồng [37]

(39)

các tiểu phần thụ quan CEBiP (Chitin elicitor binding protein, motif lysine hay LYM) CERK1 (Chitin elicitor receptor kinase 1) màng tế bào mở đầu đường truyền tín hiệu RLCK (Receptor Like cytoplasmic Kinase) dẫn truyền đến RLCK185 qua phosphoryl hóa MAPKK (Mitogen activated ptotein kinase) theo tầng để cảm ứng tính kháng bệnh thực vật từ chitin (Hình 1.4B) [36] Một chế tương tự tìm thấy thụ quan PBL27 Arabidopsis thaliana Trong thí nghiệm phân đoạn oligochitin (DP = - 8) tìm thấy thích hợp cho đường truyền tín hiệu Arabidopsis thaliana [45] Kết dựa mơ hình thực khẳng định vai trị kích kháng thực vật chitin

Chitosan lần chứng minh có tính kháng nấm từ năm 1979 Allan Hadwiger Hiện có đến 8.700 cơng trình nghiên cứu chitosan dẫn xuất cơng bố tạp chí Scopus cho thấy chitosan/oligochitosan có nhiều hoạt tính sinh học kháng khuẩn, kháng nấm, tuyến trùng, kháng côn trùng, kháng stress phi sinh học chống oxi hóa áp dụng rộng rãi xử lý môi trường, y học, mỹ phẩm, thực phẩm nông nghiệp [46, 47, 48, 49]

Mặc dù chitosan, oligochitosan sản phẩm deacetyl hóa chitin có nhiều cơng dụng chế kích kháng bệnh đường truyền tín hiệu có liên quan đến chất cịn tìm kiếm chưa hồn tồn hiểu rõ [50] Việc tìm kiếm oligochitosan trọng lượng phân tử nhỏ có khả kích kháng thực vật, nhiều phân đoạn chọn lọc [51, 52] nhiều phương pháp khác sử dụng cắt mạch hóa học [53], thủy phân enzyme [54], dùng sóng siêu âm [55] chiếu xạ tia gamma

(40)

Phương pháp khử sinh học sử dụng enzyme cắt mạch cho hiệu suất tương đối cao giá thành đắt so với phương pháp hóa học nguồn enzyme khơng phải ln có sẵn chi phí cao

Một số nghiên cứu dùng sóng siêu âm cho phép biến đổi chitosan có khối lượng phân tử lớn thành chitosan có khối lượng phân tử trung bình, chưa tạo chitosan với trọng lượng phân tử nhỏ

Phương pháp chiếu xạ xem kỹ thuật hữu hiệu để cắt mạch chitosan quan điểm thân thiện với môi trường Phương pháp gây thay đổi cấu trúc phân tử chitosan, ảnh huởng tới độ deacetyl chitosan Hiện nay, phương pháp chiếu xạ sử dụng nhiều để chế tạo oligochitosan với khối lượng phân tử nhỏ có khả kích kháng nấm gây bệnh cho trồng [56]

Sử dụng phương pháp chiếu xạ (tia γ) cho thấy trọng lượng phân tử trung bình chitin/chitosan thay đổi từ 10 - 100 kDa, oligochitosan thường có trọng lượng phân tử nhỏ 10 kDa Các nghiên cứu gần cho thấy phân đoạn oligochitosan có trọng lượng phân tử nhỏ (5 kDa) thường có hoạt tính kháng bệnh cao [57] Ngồi phân đoạn kDa cịn phân đoạn khác chưa khảo sát, nguồn nguyên liệu đầy tiềm nghiên cứu liên quan đến tính kháng bệnh số thực vật kích thích tăng trưởng thực vật số oligosaccharide khác [58]

Việc kết hợp phương pháp chiếu xạ xử lý hóa học tạo oligichitosan xem điểm nghiên cứu này: làm giảm liều chiếu xạ, kiểm soát hiệu trình cắt mạch chitosan để tạo phân đoạn oligochitosan có kích thước nhỏ phù hợp

1.4.2 Vai trị Silic kích kháng bệnh

(41)

sức đề kháng cho trồng chịu hạn, mặn, nhiễm độc kim loại làm tăng hoạt động enzyme Si tham gia vào tái tạo vách tế bào hàng rào phòng thủ hữu hiệu thực vật Si bảo vệ thực vật chống lại stress, không làm ảnh hưởng đến tăng trưởng suất trồng

Hơn nữa, Si chứng minh giúp cải thiện sức đề kháng nhiều thực vật tác nhân gây bệnh (nấm, vi khuẩn virus) khác [59, 60] Việc áp dụng Si đề xuất biện pháp thay cho biện pháp kỹ thuật thông thường nhằm kiểm sốt bệnh trồng Si cải thiện khả chịu áp lực môi trường tăng sản lượng vụ mùa Hơn nữa, sử dụng Si biện pháp phòng ngừa chống lại số bệnh nấm Hai giả thuyết cho Si nâng cao khả kháng nấm bệnh đề xuất Đầu tiên liên kết với lắng đọng cao Si để hình thành rào cản vật lý để cản trở tác nhân gây bệnh xâm nhập Điều thứ hai có liên quan đến vai trị hoạt tính sinh học điều hịa biểu gen biểu chế phòng vệ tự nhiên (cơ chế sinh hóa phân tử) (Hình 1.6)

(42)

Hình 1.6 Cơ chế phịng vệ (A) rào phòng thủ vật lý (B) Si nấm bệnh

[59]

Về giả thuyết thứ hai kích kháng tăng cường sinh hóa, Si hịa tan tế bào thực vật liên quan chặt chẽ với gia tăng sức đề kháng với nấm bệnh Trong mơ hình này, việc tăng cường sức đề kháng tăng hoạt động enzyme phòng vệ liên quan polyphenoloxidase, peroxidase, phenylalanine ammonialyase, chitinase, β-1,3-glucanase gia tăng hợp chất kháng nấm, sản phẩm chuyển hoá phenolic (lignin), flavonoid, phytoalexin protein liên quan đến bệnh thực vật kích hoạt số gen phòng bệnh thực vật [63] Hàm lượng acid salicylic, acid jasmonic ethylene báo cáo gia tăng bổ sung Si số tương tác chủ-tác nhân gây bệnh phấn trắng Arabidopsis thaliana Gol cichoracearum đốm nâu lúa

Cochliobolus miyabeanus [64]

(43)

hóa protein trung gian tín hiệu tế bào Si kiểm sốt truyền phát tín hiệu hướng dẫn việc tổng hợp hợp chất kháng khuẩn, kiểm sốt phát hệ thống tín hiệu Bằng cách này, acid silicic đóng vai trị kích kháng, chỗ hệ thống [59, 65]

Domiciano cộng (2015) khảo sát ảnh hưởng Si lên khả kháng bệnh đạo ôn (cháy lá) gây Pyricularia oryzae lúa Cây lúa bổ sung thêm dung dịch dinh dưỡng chứa mM Si (+Si) không bị nhiễm P oryzae trong không bổ sung Si (-Si) bị nhiễm P oryzae Các số sinh lý hóa có liên quan đến tính kháng bệnh sinh trưởng bổ sung +Si cao so với –Si nồng độ chlorophyll a, chlorophyll b, chlorophyll a + b, carotenoid, hoạt tính lypoxigenase (LOX), catalase (CAT) Việc sử dụng Si có tác dụng làm giảm tượng cháy lúa, cải thiện hiệu suất trao đổi khí, giảm rối loạn quang hóa lúa [66]

Mức độ nhiễm bệnh thán thư nấm C lindemuthianum gây đậu giảm 34% +Si so với đối chứng Tỷ lệ hấp thụ carbon, tốc độ dẫn khí thoát nước +Si cao đáng kể so với đối chứng Nồng độ superoxide dismutase (SOD), ascorbate peroxidase (APX) glutathione reductase (GR) +Si cao so với đối chứng Nồng độ hydrogen peroxide +Si thấp đáng kể so với đối chứng Kết nghiên cứu cho thấy việc sử dụng Si hạn chế bệnh thán thư nấm C lindemuthianum gây ra, tăng cường enzyme chống oxy hố, tăng cường khả trao đổi khí, giảm hình thành phản ứng liên quan đến CO2 [67]

1.5 Chế tạo oligochitosan, nano silica ứng dụng kích kháng bệnh

1.5.1 Chế tạo oligochitosan

Nhiều phương pháp nghiên cứu đề xuất để chế tạo chitosan từ chitin Tuy nhiên phương pháp phổ biến deacetyl hóa chitin dung dịch kiềm sử dụng nhiệt độ cao (> 80oC) Việc sản xuất công nghiệp chitosan dựa theo

(44)

một phản ứng hóa học nhiều giai đoạn, điều kiện phản ứng (kích thước phân tử chitin ban đầu, tỷ lệ chất phản ứng, chất xúc tác, nhiệt độ) có ảnh hưởng lớn đến cấu trúc đặc tính chitosan tạo thành Chính thế, nghiên cứu chế tạo chitosan từ chitin nghiên cứu để kiểm sốt q trình phản ứng chất lượng chitosan tạo thành [69]

Phương pháp deacetyl chậm dung dịch kiềm nhiệt độ phòng nghiên cứu [70] Phản ứng xảy nhiệt độ phòng, thời gian phản ứng khoảng 48 để sản xuất chitosan với độ deacety khoảng 50% Sự phân bố ngẫu nhiên đơn vị acetyl cấu trúc chitin tạo số điểm đẳng điện giúp chitosan tan dung dịch nước trung tính

Phương pháp chế tạo chitosan dung dịch kiềm lạnh nghiên cứu Trong phương pháp này, chitin xử lý dung dịch NaOH (10 - 50% wt) qua nhiều q trình lạnh đơng rã đông tạo thành cấu trúc đặc biệt chitin Cuối dung dịch đun nóng (khoảng 110oC) để tiến hành

quá trình deacetyl hóa [70]

(45)

Vellingiri cộng (2013) tiến hành nghiên cứu tổng hợp thành công hạt nano chitosan Kích thước hạt thay đổi từ nm đến 180 nm, xác định thơng qua kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) tán xạ ánh sáng (DLS) Các hạt nano chitosan được dùng để xử lý vật liệu cotton 100%, viscose polyester để chống vi khuẩn Các loại vải xử lý thử nghiệm cho hoạt tính kháng khuẩn theo AATCC 100-2004 AATCC 124-2009 kết chứng minh hoạt tính kháng khuẩn Salmonella aureus cao hai thí nghiệm định tính định lượng [74] Chitosan chế tạo từ vỏ tôm (α-chitosan) mai mực (β-chitosan) Cắt mạch dung dịch chitosan để chế tạo oligochitosan chiếu xạ gamma Co-60 nghiên cứu Cấu trúc oligochitosan khảo sát phổ FT-IR phổ UV-Vis Kết cho thấy xuất nhóm carbonyl liên kết đơi chưa bão hòa C=C cuối mạch sản phẩm chiếu xạ [75]

Trần Xuân Mậu (2015) điều chế oligochitosan cách cắt mạch chitosan H2O2 Các yếu tố tác động lên trình cắt mạch nhiệt độ, nồng độ H2O2

thời gian phản ứng Hàm mục tiêu phân tử lượng (M) độ deacetyl hóa (DD) oligochitosan Phân tử lượng oligochitosan phụ thuộc nhiều vào điều kiện phản ứng đạt giá trị khoảng tử đến 30,414 kDa Độ deacetyl hóa chitosan giảm từ 86% xuống 65% phản ứng Oligochitosan với phân tử lượng 30,414 kDa độ deacetyl hóa 78% có tác dụng kích thích nẩy mầm hạt lúa nồng độ 0,005% dung dịch acid acetic 0,1% [76]

1.5.2 Chế tạo nano silica

Si có nhiều ứng dụng làm vật liệu hấp phụ, chất mang, chất độn, làm chất tăng trưởng kích kháng bệnh cho trồng [77, 78, 79] Vỏ trấu phụ phẩm lúa, nguồn phế thải nơng nghiệp có nhiều nước trồng lúa Việt Nam, Thái Lan, Trung Quốc Theo ước tính lúa thải ~0,23 vỏ trấu Ở Việt Nam, ước tính sản lượng lúa khoảng 40 triệu tấn/năm, lượng vỏ trấu thải khoảng 9,2 triệu tấn/năm Khi đốt cháy vỏ trấu tạo tro chứa 90% SiO2 (silica), thường dạng kết tinh Nếu kiểm soát trình điều kiện đốt cháy,

(46)

silica (nano SiO2) từ vỏ trấu nhằm giá tăng giá trị nguồn phế thải nông nghiệp

[80] Lê Văn Hai cộng (2013) xây dựng quy trình tạo nano silica có kích thước đồng qua hai giai đoạn: Đầu tiên vỏ trấu xử lý nhiệt để tạo thành tro trấu, sau nano silica tạo thành phương pháp sol-gel từ tro trấu

- Tro trấu đạt phương pháp xử lý nhiệt vỏ trấu nhiệt độ 600oC

trong giờ, tiếp tục xử lý HCl H2SO4 nhằm loại bỏ tạp chất vô

để thu sản phẩm silica có độ tinh thiết cao

- Silica tinh khiết hòa tan dung dịch NaOH cuối kết tủa H2SO4 pH hỗn hợp butanol/nước với diện chất hoạt động

bề mặt cation

Sản phẩm thu dạng bột silica vơ định hình có kích thước trung bình khoảng 15 nm Cấu trúc tính chất sản phẩm nano silica xác định phương pháp SEM, TEM, XRD, EDX, FTIR Quy trình tổng hợp ứng dụng để sản xuất silica kích thước nanomet có nguồn gốc từ chất thải nơng nghiệp vỏ trấu [81]

Nguyễn Trí Tuấn cộng (2014) tổng hợp thành công hạt nano silica từ vỏ trấu phương pháp kết tủa: vỏ trấu nung nhiệt độ từ 500 – 700oC thời

gian giờ, thu tro vỏ trấu Sau bột silica nano tách chiết từ tro trấu cách sử dụng dung dịch NaOH có nồng độ 3N tiếp tục thêm dung dịch HCl độ pH dung dịch kết tủa trắng Sản phẩm hạt nano silica chế tạo có pha vơ định hình kích thước hạt trung bình khoảng 15 nm [82]

Sản phẩm nano silica nghiên cứu tạo theo Lê Văn Hai cộng (2013) có cải tiến: vỏ trấu xử lý hóa học acid HCl trước nung

1.5.3 Chế tạo oligochitosan-silica nano

(47)

thuộc vào giá trị pH, vai trò chitosan việc hình thành hạt nano silica khác Ở nồng độ pH thấp (5 - 6), chitosan thúc đẩy hình thành nano silica kích thước lớn so với hạt nano silic tạo điều kiện pH 6,5 - 8,5 Tuy nhiên kết phân tích khả hấp thu nitơcho thấysự phát triển nano silica giai đoạn khác tạo hạt nano silica có kích thước khác Ở nồng độ chitosan cao, kích thước hạt nano silica tăng khoảng pH - 6, pH 6,5 - 8,5 hạt nano silica thu có kích thước nhỏ Ở pH 9, nồng độ chitosan không ảnh hưởng đến hình thành hạt nano silica [83]

Al-Mulla Al-Sagheer (2013) thực thí nghiệm gồm hai yếu tố: Tỷ lệ chitosan/silic (0,1; 0,4; 0,8 1,6) pH hỗn hợp (3, 6) Kết cho thấy phối trộn chitosan silic giá trị pH ban đầu, hỗn hợp kết tủa nhanh chóng Lượng kết tủa tăng lên tăng pH hỗn hợp tăng tỷ lệ chitosan/silic lượng kết tủa không giảm giảm pH hỗn hợp Hỗn hợp chuẩn bị môi trường pH tạo hai pha rắn (bao gồm pha giàu silic pha giàu chitosan), khi hỗn hợp chuẩn bị pH tạo pha lỏng pha rắn Ở pH sản phẩm sau nung từ pha giàu silic cho cấu trúc xốp phức tạp, pha giàu chitosan cho cấu trúc xốp phân cấp, pH sản phẩm sau nung có cấu trúc phân cấp Cấu trúc phân cấp khác sản phẩm silic thu cách thay đổi giá trị pH hỗn hợp tỷ lệ chitosan/silic Chitosan có tính ổn định nhiệt thấp vật liệu nano chitosan - silic [84]

(48)

Kết nghiên cứu Sun cộng (2016) cho thấy nồng độ SiOx ảnh hưởng đến hình thái cấu trúc vi mô lớp màng phủ chitosan Khi tăng nồng độ nano SiOx kích thước hạt số lượng nano SiOx tăng Hỗn hợp chitosan-nano SiOx hình thành liên kết hydro nano SiOx phân tử chitosan, đồng thời liên kết C=O amidell phân tử chitosan bị ảnh hưởng Nồng độ nano SiOx tối ưu kết hợp với chitosan màng chitosan có tính bán thấm tính học tốt nhất, cải thiện đặc tính chitosan 0,03% [86]

1.5.4 Ứng dụng vật liệu nano nơng nghiệp

Nhóm nghiên cứu Trung tâm VINAGAMMA hợp tác với Viện Nghiên cứu Mía đường Viện lúa Đồng Sông Cửu Long khảo sát hiệu ứng kích kháng bệnh tăng trưởng oligochitosan mía lúa Chỉ số bệnh than nấm

Ustilago scitaminea bệnh thối đỏ nấm Collectotrichum falcatum gây giảm

xuống tương ứng cịn 44,5% 72,3% lơ xử lý phun oligochitosan 30 ppm so với đối chứng phun nước (100%) Kết cho thấy xử lý phun oligochitosan nồng độ 15, 30 60 ppm cho mía làm gia tăng chiều cao suất Đối với nghiệm thức xử lý oligochitosan 15 ppm, chiều cao suất cao so với đối chứng khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê Xử lý oligochitosan 30 ppm làm gia tăng rõ rệt chiều cao suất mía thí nghiệm: suất tăng từ 63,24 tấn/ha (ĐC) lên đến 71,38 tấn/ha (xử lý oligochitosan 30 ppm) Khi tăng nồng độ oligochitosan lên 60 ppm, chiều cao suất mía tăng khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức xử lý oligochitosan 30 ppm Phun qua oligochitosan nồng độ 30 ppm thích hợp để kích kháng bệnh kích thích sinh trưởng tăng suất mía [87]

Nghiên cứu trái lê nhóm nghiên cứu Meng cộng (2010) cho thấy chitosan (350,0 kDa) oligochitosan (6,0 kDa) có hiệu ức chế phát sinh bào tử phát triển hệ sợi nấm Alternaria kikuchiana Tanaka

Physalospora piricola Nose Chitosan oligochitosan tác động ức chế tăng trưởng

(49)

β-1,3-glucanase, chitosan lại làm tăng hoạt động peroxidase Oligochitosan 6,0 kDa cho kết kháng nấm in vitro tốt hơn, chitosan lại cho kết kháng bệnh thán thư trái lê tốt [88]

Nghiên cứu bệnh thán thư trái đu đủ Eksotika II sau thu hoạch, Asgar Ali đã cho trái đu đủ thí nghiệm tiếp xúc với nấm C gloeosporioides phút nhúng vào dung dịch chitosan nồng độ khác nhau, sau bảo quản 12oC độ

ẩm 80 - 90% Kết cho thấy chitosan nồng độ 1,5% 2% giúp làm giảm đáng kể bệnh thán thư nấm C gloeosporioides trái đu đủ Nghiên cứu cho thấy hàm lượng hợp chất phenol, xem chất kích kháng tế bào thực vật sản sinh hoạt động enzyme chitinase, β-1,3-glucanase peroxidase tăng cao trái đu đủ có xử lý với chitosan so với đối chứng không xử lý Chitosan có tiềm làm chất bảo vệ sinh học để kiểm soát hư hỏng sau thu hoạch nấm C gloeosporioides gây trái đu đủ thông qua tích lũy hợp chất phenol enzyme chitinase, β-1,3-glucanase peroxidase trái đu đủ Đây tác động tổng hợp bao gồm tác động trực tiếp chitosan lên nấm làm tăng nhạy cảm nấm enzyme thủy phân tế bào thực vật sản sinh [89]

Nghiên cứu Võ Thị Mai Hương Trần Thị Kim Cúc (2012) cho thấy chitosan oligosaccharid (COS) có tác dụng kích thích sinh trưởng lạc (Arachis

hypogea), tăng khả hình thành nốt sần, kích thích hoa tăng suất

lạc, đặc biệt nồng độ COS 100 - 150 ppm Số lượng khối lượng nốt sần lạc tăng đạt cao (146,5 nốt sần/cây 1,19 g/cây) nồng độ COS 100 - 150 ppm Các yếu tố cấu thành suất lạc tăng sử dụng nồng độ COS 100 - 200 ppm Ở giai đoạn thu hoạch, lơ có xử lý COS có hàm lượng chất khơ cao so với đối chứng COS có nồng độ 100 - 150 ppm có hiệu khả tích lũy chất khơ lạc với hàm lượng 26,18 - 27,06% Năng suất đạt cao 32,82 tạ/ha xử lý COS nồng độ 100 ppm, tăng 20,70% [90]

(50)

ATCC 10231) Gram âm (Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 E coli ATCC 8739) 150 – 490 μg/mL Các chitosan tạo thành từ thủy phân chitosan có khối lượng phân tử lớn khoảng 200 kDa với phương pháp thủy phân enzyme chitosanase Khối lượng phân tử trung bình chitosan tạo nằm khoảng 3,5 - 7,8 kDa xác định phương pháp phân tích HPLC, MALDI-TOF MS phân tích khối phổ [91]

Qing cộng (2015) nghiên cứu ảnh hưởng chitosan lên nấm

Sclerotinia sclerotiorum gây bệnh mốc trắng củ cà rốt (Daucus carota subsp sativus

(Hoffm.) Schübl & G Martens) cho kết chitosan có độ deacetyl 90%, khối lượng phân tử 350 kDa nồng độ 1% có tác động ức chế rõ rệt đến phát triển tơ nấm sinh khối nấm Màng sinh chất sợi nấm xử lý với chitosan bị phá hủy, đồng thời peroxit hóa lipit rị rỉ protein sợi nấm có xử lý chitosan cao sợi nấm đối chứng không xử lý chitosan Như chitosan phá hủy trực tiếp màng sinh chất sợi nấm S sclerotiorum cảm ứng hoạt động enzyme bảo vệ cà rốt gồm polyphenoloxidase peroxidase [92]

Chitosan kết hợp với nano bạc để đánh giá khả kháng nấm C

gloeosporioides gây bệnh thán thư trái xoài 78% phát sinh bào tử nấm C gloeosporioides bị ức chế sử dụng chitosan nano bạc nồng độ 10 μg/mL Sự phát

sinh bào tử nấm bị ức chế hoàn toàn tăng nồng độ chitosan nano bạc lên đến 100 μg/mL [93]

Lê Quang Luân (2014) tổng hợp chế phẩm keo nano bạc có kích thước hạt nano 5, 10 15 nm chế tạo phương pháp chiếu xạ tia gamma (Co-60) sử dụng chitosan 1% làm chất ổn định Trong khoảng nồng độ bạc bổ sung từ 20 đến 100 ppm có tác dụng ức chế phát triển khuẩn lạc nấm Phytophthora

capsici, gây bệnh chết nhanh cho hồ tiêu (Piper nigrum L.) điều kiện in vitro, tương ứng từ 22,6% đến 92,9% Hiệu lực ức chế phát triển nấm gia tăng

(51)

bức xạ hứa hẹn sản phẩm cơng nghệ cao, an tồn hiệu phòng trị bệnh chết nhanh hồ tiêu nấm P capsici gây [94]

Nghiên cứu tác dụng nano silica ngô (Zea mays L.) tiết lộ khả cải thiện tăng trưởng tăng ổn định giống, giúp giảm stress phi sinh học đóng góp đáng kể đến thích nghi ngơ Ngồi sử dụng nano silica ngơ giúp cải thiện tỷ lệ nước lá, q trình chống oxy hóa Nano silica cịn tổng hợp để sử dụng nguồn phân bón hỗ trợ cho nông nghiệp bền vững [95]

Khảo sát ảnh hưởng nano silica đến sâu khoang Spodoptera littoralis cây cà chua (Solanum lycopersicum L.), thí nghiệm tiến hành với hai nghiệm thức: Xử lý với nano silica không xử lý, lặp lại lần LD50 nano silica 212,045 ppm với độ dốc 4,553 Nồng độ nano silica sử dụng 100, 150, 200, 250, 300 350 ppm với liều lượng 50 mL/cây, ấu trùng Spodoptera littoralis phơi nhiễm cà chua bị chết sau 15 ngày xử lý Ở tất nồng độ xử lý có khả năng gây độc với Spodoptera littoralis khả gây độc cao nồng độ 300 350 ppm Kết nghiên cứu khẳng định sử dụng nano silica để kiểm sốt

Spodoptera littoralis [96]

Nguyễn Thị Bích Ngọc cộng (2015) chế tạo thành công nano composit Ag–silica sử dụng để bọc hạt giống đậu tương nhằm loại trừ tác hại số loại nấm tồn lưu đất Fusarium oxysporum, Colletotrichum spp Rhizoctonia

solani gây bệnh cho trồng Các kết cho thấy, nồng độ 200 ppm nano bạc

chứa vật liệu nano composit, loại nấm gần bị ức chế hoàn toàn Khi sử dụng vật liệu bọc bề mặt hạt đậu tương làm tăng khả chống lại xâm nhiễm nấm giai đoạn con, tạo điều kiện cho sinh trưởng phát triển tốt [97]

Nghiên cứu ảnh hưởng nano silica so với Silic Diazinon, loại thuốc trừ sâu, thực lên bí nhà kính để phịng trừ ấu trùng

Spodoptera littoralis (Bosid.) bốn nồng độ khác nhau: 200, 300, 400 500 ppm

Kết thu sử dụng nano silica cho khả kháng ấu trùng Spodoptera

(52)

tăng tăng nồng độ xử lý Tỷ lệ ấu trùng nở bị ảnh hưởng nồng độ phương pháp xử lý, tỷ lệ chết ấu trùng nở 73,07; 79,72; 87,88 89,82% theo nồng độ xử lý xử lý với Diazinon, tỷ lệ chết 95,95% Ở giai đoạn phát triển, số lượng côn trùng bị ảnh hưởng phương pháp điều trị Nghiên cứu khuyến cáo sử dụng nano silica nồng độ 500 ppm để phòng trừ

(53)

CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

Đề tài gồm bốn nội dung thực

- Nội dung 1: Phân lập, khảo sát khả gây bệnh mẫu phân lặp định danh hình thái, đặc điểm phân tử lồi nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư ớt thiên

- Nội dung 2: Hoàn thiện công nghệ tạo oligochitosan-silica nano

- Nội dung 3: Đánh giá khả kích kháng bệnh thán thư nấm

Colletotrichum gloeosporioides C truncatum gây oligochitosan-silica nano

trên ớt điều kiện phịng thí nghiệm

- Nội dung Đánh giá khả kích kháng bệnh thán thư nấm C

gloeosporioides C truncatum gây oligochitosan-silica nano ớt trồng

trong điều kiện nhà màng đồng ruộng

Hình 2.1 Sơ đồ thể liên quan nội dung nghiên cứu đề tài

2.2 Thời gian, địa điểm điều kiện nghiên cứu

2.2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu

Đề tài thực từ 2014 đến 2018 tại: Nội dung

Nội dung

Kết tốt từ ND 1,

(54)

+ Các mẫu bệnh thán thư ớt thu thập ruộng sản xuất Củ Chi (Thành phố Hồ Chí Minh), Huyện Thanh Bình (Tỉnh Đồng Tháp) Huyện Tân Châu (Tỉnh Tây Ninh)

+ Việc phân lập, khảo sát định danh mẫu phân lập thực Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

+ Thí nghiệm điều chế oligochitosan, nano silica oligochitosan-silica nano thực Trung tâm Nghiên cứu Triển khai Cơng nghệ Bức xạ (VINAGAMMA)

+ Thí nghiệm khảo sát hiệu kích kháng phân oligochitosan, nano silica oligochitosan-silica nano thực Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học Môi trường (Trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh), Củ Chi Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao

2.2.2 Điều kiện thực nghiên cứu

2.2.2.1 Điều kiện nhà màng thí nghiệm (tại Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Nông nghiệp Cơng nghệ cao)

Hình 2.2 Kiểu nhà màng thơng gió cố định sử dụng làm thí nghiệm

(55)

được lợp màng Polymer dày 150 µm vách xung quanh che lưới chắn côn trùng dày 50 mesh

Các thí nghiệm nhà màng tiến hành từ tháng 03 – 09/2017 Cây ớt trồng bầu giá thể 70% mụn xơ dừa + 20% phân trùn quế + 10% tro trấu

Bảng 2.1 Nhiệt độ ẩm độ khơng khí nhà màng thời gian thí nghiệm

Tháng Nhiệt độ trung bình (oC) Ẩm độ khơng khí trung bình (%)

3/2017 33,5 59,1

4/2017 34,2 58,6

5/2017 33,4 59,2

6/2017 32,1 60,3

7/2017 31,7 62,6

8/2017 31,5 64,5

9/2017 31,2 61,8

(Ghi nhận tác giả thời gian thí nghiệm)

Giá trị trình bày Bảng 2.1 trung bình lần quan trắc 7, 9, 11, 13, 15 17 hàng ngày Bảng 2.1 cho thấy nhiệt độ trung bình khoảng thời gian thí nghiệm dao động từ 31,2 - 34,2oC ẩm độ không khí dao động từ 58,6 -

64,5%, thích hợp cho sinh trưởng phát triển ớt thiên, khơng ảnh hưởng đến yếu tố thí nghiệm

2.2.2.2 Điều kiện đồng ruộng Thành phố Hồ Chí Minh

Các thí nghiệm đồng ruộng tiến hành từ tháng 10/2017 đến tháng 12/2017 đất xám phù sa Thành phố Hồ Chí Minh

(56)

Bảng 2.2 Đặc tính lý hóa đất khu thí nghiệm

Thành phần

cơ giới (%) pHH2O CHC

(%)

CEC (meq/100g)

Nts Pts Kts Pdt Kdt

Cát Thịt Sét (mg/kg) (mg/100g)

62,4 28,6 9,0 5,3 2,1 3,3 786 336 772 12,6 8,5

(Trung tâm Quản lý Môi trường Tài nguyên, trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM, 2017) Bảng 2.3 Đặc điểm khí hậu thời tiết Thành phố Hồ Chí Minh

trong thời gian thí nghiệm

Tháng Nhiệt độ trung bình (oC)

Tổng số nắng (giờ)

Tổng lượng mưa (mm)

Độ ẩm trung bình (%)

10/2017 28,0 140,8 574,6 79,0

11/2017 28,0 147,0 223,3 77,0

12/2017 27,4 155,2 75,6 70,0

(Trung tâm dự báo Khí tượng Thủy văn khu vực Nam Bộ, 2018)

Bảng 2.3 cho thấy nhiệt độ trung bình ẩm độ trung bình từ tháng 10 năm 2017 đến tháng 12 năm 2017 phù hợp cho sinh trưởng phát triển ớt Về tổng lượng mưa nắng tương đối, tác động đến khả sinh trưởng phát triển ớt đồng ruộng

2.3 Vật liệu nghiên cứu

- Giống ớt thiên TN 278 Công ty Trang Nông phân phối: Giống sinh trưởng phát triển mạnh, chiều cao trung bình từ 90 - 110 cm, có nhiều trái, trái đẹp, suất trung bình từ 1,5 đến 2,5 tấn/1.000 m2

(57)

môi trường PDA

- Chitosan (Chitoworld, Việt Nam) ngun liệu chế tạo từ vỏ tơm có Mw ~ 110,4 kDa, độ deacetyl khoảng 93,2%

- Hydro peroxit (H2O2) ( Merck, Đức)

- Vỏ trấu lấy từ nhà máy chế biến vỏ trấu Tỉnh Cần Thơ Mẫu lấy cách ngẫu nhiên, không phụ thuộc vào giống lúa, thời gian lấy mẫu

- HCl, acid lactic, NaOH, CH3COONa, CH3COOH, KBr (Merck, Đức)

- Môi trường nuôi cấy vi sinh vật PDA (Merck, Đức)

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Nội dung Phân lập, khảo sát khả gây bệnh mẫu phân lập định danh loài nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư ớt

2.4.1.1 Phân lập nấm gây bệnh thán thư ớt

Các mẫu lá, thân trái ớt có biểu triệu chứng bệnh thán thư thu thập ruộng ớt Củ Chi (Thành phố Hồ Chí Minh), Tân Châu (Tây Ninh), Thanh Bình (Đồng Tháp) (Bảng 2.4) Đây địa điểm có diện tích trồng ớt nhiều bệnh thán thư gây hại lớn

Đối với mẫu trái bệnh: mẫu bệnh thu nguyên phần trái Mẫu bệnh thân thu đoạn có phần mơ khỏe mơ bị bệnh Thu thập mẫu bị nhiễm bệnh Mẫu bệnh ghi đầy đủ thơng tin mã hóa ký hiệu:

- Địa điểm: Tây Ninh: TN; Hồ Chí Minh: HCM; Đồng Tháp: ĐT;

- Bộ phận gây hại: trái: Tr; lá: L; Thân: Th

(58)

Bảng 2.4 Danh sách mẫu bệnh thu thập đề tài

Tên mẫu Bộ phận gây hại Địa điểm lấy mẫu

TN-Tr1 Trái Tân Châu - Tây Ninh

TN-L1 Lá Tân Châu - Tây Ninh

TN-Th1 Thân Tân Châu - Tây Ninh

TN-Th2 Thân Tân Châu - Tây Ninh

HCM-Tr1 Trái Củ Chi - Thành phố Hồ Chí Minh

HCM-L1 Lá Củ Chi - Thành phố Hồ Chí Minh

HCM-L2 Lá Củ Chi - Thành phố Hồ Chí Minh

ĐT-Tr1 Trái Thanh Bình - Đồng Tháp

(59)

Chỉ tiêu theo dõi

- Màu sắc tản nấm: quan sát sau ngày nuôi cấy, theo dõi đĩa petri

- Hình dạng bao tử

- Kích thước bào tử

- Màu sắc bào tử

- Giác bám

- Thời gian nảy mầm hình thành giác bám bào tử mẫu phân lập môi trường PDA

2.4.1.2 Đánh giá khả gây bệnh mẫu phân lập nấm bệnh điều kiện phịng thí nghiệm nhà màng

Các mẫu nấm Colletotrichum spp sau thu thập, phân lập, tiến hành lây nhiễm nhân tạo trái ớt thiên theo nguyên tắc Koch [101]

a) Thí nghiệm 1: Khảo sát khả gây bệnh mẫu phân lập nấm điều kiện phịng thí nghiệm

Các mẫu nấm phân lập từ nội dung 2.4.1.1 Nguồn nấm nhân sinh khối môi trường PDA, sau ngày nuôi cấy nhiệt độ 25oC, bào tử nấm hình thành

môi trường Cho 10 mL nước cất khử trùng vào đĩa petri có nguồn nấm, dùng tăm gạt nhẹ hệ sợi nấm để bào tử hịa vào nước cất Sau lọc bào tử nấm

Colletotrichum spp qua giấy thấm lần, nhằm loại bỏ hệ sợi nấm môi trường nuôi

cấy Thu phần dịch, đếm mật số bào tử nấm Colletotrichum spp buồng đếm hồng cầu, tính mật số bào tử theo cơng thức sau:

D = (4000 x a x 103 x 10-n)/b

(60)

Sau điều chỉnh dịch bào tử vệ nồng độ 106 bào tử/mL để thí nghiệm

Mẫu trái ớt thiên dùng để thí nghiệm trái chín đỏ đều; Mẫu ớt thiên dùng để thí nghiệm hoàn chỉnh, lấy thứ từ đỉnh sinh trưởng xuống, thu từ 40 ngày sau trồng Các mẫu trái có ngoại hình bình thường, mang đặc trưng giống, khơng có dấu vết sâu bệnh hại, khơng có vết thương giới

Phương pháp tiến hành: Mẫu trái tươi rửa vòi nước chảy 60 giây, sau nhúng mẫu vào ethanol 70% phút, nhúng vào dung dịch sodium hypochlorite 1% phút rửa lại lần nước cất vô trùng, phút cho lần rửa, sau thấm khô giấy thấm vô trùng

Mẫu trái sau khử trùng bề mặt, đặt vào hộp nhựa kích thước 20 x 11 x cm lau cồn 70o, đáy hộp có đặt giấy lớp

giấy (đã vô trùng) giữ ẩm để tạo điều kiện cho nấm gây bệnh Mẫu trái nhiễm bệnh phương pháp nhỏ giọt điều kiện có khơng có gây vết thương Tạo vết thương trái đầu kim vơ trùng sau nhỏ 20 μL dịch 106 bào tử/mL vào vết thương, lá/trái; đối chứng nhỏ 10 μL nước cất vô trùng

vào vết thương Giữ ẩm ủ tối 24 giờ, điều kiện nhiệt độ phòng Vết thương tạo vị trí trái

Thí nghiệm trái tiến hành tương tự Thí nghiệm đơn yếu tố, bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên (CRD), 20 nghiệm thức 20 mẫu phân lập nấm, lần lặp lại Mỗi ô sở gồm 10 trái (5 lá/trái tạo vết thương lá/trái không tạo vết thương)

Đối với mẫu không gây vết thương thực cách nhỏ 10 dịch bào tử 106 bào tử/mL vào vị trí lá/trái

(61)

- Quan sát ghi nhận thời gian (NSLN) xuất triệu chứng bệnh (được tính từ lây nhiễm đến xuất vết bệnh đầu tiên)

- Tính tỷ lệ bệnh số bệnh 3, NSLN Cách xác định tỷ lệ bệnh số bệnh (Vũ Triệu Mân Lê Lương Tề, 1998) [102]:

Tỷ lệ bệnh (%) = Số (trái) bệnh/tổng số (trái) theo dõi x 100 Chỉ số bệnh lá/thân (%) = [∑ (a x b)/(NxT)] x 100

Trong đó: a: số lá/trái bị bệnh cấp

b: trị số cấp bệnh tương ứng

N: tổng số lá/trái theo dõi

T: trị số cấp bệnh cao bảng phân cấp

Thang phân cấp bệnh lá/trái theo QCVN 01-160:2014/BNNPTNT:

- Cấp ≤ 5% diện tích trái/lá bị bệnh

- Cấp > – 15% diện tích trái/lá bị bệnh

- Cấp > 15 – 25% diện tích trái/lá bị bệnh

- Cấp > 25 – 50% diện tích trái/lá bị bệnh

(62)

- Cấp > 50% diện tích trái/lá bị bệnh

Cấp Cấp Cấp Cấp Cấp

Hình 2.4 Thang phân cấp bệnh trái ớt (QCVN 01-160:2014/BNNPTNT)

b) Thí nghiệm 2: Khảo sát khả gây bệnh mẫu phân lập nấm điều kiện nhà màng

Thí nghiệm đơn yếu tố bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) gồm 20 nghiệm thức 20 mẫu phân lập nấm, lần lặp lại Tiến hành lây nhiễm 30 cây/ô sở

Lây nhiễm giai đoạn con, có - thật Cây lây nhiễm khơng có triệu chứng bị bệnh bị vết thương giới Tiến hành phun trực tiếp dịch bào tử ướt với nồng độ 107 bào tử/mL, phun 20 mL dung dịch/cây Duy trì

ẩm độ vườn cách tưới đẩm nhà màng ủ tối 24 để tạo điều kiện cho nấm xâm nhiễm

(63)

Quan sát biểu triệu chứng nhiễm bệnh thân sau lây nhiễm

- Thời điểm xuất bệnh (NSLN) tính từ lây nhiễm đến có triệu chứng bệnh thân

- Tỉ lệ bệnh (%) số bệnh (%) thời điểm 5, 7, 9, 11 14 NSLN Tính tỉ lệ bệnh (%) số bệnh (%) thân/lá (tương tự Thí nghiệm 1)

2.4.1.3 Định danh hình thái phân tử loài nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư ớt phân lập

a) Phương pháp định danh dựa đặc điểm hình thái

Việc định danh nấm Colletotrichum spp hại ớt (cũng loài

Colletotrichum spp khác) chủ yếu dựa vào nguồn gốc ký chủ đặc điểm hình

thái bao gồm (i) màu sắc, tốc độ phát triển cấu trúc tản nấm; (ii) hình dạng kích thước bào tử phân sinh; (iii) hình dạng kích thước đĩa áp, (iv) có hay khơng có lơng gai đĩa cành; (v) hình thành hay khơng hình thành hạch nấm; (vi) hình thành hay khơng hình thành giai đoạn sinh sản hữu tính

Cấy khoanh hệ sợi nấm ngày tuổi có đường kính khoảng mm (lấy từ mép tản nấm) lấy từ môi trường nuôi cấy vào đĩa petri có chứa mơi trường PDA, ủ tối 25oC Thí nghiệm đơn yếu tố bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên (CRD)

với 20 nghiệm thức 20 mẫu phân lập, lần lặp lại

Sau ngày, kích thước hình dạng 30 bào tử thu từ đĩa ni cấy ghi nhận kính hiển vi phóng đại 400 lần Quan sát hình thành giác bám cách sử dụng kỹ thuật nuôi cấy lame (a slide culture technique), sau ngày nuôi cấy mơi trường PDA 25oC hình dạng kích thước đĩa áp ghi nhận

[100]

(64)

+ Quan sát hình thái tốc độ phát triển tản nấm

+ Quan sát hình dạng, màu sắc bào tử đo kích thước (chiều dài, chiều rộng) 30 bào tử

+ Quan sát hình dạng, màu sắc giác bám đo kích thước (chiều dài, chiều rộng) 30 giác bám

+ Quan sát tỷ lệ nảy mầm 100 bào tử

b) Phương pháp định danh cấp độ loài mẫu phân lập nấm kỹ thuật phân tử

Trong số bệnh hại ớt, bệnh thán thư nấm Colletotrichum spp gây được xem nguy hiểm Việc xác định nấm Colletotrichum hại ớt (cũng như loài Colletotrichum khác) chủ yếu dựa vào nguồn gốc ký chủ đặc điểm hình thái bao gồm (i) màu sắc, tốc độ phát triển cấu trúc tản nấm; (ii) hình dạng kích thước bào tử phân sinh; (iii) hình dạng kích thước đĩa áp, (iv) có hay khơng có lơng gai đĩa cành; (v) hình thành hay khơng hình thành hạch nấm; (vi) hình thành hay khơng hình thành giai đoạn sinh sản hữu tính Gần đây, định danh nấm

Colletotrichum dựa phân tích phân tử ngày phổ biến dẫn tới nhiều thay

đổi phân loại loài thuộc chi Các nghiên cứu cho thấy, chẳng hạn C

gloeosporioides C acutatum thực chất phức hợp loài (special complex),

trong C gloeosporioides gồm 22 lồi khác C acutatum gồm 31 loài khác Do xác định lồi Colletotrichum dựa đặc điểm hình thái thường thời gian nên kỹ thuật PCR áp dụng

Sáu mẫu phân lập nấm xác định có tính độc cao có tính chuyên biệt gây hại phận ớt phịng thí nghiệm điều kiện nhà màng TN-Tr2, HCM-Tr2, ĐT-TH1, TN-TH1, HCM-L2 TN-L3 định danh mức độ loài thị phân tử

(65)

Phương pháp tách chiết DNA: Nấm sau phân lập nuôi cấy môi trường PDA tăng sinh khối môi trường PDB Sau tuần, sinh khối nấm thu tiến hành ép khô chiết suất DNA tổng số phương pháp SDS Lee cộng (1988) [104] có cải tiến: Dung dịch đồng mẫu chứa Tris-HCl 1M, NaCl 1,2M, EDTA 0,5M, SDS 10% chuẩn pH Nghiền 50 mg nấm nitơ lỏng, mẫu đặt eppendorf 1,5 mL Hút 600 μL dung dịch đồng mẫu thêm vào eppendorf trộn mẫu Ủ mẫu 65oC giờ, ly tâm 12.000 vòng/phút

15 phút Phần dịch chiết xuất với Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1), tiếp tục trộn dung dịch Ly tâm 9.000 vòng/phút 10 phút 25oC

Phần dịch tiếp tục chiết xuất với Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1) Ly tâm 9.000 vòng/phút 20 phút 25oC Hút dịch vào eppendorf Thêm 18 μL

sodium acetate 3M 360 μL Isopropanol lạnh Đảo nhẹ eppendorf, ly tâm 13.000 vòng/phút phút 4oC Phần dịch loại bỏ Phần DNA kết tủa

rửa ethanol 70% lạnh lần Làm khô DNA kết tủa, hòa tan DNA với 50 μL TE 1X DNA bảo quản -20oC Kiểm tra DNA tổng số thực gel agarose 1% hiệu điện 100 V, 250 mA, 15 phút

Các cặp mồi (Bảng 2.5) sử dụng để khuếch đại vùng gen ITS4, (internal transcribed spacer), ACT (partical actin), GPDH (Glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase), TUB2 (β-tubin), GS (Glutamine synthetase), CHS (Chitin synthase) CAL (Calmodin)

Việc ly trích, phân tích DNA, giải trình tự đoạn khuếch đại định danh nấm Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học Môi trường, trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh thực

Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gen ITS (cặp mồi ITS4/ITS5): tiền biến tính 95oC phút; 35 chu kỳ khuếch đại: biến tính 95oC

(66)

Bảng 2.5 Thông tin mồi sử dụng nghiên cứu

Tên mồi Trình tự (5’-3’) Tham

khảo

ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC [105]

ITS5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG

ACT512F ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC [106]

ACT783R TACGAGTCCTTCTGGCCCAT

GD92F1 GCCGTCAACGACCCCTTCATTGA [107]

GDR1 GGGTGGAGTCGTACTTGAGCATGT

Bt2a GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC [108]

Bt2b ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC

GSF1 ATGGCCGAGTACATCTGG [107]

GSR1 GAACCGTCGAAGTTCCAC

CHS79F TGG GGC AAG GAT GCT TGG AAG AAG [106]

CHS354R TGG AAG AAC CAT CTG TGA GAG TTG

CL1C GAA TTC AAG GAG GCC TTC TC [06]

CL2C CTT CTG CAT CAT GAG CTG GAC

Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gen ACTIN (cặp mồi ACT512F/ACT783R): tiền biến tính 95oC phút; 35 chu kỳ khuếch đại: biến

tính 95oC 30 giây, bắt cặp 65oC 30 giây kéo dài 72oC 30 giây; hậu kéo dài 72oC phút; lưu mẫu 4oC

(67)

95oC 30 giây, bắt cặp 60oC 30 giây kéo dài 72oC 45 giây; hậu kéo dài 72oC 10 phút; lưu mẫu 4oC

Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gen TUBULIN (cặp mồi Bt2a/Bt2b): tiền biến tính 95oC phút; 35 chu kỳ khuếch đại: biến tính 95oC phút, bắt cặp 65oC phút kéo dài 72oC phút; hậu kéo dài

72oC 10 phút; lưu mẫu 4oC

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng PCR

Hóa chất Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích (μL)

Master mix X X 12,5

Mồi xuôi 10 µM 0,4 µM

Mồi ngược 10 µM 0,4 µM

DNA đích 50 ng/μL

Nước cất 9,5

Tổng thể tích 25

Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gen GS (cặp mồi GSF1/GSR1): tiền biến tính 95oC phút; 35 chu kỳ khuếch đại: biến tính 95oC 45

giây, bắt cặp 63oC 45 giây kéo dài 72oC phút; hậu kéo dài 72oC

trong 10 phút; lưu mẫu 4oC

Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gen CHS (cặp mồi CHS79F/CHS354R): tiền biến tính 95oC phút; 35 chu kỳ khuếch đại: biến

tính 95oC 30 giây, bắt cặp 62oC 30 giây kéo dài 72oC 30 giây; hậu kéo dài 72oC phút; lưu mẫu 4oC

Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gen CAL (cặp mồi CL1C/CL2C): tiền biến tính 95oC phút; 35 chu kỳ khuếch đại: biến tính 95oC 30 giây, bắt cặp 64oC 30 giây kéo dài 72oC phút; hậu

(68)

2.4.2 Nội dung Hoàn thiện công nghệ tạo oligochitosan-silica nano

*Các nội dung cần hồn thiện cơng nghệ so với cơng nghệ cũ:

- Công nghệ cũ sử dụng chitosan chitosan có khối lượng phân tử thấp (> 30 kDa), mơi trường trung tính chitosan bị biến tính bị kết tủa suy giảm hiệu lực chế phẩm Do yêu cầu cần tạo oligochitosan ổn định mơi trường trung tính

- Trong cơng nghệ cũ, oligochitosan tạo có khối lượng phân tử từ 100 kDa đến 30 kDa, dẫn đến khó điều chỉnh khối lượng phân tử sản xuất quy mơ lớn Vì cần tạo oligochitosan có khối lượng phân tử nhỏ (> 10 kDa) phương pháp chiếu xạ thích hợp ứng dụng nơng nghiệp Hồn thiện quy trình sản xuất oligochitosan ứng dụng sản xuất quy mô công nghiệp, sản phẩm tạo thành có độ tinh khiết, ổn định cao; dễ dàng điều chỉnh khối lượng phân tử sản xuất

- Trong cơng nghệ cũ, chưa có sản phẩm hỗn hợp oligochitosan – silica nano sản xuất Trong nghiên cứu chưa kết hợp loại vật liệu có hiệu ứng kích kháng để chế tạo vật liệu lai ứng dụng nông nghiệp Điều chế tạo hỗn hợp oligochitosan – silica nano ổn định pH trung tính để ứng dụng nơng nghiệp

2.4.2.1 Điều chế phân đoạn oligochitosan

a) Phương pháp tiến hành

Điều chế phân đoạn oligochitosan có trọng lượng phân tử nhỏ phương pháp chiếu xạ tia gamma Co-60 kết hợp xử lý H2O2

Nguyên liệu: chitosan dạng bột, có khối lượng phân tử Mw = 44,4 kDa Mn = 15,5 k Da; độ deacetyl 91,4%

- Mẫu 1: Dung dịch chitosan 4% (w/v), acid lactic 2% (w/v): Hòa tan g chitosan dạng bột có khối lượng phân tử Mw = 44,4 k Da 80 mL dung dịch acid lactic 2,5% Sau thêm vào 20 mL nước, khuấy

- Mẫu 2: Dung dịch chitosan 4% (w/v), H2O2 0,5% (w/v) acid lactic 2%

(69)

mL dung dịch acid lactic 2,5% Sau thêm vào 1,5 mL dung dịch H2O2 (30%),

nước đủ 100 mL, khuấy

- Mẫu 3: Dung dịch chitosan 4% (w/v), H2O2 1% (w/v) acid lactic 2%

(w/v): Hòa tan g chitosan dạng bột có khối lượng phân tử Mw = 44,4 k Da 80 mL dung dịch acid lactic 2,5% Sau thêm vào mL dung dịch H2O2 (30%), nước

đủ 100 mL, khuấy

- Mẫu 4: Dung dịch chitosan 2% (w/v), H2O2 0,5% (w/v) acid lactic 1%

(w/v): Hòa tan g chitosan dạng bột có khối lượng phân tử Mw = 44,4 kDa 80 mL dung dịch acid lactic 1,25% Sau thêm vào 1,5 mL dung dịch H2O2 (30%),

nước đủ 100 mL, khuấy

Đưa dung dịch chitosan/H2O2 chuẩn bị (100 mL) vào lọ thủy

tinh có nút vặn kín khí chiếu xạ nguồn gamma SVST Co-60/B (Isotopes Institute, Budapest, Hungary) khoảng liều ~21 kGy thời gian ~17,5

Kết tủa mẫu chitosan từ dung dịch chiếu xạ tiến hành sau: Lấy 20 mL dung dịch mẫu chitosan, trung hòa dung dịch NH4OH 5% pH ~7,5 -

Sau kết tủa mẫu chitosan 120 mL cồn tuyệt đối, để lắng kết tủa khoảng 30 phút Lọc rửa kết tủa cồn Để khơ khơng khí qua đêm Sấy khơ kết tủa tủ sấy quạt gió 60oC

Mẫu chitosan oligochitosan khô nghiền nhỏ dùng để đo khối lượng phân tử (KLPT), độ deacetyl hóa (ĐĐA) giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD)

- KLPT mẫu chitosan xác định phương pháp sắc kí gel thấm qua (GPC) máy LC-20AB Shimadzu, Nhật Bản, sử dụng đầu dò RID-10A cột Utrahydrogel 250 hãng Waters (Milford, Mỹ), kích thước cột 7,8  300 mm Nhiệt độ cột 40oC, pha động dung môi CH

3COOH 0,25M/CH3COONa 0,25M với tốc

(70)

- ĐĐA chitosan xác định phương pháp đo phổ hồng ngoại máy FT-IR 8400S, Shimadzu, Nhật Bản tính từ phổ đồ theo phương trình [109]:

ĐĐA % = 100  ([31,92  (A1320/A1420)]  12,20)

Trong đó: A1320 A1420 mật độ quang tương ứng đỉnh 1320 1420/cm

- Xác định đặc trưng giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD) mẫu chitosan oligochitosan máy D8 Advance A25 Brucker, Đức

Chọn lọc phân đoạn oligochitoan có khối lượng phân tử nhỏ (2,5 -10,0 kDa)

b) Đánh giá khả ức chế nấm bệnh thán thư C gloeosporioides phân đoạn oligochitosan điều chế

Chọn lọc phân đoạn oligochitosan có khối lượng phân tử nhỏ (2,5, 4,6 7,7 kDa) dùng dung dịch có nồng độ khác (0,01; 0,05; 0,1; 0,5 1,0%) để khảo sát khả ức chế nấm C gloeosporioides gây bệnh phân lập Dùng môi trường thạch rắn PDA

Môi trường PDA có nồng độ oligochitosan 0,01; 0,05; 0,1; 0,5 1% (w/v) dùng để đổ đĩa nuôi cấy chuẩn bị sau: Hòa tan 0,005; 0,025; 0,05; 0,25 0,5 gam oligochitosan phân đoạn vào 25 ml nước cất có bổ sung thêm 0,25 ml acid acetic Bổ sung thêm 1,95 g môi trường PDA Thêm nước vừa đủ 50 ml để có mơi trường PDA có nồng độ oligochitosan tương ứng Điều chỉnh pH 5,0-6,0 NaOH M Hấp khử trùng 121oC / 20 phút Tiến hành đổ đĩa với mẫu đối chứng sử dụng môi trường PDA có khơng có bổ sung acid acetic 0,5% trung hịa pH 5,0 ÷ 6,0 NaOH 1M

(71)

Phương pháp tiến hành Các khoanh nấm ngày tuổi có đường kính mm

được cấy vào trung tâm đĩa môi trường, nuôi cấy điều kiện tối nhiệt độ 250C

Theo dõi đường kính tản nấm Colletotrichum spp Hoạt lực ức chế phân đoạn oligochitosan xác định sở mức độ phát triển so với đối chứng (SVĐC) sau: MĐPTSVĐC (%) = ((D-d)/D) x 100, đó: D, d (mm) đường kính khuẩn lạc nấm mơi trường PDA khơng bổ sung (đối chứng) có bổ sung phân đoạn oligochitosan

2.4.2.2 Điều chế hạt nano silica từ vỏ trấu

- Xử lý vỏ trấu: Vỏ trấu ngâm rửa nước máy, gạn lọc lần để loại bỏ chất bẩn, cát Sấy khô đến khối lượng khơng đổi tủ sấy quạt gió 60oC (Yamato,

DNF 410, Nhật Bản)

Cân 50 g vỏ trấu sấy khơ đưa vào bình tam giác lít, thêm 500 mL nước cất (mẫu 1, kí hiệu RH0), acid HCl 5% (mẫu 2, kí hiệu RH5) acid HCl 10% (mẫu 3, kí hiệu RH10), khuấy cá từ bếp gia nhiệt (Selecta, Tây Ban Nha) giờ, để yên qua đêm Lọc vỏ trấu qua vải cotton, rửa nước cất pH nước cất Sấy khô đến khối lượng khơng đổi 60oC tủ sấy quạt gió Nghiền nhỏ mẫu

vỏ trấu xử lý thành dạng bột máy nghiền bi Fritsch, Đức

- Nung vỏ trấu tạo nano silica: Bột vỏ trấu đưa vào chén sứ, nung nhiệt độ 700oC thời gian tính từ đạt nhiệt độ 700oC lò nung

(Nabertherm GmbH, Đức)

- Xác định tính chất đặc trưng nano silica:

+ Hiệu suất tạo nano silica xác định theo phương pháp trọng lượng, cân ba mẫu tính kết trung bình

+ Kích thước hạt xác định chụp ảnh kính hiển vi điện tử truyền qua máy TEM model JEM1400, JEOL, Nhật Bản

(72)

+ Chụp ảnh kích thước hạt máy FE-SEM (field emission scanning electron microscopy: FE-SEM, Hitachi S-4800)

+ Xác định hàm lượng nguyên tố phương pháp tán sắc lượng tia X (energy dispersive x-ray spectrometer: EDX, Horiba 7593-H)

+ Phổ hồng ngoại đo máy FT-IR 8400S spectrometer (Shimadzu, Japan) sử dụng ép viên KBr

+ Phân bố kích thước hạt nano silic đo phương pháp tán xạ laser

máy Particle size analyser, LB550, Horiba, Nhật

+ Xác định kích thước hạt silica nano: Dịch nano sau tạo thành xác

định kích thước kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) máy TEM model JEM 1400, JEOL, Janpan

2.4.2.3 Điều chế oligochitosan-silica nano

- Vật liệu thí nghiệm: Oligochitosan có khối lượng phân tử nhỏ (4,6 kDa) chọn lọc từ kết nội dung 2.4.2.1 hạt nano silica chế tạo từ vỏ trấu mô tả phần nội dung 2.4.2.2

- Phương pháp tiến hành: Cân g nano silica điều chế cho vào cốc thủy tinh 100 mL, thêm 7,7 mL dung dịch NaOH 1M khấy khoảng 60 phút Thêm 25 mL dung dịch oligochitosan 4% (w/v) nước cất 100 mL, khuấy thời gian nhiệt độ phòng Điều chỉnh pH dung dịch HCl 1M NaOH 1M để đạt pH hỗn hợp dung dịch oligochitosan/ nano silica 5,0; 6,5; 7,5 8,5 Theo dõi sa lắng silica dung dịch theo thời gian Chọn mẫu dung dịch oligochitosan-silica nano tạo gel tốt nhất, thêm chất tạo đặc HEC nồng độ 1% w/v tạo sản phẩm hỗn hợp oligochitosan-silica nano có độ ổn định gel tốt nhằm bảo quản lâu dài cho ứng dụng thực tiễn Sấy khô hỗn hợp oligochitosan-silica nano đĩa petri tủ sấy quạt gió 60oC (Yamato, DNF 410, Nhật Bản), nghiền nhỏ mẫu

cối nghiền bi

(73)

- Phổ hồng ngoại đo máy Shimadzu FT-IR 8400S sử dụng phương pháp ép viên KBr

2.4.3 Nội dung Đánh giá khả kích kháng bệnh thán thư nấm C

gloeosporioides C truncatum gây oligochitosan-silica nano ớt

chỉ thiên điều kiện phịng thí nghiệm

Hình 2.5 Thí nghiệm khả kích kháng nấm C gloeosporioides C truncatum

trong phịng thí nghiệm

Hạt ớt gieo vỉ xốp loại 50 lỗ (55 x 30 x cm) (Hình 2.5) Khi có thật, chuyển sang ly nhựa (đường kính cm, thể tích 200 cm3), mơi

trường trồng cát bổ sung dinh dưỡng cải tiến (được bổ sung g NPK 20-20-10/ly nhựa) Cây ớt trồng phòng sinh trưởng điều kiện 16 sáng/ngày với nhiệt độ khoảng 28oC ± 2oC

Nội dung gồm sáu thí nghiệm tương ứng với hai loài nấm (C gloeosporioides và C truncatum) ba loại vật liệu (oligochitosan, nano silica oligochitosan-silica nano) đơn yếu tố bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD), gồm nghiệm thức (tương ứng ba nồng độ 25, 50, 100 ppm đối chứng (-): không phun vật liệu, phun lây bệnh (+): không phun vật liệu, không phun lây bệnh), ba lần lặp lại Mỗi ô sở có 30

- Thí nghiệm 4: đánh giá khả kích kháng nấm C gloeosporioides

(74)

C truncatum nano silica

C truncatum oligochitosan-silica nano

- Phương pháp tiến hành: Tiến hành phun vật liệu tương ứng lên ớt giai đoạn thật với liều lượng 10 mL dung dịch/cây Số lần phun dung dịch thí nghiệm: lần, lần cách ngày Hai mươi bốn sau phun lần 3, tiến hành lây bệnh nhân tạo cách nhỏ giọt dịch bào tử nấm C gloeosporioides C

truncatum tương ứng lên ớt vị trí gây vết thương nhẹ (ba giữa),

giọt μL Sau lây nhiễm bệnh, ớt giữ điều kiện ẩm, tối, 28oC

trong 24 sau chuyển lại phịng sinh trưởng với điều kiện 16 sáng/ngày, cường độ 5.000 lux, nhiệt độ khoảng 28oC ± 2oC

- Chi tiêu theo dõi: Ghi nhận tỉ lệ bệnh số bệnh thời điểm 7, 14 21 ngày sau xử lý (NSXL) phân tích tiêu kích kháng bệnh: Hàm lượng protein kháng bệnh PR (chitinase, glucanase), phytoalexin đặc trưng (caspsidiol) hàm lượng marker thị đường kháng bệnh SAR (Salicylic acid) ISR (Jasmonic acid) xác định dựa theo phương pháp sau

+ Phương pháp phân tích enzyme chitinase [110]: Độ hoạt động chitinase ((CHI) xác định theo phương pháp Wirth and Wolf (1990) có sửa đổi, sử dụng dung dịch carboxymethylchitin-ramazol brilliant violet (CMChitin-RBV mg/mL, Loewe Biochemica, Đức) làm chất Hỗn hợp phản ứng gồm 100 μL dịch chiết thô 200 μL dung dịch CM-Chitin-RBV 100 μL đệm natri acetat (pH 5,2) 100 mM ủ 37oC Sau ủ, phản ứng dừng lại cách

(75)

+ Phương pháp phân tích enzyme β 1,3-glucanase [110]: Độ hoạt động enzyme β 1,3-glucanase xác định lượng đường khử giải phóng từ larminarin Độ hoạt động β 1,3-glucanase phân tích cách ủ 100 μL dịch chiết với 100 μL (w/v) larminarin 2% (L9634, Sigma) 40oC Phản ứng dừng lại cách cho thêm 400 μL dinitrosalicylic (được chuẩn bị cách cho 300 mL dung dịch NaOH 4,5% vào 880 mL dung dịch gồm 8,8 g acid dinitrosalicylic 255 g KNaC4H4O6.6H2O) gia nhiệt hỗn hợp nước đun sôi

trong phút Hỗn hợp pha loãng với nước cất theo tỉ lệ 1:10, đo độ hấp thụ bước sóng 490 nm Hoạt động β -1,3-glucanase thể dạng U/mg protein tổng, đơn vị U xác định hoạt động enzyme xúc tác hình thành µmol glucose

+ Phương pháp phân tích hàm lượng capsidiol [111]: Bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE), tiến hành chiết qua chất hấp thu chứa cột Hỗn hợp đưa vào cột polyamide (500 mg MN-polyamide CC 6,6/cột) để loại bỏ tế bào dư Capsidiol cho chảy qua cột thứ C18 (250 mg C18/cột) Chất hấp thu giữ lại capsidiol, sau rửa cột C18 mL nước Tiếp theo, capsidiol tách rửa với mL ethanol tiến hành cho bay dung dịch, dư lượng giải 0,2 mL methanol Capsidiol phân tích phương pháp sắc ký (tham chiếu với tiêu chuẩn phịng thí nghiệm Dr Milat’s (Dijon, France) Định lượng capsidiol hệ thống sắc ký HPLC với đầu dò DAD thiết lập 210 nm cột pha đảo LC-8-DB (4,6 mm × 25 cm, kích thước hạt µm) pha tĩnh C8 (Sigma Aldrich) Thể tích mẫu 10 mL, pha động methanol-nước Gradient rửa giải bắt đầu mức methanol 70%, tăng tuyến tính từ 70 đến 80% 16 phút (tốc độ dòng mL/phút) Sai số chuẩn phân tích khoảng ± 0,8%

+ Phương pháp phân tích acid salicylic acid jasmonic [112]: Tất sau thu hoạch phải bảo quản nitơ lỏng sau trữ vào tủ âm sâu -80oC Lấy 10 mg chuẩn rắn acid jasmonic, acid salicylic pha riêng chất

methanol Cả chuẩn gốc chuẩn làm việc bảo quản -20oC, tránh ánh

(76)

phút với tốc độ 6.000 vịng/phút sau bảo quản 4oC qua đêm Ngày hôm sau, thêm 10 mL ethyl acetate, vortex phút ly tâm 10 phút với tốc độ 10.000 vịng/phút 4oC Thu dịch lớp phía làm với 0,2 g carbon

hoạt tính 0,6 g PSA (Primary secondary amine Vortex vịng phút sau ly tâm 5.000 vịng/phút Thu dịch lớp phía đem thổi khơ thiết bị thổi khơ khí nitơ Hịa tan cặn với mL ethyl acetat đem phân tích

2.4.4 Nội dung Đánh giá khả kích kháng bệnh thán thư nấm C gloeosporioides C truncatum gây oligochitosan-silica nano ớt thiên trồng điều kiện nhà màng đồng ruộng

Oligochitosan-silica nano tạo từ Nội dung 2, giống ớt TN 278 thực hiện khảo sát hai loài nấm C gloeosporioides C truncatum

Nội dung gồm 12 thí nghiệm (tương ứng với hai môi trường canh tác (trong nhà màng đồng), hai loài nấm (C gloeosporioides C truncatum) ba loại vật liệu: oligochitosan, nano silica oligochitosan-silica nano) đơn yếu tố bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên, gồm nghiệm thức (tương ứng ba nồng độ 25, 50, 100 ppm đối chứng (-): không phun vật liệu, phun lây bệnh (+): không phun vật liệu, không phun lây bệnh), ba lần lặp lại Mỗi thí nghiệm có diện tích 20 m2, tổng diện tích thí nghiệm 900 m2

C truncatum oligochitosan điều kiện nhà màng

- Thí nghiệm 11 12: đánh giá khả kích kháng nấm C gloeosporioides và C truncatum nano silica điều kiện nhà màng

- Thí nghiệm 13 14: đánh giá khả kích kháng nấm C gloeosporioides và C truncatum oligochitosan-silica nano điều kiện nhà màng

(77)

- Thí nghiệm 17 18: đánh giá khả kích kháng nấm C gloeosporioides và C truncatum nano silica điều kiện đồng ruộng

- Thí nghiệm 19 20: đánh giá khả kích kháng nấm C gloeosporioides và C truncatum oligochitosan-silica nano điều kiện đồng ruộng

Quy trình trồng: Ớt trồng nhà màng đồng ruộng theo quy trình trồng ớt Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao (Phụ lục 2)

Số lần phun lên ớt: lần, lần cách ngày; thời điểm phun lần đầu vào khoảng thời gian chuẩn bị hoa (30 NST) Sau phun xong lần 3, tiến hành lây nhiễm nấm bệnh cho ớt thí nghiệm

Phương pháp lây nhiễm: dung dịch bào tử nấm C gloeosporioides C

truncatum chuẩn bị thí nghiệm 1, sử dụng với nồng độ bào tử

107/mL có bổ sung Tween20 0,05%, với liều lượng 50 mL/cây Lây nhiễm vào lúc

chiều mát (khơng cịn ánh nắng mặt trời) Phun ướt ớt với dung dịch bào tử bình phun cầm tay (bình tích lít) Sau dùng túi đen phủ kín tất ớt lây nhiễm, ủ tối 12 vào buổi tối, ban ngày mở bao ra, 12 sau bọc lại tiếp cho đủ 24 Giỡ bỏ túi bao trước mặt trời chiếu vào khu thí nghiệm để tránh bị tuột

- Tỷ lệ bệnh (%) số bệnh (%) trái: tương tự thí nghiệm

- Số trái/cây (trái): Đếm tổng số trái đợt thu hoạch, đến 30 cây/ô

- Khối lượng trung bình 100 trái (g/100 trái): Cân 100 trái thu hoạch, ô cân lần đợt thu hoạch thứ hai

- Chiều dài trái (mm): Đo chiều dài trái thu hoạch lứa thứ hai, đo 30 trái/ô

(78)

- Năng suất lý thuyết (kg/1.000 m2) = Số trái/cây x trọng lượng 100 trái x 2.000 cây/1.000 m2 x 10-5

- Năng suất thực thu (kg/1.000 m2): Cân toàn trái sau thu hoạch, quy đổi

ra suất 1.000 m2

2.2.5 Xử lý số liệu

Số liệu phân tích phương sai ANOVA trắc nghiệm phân hạng Duncan với xác suất tin cậy P < 0,01 chương trình SAS 9.1

(79)

CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Phân lập, khảo sát khả gây bệnh định danh loài nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư ớt thiên (Capsicum frutescens L.)

3.1.1 Phân lập định danh hình thái mẫu nấm gây bệnh thán thư

Hình 3.1 Triệu chứng bệnh thán thư trái (A - C), (D) thân (D)

cây ớt tự nhiên

(80)

những hạch nấm màu đen bề mặt hệ sợi nấm Bào tử có dạng từ hình trụ, hai đầu tròn, đầu nhọn đầu tròn hay hai đầu nhọn, đến dạng bào tử hình thoi nhọn hai đầu hay bào tử có dạng hình liềm Ổ bào tử dạng giọt dầu màu cam đến đen Đĩa cành có khơng có lơng gai Bào tử nảy mầm sau 12 giờ, hình thành giác bám sau 24 giờ, giác bám có dạng hình trịn, hình trụ, hình thùy, hình trứng ngược hay bất định , có khơng có phân thùy Lúc hình thành giác bám khơng màu sau có màu nâu đến nâu đen, bề mặt trơn hay gồ ghề

Đặc điểm hình thái C gloeosporioides (10 mẫu Tr1; Tr2; TN-Tr3; TN-L1; TN-L2; HCM-Tr1; HCM-Tr2; HCM-Tr4; ĐT-Tr1, ĐT-Tr3): Tản nấm có màu trắng hồng (HCM-Tr1, ĐT-Tr1, ĐT-Tr3) màu trắng cam (TN-Tr2, TN-Tr3, TN-L2) phần tâm Sợi nấm màu trắng màu trắng, xuất đường tròn đồng tâm bề mặt tản nấm Sợi nấm mọc bung thạch (TN-Tr1, TN-Tr2, HCM-Tr2, HCM-Tr4, ĐT-Tr3) mọc sát mặt thạch (TN-Tr3, TN-L1, TN-L2, HCM-Tr1, ĐT-Tr1) Bào tử hình thành sau - 10 ngày nuôi cấy, bào tử có màu trắng, có dạng hình trụ đầu trịn đầu nhọn hay đầu trịn; có eo thắt (TN-L1, HCM-Tr1, HCM-Tr4, ĐT-Tr1), khơng có eo thắt (ĐT-Tr3) Bào tử nảy mầm sau 12 hình thành giác bám sau 24 Giác bám lúc hình thành khơng màu sau có màu nâu nhạt đến màu nâu đậm; viền đậm (TN-Tr1, TN-Tr2, HCM-Tr2, HCM-Tr4) bên chứa hạt dịch nhỏ, có dạng hình chùy, hình trứng ngược, hình trịn (TN-Tr3, TN-L1, HCM-Tr1, HCM-Tr2, HCM-Tr4, ĐT-Tr1, ĐT-Tr2) bất định, khơng có thùy có hay khơng có phân thùy (TN-Tr1, TN-Tr2 TN-Tr3, TN-L1) Kích thước giác bám mẫu TN-Tr1: 9,2 - 12,5 x 5,9 - 9,0 µm; mẫu TN-Tr2: 9,4 - 14,3 x 6,1 - 9,3 µm; TN-Tr3: 7,8 - 11,5 x 5,8 - 7,7 µm; TN-L1: 9,3 - 12,4 x 5,7 - 7,5 µm; TN-L2: 9,5 - 15,5 x 5,9 - 8,4 µm; HCM-Tr1: 7,0 - 9,5 x 5,1 - 6,7 µm; HCM-Tr2: 7,6 - 11,6 x 4,8 - 6,7 µm; HCM-Tr4: 9,8 - 13,1 x 5,9 - 9,2 µm; ĐT-Tr1: 2,9 - 9,2 x 5,6 - 6,6 µm, ĐT-Tr3: 7,0 - 8,6 x 5,1 - 6,5 µm)

(81)

thạch xuất dịch bào tử màu cam (HCM-Tr5); có màu trắng có vệt màu nâu (HCM-L1); có màu trắng xám (ĐT-Tr2) Cành bào tử phân sinh đĩa cành có nhiều gai cứng, màu nâu (TN-Tr4; TN-L3; TN-Th2; HCM-Tr3; HCM-L2, ĐT-Th1) Ổ bào tử hình thành bề mặt tản nấm (HCM-L1; ĐT-Tr2) Bào tử hình thành sau - 10 ngày ni cấy (TN-Tr4; TN-L3; TN-Th1; TN-Th2; HCM-Tr5; ĐT-Th1) sau 10 - 12 ngày nuôi cấy (HCM-Tr3; HCM-L1; HCM-L2; ĐT-Tr2) Bào tử không màu dạng hình liềm, khơng có vách ngăn, khơng có eo thắt Bào tử nảy mầm sau 12 hình thành giác bám sau 24 Giác bám lúc hình thành khơng màu sau chuyển sang màu nâu nhạt đến nâu đậm, viền màu nâu đậm, có dạng hình trịn, hình trứng ngược, hình chùy (HCM-Tr3; HCM-L2; ĐT-Tr2; ĐT-Th1) bất định (TN-Th1; HCM-Tr5; ĐT-Tr2) không phân thùy có hay khơng có phân thùy (TN-Th1; HCM-Tr5; ĐT-Tr2; ĐT-Th1) Kích thước giác bám mẫu TN-Tr4: 10,1 - 14,9 x 5,9 - 9,0 µm; TN-L3: 9,5 - 14,5 x 4,7 - 7,5 µm; TN-Th1: 10,6 - 15,7 x 5,8 - 9,4 µm; TN-Th2: 10,6 - 15,7 x 5,8 - 9,4 µm; Tr3: 9,5 - 13,3 x 6,6 - 9,7 µm; HCM-Tr5: 8,5 - 12,6 x 6,6 - 9,1 µm; HCM-L1: 10,1 - 14,7 x 7,8 - 9,1 µm; HCM-L2: 9,2 - 11,9 x 7,0 - 9,0 µm; ĐT-Tr2: 10,0 - 13,6 x 6,5 - 8,3 µm, ĐT-Th1: 8,1 - 11,9 x 5,3 - 7,7 µm

A:TN-Tr1 B: TN-Tr2 C: TN-Tr3 D: TN-L1 E: TN-L2

F: HCM-Tr1 G: ĐT-Tr3 H: ĐT-Tr1 I: HCM-Tr2 J: HCM-Tr4

Hình 3.2 Hình thái Colletotrichum gloeosporioides qua mẫu: a -tản nấm;

(82)

A: TN-Tr4 B: TN-L3 C: TN-Th1 D: TN-Th2 E: HCM-Tr3

F: ĐT-Th1 G: HCM-Tr3 H: ĐT-Tr2 I: HCM-L1 J; HCM-L2

Hình 3.3 Hình thái Colletotrichum truncatum qua mẫu: a -tản nấm; b,c, d,e,f

-bào tử nẩy mẩm hình thành giác bám

3.1.2 Khả gây bệnh mẫu nấm Colletotrichum spp phân lập điều kiện phịng thí nghiệm nhà màng

3.1.2.1 Khả gây bệnh loài nấm Colletotrichum spp phân lập điều kiện phòng thí nghiệm

* Đánh giá kết gây bệnh ớt: Kết lây nhiễm mẫu nấm

Colletotrichum spp phân lập mẫu điều kiện gây vết thương

phịng thí nghiệm thể Bảng 3.1

(83)

các mẫu phân lập TN-Tr3 (1,7%), TN-Tr4 (0,7%), HCM-Tr3 (1,5%), HCM-L1 (1,5%), HCM-L2 (1,5%), ĐT-Tr1 (0,7%), ĐT-Tr2 (1,5%), ĐT-Tr3 (0,7%)

Bảng 3.1 Tình hình bệnh điều kiện gây vết thương (%)

Mã mẫu Tỷ lệ bệnh

(1) (%) Chỉ số bệnh(2) (%)

3 NSLN 5 NSLN 7 NSLN 3 NSLN 5 NSLN 7 NSLN

TN-Tr1 38,9 cde 38,9 c 38,9 fg 2,2 bcd 2,2 c 2,2 ef

TN-Tr2 46,9 c 51,2 b 63,8 ab 2,5 ab 2,9 b 3,6 bc

TN-Tr3 26,2 f 26,2 d 34,7 g 1,7 efg 1,7 d 2,0 f

TN-Tr4 1,3 g 1,3 e 1,3 i 0,7 h 0,7 e 0,7 g

TN-L1 38,9 cde 46,9 bc 63,5 ab 2,8 a 2,4 c 3,0 d

TN-L2 26,2 f 38,9 c 46,9 ef 1,7 efg 2,2 c 3,2 cd

TN-L3 68,0 a 68,5 a 68,5 a 2,2 ab 3,7 a 4,8 a

TN-Th1 51,2 b 55,4 b 63,5 ab 2,7 a 3,3 b 4,1 b

TN-Th2 47,3 c 51,2 b 55,4 cd 2,5 ab 3,0 b 4,6 a

HCM-Tr1 55,4 b 51,2 b 51,2 de 2,6 ab 2,9 b 3,6 bc

HCM-Tr2 30,8 ef 50,8 b 59,2 bc 1,8 d-g 3,3 b 4,7 a

HCM-Tr3 22,4 f 22,4 d 26,6 h 1,5 fg 1,5 d 2,0 f

HCM-Tr4 35,0 de 38,9 c 46,9 ef 2,0 c-f 2,4 c 3,2 cd

HCM-Tr5 1,3 g 1,3 e 1,3 i 0,7 h 0,7 e 0,7 g

HCM-L1 22,4 f 22,4 d 35,0 g 1,5 g 1,5 d 2,3 ef

HCM-L2 22,4 f 22,4 d 39,3 fg 1,5 g 1,5 d 2,5 e

ĐT-Tr1 1,3 g 1,3 e 1,3 i 0,7 h 0,7 e 0,7 g

ĐT-Tr2 22,4 f 22,4d 26,6 h 1,5 fg 1,5 d 2,0 f

ĐT-Tr3 1,3 g 1,3 e 1,3 i 0,7 h 0,7 e 0,7 g

ĐT-Th1 35,0 de 38,9 c 46,9 ef 2,0 c-f 3,0 b 3,4 cd

CV(%) 12,0 11,1 9,1 11,0 7,8 7,0

Ft 92,9** 106,5** 138,2** 38,3** 108,7** 159,4**

* Ghi chú: Trong cột hàng, trị số có ký tự kèm khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê; ** khác biệt có ý nghĩa thống kê; số liệu xử lý chuyển đổi theo công thức: (1) chuyển đổi

arsin√x; (2) chuyển đổi √x

(84)

cao mẫu phân lập TN-L3 (4,8%), HCM-Tr2 (4,7%), TN-Th2 (4,6%) khác biệt có ý nghĩa thống kê so với mẫu phân lập TN-Tr1 (2,2%), TN-Tr3 (2,0%), TN-Tr4 (0,7%), Tr3 (2,0%), Tr5 (0,7%), L1 (2,3%), HCM-L2 (2,5%), ĐT-Tr1 (0,7%), ĐT-Tr2 (2,0%), ĐT-Tr3 (0,7%) Trong điều kiện không gây vết thương khơng có tượng lây nhiễm nấm bệnh

Bảng 3.2 Tình hình bệnh trái điều kiện gây vết thương (%)

Mã Mẫu Tỷ lệ bệnh (%) Chỉ số bệnh

(2) (%)

3 NSLN 5 NSLN NSLN 3 NSLN 5 NSLN NSLN TN-Tr1 22,4 g 72,3 a 88,8 a 1,5 f 3,0 ghi 5,0 cde TN-Tr2 59,2 ab 63,5 c 80,3 b 2,9 b 3,5 efg 4,9 c-f TN-Tr3 42,7 ef 55,0 e 59,2 d 2,3 de 3,5 efg 4,3 e-h TN-Tr4 38,9 f 46,9 g 59,2 d 2,8 b 3,2 f-i 4,2 fgh TN-L1 55,0 bc 67,7 b 67,7 c 2,8 b 3,9 cde 5,6 bc TN-L2 18,1 g 51,2 f 55,0 de 1,3 f 2,9 i 4,5 e-h TN-L3 59,2 ab 71,9 a 80,3 b 3,3 a 4,9 a 6,1 ab TN-Th1 51,2 abc 59,2 d 80,3 b 2,7 bcd 4,1 cd 7,0 a TN-Th2 51,2 cd 67,7 a 88,8 a 2,7 bc 3,7 def 5,5 bc HCM-Tr1 38,9 f 46,9 g 59,2 d 2,2 e 3,5 efg 4,8 c-f HCM-Tr2 55,0 bc 63,5 c 80,3 b 2,8 b 4,3 bc 5,1 cd HCM-Tr3 38,9 f 50,8 f 50,8 ef 2,2 e 3,2 fghi 3,8 h HCM-Tr4 22,4 g 43,1 h 46,9 f 1,5 f 2,9 i 3,9 gh HCM-Tr5 63,8 a 72,3 a 59,2 d 2,9 b 3,9 cde 4,7 def HCM-L1 42,7 ef 50,8 f 59,2 d 2,3 de 3,4 e-h 4,6 d-g HCM-L2 59,2 ab 59,2 d 80,3 b 2,9 b 4,7 ab 6,1 ab ĐT-Tr1 42,7 ef 50,8 f 50,8 ef 2,3 de 3,8 cde 4,7 def ĐT-Tr2 46,9 de 55,0 e 71,9 c 2,8 b 4,1 cd 6,1 ab ĐT-Tr3 38,9 f 51,2 f 67,7 c 2,4 cde 3,6 def 4,8 c-f ĐT-Th1 43,1 de 55,0 e 71,9 c 2,6 bc 4,3 bc 5,6 bc

CV (%) 4,5 2,3 5,0 5,7 5,9 6,2

Ft 129,6** 156,3** 44,7** 43,7** 21,4** 20,3**

* Ghi chú: Trong cột hàng, trị số có ký tự kèm khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê; ** khác biệt có ý nghĩa thống kê; số liệu xử lý chuyển đổi theo công thức: (2) chuyển đổi √x

(85)

kiện có gây vết thương mẫu nấm gây bệnh không gây bệnh điều kiện không gây vết thương

* Kết gây bệnh trái ớt: Kết đánh giá khả lây nhiễm mẫu phân lập nấm Colletotrichum spp trái ớt điều kiện gây vết thương không gây vết thương phịng thí nghiệm thể Bảng 3.2 Bảng 3.3

(86)

Bảng 3.3 Tình hình bệnh trái điều kiện khơng gây vết thương (%) Mã mẫu

Tỷ lệ bệnh (%) Chỉ số bệnh (%)

3 NSLN 5 NSLN 7 NSLN 3 NSLN 5 NSLN 7 NSLN

TN-Tr1 0,7 b 0,7 d 0,7 c 0,7 b 0,7 c 0,7 c

TN-Tr2 0,7 b 2,0 c 4,5 a 0,7 b 1,0 c 1,6 b

TN-Tr3 0,7 b 0,7 d 0,7 c 0,7 b 0,7 c 0,7 c

TN-Tr4 0,7 b 0,7 d 0,7 c 0,7 b 0,7 c 0,7 c

TN-L1 0,7 b 0,7 d 0,7 c 0,7 b 0,7 c 0,7 c

TN-L2 0,7 b 0,7 d 0,7 c 0,7 b 0,7 c 0,7 c

TN-L3 3,3 a 3,9 a 4,5 a 1,3 a 2,1 a 2,3 a

TN-Th1 2,0 ab 2,0 c 2,0 b 1,0 a 1,0 c 1,4 b

TN-Th2 0,7 b 0,7 d 0,7 c 0,7 b 0,7 c 0,7 c

HCM-Tr1 0,7 b 0,7 d 0,7 c 0,7 b 0,7 c 0,7 c

HCM-Tr2 0,7 b 0,7 d 0,7 c 0,7 b 0,7 c 0,7 c

HCM-Tr3 0,7 b 0,7 d 0,7 c 0,7 b 0,7 c 0,7 c

HCM-Tr4 0,7 b 0,7 d 0,7 c 0,7 b 0,7 c 0,7 c

HCM-Tr5 0,7 b 0,7 d 0,7 c 0,7 b 0,7 c 0,7 c

HCM-L1 0,7 b 0,7 d 0,7 c 0,7 b 0,7 c 0,7 c

HCM-L2 0,7 b 0,7 d 0,7 c 0,7 b 0,7 c 0,7 c

ĐT-Tr1 0,7 b 0,7 d 0,7 c 0,7 b 0,7 c 0,7 c

ĐT-Tr2 0,7 b 0,7 d 0,7 c 0,7 b 0,7 c 0,7 c

ĐT-Tr3 0,7 b 0,7 d 0,7 c 0,7 b 0,7 c 0,7 c

ĐT-Th1 3,0 a 2,9 b 3,3 b 1,5 a 1,8 b 2,0 a

CV (%) 3,5 3,3 3,7 16,1 20,7 14,8

Ft 17,4** 21,0** 22,5** 8,6** 13,7** 38,9**

* Ghi chú: Trong cột hàng, trị số có ký tự kèm khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê; ** khác biệt có ý nghĩa thống kê; *: khác biệt có ý nghĩa; số liệu xử lý chuyển đổi theo công

thức √x

(87)

lệ bệnh cao đạt 3,9%, tiếp đến mẫu ĐT-Th1 (đạt 2,9%), TN-Tr2 (2,0%) TN-Th1 (2,0%) khác biệt có ý nghĩa so với mẫu phân lập lại Đối với số bệnh, mẫu phân lập TN-L3 có giá trị cao (2,1%), ĐT-Th1 (1,8%), khác biệt có ý nghĩa so với mẫu phân lập lại Thời điểm NSLN, tỷ lệ bệnh đạt cao 4,5% mẫu phân lập TN-Tr2, TN-L3, mẫu phân lập ĐT-Th1 (3,3%), khác biệt có ý nghĩa so với mẫu phân lập lại Chỉ số bệnh cao TN-L3 (2,3%) ĐT-Th1 (2,0%), tiếp đến mẫu phân lập TN-Tr2 (1,6%), TN-Th1 (1,4%) khác biệt có ý nghĩa so với mẫu phân lập lại

Kết lây nhiễm mẫu nấm Colletotrichum spp phân lập mẫu trái điều kiện phịng thí nghiệm cho thấy có 20 mẫu nấm Colletotrichum spp gây bệnh trái điều kiện gây vết thương có mẫu nấm gây bệnh điều kiện không gây vết thương sau ngày NSLN TN-Tr2 TN-L3, TN-Th1, ĐT-Th1

3.1.2.2 Đánh giá khả gây bệnh mẫu nấm Colletotrichum spp phân lập điều kiện nhà màng

Kết thí nghiệm phun lây nhiễm 20 mẫu nấm gây bệnh thán thư ớt điều kiện nhà màng, trình bày theo tỷ lệ bệnh (Bảng 3.4) số bệnh (Bảng 3.5)

(88)

nghiệm thức phun mẫu phân lập ĐT-Tr3 8,91% Sự khác biệt nghiệm thức thí nghiệm có ý nghĩa mặt thống kê

Bảng 3.4 Tỷ lệ bệnh sau lây nhiễm điều kiện nhà màng (%)

Mã mẫu 5 NSLN 7 NSLN 9 NSLN 11 NSLN 14 NSLN

TN-Tr1 2,19 de 4,98 cd 8,14 bcd 10,02 b 14,44 c

TN-Tr2 2,36 cde 7,39 a 8,58 bc 13,18 a 15,83 c

TN-Tr3 2,3 cde 4,15 de 4,70 ijk 5,32 de 9,88 ef TN-Tr4 2,14 de 3,58 e 4,22 jk 5,77 de 11,06 de TN-L1 2,71 bcd 4,48 de 6,08 gh 7,84 c 10,18 ef TN-L2 2,08 de 4,21 de 5,08 ij 6,33 d 10,9 de

TN-L3 3,41 a 6,45 ab 9,94 a 13,48 a 19,96 a

TN-Th1 2,51 cde 5,86 bc 8,99 b 13,78 a 17,98 b

TN-Th2 2,82 bc 3,95 de 4,10 k 4,59 e 12,45 d HCM-Tr1 2,08 de 5,84 bc 6,97 efg 10,31 b 14,9 c

HCM-Tr2 3,24 ab 7,33 a 8,80 b 13,65 a 18,51 ab

HCM-Tr3 2,14 de 6,67 ab 7,31 def 8,68 c 15,59 c HCM-Tr4 1,98 e 6,43 ab 7,80 cde 11,12 b 14,90 c HCM-Tr5 2,16 de 3,82 e 4,81 ijk 6,01 d 10,93 de HCM-L1 2,14 de 4,2 de 6,42 fg 8,38 c 10,78 e HCM-L2 2,72 bcd 6,18 b 8,50 bc 10,44 b 19,09 ab ĐT-Tr1 2,08 de 3,89 de 4,64 ijk 8,38 c 9,70 ef ĐT-Tr2 2,08 e 3,89 de 4,64 ijk 5,69 de 9,7 ef ĐT-Tr3 2,13 de 3,70 e 4,96 ijk 5,89 d 8,91 f ĐT-Th1 2,51 dce 5,86 bc 8,99 b 13,78 a a 17,98 b

CV (%) 10,59 8,42 5,90 5,79 5,09

Ft 8,12** 27,62** 72,82** 116,84** 86,97**

* Ghi chú: Trong cột hàng, trị số có ký tự kèm khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê; ** khác biệt có ý nghĩa thống kê; số liệu xử lý chuyển đổi theo công thức √x

(89)

khơng có khác biệt với nghiệm thức phun mẫu phân lập (L2, HCM-Tr2, TN-Thl TN-L3), thấp nghiệm thức phun mẫu phân lập TN-Tr4 với số bệnh 1,75% mẫu phân lập TN-Th2 1,54% Sau 14 ngày phun lây nhiễm mẫu phân lập TN-L3 có số bệnh ớt thí nghiệm cao 6,41%, khơng có khác biệt với nhiệm thức phun mẫu phân lập TN-Thl (5,83%), số bệnh thấp nghiệm thức phun mẫu phân lập ĐT-Tr2 3,02% Sự khác biệt nghiệm thức thí nghiệm có ý nghĩa mặt thống kê

Bảng 3.5 Chỉ số bệnh sau lây nhiễm điều kiện nhà màng (%)

Mã Mẫu 5 NSLN 7 NSLN 9 NSLN 11 NSLN 14 NSLN

TN-Tr1 0,68 1,15 e 2,46 def 3,05 c-f 4,36 de

TN-Tr2 1,14 3,24 ab 3,81 a 4,82 a 5,43 bc

TN-Tr3 0,94 1,14 e 1,64 g-j 1,87 gh 3,29 fg

TN-Tr4 0,94 1,07 e 1,44 ij 1,75 h 3,26 fg

TN-L1 1,07 1,15 e 1,91 f-i 2,5 d-h 3,26 fg

TN-L2 0,98 1,14 e 1,5 hij 1,95 gh 3,26 fg

TN-L3 1,17 2,62 bc 2,91 cd 4,45 ab 6,41 a

TN-Thl 0,95 2,59 bc 3,02 cd 4,47 ab 5,83 ab

TN-Th2 1,01 1,1 e 1,26 j 1,54 h 3,99 ef

HCM-Tr1 1,03 2,27 cd 2,84 cde 3,35 cde 5,03 bcd

HCM-Tr2 1,44 3,32 a 3,71 ab 4,57 ab 5,44 bc

HCM-Tr3 1,1 2,84 abc 3,11 bc 3,43 cd 4,28 de HCM-Tr4 1,05 2,47 bc 3,18 bc 3,82 bc 4,72 cde HCM-Tr5 0,87 1,69 de 2,43 def 2,98 c-f 4,18 de HCM-L1 0,95 1,32 e 2,26 efg 3,06 c-f 3,85 efg

HCM-L2 0,96 2,79 abc 3,43 abc 4,67 ab 5,52 bc

ĐT-Tr1 0,89 1,25 e 1,82 f-j 2,45 e-h 3,02 g

ĐT-Tr2 0,89 1,25 e 1,82 f-j 2,45 e-h 3,02 g

ĐT-Tr3 0,91 1,23 e 1,83 f-j 2,21 fgh 3,30 fg

ĐT-Th1 0,95 2,59 bc 3,02 cd 4,47 ab 5,83 ab

CV (%) 7,60 15,38 10,67 12,28 8,34

Ft 1,04ns 24,31** 27,31** 24,06** 27,59**

* Ghi chú: Trong cột hàng, trị số có ký tự kèm khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê; ** khác biệt có ý nghĩa thống kê; số liệu xử lý chuyển đổi theo công thức √x

(90)

TN-Th1, HCM-Tr2, HCM-L2, ĐT-Th1 Các mẫu dùng để định danh kiểm tra loài phương pháp sinh học phân tử

3.1.2.3 Định danh mẫu nấm Colletotrichum spp gây bệnh có độc lực cao kỹ thuật sinh học phân tử

ITS4/ITS5 ACT512F/ACT783R

GDF1/GDR1 Bt2a/Bt2b

GSF1/GSR1 CHS79F/CHS354R

CL1C/CL2C

Hình 3.4 Điện di sản phẩm khuếch đại PCR mẫu phân lập Colletotrichum spp

Phụ lục 36 Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi ITS4/ITS5

1: TN-Tr2; 2: HCM-Tr2; 3: ĐT-Th1; 4: TN-Th1; 5: HCM-L2; 6: TN-L3; Ladder 100bp 1: TN-Tr2; 2: HCM-Tr2; 3: ĐT-Th1; 4: TN-Th1; 5: HCM-L2; 6: TN-L3; Ladder 100bp

Phụ lục 38 Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi GDF1/GDR1

1: TN-Tr2; 2: HCM-Tr2; 3: ĐT-Th1; 4: TN-Th1; 5: HCM-L2; 6: TN-L3; Ladder 100bp 1: TN-Tr2; 2: HCM-Tr2; 3: ĐT-Th1; 4: TN-Th1; 5: HCM-L2; 6: TN-L3; Ladder 100bp

Phụ lục 40 Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi GSF1/GSR1

1: TN-Tr2; 2: HCM-Tr2; 3: ĐT-Th1; 4: TN-Th1; 5: HCM-L2; 6: TN-L3; Ladder kb 1: TN-Tr2; 2: HCM-Tr2; 3: ĐT-Th1; 4: TN-Th1; 5: HCM-L2; 6: TN-L3; Ladder 100bp

Phụ lục 42 Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CL1C/CL2C

(91)

Các mẫu nấm gây bệnh có tính độc cao từ kết đánh giá độc lực mẫu phân tích thuộc hai nhóm phức hợp lồi Colletotrichum gloeosporioides (TN-Tr2 HCM-Tr2) Colletotrichum truncatum (TN-L3, TN-Th1, HCM-L2 ĐT-Th1) Để kiểm tra định danh mức độ loài phương pháp sinh học phân tử, mồi khuếch đại dựa vào trình tự mồi vùng gen ITS4,5 (internal transcribed spacer), ACT (partical actin), GPDH (Glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase), TUB2 (β-tubin), GS (Glutamine synthetase), CHS (Chitin synthase) CAL (Calmodin) (Bảng 2.5)

Bảng 3.6 Kết định danh lồi Colletotrichum spp dựa vào trình tự vùng gen

Tên mẫu/Vùng

gen

TN-Tr2 (1) HCM-Tr2 (2) ĐT-TH1 (3) TN-TH1 (4) HCM-L2 (5) TN-L3 (6)

ITS (I) Colletotrichum

gloeosporioides Colletotrichum scovillei Colletotrichum truncatum Colletotrichum truncatum Colletotrichum truncatum Colletotrichum truncatum ACTIN (A) Colletotrichum siamense Colletotrichum siamense Colletotrichum truncatum Colletotrichum truncatum Colletotrichum truncatum Colletotrichum truncatum GAPDH (G) Colletotrichum siamense Colletotrichum scovillei Colletotrichum truncatum Colletotrichum truncatum Colletotrichum truncatum Colletotrichum truncatum

TUBIN (T) Colletotrichum

siamense Colletotrichum scovillei Colletotrichum truncatum Colletotrichum truncatum Colletotrichum truncatum Colletotrichum truncatum

GS (S) Colletotrichum

gloeosporioides Colletotrichum acutatum Colletotrichum truncatum Colletotrichum truncatum Colletotrichum truncatum Colletotrichum truncatum CHS (C) Colletotrichum fructicola Colletotrichum scovillei Colletotrichum truncatum Colletotrichum truncatum Colletotrichum truncatum Colletotrichum truncatum

CAL (L) Colletotrichum

siamense Colletotrichum scovillei Colletotrichum siamense Colletotrichum siamense Colletotrichum siamense Colletotrichum siamense

Sau khuếch đại mồi, mẫu gởi định danh phân loại phức hợp loài Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học Môi trường, trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh nhận thực (dịch vụ theo hợp đồng) (Phụ lục 3)

Kết phân tích mẫu Bảng 3.6 cho thấy hai phức hợp loài

Colletotrichum spp phân loại định danh dùng hình thái, đề tài ghi nhận

thêm số phân loài C siamense, C scovillei, C acutatum C

fructicola Sự đa dạng loài phát sinh loài nấm Colletotrichum spp

(92)

Theo Cannon cộng (2012), định danh nấm Colletotrichum spp dựa phân tích phân tử ngày phổ biến dẫn tới nhiều thay đổi phân loại lồi thuộc chi Thơng thường Colletotrichum spp., thường sử dụng cặp mồi trở lên vùng gen khác Kết nghiên cứu Weir cộng (2012) cho thấy, C gloeosporioides thực chất phức hợp loài (special complex), đó C gloeosporioides gồm 22 loài khác [5,6] Và kết chạy sinh học phân tử cặp mồi cho mẫu nấm C truncatum cho kết thống cặp mồi chạy Với cơng trình nghiên cứu cơng bố ngồi nước cho thấy nấm Colletotrichum spp có biến đổi đa dạng

3.2 Hồn thiện cơng nghệ tạo oligochitosan-silica nano

Nhiều cơng trình nghiên cứu giới quan tâm đến vật liệu lai “vô – hữu cơ” chúng có nhiều hiệu ứng cộng gộp tính chất lý, hóa sinh học hai loại vật liệu Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu chế tạo hỗn hợp lai nSiO2 với loại vật liệu khác hỗn hợp nSiO2/chitosan, nSiO2/tripolyphosphaste (TPP) Tuy

vậy, chưa có cơng trình nghiên cứu chế tạo vật liệu lai nSiO2/oligochitosan, đặc

biệt hiệu ứng sinh học hỗn hợp vật liệu lai thực vật, điển hình hiệu ứng kích kháng bệnh ớt

Các công nghệ trước chế tạo hỗn hợp nSiO2/chitosan, nSiO2/TPP thường ổn

địn môi trường pH thấp (~3  3,5), bị kết lắng mơi trường có pH cao (trung tính kiềm nhẹ) khó ứng dụng nông nghiệp Do oligochitosan không bị kết tủa mội trường trung tính kiềm nhẹ, nên q trình chế tạo hỗn hợp vật liệu lai (vô cơ/hữu cơ) nSiO2/oligochitosan thuận lợi so với công nghệ

trước sản xuất hỗn hợp nSiO2/chitosan, nSiO2/TPP Đây sở

(93)

3.2.1 Điều chế oligochitosan có trọng lượng phân tử thấp phương pháp xác định liều lượng chiếu xạ tia gamma Co-60 kết hợp với H2O2

Kết KLPT (Mw) chitosan chiếu xạ với liều xạ khác mẫu dung dịch chitosan 4% có khơng có H2O2 (Bảng 3.7)

Kết Bảng 3.7 cho thấy với mẫu dung dịch chitosan 4% có khơng có H2O2, tăng liều chiếu xạ, KLPT chitosan giảm xuống Khi có mặt H2O2,

mức độ suy giảm KHPT chitosan nhanh so với dung dịch khơng có H2O2

mức độ suy giảm tăng hàm lượng H2O2 tăng từ 0,5 đến 1% Kết phù hợp với

các kết khảo sát cắt mạch chitosan dung dịch chứa H2O2 xảy theo hiệu

ứng đồng vận [113, 114, 115]

Bảng 3.7 Sự suy giảm KLPT chitosan dung dịch 4% có khơng có H2O2

theo liều xạ

Liều xạ, kGy CTS 4% CTS 4%/H2O2 0,5% CTS 4%/H2O2 1%

0 44,500 44,500 44,500

3,5 319,000 17,900 16,700

7,0 14,800 12,600 10,500

10,5 12,300 9,000 7,700

14,0 10,500 6,600 5,500

17,5 9,100 5,500 4,600

21,0 7,900 5,000 4,200

Từ kết Bảng 3.7, chọn 02 mẫu oligochitosan từ dung dịch chitosan 4%/H2O2 1%, chiếu xạ liều 10,5 17,5 kGy có KLPT tương ứng 7,7 kDa 4,6

kDa dùng cho thí nghiệm ức chế nấm bệnh thực vật

Kết Bảng 3.8 cho thấy mẫu chitosan 4%/H2O2 1%, liều xạ 21 kGy,

(94)

gốc tự đại phân tử dẫn đến liên kết glucozit bị cắt, tạo thành phân tử chitosan có KLPT thấp [116]

Bảng 3.8 Độ ĐĐA% số đa phân tán (PI) chitosan theo liều xạ

Liều xạ, kGy

CTS 4% CTS 4%/H2O2 0,5% CTS 4%/H2O2 1%

ĐĐA % PI ĐĐA % PI ĐĐA % PI

0 91,3 3,37 91,3 3,37 91,3 3,37

3,5 90,2 2,63 89,9 2,78 89,6 2,69

7,0 89,4 2,60 89,1 2,52 88,5 2,55

10,5 89,0 2,56 88,6 2,48 87,7 2,31

14,0 88,7 2,49 88,0 2,18 86,2 1,95

17,5 88,5 2,43 87,6 1,97 85,9 1,81

(95)

Hình 3.5 Sắc kí đồ GPC mẫu oligochitosan có Mw 2,5 kDa (a);

4,6 kDa (b) 7,7 kDa (c)

Kết Bảng 3.9 cho thấy với nồng độ H2O2 0,5% chitosan nhỏ hơn, cụ

thể 2% mức độ suy giảm KLPT theo liều xạ nhanh so với dung dịch chitosan nồng độ cao (4%) Như dự đốn muốn tạo oligochitosan KLPT nhỏ việc lựa chọn nồng độ chitosan thích hợp cần thiết Ngồi cịn có yếu tố khác chủ yếu KLPT ban đầu chitosan Từ kết Bảng 3.9, lựa chọn mẫu oligochitosan có KLPT 2,5 kDa nhận liều xạ 21 kGy

Từ kết thí nghiệm đề tài chọn mẫu oligochitosan có KLPT 7,7 kDa, 4,6 kDa 2,5 kDa dùng cho thí nghiệm ức chế nấm bệnh ớt

a

b

(96)

Bảng 3.9 KLPT (Mw), PI ĐĐA chitosan dung dịch 2%/H2O2 0,5% theo

liều xạ

Liều xạ, kGy KLPT, Mw ĐĐA % PI

0,0 44.500 91,3 3,37

3,5 11.900 90,7 2,90

7,0 6.300 89,4 2,33

10,5 4.400 88,1 1,63

14,0 3.500 87,6 1,40

17,5 2.900 86,4 1,32

21,0 2.500 85,9 1,25

3.2.1.1 Khảo sát số đặc trưng tính chất phân đoạn oligochitosan điều chế

Tính chất phổ hồng ngoại (IR): Kết phổ hồng ngoại cho thấy chitosan cắt mạch tạo oligochitosan có KLPT từ 2,5 đến 7,7 kDa có cấu trúc khơng thay đổi so với chitosan ban đầu (Hình IR 3.6a) Sự khác cường độ đỉnh 1320 1420 cm-1 đặc trưng tương ứng cho nhóm N-acetylglucosamine

nhóm so sánh -CH2 thể thay đổi ĐĐA chitosan oligochitosan [115]

(97)

Hình 3.6 Phổ hồng ngoại (IR) nhiễu xạ tia X (XRD) mẫu chitosan (a)

các phân đoạn oligochitosan 7,7 kDa (b); 4,6 kDa (c) 2,5 kDa (d)

Kết luận: Đã chế tạo oligochitosan phương pháp chiếu xạ tia gamma Co-60 dung dịch chitosan có khơng có H2O2 Đã khảo sát ảnh hưởng nồng độ

chitosan nồng độ H2O2 lên trình cắt mạch chitosan tạo oligochtosan Đã lựa

chọn 03 mẫu oligochitosan với KLPT là: 7,7; 4,6 2,5 kDa dùng để thí nghiệm ức chế nấm bệnh ớt Ngoài mẫu oligochitosan dùng để tạo hỗn hợp vật liệu lai với silica nano chế tạo từ vỏ trấu

3.2.1.2 Đánh giá khả ức chế nấm bệnh phân đoạn oligochitosan điều chế

Trong trình khảo sát khả kích kháng bệnh thán thư ớt (Capsicum frutescens L.) gây nấm Colletotrichum spp hỗn hợp oligochitosan nano silica, cần xác định phân đoạn nồng độ kháng nấm

Colletotrichum spp thích hợp đơn vị kết hợp điều kiện in vitro Hoạt

(98)

Bảng 3.10 Ảnh hưởng phân đoạn oligochitosan khác nồng độ 0,01%

đến phát triển Colletotrichum spp môi trường PDA

Mẫu Đường kính tản nấm

3NSC 4NSC 5NSC 6NSC 7NSC 8NSC 9NSC

2,5 kDa 2,08±0,38 2,63±0,33 3,76±0,22 4,24±0,58 4,93±0,43 5,35±0,31 5,78±0,16 4,6 kDa 2,03±0,10 2,64±0,28 3,07±0,12 4,05±0,49 4,63±0,45 5,19±0,41 5,78±0,38 7,7 kDa 2,33±0,12 3,04±0,18 3,80±0,16 4,44±0,42 5,60±0,20 6,15±0,28 6,56±0,18 92,0 kDa 1,15±0,23 1,58±0,19 2,72±0,33 3,03±0,29 4,02±0,32 4,79±0,37 5,13±0,34 ĐC 2,08±0,37 2,71±0,29 2,98±0,21 3,73±0,40 5,08±0,45 5,41±0,57 6,08±0,42

Kết Bảng 3.10 cho thấy khả ức chế nấm Colletotrichum spp phân đoạn oligochitosan khác nồng độ 0,01% Đối với phân đoạn oligochitosan (2,5 kDa) đường kính tản nấm tăng dần Sau ngày đường kính tản nấm khơng khác biệt nhiều so với đối chứng âm Kết tương tự phân đoạn oligochitosan (4,6 kDa), đường kính tơ nấm tăng dần từ ngày đến ngày 9, nhiên đường kính tản nấm thấp so với phân đoạn oligochitosan 2,5 kDa Đối với phân đoạn oligochitosan tức phân đoạn 7,7 kDa, đường kính tản nấm đo cao so với oligochitosan phân đoạn Kích thước tản nấm tăng dần Đường kính tản nấm có tác động chitosan 92,0 kDa tăng dần từ ngày đến ngày theo dõi số liệu đo cho thấy đường kính đo thấp đối chứng âm nước cất phân đoạn oligochitosan Từ kết cho thấy khơng có ức chế nấm Colletotrichum spp ba phân đoạn oligochitosan nồng độ 0,01% ngày theo dõi Đối với phân đoạn oligochitosan có kích thích nấm

Colletotrichum spp mọc nhanh điều kiện in vitro Còn đối chứng dương

(99)

2,5 kDa 1,79±0,16 2,60±0,26 3,46±0,24 3,95±0,36 4,83±0,26 5,37±0,28 5,68±0,22 4,6 kDa 1,90±0,07 2,43±0,42 2,78±0,27 3,88±0,56 4,58±0,49 4,87±0,24 5,27±0,31 7,7 kDa 2,16±0,14 2,81±0,19 3,73±0,54 4,16±0,55 5,38±0,42 6,00±0,43 6,42±0,34 92,0 kDa 1,01±0,28 1,24±0,27 1,87±0,65 2,26±0,80 3,06±0,96 3,53±1,06 3,88±1,04 ĐC 2,08±0,37 2,71±0,29 2,98±0,21 3,73±0,40 5,08±0,45 5,41±0,57 6,08±0,42

Kết Bảng 3.11 cho thấy ức chế nấm Colletotrichum spp nồng độ 0,05% phân đoạn oligochitosan khác ngày Đối với phân đoạn oligochitosan (2,5 kDa) đường kính tản nấm tăng dần từ ngày đến ngày theo dõi Sự ức chế nấm xuất ngày Kết đường kính tản nấm Colletotrichum spp tác động oligochitosan phân đoạn 4,6 kDa tăng dần từ ngày đến ngày Kết cho thấy có ức chế nấm Colletotrichum sp in vitro từ ngày đến ngày Đối với phân đoạn oligochitosan 7,7 kDa, đường kính tản nấm tăng dần từ ngày đến ngày (2,16 ± 0,14 cm ngày đến ngày số liệu đo tăng đến 6,42 ± 0,34 cm) Số liệu kết cho thấy đường kính đo cao so với đối chứng dương (3,88±1,04 cm ngày theo dõi) âm (6,08 ± 0,42 cm vào ngày 9), kể hai phân đoạn oligochitosan Khơng có ức chế nấm phân đoạn oligochitosan từ ngày đến ngày 8, đến ngày có ức chế nấm

Colletotrichum spp nhiên không rõ rệt Phân đoạn oligochitosan cho thấy có

sự ức chế nấm ngày ngày đến Đối với phân đoạn oligochitosan có kích thích nấm mọc nhanh điều kiện in vitro Đối chứng dương có ức chế nấm

Colletotrichum spp in vitro rõ rệt

(100)

7 4,01 ± 0,36 cm, ngày tản nấm tăng trưởng 4,67 ± 0,37 cm, 4,88 ± 0,41 cm ở ngày 9) ức chế nấm Colletotrichum spp ngày 4, 7, điều kiện in vitro

đến phát triển Colletotrichum spp mơi trường PDA

2,5 kDa 1,80±0,11 2,76±0,30 3,48±0,28 4,19±0,73 5,13±0,37 5,48±0,22 5,71±0,22 4,6 kDa 1,74±0,21 2,03±0,36 3,02±0,32 3,71±0,38 4,01±0,36 4,67±0,37 4,88±0,41 7,7 kDa 2,22±0,27 2,93±0,18 3,58±0,25 4,26±0,46 5,18±0,42 5,78±0,37 6,39±0,30 92,0 kDa 0,93±0,28 1,14±0,24 1,77±0,53 2,22±0,65 2,51±0,70 2,79±0,71 3,08±0,72 ĐC 2,08±0,37 2,71±0,29 2,98±0,21 3,73±0,40 5,08±0,45 5,41±0,57 6,08±0,42

Từ kết cho thấy ức chế nấm điều kiện in vitro phân đoạn oligochitosan 2,5 kDa 7,7 kDa nồng độ 0,1% Hơn cịn có khả kích thích tản nấm Colletotrichum spp tăng nhanh Có ức chế nấm

Colletotrichum spp in vitro phân đoạn oligochitosan 4,6 kDa Kikov cộng sử

dụng loạt oligochitosan phân đoạn khác để ức chế nấm Candida

albicans cho thấy phân đoạn từ 6,0 – 20,0 kDa nồng độ từ 16 - 256 ppm có

sự ức chế [123] Cịn phân đoạn oligochitosan thấp 5,0 kDa khơng có ức chế nấm Điều phù hợp với kết phân đoạn oligochitosan 4,6 kDa có sự ức chế nấm Colletotrichum spp

Kết Bảng 3.13 cho thấy ức chế đường kính tản nấm Colletotrichum spp

in vitro oligochitosan phân đoạn khác nồng độ 0,5% Đường kính

(101)

2,5 kDa 2,31±0,12 2,53±0,08 3,48±0,25 4,13±0,66 5,11±0,18 5,67±0,20 5,70±0,08 4,6 kDa 1,58±0,20 1,95±0,30 2,84±0,23 3,54±0,48 4,04±0,35 4,56±0,54 4,85±0,51 7,7 kDa 2,36±0,43 2,89±0,28 3,42±0,22 4,48±0,15 5,27±0,36 5,83±0,41 6.35±0,47 92,0 kDa 0,8±0,17 1,07±0,18 1,32±0,20 1,51±0,22 1,71±0,18 1,98±0,16 2,23±0,17 ĐC 2,08±0,37 2,71±0,29 2,98±0,21 3,73±0,40 5,08±0,45 5,41±0,57 6,08±0,42

Đối với phân đoạn oligochitosan ức chế nấm Colletotrichum spp từ ngày đến ngày Khơng có ức chế nấm Colletotrichum spp phân đoạn oligochitosan cịn kích thích nấm Colletotrichum spp mọc nhanh ở điều kiện in vitro Mặc dù nồng độ có ức chế nấm Colletotrichum spp phân đoạn oligochitosan 4,6 kDa Yang cộng sử dụng oligochitosan phân đoạn thấp để ức chế nảy mầm kéo dài ống bào tử nấm Monilinia fructicola [124] Kết nghiên cứu cho thấy nồng độ 1g/L oligochitosan có ức chế nảy mầm nấm Monilinia fructicola in vitro

(102)

Bảng 3.14 Ảnh hưởng phân đoạn oligochitosan khác nồng độ 1% đến

sự phát triển Colletotrichum spp mơi trường PDA

2,5 kDa 2,09±0,12 2,78±0,24 3,43±0,25 4,27±0,39 5,26±0,29 5,54±0,15 5,79±0,16 4,6 kDa 1,75±0,27 1,15±0,49 2,83±0,32 3,68±0,51 4,35±0,46 4,91±0,33 5,20±0,13 7,7 kDa 2,20±0,16 2,73±0,27 3,34±0,26 4,07±0,35 5,31±0,41 5,30±1,45 6,38±0,37 92,0 kDa 0,71±0,10 0,87±0,12 1,04±0,17 1,26±0,23 1,28±0,30 1,72±0,28 1,98±0,30 ĐC 2,08±0,37 2,71±0,29 2,98±0,21 3,73±0,40 5,08±0,45 5,41±0,57 6,08±0,42

Những kết cho thấy phân đoạn oligochitosan 4,6 kDa nồng độ 1% có ức chế nấm Colletotrichum spp in vitro Đồng thời cho thấy phân đoạn oligochitosan 2,5 kDa 7,7 kDa kích thích nấm Colletotrichum spp mọc nhanh điều kiện phịng thí nghiệm Tương tự với kết trên, Meng cộng nghiên cứu sử dụng Oligochitosan phân đoạn 6,0 kDa ức chế nấm nấm Physalospora piricola Nose nồng độ g/L kháng nấm nấm Physalospora piricola Nose có ức chế [125]

Những kết khảo sát cho thấy phân đoạn oligochitosan 4,6 kDa với nồng độ 0,5 - 1% có khả ức chế nấm Colletotrichum spp., thích hợp ba phân đoạn Oligochitosan khảo sát.

3.2.2 Điều chế hạt nano silica từ nguồn vỏ trấu

Vỏ trấu xử lý với HCl 5% 10% nung 700oC tạo nano silica màu trắng

(103)

Hình 3.7 Nano silica chế tạo từ vỏ trấu: xử lý với nước (a), HCl 5% (b) 10% (c)

Hiệu suất tạo nano silica từ HCl 5% vỏ trấu trung bình 10, 21% (Bảng 3.15) Tùy nhiên tùy thuộc vào xuất xứ hay vị trí địa lý trồng lúa mà hiệu suất nano silica vỏ trấu thay đổi [126]

Bảng 3.15 Hiệu suất tạo nano silica từ vỏ trấu xử lý với HCl 5%

Mẫu Vỏ trấu (g) nano-SiO2 (g) Hiệu suất (%)

1 0,5105 10,33

2 0,5022 10,04

3 0,5128 10,26

Kết (theo Hình 3.8A,B) cho thấy kích thước hạt nano silica chế tạo nung vỏ trấu 700oC, khoảng 10 - 30 nm Kết phù hợp với nghiên cứu Wang cộng [127]; Athinarayanan cộng [128] nhận kích thước hạt nano silica tương tự nung bột vỏ trấu 700oC, Trong

khi nung nhiệt độ thấp cụ thể 500 600oC tạo nano silica kích

thước hạt lớn Như nhiệt độ 700oC nhiệt độ thích hợp để nung vỏ trấu xử

lý với acid để chế tạo nano silica

(104)

hạt nano silica phân bố hình chng (Gaussian distribution) Kết đo kích thước hạt nano silica SEM (~30-70 nm) lớn hớn so với kết chụp TEM

Đặc trưng tính chất hạt nano silica điều chế

Hình 3.8 Hình chụp TEM (A, B); phân bố kích thước hạt đo phương pháp tán xạ

laser (C); giản đồ XRD (D) EDX (E) hạt nano silica điều chế

Giản đồ nhiễu xạ tia X nano silica Hình 3.8D cho thấy có đỉnh 2 ~22o Kết nhận xác nhận cấu trúc vơ định hình nano silica nhận từ

vỏ trấu xử lý với acid nung 700oC [131, 132] Than từ vỏ trấu Việt Nam không xử lý acid có thành phần kim loại K2O (0,39%), Al2O3 (0,48%),

Fe2O3 (0,15%), CaO (0,73%), MgO (0,55%), Na2O (0,12%) SiO2 96,15% [131]

Trong thí nghiệm dùng vỏ trấu (không phải than đốt từ vỏ trấu) xử lý với HCl trước nung, tạp chất oxíd kim loại loại bỏ Mặc dù nano silica tạp chất Al2O3 (k đỉnh 1.486 keV) với hàm lượng ~0,7%

(105)

loại có vỏ trấu nhằm gia tăng độ tinh khiết sản phẩm nano silica đáp ưng nhu cầu sản xuất (cleaner production) Ngồi sử dụng than từ vỏ trấu xử lý với acid, nung tạo nano silica Kết tương tự với cấu trúc vơ định hình nano silica nhận từ nung vỏ trấu

Kết luận: Đã chế tạo nano silica theo phương pháp nung vỏ trấu xử lý với acid để loại bỏ tạp chất chủ yếu ion kim loại Kích thước hạt nano silica nhận khoảng 10 - 30 nm với đặc trưng cấu trúc pha vơ định hình có đỉnh nhiễu xạ tia X góc 2 ~22o Sản phẩm nano silica nhận dùng cho thí nghiệm

kích kháng bệnh tăng trưởng ớt Ngoài ra, nano silica sử dụng chế tạo hỗn hợp vật liệu lai oligochitosan-silica nano với mục đích dùng cho thí nghiệm kích kháng bệnh tăng trưởng ớt

3.2.3 Điều chế hỗn hợp oligochitosan-silica nano

Tỷ lệ phối trộn nSiO2 oligochitosan nghiên cứu lựa chọn từ

công trình nghiên cứu độ bền tách pha theo thời gian hỗn hợp nSiO2/chitosan

và thông qua nghiên cứu tiền khảo sát, thực nghiệm độ bền tách pha hỗn hợp nSiO2/oligochitosan theo tỷ lệ khác nhau: 1;1, 2:2 (w/v) từ lựa chọn

tỷ lệ thích hợp sử dụng nghiên cứu

(106)

Hình 3.9 Sự phối trộn tạo gel tạo chế phẩm (A), khảo sát độ bền gel theo pH 5; 6,5;

7,5; 8,5 (D) thành phẩm pH 7,5 1% HEC (E) Các tính chất chế phẩm tạo thành hình chụp TEM (G) TEM pH (H) phổ FTIR ban đầu hạt nano silica (B)

oligochitosan (C) phối trộn (F) thành phẩm (I)

Ảnh TEM Hình 3.9G cho thấy nano silica phân bố dung dịch oligochitosan với kích thước có phần biến dạng so với nano silica dạng tinh khiết Cho đến chưa có cơng trình nghiên cứu cơng bố kết chụp ảnh TEM hỗn hợp oligochitosan-silica nano để so sánh Ảnh TEM hình 3.9H hỗn hợp oligochitosan-silica nano cho thấy hạt nano silica tách biệt rõ ràng hơn, không giống trường hợp pH 7,5 có trương hạt nano silica Chính lý mà hạt nano silica dung dịch oligochitosan không tạo gel bền dễ sa lắng

(107)

802/cm dao động uốn (bending vibration) đỉnh 467/cm Ngồi ra, Phổ FTIR cịn xuất đỉnh 1.635/cm, theo tác giả cơng trình [132] đỉnh đặc trưng cho giao động uốn liên kết H−O−H liên quan đến phân tử nước bị bẫy (trapped water moleces) cấu trúc matrix nano silica

Phổ FTIR oligochitosan Hình 3.9C cho thấy dao động co giãn nhóm (C=O) đỉnh 1.647/cm nhóm (C−N) đỉnh 1593/cm [84] Dao động uốn nhóm (N−H) đặc trưng cho chitin xuất đỉnh 771/cm Dao động co giãn bất đối xứng nhóm (C−O−C) đặc trưng đỉnh 1.153/cm đỉnh dao động co giãn nhóm (C−O) đặc trưng chung cho polysaccharide xuất đỉnh 1.031 1.074/cm Nhóm (OH) dao động đặc trưng vùng số sóng 3.420 – 3.450/cm

Phổ FTIR hỗn hợp oligochitosan-silica nano Hình 3.9F cho thấy xuất đỉnh 1.083/cm 781/cm đặc trưng cho liên kết Si−O−C, đỉnh không xuất phổ FTIR oligochitosan nano silica Ngoài phổ đồ FTIR hỗn hợp oligochitosan-silica nano (Hình 3.9I) cịn xuất thêm đỉnh 927/cm đặc trưng cho liên kết Si−O−H trình tạo liên kết hydro nhóm silanol nano silica nhóm –NH2, −OH oligochitosan [117] Nói chung

khi đưa silica nano vào dung dịch oligochitosan cường độ đỉnh đặc trưng chitosan bao gồm nhóm (N−H) giảm số sóng thấp so với oilgochitosan tinh khiết tương tác bề mặt oilgochitosan với pha vô nano silica

 Thuyết minh quy trình tạo oligochitosan-silica nano:

1 Tạo hạt nano silica từ vỏ trấu:

Vỏ trấu loại bỏ chất bẩn, cát Sau xay nhuyễn, ngâm trương nước Xử lý vỏ trấu với dung dịch HCl 5% 12h Loại bỏ dung dịch acid rửa lại với nước cất đến pH trung tính Nung vỏ trấu 700oC 2h thu nano

silica

2 Tạo oligochitosan

(108)

chitosan: acid lactic: H2O2 4:2:1.3 Chiếu xạ với tia gamma Co-60 khoảng

liều ~21 kGy thời gian ~17,5 Tạo oligochitosan-silica nano

Khuấy nano silica NaOH 1M khoảng 1h Bổ sung thêm dung dịch oligochitosan 4% tiếp tục khuấy nhiệt độ phòng cho tỷ lệ silica nano:oligochitosan:nước (w/v/v) 1:25:100 Điều chỉnh pH dung dịch khoảng 6,5 – 7,5 Bổ sung thêm chất tạo đặc HEC nồng độ 1% w/v tạo sản phẩm hỗn hợp oligochitosan-silica nano

- Cơng nghệ cũ: sử dụng chitosan chitosan có khối lượng phân tử thấp (> 30,0 kDa) Công nghệ hồn thiện: Tạo oligochitosan từ chitosan có độ ổn định cao mơi trường trung tính phương pháp chiếu xạ tia gamma Co-60 kết hợp xử lý H2O2; mơi trường trung tính oligochitosan khơng bị biến tính không bị kết

tủa dễ dàng ứng dụng nơng nghiệp

(109)

Quy trình chế tạo hỗn hợp oligochitosan-silica nano tóm tắt sau:

- Cơng nghệ cũ: Chưa có sản phẩm hỗn hợp oligochitosan – silica nano sản xuất Công nghệ hoàn thiện: Điều chế tạo hỗn hợp oligochitosan – silica nano ổn định pH trung tính để ứng dụng nông nghiệp; hỗn hợp oligochitosan – silica nano có độ ổn định cao, dễ ứng dụng nơng nghiệp

Quy trình chế tạo nano silica/oligochitosan quy trình luận án nghiên cứu thiết lập, ưu điểm quy trình dễ dàng triển khai sản xuất quy mơ lớn, sản phẩm chế tạo có giá thành cạnh tranh Có thể xem sản phẩm có giá trị gia tăng, chế tạo sở kết hợp ứng dụng hai công nghệ, công nghệ nano công nghệ xạ

Hạt nano silica nSiO2

1 gam

Dung dịch oligochitosan 4%

25 mL

NaOH 1M

7,7 mL

Định mức 100 mL

Khuấy

Chỉnh pH ~ 6,5  7,5

Bổ sung chất tạo đặc

Khuấy

Dung dịch nano silica / oligochitosan

nSiO2 / COS

HCl 1M NaOH 1M

HEC 1% (w/v)

H2O

4

(110)

3.3 Khả kích kháng bệnh thán thư nấm Colletotrichum gloeosporioides và C truncatum gây oligochitosan-silica nano ớt trồng điều kiện phịng thí nghiệm

3.3.1 Tình hình bệnh thán thư nấm C gloeosporioides C truncatum gây trên ớt

mức độ bệnh thán thư nấm C gloeosporioides C truncatum gây điều kiện phòng thí nghiệm

Nghiệm thức

Tỷ lệ bệnh (%) Chỉ số bệnh(2) (%)

7NSXL 14NSXL 21NSXL 7NSXL 14NSXL 21NSXL

Oligochitosan

ĐC (-) 16,88 a 19,92 a 23,13 a 3,65 a 5,26 a 6,03 a

ĐC (+) 17,21 a 19,50 b 21,54 b 3,63 a 5,00 b 5,92 b

25 ppm 12,08 c 5,70 d 9,24 c 2,60 b 1,78 c 2,18 c

50 ppm 12,50 b 6,07 c 9,12 c 2,50 b 1,84 c 2,19 c

100 ppm 12,46 b 5,98 c 9,19 c 2,40 b 1,77 c 2,02 c

CV(%) 5,73 3,96 3,88 5,32 5,37 7,21

Ft 103,26** 660,92** 370,58** 255,38** 20,20** 140,79**

Nano silica

ĐC (-) 18,11 a 20,19 a 25,51 a 3,24 a 4,35 a 5,39 a

ĐC (+) 16,97 b 19,19 b 24,82 b 3,05 ab 4,00 b 5,18 b

25 ppm 15,37 c 8,22 c 11,42 c 2,94 b 2,63 b 3,04 c

50 ppm 13,31 d 6,44 cd 10,51 d 2,87 c 2,06 c 2,33 d

100 ppm 13,11 d 5,69 d 11,16 c 2,80 c 2,14 c 2,32 d

CV(%) 4,89 7,25 4,82 5,64 10,76 7,75

Ft 143,25** 165,66** 139,55** 89,93** 9,64** 42,85**

Oligochitosan – silica nano

ĐC (-) 17,90 a 20,60 a 25,47 a 3,38 a 4,34 a 5,08 a

ĐC (+) 16,97 b 19,43 b 23,51 b 3,10 b 3,92 b 4,65 b

25 ppm 14,60 c 8,51 c 11,43 d 2,42 c 1,05 c 1,99 c

50 ppm 14,11 d 8,25 d 11,45 d 2,20 d 0,94 d 1,91 d

100 ppm 14,22 d 8,50 c 11,74 c 2,33 c 0,97 c 1,97 c

CV(%) 4,53 5,66 5,83 6,34 11,41 11,18

Ft 136,73** 158,83** 85,97** 132,94** 98,70** 43,53**

* Ghi chú: Trong cột, trị số có ký tự kèm khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê; ns: không sai khác thống kê;** khác biệt có ý nghĩa thống kê, BĐXL: Bắt đầu xử lý, NSXL: Ngày sau xử lý; số

(111)

Kết Bảng 3.16 cho thấy, Oligochitosan có tác động đến tình hình tỷ lệ bệnh số bệnh thán thư gây hại ớt Khi phun Oligochitosan nồng độ 25, 50 100 ppm cho kết tỷ lệ bệnh số bệnh thấp so với hai đối chứng Ở thời điểm NSXL, tỷ lệ bệnh đạt từ 12,08 đến 12,50% số bệnh đạt từ 2,40 đến 2,60 %, tỷ lệ bệnh thấp phun oligochitosan nồng độ 25 ppm (chỉ có 12,08%, thấp hai đối chứng 4,80% 5,13%), số bệnh đạt thấp phun oligochitosan từ 25 đến 100 ppm Trong đó, giai đoạn 14 ngày sau xử lý, tỷ lệ bệnh số bệnh lại có xu hướng giảm phun oligochitosan Điều khẳng định rằng, Oligochitosan có ảnh hưởng rõ đến tỷ lệ bệnh thán thư ớt, phun oligochitosan nồng độ 25 ppm thời điểm 14 NSXL cho tỷ lệ bệnh thấp (chỉ có 5,70%) số bệnh đạt thấp phun oligochitosan từ 25 đến 100 ppm

Nhưng thời điểm 21 NSXL, tỷ lệ bệnh số bệnh lại có xu hướng tăng nhẹ trở lại có phun oligochitosan (tỷ lệ bệnh dao động từ 5,70 đến 6,07%, phun oligochitosan nồng độ 25 ppm cho tỷ lệ bệnh thấp số bệnh từ 2,02 đến 2,19% phun oligochitosan từ 25 đến 100 ppm

Về nano silica, tỷ lệ bệnh số bệnh thán thư tương tự phun oligochitosan, giai đoạn từ sau ngày xử lý đến 14 ngày sau xử lý, tỷ lệ bệnh số bệnh có xu hướng giảm dần tăng trở lại giai đoạn sau 21 ngày xử lý, kết cho tỷ lệ bệnh số bệnh thấp phun nano silica từ 50 đến 100 ppm

(112)

hai đối chứng từ 3,30 đến 14,04% số bệnh có từ 0,94 đến 2,20%, thấp hai đối chứng từ 3,17 đến 14,02%)

Oligochitosan tham gia hiệu hiệu ứng phối hợp tạo phytoalexin xem chất kháng sinh thực vật Các hạt silica nano dễ dàng hấp thu tích lũy mơ biểu bì tăng cường cấu trúc cho mô để chống lại xâm nhập nấm bệnh Cuối cùng, hạt nano làm gia tăng hoạt động sản xuất hợp chất phenolic enzyme chitinase, nhằm chống lại xâm nhập mầm bệnh [135] Kết nghiên cứu Rodrigues cho thấy silica đóng vai trị quan trọng cảm ứng kích kháng bệnh bạc lúa cách cảm ứng tạo phytoalexin [136] Gần đây, Kiirika cộng kết hợp sử dụng silica chitosan để cảm ứng hiệu ứng phối hợp kích kháng bệnh héo rũ vi khuẩn cà chua [137] Thực vật tạo nhiều loại phytoalexin với cấu trúc đa dạng Ở họ Cà, phytoalexin sesquiterpene, ví dụ capsidiol phytoalexin tạo ra loài Nicotiana Capsicum, rishitin loài Solanum Trái lại lúa

(Oryza sativa) tạo sakuranetin diterpene momilactone, Arabidopsis thaliana

tạo camalexin Mặc dù vai trò quan trọng phytoalexin phản ứng phòng vệ thực vật ức chế phát triển tác nhân gây bệnh, chế vận chuyển chúng tới điểm tác nhân gây bệnh công thực vật chưa hiểu rõ [138]

3.3.2 Đánh giá khả kích kháng bệnh thán thư nấm C gloeosporioides và C truncatum gây ớt

3.3.2.1 Sự thay đổi hoạt tính enzyme chitinase

Qua Bảng 3.17 Hình 3.10 cho thấy phun oligochitosan, nano silica oligochitosan-silica nano có tác động đến hoạt tính chitinase

(113)

tính chitinase tốt so với hai đối chứng (đạt 3,04 U/mg protein, cao hai đối chứng từ 1,26 đến 1,40 U/mg protein)

Kết Bảng 3.18 Hình 3.11 cho thấy, oligochitosan có ảnh hưởng đến gia tăng hoạt tính β 1,3-glucanase, cụ thể bắt đầu xử lý oligochitosan nghiệm thức có dao động không sai khác mặt thống kê Nhưng ngày sau xử lý đến 21 ngày sau xử lý, hoạt tính β 1,3-glucanase tăng mạnh có xử lý oligochitosan nồng độ từ 25 đến 100 ppm Trong đó, tăng mạnh giai đoạn từ ngày sau xử lý đến 14 ngày sau xử lý, sau giảm nhẹ giai đoạn 21 ngày sau xử lý

Hình 3.10 Ảnh hưởng oligochitosan, silica nano oligochitosan-silica nano đến

hoạt tính chitinase điều kiện phịng thí nghiệm

(114)

hoạt tính chitinase (U/mg protein) điều kiện phịng thí nghiệm

Nghiệm

thức BĐXL 7 NSXL 14 NSXL 21 NSXL

Oligochitosan

ĐC (-) 1,46 1,68 c 1,87d 1,89 d

ĐC (+) 1,45 1,53 d 1,58 e 1,62 e

25 ppm 1,45 2,27 a 2,91 a 2,95 a

50 ppm 1,45 2,10 b 2,64 b 2,69 b

100 ppm 1,45 2,01 b 2,37 c 2,44 c

CV(%) 2,16 3,38 3,57 3,70

Ft 0,02ns 66,48** 136,59** 124,43**

Nano silica

ĐC (-) 1,24 1,47 c 1,54 c 1,58 c

ĐC (+) 1,22 1,32 d 1,40 d 1,42 d

25 ppm 1,22 1,95 b 2,17 b 2,20 b

50 ppm 1,23 2,08 ab 2,25 b 2,31 b

100 ppm 1,24 2,25 a 2,44 a 2,46 a

CV(%) 4,43 4,52 2,76 2,29

Ft 0,09ns 70,90** 218,60** 309,23**

Oligochitosan – silica nano

ĐC (-) 1,45 1,68 b 1,76 c 1,78 c

ĐC (+) 1,44 1,53 c 1,59 d 1,64 d

25 ppm 1,45 2,39 a 2,80 ab 2,90 ab

50 ppm 1,45 2,56 a 2,97 a 3,04 a

100 ppm 1,44 2,26 a 2,64 b 2,75 b

CV(%) 1,75 7,56 2,81 3,59

Ft 0,09ns 42,87** 275,75** 174,12**

* Ghi chú: Trong cột, trị số có ký tự kèm khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê; ns: không sai khác thống kê; ** khác biệt có ý nghĩa thống kê; BĐXL: Bắt đầu xử lý, NSXL: Ngày sau xử lý;

3.3.2.2 Sự thay đổi hoạt tính enzyme β 1,3-glucanase

(115)

β 1,3-glucanase tăng mạnh từ sau ngày xử lý đến 14 ngày xử lý, sau giảm nhẹ giai đoạn 21 ngày sau xử lý

hoạt tính β 1,3-glucanase (µmol/h/mg protein) điều kiện phịng thí nghiệm

Nghiệm

Oligochitosan

ĐC (-) 0,57 0,69 d 0,73 c 0,67 c

ĐC (+) 0,54 0,56 e 0,60 d 0,54 d

25 ppm 0,56 1,88 a 2,04 a 1,94 a

50 ppm 0,56 1,63 b 1,87 ab 1,73 ab

100 ppm 0,57 1,37 c 1,67 b 1,60 b

CV(%) 12,49 7,77 6,67 6,55

Ft 0,13ns 111,63** 159,13** 172,58**

Nano silica

ĐC (-) 0,57 0,65 c 0,70 c 0,66 d

ĐC (+) 0,55 0,57 d 0,62 d 0,58 e

25 ppm 0,55 1,25 b 1,43 b 1,37 c

50 ppm 0,57 1,44 ab 1,67 a 1,58 b

100 ppm 0,57 1,64 a 1,83 a 1,78 a

CV(%) 9,87 8,43 6,32 5,00

Ft 0,11ns 78,41** 1149,46** 248,65**

Oligochitosan – Silica nano

ĐC (-) 0,57 0,66 c 0,73 d 0,71 d

ĐC (+) 0,57 0,59 d 0,65 e 0,62 e

25 ppm 0,58 1,42 b 1,66 b 1,63 b

50 ppm 0,57 1,64 a 2,21 a 2,18 a

100 ppm 0,57 1,28 b 1,45 c 1,42 c

CV(%) 8,70 6,57 5,56 5,22

Ft 0,05ns 120,80** 233,41** 271,13**

* Ghi chú: Trong cột, trị số có ký tự kèm khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê; ns: không sai khác thống kê;** khác biệt có ý nghĩa thống kê BĐXL: Bắt đầu xử lý, NSXL: Ngày sau xử lý

(116)

Ở giai đoạn từ ngày sau xử lý đến 14 ngày sau xử lý, oligochitosan-silica nano tác động mạnh làm tăng mạnh hoạt tính β 1,3-glucanase lại giảm nhẹ giai đoạn 21 ngày sau xử lý Tuy nhiên, qua giai đoạn xử lý khác nhau, phun oligochitosan-silica nano nồng độ 50 ppm cho kết tốt từ ngày sau xử lý đến 21 ngày sau xử lý, hoạt tính β 1,3-glucanase từ 1,64 đến 2,21 µmol/h/mg protein (cao hai đối chứng từ 0,98 đến 1,48 µmol/h/mg protein) Như vậy, oligochitosan-silica nano làm tăng hoạt tính β 1,3-glucanase, tăng mạnh sử dụng nồng độ 50 ppm

hoạt tính β 1,3- glucanase điều kiện phịng thí nghiệm

Như vậy, sử dụng riêng lẻ hay kết hợp oligochitosan nano silica có tác động đến hoạt tính β 1,3-glucanase, tăng mạnh giai đoạn từ ngày sau xử lý đến 14 ngày sau xử lý sử dụng oligochitosan-silica nano nồng độ 50ppm làm tăng lớn hoạt tính β 1,3-glucanase

3.3.2.3 Sự thay đổi capsidiol

(117)

động không sai khác mặt thống kê Nhưng ngày sau xử lý đến 21 ngày sau xử lý, tích lũy capsidiol tăng mạnh có xử lý oligochitosan nồng độ từ 25 đến 100 ppm Trong đó, tăng mạnh giai đoạn từ ngày sau xử lý đến 14 ngày sau xử lý, sau giảm nhẹ giai đoạn 21 ngày sau xử lý Trong giai đoạn xử lý khác nhau, nghiệm thức phun oligochitosan nồng độ 25 ppm cho kết tốt giai đoạn từ ngày sau xử lý đến 21 ngày sau xử lý (đạt từ 93,7 đến 120,7 µg/g FW, cao hai đối chứng từ 75,4 đến 100,7 µg/g FW) Như vậy, phun Oligochitosan làm tăng tích lũy capsidiol phun oligochitosan tốt nồng độ 25 ppm cho kết tốt

capsidiol (µg/g FW) điều kiện phịng thí nghiệm

Nghiệm

Oligochitosan

ĐC (-) 12,3 18,3 c 25,7 d 24,0 d

ĐC (+) 12,0 13,7 d 20,0 e 18,3 e

25 ppm 12,3 93,7 a 120,7 a 118,7 a

50 ppm 12,0 82,0 b 112,7 b 108,7 b

100 ppm 12,3 77,0 b 103,7 c 100,7 c

CV (%) 5,98 5,88 3,89 3,54

Ft 0,03ns 384,53** 826,67** 1038,36**

Nano silica

ĐC (-) 12,0 22,7 d 28,7 d 26,7 d

ĐC (+) 11,0 16,7 e 22,3 e 20,7 e

25 ppm 11,7 72,7 c 99,3 c 96,3 c

50 ppm 12,0 78,7 b 110,7 b 105,7 b

100 ppm 12,3 88,7 a 120,3 a 117,0 a

CV (%) 4,01 4,06 4,37 3,78

Ft 0,28ns 659,92** 594,96** 824,94**

ĐC (-) 12,3 26,3 c 30,3 d 28,3 d

ĐC (+) 12,0 22,3 d 25,0 e 23,7 e

25 ppm 12,3 95,7 ab 119,0 b 117,3 b

50 ppm 12,7 101,0 a 132,0 a 130,0 a

100 ppm 12,3 88,7 b 110,0 c 106,3 c

CV (%) 12,72 4,41 3,15 2,60

Ft 0,07ns 527,53** 1153,77** 1750,25**

(118)

Đối với nano silica có tác động đến tích lũy capsidiol, điều thể rõ tác dụng nano silica từ bắt đầu xử lý đến giai đoạn 21 ngày sau xử lý, nghiệm thức xử lý nano silica nồng độ 100 ppm cho kết tốt, (đạt 120,3 µg/g FW 14 ngày sau xử lý) Cũng tương tự oligochitosan, tích lũy capsidiol tăng mạnh từ sau ngày xử lý đến 14 ngày xử lý, sau giảm nhẹ giai đoạn 21 ngày sau xử lý

capsidiol phịng thí nghiệm

(119)

107,0 µg/g FW) Như vậy, oligochitosan-silica nano làm tăng tích lũy capsidiol, tăng mạnh sử dụng nồng độ 50 ppm

3.3.2.4 Sự thay đổi salicylic acid

Qua Bảng 3.20 Hình 3.13 cho thấy, salicylic acid chịu tác động oligochitosan, silca nano hay oligochitosan-silica nano

salicylic acid (ng/g FW) điều kiện phịng thí nghiệm

Nghiệm

Oligochitosan

ĐC (-) 4,51 18,23 d 25,23 c 23,70 c

ĐC (+) 4,52 13,96 e 17,96 d 17,84 d

25 ppm 4,51 69,40 a 96,26 a 91,66 a

50 ppm 4,52 65,14 b 89,47 b 84,43 b

100 ppm 4,51 61,45 c 84,11 b 80,75 b

CV (%) 0,85 2,92 3,33 3,24

Ft 0,05ns 1243,58** 987,48** 1025,04**

Nano silica

ĐC (-) 4,16 24,23 d 29,50 d 29,12 c

ĐC (+) 4,16 19,55 e 25,33 e 23,88 d

25 ppm 4,16 51,43 c 71,79 c 68,97 b

50 ppm 4,18 55,49 b 82,76 b 80,02 a

100 ppm 4,16 60,40 a 90,75 a 87,06 a

CV (%) 0,63 2,51 4,31 5,50

Ft 0,50ns 951,91** 417,70** 255,53**

ĐC (-) 4,75 21,23 d 33,50 d 32,40 d

ĐC (+) 4,75 17,87 e 27,07 e 26,41 e

25 ppm 4,75 64,08 b 98,75 b 97,42 b

50 ppm 4,76 69,43 a 112,01 a 109,97 a

100 ppm 4,75 58,75 c 92,41 c 89,21 c

CV (%) 0,58 4,13 2,51 2,27

Ft 0,16ns 502,29** 1402,21** 1735,21**

(120)

Ở hai nghiệm thức đối chứng, salicylic acid có tăng nhẹ Nhưng nghiệm thức có xử lý từ 25 đến 100 ppm lại tăng mạnh so với hai đối chứng Trong đó, xử lý chế phẩm khác hàm lượng salicylic acid tăng khác nhau, salicylic acid tăng mạnh giai đoạn ngày sau xử lý đến 14 ngày sau xử lý có giảm nhẹ giai đoạn 21 ngày sau xử lý Trong đó, phun Oligochitosan nồng độ 25 ppm (đạt lớn giai đoạn sau 14 ngày xử lý, 96,26 ng/g FW) hay phun nano silica nồng độ 100 ppm cho hàm lượng salicylic acid lớn giai đoạn 14 ngày sau xử lý (đạt 90,75 ng/g FW) phun oligochitosan-silica nano nồng độ 50 ppm cho hàm lượng salicylic acid lớn giai đoạn 14 ngày sau xử lý (đạt 112,01 ng/g FW, cao hai đối chứng từ 78,51 đến 84,94 ng/g FW)

salicylic acid phịng thí nghiệm

(121)

hóa phản ứng peroxide hóa lipid tạo gốc tự Các biểu “siêu mẫn cảm” (Hypersentitive response-HR) tạo phân tử đóng vai trị làm chất tín hiệu thứ cấp chủ salycilic acid (SA), ethylene jasmonic acid Các chất dẫn xuất chúng họat hóa hệ thống phịng vệ kháng bệnh chủ kích thích làm tăng tính kháng bệnh chủ thơng qua hệ thống cảm ứng kháng bệnh thu SAR (systemic acquired resistance) gây đáp ứng kháng lại yếu tố gây tổn thương mô mô lành bên cạnh [36] Sự kết hợp HR SAR liên quan đến biểu gen gây tính kháng bệnh chủ PR (pathogenesis related gene) Sản phẩm biểu gen đươc sử dụng làm phân tử đánh dấu nghiên cứu bệnh học trồng

3.3.2.5 Sự thay đổi jasmonic acid

Kết Bảng 3.21 Hình 3.14 cho thấy, oligochitosan có tác động đến hàm lượng jasmonic acid

jasmonic acid (ng/g FW) điều kiện phòng thí nghiệm

Nghiệm

Oligochitosan

ĐC (-) 2,90 4,08 c 4,76 c 4,61 d

ĐC (+) 2,90 3,67 d 4,36 d 4,13 e

25 ppm 2,91 5,59 a 7,09 a 7,03 a

50 ppm 2,90 5,10 ab 6,78 ab 6,70 b

100 ppm 2,90 4,77 b 6,43 b 6,38 c

CV (%) 2,22 4,52 2,44 1,74

Ft 0,03ns 45,96** 224,45** 509,67**

Nano silica

ĐC (-) 2,87 3,45 c 4,04 d 3,87 c

ĐC (+) 2,86 3,10 d 3,60 e 3,51 d

25 ppm 2,87 4,15 b 5,68 c 5,34 b

50 ppm 2,92 4,40 b 5,97 b 5,61 b

100 ppm 2,86 4,77 a 6,24 a 5,95 a

CV (%) 2,37 3,20 1,73 2,13

Ft 0,47ns 87,80** 557,12** 334,06**

ĐC (-) 2,77 3,65 d 4,33 d 4,20 d

ĐC (+) 2,78 3,24 e 3,74 e 3,66 e

25 ppm 2,80 5,20 b 7,05 b 6,93 b

50 ppm 2,77 5,66 a 7,43 a 7,40 a

100 ppm 2,81 4,75 c 6,62 c 6,57 c

CV (%) 3,81 2,91 2,94 2,87

Ft 0,08ns 426,61** 663,63** 750,73**

(122)

Ở giai đoạn bắt đầu xử lý, hàm lượng jasmonic acid khơng có sai khác mặt thống kê cơng thức thí nghiệm Nhưng giai đoạn từ sau ngày xử lý đến sau 21 ngày xử lý, jasmonic acid lại có khác biệt rõ rệt, hàm lượng jasmonic acid tăng mạnh từ ngày sau xử lý đến 14 ngày sau xử lý giảm nhẹ sau 21 ngày xử lý Như vậy, qua giai đoạn xử lý khác nhau, hàm lượng jasmonic acid tốt phun oligochitosan nồng độ từ 25 đến 50 ppm (đạt từ 6,78 đến 7,09 ng/g FW giai đoạn 14 ngày sau xử lý), cao hai đối chứng từ 2,02 đến 2,73 ng/g FW Tương tự oligochitosan, nano silica, hàm lượng Jasmonic acid tốt phun nano silica nồng độ 100 ppm giai đoạn 14 ngày sau xử lý (đạt 6,24 ng/g FW) Đối với Oligochitosan-silica nano, hàm lượng jasmonic acid có dao động từ bắt đầu xử lý đến giai đoạn sau 21 ngày sau xử lý giai đoạn 14 ngày sau xử lý tăng hàm lượng jasmonic acid mạnh so với giai đoạn xử lý khác Tuy nhiên, phun Oligochitosan-silica nano nồng độ 50 ppm cho kết tốt (đạt 7,43 ng/g FW)

Hệ thống miễn dịch thực vật sử dụng số tín hiệu thứ cấp để mã hóa thơng tin tạo phân tử liên quan tác nhân gây bệnh PAMP (Pathogen-associated molecar patterns) cung cấp thông tin tới protein thụ thể (PRRS) có nhiệm vụ giải mã/xử lý tín hiệu để khởi động gen phòng vệ Hệ thống jasmonic acid (JA) thành phần quan trọng hệ thống phức hợp tín hiệu hc mơn thực vật Việc sản xuất JA thực vật điều hòa chặt chẽ Ở thực vật khỏe mạnh, hàm lượng JA thấp, tín hiệu từ PAMP kích thích sinh tổng hợp tích lũy JA mơ bị bệnh Tín hiệu elicitor PAMP kích hoạt G-protein làm thay đổi kênh vận chuyển ion Ca2+ kích hoạt NADPH oxidase tạo H

2O2 Đồng biểu gen

(123)

silencing micro RNA kích hoạt sinh tổng hợp JA JA-Ile tổng hợp

de novo vận chuyển vào mơ hệ thống để kích hoạt ISR

jasmonic acid điều kiện phịng thí nghiệm

Như vậy, hàm lượng jasmonic acid chịu tác động oligochitosan-silica nano chế phẩm làm tăng hàm lượng jasmonic acid phun nồng độ 25 ppm Tuy nhiên, so với mức độ tăng hàm lượng salicylic acid hàm lượng jasmonic acid tăng không đáng kể

3.4 Khả kích kháng bệnh thán thư nấm Colletotrichum gloeosporioides và C truncatum gây oligochitosan-silica nano ớt trồng điều kiện nhà màng đồng ruộng

(124)

Các điều kiện ngoại cảnh (nhiệt độ, ẩm độ, tác nhân vật lý, côn trùng, mầm bệnh, ) địa điểm thí nghiệm (trong phịng thí nghiệm, nhà màng ngồi đồng ruộng) khác Do đó, để đánh giá xác tác động vật liệu oligochitosan, nano silica, oligochitosan-silica nano cần đảm bảo nghiên cứu phải sử dụng nồng độ cho ba điều kiện ngoại cảnh khác để có đánh giá xác Bên cạnh đó, đánh giá hiệu lực phải đánh giá từ diện hẹp (trong phịng thí ngiệm, nhà màng) đến diện rộng (ngồi đồng ruộng) để xác định xác hiệu lực chế phẩm, chứng minh hiệu kháng nấm vật liệu đơn lẻ vật liệu kết hợp tất điều kiện thí nghiệm làm sở cho việc ứng dụng thực tế

3.4.1 Khả kích kháng bệnh thán thư C gloeosporioides gây oligochitosan-silica nano ớt trồng điều kiện nhà màng

3.4.1.1 Chỉ tiêu tỷ lệ bệnh

Đối với trồng, khả phòng vệ biểu hình thái bên ngồi bị tác động điều kiện bất lợi Tỷ lệ ớt bị nhiễm bệnh phản ánh khả kháng bệnh bị nhiễm bệnh

(125)

Như vậy, có tác động đến tỷ lệ bệnh thán thư phun oligochitosan ớt Trong đó, phun 25, 50 100 ppm oligochitosan cho tỷ lệ bệnh thán thư thấp đối chứng Điều với chế tác động oligochitosan xâm nhập vào mơ kết dính quanh vị trí bệnh xâm nhập để tránh mầm bệnh lây lan kết dính với nấm bệnh gây q trình rị rỉ protein quan nội bào nấm gây bệnh thán thư bị tổn thương Đây điều quan trọng nhằm hạn chế bệnh thán thư giúp ớt sinh trưởng phát triển tốt

tỷ lệ nhiễm bệnh thán thư (%) ớt điều kiện nhà màng

Nghiệm thức 7 NSXL 14 NSXL 21 NSXL

Oligochitosan

ĐC (-) 1,24 a 0,96 a 0,89 a

ĐC (+) 1,17 ab 0,89 ab 0,84 ab

25 ppm 0,64 b 0,74 b 0,65 c

50 ppm 0,81 b 0,82 ab 0,74 bc

100 ppm 0,87 b 0,86 ab 0,77 abc

CV (%) 14,35 11,59 9,28

Ft 9,06** 2,13* 4,97*

Nano silica

ĐC (-) 1,47 a 1,01 a 0,83 a

ĐC (+) 1,02 ab 0,99 ab 0,78 ab

25 ppm 0,99 ab 0,81 abb 0,74 b

50 ppm 0,90 ab 0,8 bc 0,75 ab

100 ppm 0,79 b 0,78 c 0,75 ab

CV (%) 3,98 12,72 6,01

Ft 1,77* 3,00* 2,03*

ĐC (-) 1,75 a 1,71 a 0,88 a

ĐC (+) 1,49 ab 1,46 ab 0,79 ab

25 ppm 1,11 bc 1,04 bc 0,70 ab

50 ppm 0,76 c 0,86 c 0,64 b

100 ppm 1,04 bc 1,11 bc 0,73 ab

CV (%) 24,6 4,92 13,87

Ft 5,00* 21,74* 1,85*

(126)

* Đối với nano silica: Silica sử dụng để chống lại bệnh thực vật cách với vai trò sản phẩm ngăn ngừa tác nhân gây bệnh thực vật Trong thời gian dài, việc quan sát có hệ thống việc tích lũy silica vách tế bào địa điểm xâm nhập mầm bệnh đưa đến kết luận trồng tăng sức đề kháng mầm bệnh Tuy nhiên, chứng gần cho thấy silic đóng vai trị tích cực việc thúc đẩy thực vật kháng bệnh cách kích thích biểu phản ứng phòng vệ tự nhiên trồng Bảng 3.22 cho thấy, từ ngày sau xử lý đến 21 ngày sau xử lý, phun nano silica có tỷ lệ bệnh thấp so với hai thí nghiệm đối chứng (không phun nano silica) Điều cho thấy, nano silica có tác động đến khả kìm hãm bệnh thán thư Khi phun nano silica nồng độ cao khả kìm hãm bệnh tốt hơn, nghiệm thức cho kết tỷ lệ bệnh thán thư tốt phun nano silica nồng độ 100 ppm (chỉ có tỷ lệ bệnh 0,79% thời điểm ngày sau xử lý 0,75% 21 ngày sau xử lý, thấp so với hai đối chứng 0,22 - 0,68% thời điểm ngày sau xử lý 0,03 – 0,08% thời điểm 21 ngày sau xử lý) Kết tương tự với kết nghiên cứu Park cộng (2007), hiệu hạt nano silica có tác dụng chống lại loại nấm

Rhizoctonia solani, Pythium timum, Botrytis cinerea, Magnaporthe grisea Colletotrichum gloeosporioides [139]

(127)

21 ngày, nghiệm thức có khác biệt rõ rệt Trong đó, phun 50 ppm oligochitosan- silica nano cho kết tỷ lệ bệnh ớt thấp

3.4.1.2 Chỉ tiêu số bệnh

Mức độ bị nhiễm bệnh hay số bệnh biểu qua cấp bệnh quan sát trái ớt Chỉ số bệnh yếu tố quan trọng cần khảo sát ớt bị nhiễm bệnh

* Đối với oligochitosan: Kết thể qua Bảng 3.23, số bệnh ngày sau xử lý có khác biệt rõ rệt mặt thống kê sinh học, hai đối chứng cho số bệnh cao so với thí nghiệm có phun oligochitosan (đạt 0,15% 0,17%) Kết tương tự thời điểm 14 ngày 21 ngày sau xử lý (đạt 0,14% 0, 19%)

chỉ số bệnh thán thư (%) ớt điều kiện nhà màng

Oligochitosan

ĐC (-) 0,17 a 0,18 a 0,19 a

ĐC (+) 0,15 ab 0,15 a 0,14 b

25 ppm 0,09 c 0,09 b 0,07 c

50 ppm 0,10 c 0,09 b 0,09 c

100 ppm 0,11 bc 0,10 b 0,09 c

CV (%) 16,04 6,66 11,99

Ft 8,23** 65,35** 35,72**

Nano silica

ĐC (-) 0,27 a 0,25 a 0,18 a

ĐC (+) 0,24 a 0,17 ab 0,15 ab

25 ppm 0,14 b 0,11 b 0,11 bc

50 ppm 0,10 b 0,09 b 0,09 c

100 ppm 0,12 b 0,09 b 0,09 c

CV (%) 13,41 23,83 16,22

Ft 31,73** 12,28** 11,33**

ĐC (-) 0,28 a 0,47 a 0,21 a

ĐC (+) 0,21 b 0,28 ab 0,10 b

25 ppm 0,15 c 0,15 b 0,09 bc

50 ppm 0,10 c 0,10 b 0,07 c

100 ppm 0,12 c 0,12 b 0,06 c

CV (%) 13,65 33,00 13,34

Ft 30,96** 13,44** 56,95**

(128)

* Đối với nano silica: Qua Bảng 3.23 cho thấy, số bệnh thí nghiệm có khác biệt mặt thống kê từ thời điểm ngày sau xử lý đến 21 ngày sau xử lý Các thí nghiệm phun nano silica từ 50 ppm đến 100 ppm cho kết thấp hai đối chứng (không phun nano silica) Điều đồng nghĩa với việc phun nano silica có tác động đến số bệnh thán thư ớt Silica hịa tan kích hoạt chế phịng vệ chống lại Pythium cách tăng cường hoạt động enzyme chitinase, peroxidase polyphenoloxydase tích tụ hợp chất phenolic Điều hỗ trợ chứng gần cho thấy silica tăng cường sức đề kháng bệnh trồng cách kích thích biểu phản ứng phịng vệ tự nhiên thơng qua việc sản xuất phytoalexin flavonoid [140]

* Đối với oligochitosan-silica nano: Qua kết Bảng 3.23 cho thấy, sau xử lý oligochitosan-silica nano từ đến 21 ngày, nghiệm thức có sai khác có ý nghĩa mặt thống kê, hai đối chứng có số bệnh cao so với nghiệm thức lại Khi xử lý từ 50 đến 100 ppm oligochitosan-silica nano cho kết thấp 21 ngày sau xử lý (chỉ có số bệnh 0,06 0,07%) Kết phù hợp với kết Yin cộng (2010), oligochitosan ức chế bệnh khảm thuốc virus nồng độ 50 mg/L sau 24 lây nhiễm nhân tạo Ở tế bào biểu bì xử lý với oligochitosan, NO H2O2 gia tăng đáng kể Oligochitosan SNP

(sodium nitroprusside) gây phản ứng tự vệ kháng lại virus khảm, tăng cường hoạt động enzym phenylalanine ammonia-lyase (PAL) [141]

Chỉ số bệnh khác nồng độ phun oligochitosan-silica nano số lần phun Khi phun 50 100 ppm oligochitosan–silica nano cho kết tốt Điều với tác động chất oligochitosan nano silica đến trồng, giúp tăng cường khả chống chịu tạo chất tự bảo vệ bị nấm bệnh công Kết trùng với kết nghiên cứu tác giả Pratana nghiên cứu hiệu ức chế làm chậm phát triển bào tử nấm C

gloeosporioides gây bệnh thán thư ớt Nồng độ 50 ppm, cho kết ức chế

(129)

của nano silica đến khả hạn chế phát triển bệnh tốt so với xử lý riêng lẻ oligochitosan [27]

3.4.1.3 Các yếu tố cấu thành suất suất

* Đối với oligochitosan: Qua kết Bảng 3.24 cho thấy, số trái/cây có tác động phun oligochitosan Các thí nghiệm dao động từ 1.210,7 trái đến 1.380,0 trái/cây Trong đó, phun oligochitosan nồng độ 25 ppm cho số trái/cây tốt hai đối chứng (đạt 1.380,0 trái/cây, cao hai đối chứng 169,3 trái/cây 172,0 trái/cây) Như vậy, kết có tác động đến suất ớt sau Về chiều dài trái đường kính trái, thí nghiệm có dao động khơng có khác biệt mặt thống kê sinh học Về trọng lượng trung bình/100 trái, nghiệm thức thí nghiệm, đối chứng ĐC (-) cho kết trọng lượng/100 trái thấp nhất, đạt 44,2 g/100 trái phun oligochitosan nồng độ 25 ppm cho kết cao hẵn so với hai nghiệm thức đối chứng, đạt 66,1 g/100 trái (cao hai đối chứng 21,9 g/100 trái 14,9 g/100 trái) Về suất lý thuyết, nghiệm thức khác có suất lý thuyết khác có ý nghĩa xử lý thống kê độ tin cậy 99 % Nghiệm thức đối chứng ĐC (-) cho suất lý thuyết thấp (đạt 1.046,9 kg/1.000 m2) nghiệm thức cho kết tốt phun

oligochitosan nồng độ 25 ppm (đạt 1.755,4 kg/1.000 m2, cao hai đối chứng lần

lượt 708,5 kg/1.000 m2 và 464,1 kg/1.000 m2) Về suất thực thu, nghiệm

thức có phun oligochitosan cho suất thực thu cao so với hai đối chứng (không phun oligochitosan) Trong đó, nghiệm thức cho suất thực thu tốt phun oligochitosan nồng độ 25 ppm (đạt 1.572,2 kg/1.000 m2, cao hai đối chứng

lần lượt 668,7 kg/1.000 m2 và 565,2 kg/1.000 m2)

Như vậy, qua yếu tố cấu thành suất suất, cho thấy oligochitosan có tác động rõ đến sinh trưởng phát triển ớt Các nồng độ oligochitosan khác có tác động khác nhau, phun oligochitosan nồng độ 25 ppm cho kết tốt

(130)

trái/cây cao so với hai đối chứng (đạt 1.329,3 trái/cây 1.353,3 trái/cây, cao đối chứng từ 136,0 đến 160,0 trái/cây)

các yếu tố cấu thành suất suất ớt điều kiện nhà màng

Nghiệm thức Số trái/cây (trái) Chiều dài trái (mm) Đường kính trái (mm) Trọng lượng trung bình 100 trái (g) Năng suất lý thuyết/10 00m2 (kg)

Năng suất thực thu/1000

m2 (kg)

Oligochi tosan

ĐC (-) 1210,7 b 51,6 8,2 44,2 d 1046,9 d 903,53 d ĐC (+) 1208,0 b 51,6 8,2 51,2 c 1291.3 c 1007,0

c 25 ppm 1380,0 a 52,7 8,4 66,1 a 1755,4 a 1572,2

a 50 ppm 1281,3 a 52,7 8,3 63,6 ab 1618,6 ab 1297,4 b 100 ppm 1273,3

ab 51,7 8,3 59,8 b 1495,0 bc 1260,7 b

CV (%) 2,9 2,3 1,4 3,7 4,5 5,0

Ft 7,8** 0,56ns 1,36ns 52,4** 41,0** 56,3**

Nano silica

ĐC (-) 1193,3 c 51,2 8,2 51,3 c 1244,0 c 1048,0 d ĐC (+) 1213,3 b 51,2 8,1 54,7 b 1304,5 b 1073,6 c 25 ppm 1256,0 ab 51,6 8,2 54,3 b 1363,6 b 1121,6 b 50 ppm 1329,3 a 51,6 8,1 57,9 a 1539,9 a 1285,6 a 100 ppm 1353,3 a 52,1 8,2 59,1 a 1600,7 a 1355,3 a

CV (%) 3,1 2,5 1,8 1,7 4,0 2,9

Ft 9,3** 0,3ns 0,4ns 34,9** 22,3** 47,4**

Oligochi tosan – silica nano

ĐC (-) 1208,0 c 51,8 8,1 47,6 c 1153,4 d 948,3 d ĐC (+) 1210,7 b 50,9 8,3 57,8 b c 1394,7 c 1151,7 c 25 ppm 1281,3 ab 52,3 8,3 63,6 ab 1631,3 b 1361,6 b 50 ppm 1380,0 a 52,1 8,2 66,1 a 1822,24 a 1565,2 a 100 ppm 1273,3 ab 51,9 8,2 60,7 ab 1545,8 bc 1326,4 b

CV (%) 3,4 2,6 2,9 4,0 4,5 4,4

(131)

Về chiều dài trái đường kính trái có dao động dao động khơng có khác biệt mặt thống kê sinh học Về trọng lượng trung bình/100 trái, phun nano silica nồng độ 50 ppm 100 ppm cho kết tốt so với thí nghiệm cịn lại, đạt 57,9 g 59,1 g/100 trái (cao hai đối chứng từ 6,6 đến 7,8 g/100 trái)

Về suất lý thuyết, nghiệm thức thí nghiệm có khác biệt mặt thống kê Nghiệm thức phun nano silica nồng độ 50 ppm 100 ppm cho suất lý thuyết tốt so với nghiệm thức lại, đạt 1.539,9 kg/1.000 m2 1.600,7 kg/1.000 m2

(cao so với hai đối chứng từ 235,4 kg/1.000 m2 đến 356,7 kg/1.000 m2)

Về suất thực thu, nghiệm thức có dao động suất thực thu, từ 1.048,0 kg/1.000 m2 đến 1.355,3 kg/1.000 m2 Nghiệm thức có suất thực

thu thấp ĐC (-), đạt 1.048,0 kg/1.000 m2 nghiệm thức có suất cao phun nano silica nồng độ 50 ppm 100 ppm, đạt 1.285,6 kg/1.000 m2 1.355,3 kg/1.000 m2 (cao so với hai đối chứng từ 212,0 đến 307,3

kg/1.000 m2)

Như vậy, phun nano silica có tác động đến tình hình sinh trưởng phát triển ớt Trong đó, phun nano silica nồng độ 50 ppm 100 ppm cho kết tốt

(132)

Về tiêu chiều dài trái đường kính trái thí nghiệm có dao động dao động khơng có ý nghĩa thống kê sinh học Như vậy, phun oligochitosan-silica nano không tác động đến chiều dài trái đường kính trái ớt Về trọng lượng trung bình/100 trái, nghiệm thức khác có khác trọng lượng trái, phun oligochitosan-silica nano sai khác có ý nghĩa đối chứng (khơng phun oligochitosan-silica nano) Trong đó, phun oligochitosan-silica nano nồng độ 50 ppm cho trọng lượng/100 trái tốt (đạt 66,1 g/100 trái, cao so với đối chứng 18,5 g/100 trái 8,3 g/100 trái) Kết có ý nghĩa việc định suất sau

Về suất lý thuyết, nghiệm thức có dao động suất lý thuyết, từ 1.153,4 đến 1.822,2 kg/1.000 m2 Sự dao động có ý nghĩa mặt thống kê

Trong đó, nghiệm thức ĐC (-) có suất lý thuyết thấp (chỉ đạt 1.153,4 kg/1.000 m2), nghiệm thức cho kết cao phun oligochitosan–silica

nano nồng độ 50 ppm (đạt 1.822,2 kg/1.000 m2, cao đối chứng 668,8

kgvà 427,5 kg/1.000 m2) Như vậy, có tác động oligochitosan–silica nano đến suất ớt

Về suất thực thu, nghiệm thức có khác biệt rõ rệt mặt thống kê Trong cồng thức có phun oligochitosan–silica nano có suất thực thu cao hẳn hai đối chứng (không phun oligochitosan-silica nano) Đây điều thể rõ từ suất lý thuyết đến suất thực thu Trong đó, phun oligochitosan-silica nano nồng độ 50 ppm cho kết suất thực thu cao (đạt 1.565,2 kg/1.000 m2, cao hai đối chứng 616,9 kg 413,5 kg/1.000

m2)

Như vậy, qua tiêu cấu thành suất suất cho thấy, phun oligochitosan-silica nano từ 25 đến 100 ppm có ảnh hưởng đến suất ớt sau thu hoạch Trong đó, kết đạt tốt phun oligochitosan–silica nano nồng độ 50 ppm

(133)

tính kháng bệnh thán thư tác động đến suất ớt Các nồng độ oligochitosan khác có tác động khác nhau, phun oligochitosan nồng độ 25 ppm cho kết tốt Khi phun nano silica, qua tiêu theo dõi thí nghiệm, phun nano silica có tác động đến tình hình bệnh thán thư tình hình sinh trưởng phát triển ớt Trong đó, phun nano silica nồng độ 50 ppm 100 ppm cho kết tốt Khi phun oligochitosan–silica nano, qua tiêu bệnh tiêu cấu thành suất suất cho thấy, phun oligochitosan-silica nano từ 25 đến 100 ppm có tính kháng bệnh có ảnh hưởng đến suất ớt sau thu hoạch Trong đó, kết đạt tốt phun oligochitosan-silica nano nồng độ 50 ppm

3.4.2 Khả kích kháng bệnh thán thư Colletotrichum truncatum gây oligochitosan-silica nano ớt trồng điều kiện nhà màng

3.4.2.1 Chỉ tiêu bệnh

* Đối với oligochitosan: Qua Bảng 3.25 cho thấy, tỷ lệ bệnh thán thư có khác biệt thí nghiệm, từ lúc trái cịn xanh đến lúc chín có khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê sinh học Trong đó, có phun oligochitosan có tỷ lệ bệnh thấp so với hai đối chứng (không phun oligochitosan) tỷ lệ bệnh thấp phun oligochitosan nồng độ 25 ppm, đạt 1,41% thời điểm trái xanh 1,88% thời điểm trái chín (thấp so với hai đối chứng từ 1,02 đến 1,52% thời điểm) Như vậy, tác động oligochitosan làm giảm tỷ lệ bệnh ớt phun oligochitosan ớt nồng độ từ 25 ppm Về số bệnh, nghiệm thức có dao động sai khác mặt thống kê Ở thời điểm trái xanh trái chín, phun oligochitosan nồng độ 25 50 ppm cho số bệnh thấp hai đối chứng (không phun oligochitosan), đạt 0,16% 0,20% thời điểm trái xanh 0,22% 0,24% thời điểm trái chín (thấp từ 0,15% đến 0,39% thời điểm trái xanh 0,19% đến 0,38% thời điểm trái chín)

(134)

lệ bệnh thấp phun nano silica nồng độ 100 ppm, đạt 1,77% thời điểm trái xanh 1,87% thời điểm trái chín (thấp so với hai đối chứng từ 0,53 đến 0,82% giai đoạn) Như vậy, tỷ lệ bệnh giảm phun oligochitosan ớt nồng độ 100 ppm

tỷ lệ nhiễm bệnh số bệnh thán thư (%) ớt trồng điều kiện nhà màng

Tỷ lệ bệnh (%) Chỉ số bệnh (%)

Thời điểm trái xanh (21 ngày

sau xử lý)

Thời điểm trái chín (28 ngày sau xử

lý)

Thời điểm trái (21 ngày

sau xử lý)

lý)

Oligochitosan

ĐC (-) 2,39 a 3,40 a 0,45 a 0,60 a

ĐC (+) 1,99 ab 2,59 b 0,35 b 0,41 b

25 ppm 1,41 c 1,88 c 0,16 c 0,22 c

50 ppm 1,60 bc 1,98 bc 0,20 c 0,24 c

100 ppm 1,67 bc 2,17 bc 0,23 c 0,29 bc

CV (%) 9,26 10,97 11,46 16,00

Ft 15,86** 16,61** 42,54** 23,83**

Nano silica

ĐC (-) 2,47 a 2,75 a 0,44 a 0,47 a

ĐC (+) 2,30 ab 2,56 ab 0,37 ab 0,48 a

25 ppm 1,93 b 2,57 ab 0,23 bc 0,30 b

50 ppm 1,86 b 1,97 bc 0,22 c 0,24 b

100 ppm 1,77 b 1,87 c 0,20 c 0,21 b

CV (%) 10,10 14,32 18,14 10,54

Ft 6,43** 4,23* 11,98** 38,46**

ĐC (-) 2,10 a 3,10 a 0,40 a 0,56 a

ĐC (+) 1,79 ab 2,40 ab 0,32 a 0,40 ab

25 ppm 1,17 c 1,83 b 0,13 b 0,24 bc

50 ppm 1,03 c 1,68 b 0,14 b 0,20 c

100 ppm 1,43 bc 1,73 b 0,17 b 0,22 bc

CV (%) 12,94 14,03 13,90 23,84

Ft 15,46** 11,84** 41,48** 11,93**

* Ghi chú: Trong cột, trị số có ký tự kèm khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê; ** khác biệt có ý nghĩa thống kê NSXL: Ngày sau xử lý; số liệu xử lý chuyển đổi theo công thức √x

(135)

thời điểm trái xanh, 0,24% 0,21% thời điểm trái chín (thấp từ 0,23 đến 0,24% ở thời điểm trái xanh 0,23 đến 0,27% thời điểm trái chín)

* Đối với oligochitosan-silica nano: Qua Bảng 3.25 cho thấy, tỷ lệ bệnh thán thư trái có khác biệt thí nghiệm, từ lúc trái cịn xanh đến lúc chín có khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê sinh học Trong đó, thí nghiệm có phun oligochitosan- silica nano có tỷ lệ bệnh thấp so với hai đối chứng (không phun oligochitosan-silica nano) tỷ lệ bệnh thấp thí nghiệm phun oligochitosan- silica nano nồng độ 25, 50 100 ppm, đạt 1,17%, 1,03% 1,43% thời điểm trái xanh 1,83%, 1,68%, 1,73% thời điểm trái chín (thấp so với hai đối chứng từ 0,36 đến 1,07% thời điểm trái xanh từ 0,57 đến 1,24% thời điểm trái chín)

Về số bệnh, thí nghiệm có dao động sai khác mặt thống kê Ở thời điểm trái xanh trái chín, phun oligochitosan-silica nano nồng độ 25, 50 100 ppm cho số bệnh thấp hai đối chứng (không phun oligochitosan- silica nano), từ 0,20% đến 0,24% thời kì trái chín Pratana nghiên cứu hiệu ức chế làm chậm phát triển bào tử nấm nấm C gloeosporioides gây bệnh thán thư nồng độ phun 50 ppm oligochitosan ớt Nồng độ 50 ppm oligochitosan cho kết ức chế hoàn toàn nảy mầm bào tử nấm gây bệnh thán thư 20 sau nhiễm bệnh tác giả Nguyễn Thụy Đan Huyền điều kiện phịng thí nghiệm [27] Ngồi ra, nghiên cứu tác giả Trần Thị Thu Thủy đối tượng dưa leo cho kết tốt phun chitosan nồng độ 100 ppm cho số bệnh thấp thời điểm 10 ngày sau nhiễm bệnh [26]

(136)

các yếu tố cấu thành suất suất ớt điều kiện nhà màng

Nghiệm thức Số trái/cây (trái) Chiều dài trái (mm) Đường kính trái (mm) Trọng lượng trung bình 100 trái (g)

Năng suất lý thuyết/1000m2 (kg) Năng suất thực thu/1000m2 (kg) Oligoch itosan

ĐC (-) 1113,3 51,0 8,1 52,9 d 1178,3 c 952,2 c

ĐC (+) 1133,3 50,9 8,2 53,4 c 1209,6 b 966,4 c

25 ppm 1140,0 52,5 8,4 58,4 a 1331,6 a 1066,1 a

50 ppm 1153,3 54,1 8,6 57,0 ab 1316,2 a 1030,9 ab

100 ppm 1153,3 52,5 8,3 55,1 bc 1271,2 ab 1013,1 abc

CV (%) 2,5 2,1 2,9 1,8 3,2 3,0

Ft 1,0ns 17,4ns 4,9ns 17,5** 8,2** 7,3**

Nano silica

ĐC (-) 1081,3 c 50,4 8,1 53,9 d 1165,0 d 963,5 e

ĐC (+) 1095,0 bc 51,3 8,1 54,1 c 1184,9 cd 966,8 d

25 ppm 1131,3 ab 52,8 8,3 56,6 bc 1279,7 bc 1068,1 c

50 ppm 1145,7 a 53,9 8,3 58,4 ab 1337,8 ab 1120,8 b

100 ppm 1164,0 a 55,2 8,5 59,8 a 1392,3 a 1230,3 a

CV (%) 1,6 2,2 2,4 2,0 3,0 2,9

Ft 11,4** 27,3ns 27,3ns 16,1** 20,1** 38,6**

Oligoch itosan –

silica nano

ĐC (-) 1180,0 50,2 8,1 53,9 c 1271,5 c 1007,7 d

ĐC (+) 1180,0 52,2 8,1 55,6 bc 1313,6 bc 1038,2 c

25 ppm 1186,7 53,6 8,8 60,3 a 1422,8 a 1170,1 ab

50 ppm 1200,0 52,4 8,3 60,2 a 1428,8 a 1250,7 a

100 ppm 1180,0 51,8 8,2 58,6 ab 1407,3 ab 1101,5 bc

CV (%) 2,3 1,8 3,4 2,0 2,9 3,6

Ft 0,3ns 4,87ns 3,0ns 17,5** 9,6** 18,6**

Trong cột hàng, trị số có ký tự kèm khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê; ** khác biệt có ý nghĩa thống kê; ns: khơng sai khác thống kê NSXL: Ngày sau xử lý

(137)

khi đó, phun oligochitosan nồng độ 25 ppm 50 ppm cho suất lý thuyết tốt so với đối chứng, đạt 1.331,6 kg/1.000 m2 và 1.316,2 kg/1.000 m2 (cao đối

chứng từ 106,6 kg/1.000 m2 đến 153,3 kg/1000 m2) Về suất thực thu, thí

nghiệm có dao động suất thực thu, từ 952,2 kg/1.000 m2 đến 1.066,1 kg/1.000 m2 Thí nghiệm phun oligochitosan nồng độ 25 ppm cho suất thực thu

cao so với hai đối chứng, đạt 1.066,1 kg/1.000 m2 (cao so với hai đối chứng

từ 99,7 kg đến 113,9 kg/1.000 m2)

Như vậy, qua tiêu theo dõi thí nghiệm có phun oligochitosan có tác động đến sinh trưởng phát triển ớt Trong đó, phun oligochitosan nồng độ 25 ppm, 50 ppm 100 ppm cho kết tốt Nhưng phun oligochitosan nồng độ 25 ppm cho kết tốt

* Đối với nano silica: Qua Bảng 3.26 cho thấy, số trái/cây có dao động thí nghiệm, từ 1.081,3 đến 1.164,0 trái/cây Trong đó, nghiệm thức phun nano silica nồng độ 50 ppm 100 ppm có số trái/cây cao hai đối chứng, đạt 1.145,7 trái/cây 1.164,0 trái/cây (cao so với hai đối chứng từ 64,4 đến 82,7 trái/cây)

Về chiều dài trái đường kính trái, thí nghiệm khơng sai khác rõ rệt vê mặt thống kê Về trọng lượng trung bình/100 trái, nghiệm thức phun nano silica nồng độ 100 ppm cho kết tốt nhất, đạt 59,8 g/100 trái (cao hai đối chứng từ 5,7 đến 5,9 g/100 trái)

Về suất lý thuyết, thí nghiệm có khác biệt mặt thống kê Nghiệm thức phun nano silica nồng độ 100 ppm cho suất lý thuyết tốt so với hai đối chứng, đạt 1.392,3 kg/1.000 m2 (cao từ 207,4 kg/1.000 m2 đến 227,3 kg/1.000

m2) Về suất thực thu, nghiệm thức có dao động suất thực thu,

từ 963,5 kg/1.000 m2 đến 1.230,3 kg/1.000 m2 Nghiệm thức cho suất cao

(138)

Như vậy, qua tiêu theo dõi thí nghiệm, phun nano silica có tác động đến tình hình sinh trưởng phát triển ớt Trong đó, phun nano silica nồng độ 100 ppm cho kết tốt

* Đối với oligochitosan-silica nano: Qua Bảng 3.26 cho thấy, số trái/cây, chiều dài trái đường kính trái, thí nghiệm dao động, nhiên dao động khơng có sai khác mặt thống kê

Về trọng lượng trung bình/100 trái, nghiệm thức phun oligochitosan-silica nano nồng độ 25 50 ppm cho kết tốt so với thí nghiệm lại, đạt 60,2 60,3 g/100 trái (cao hai đối chứng từ 5,3 đến 6,4 g/100 trái) Về suất lý thuyết, thí nghiệm có khác biệt mặt thống kê Nghiệm thức phun oligochitosan- silica nano nồng độ 25 ppm 50 ppm cho suất lý thuyết tốt so với hai đối chứng, đạt 1.422,8 kg/1.000 m2 1.428,8 kg/1.000 m2 (cao đối chứng từ 115,2 kg/1.000 m2 đến 151,3 kg/1.000 m2)

Về suất thực thu, nghiệm thức có dao động suất thực thu, từ 1.007,7 kg/1.000 m2 đến 1.250,7 kg/1.000 m2 Nghiệm thức có suất thực thu thấp ĐC (-), đạt 1.007,7 kg/1.000 m2 Nghiệm thức có suất cao

nhất phun oligochitosan- silica nano nồng độ 50 ppm, đạt 1.250,7 kg/1.000 m2

(cao so với hai đối chứng từ 212,5 đến 243,0 kg/1.000 m2)

Như vậy, qua tiêu theo dõi thí nghiệm, phun oligochitosan- silica nano có tác động đến tình hình sinh trưởng phát triển ớt Trong đó, phun oligochitosan- silica nano nồng độ 50 ppm cho kết tốt

(139)

đó, phun oligochitosan-silica nano nồng độ 50 ppm cho kết tốt Hình ảnh thí nghiệm nhà mảng minh họa phụ lục (Hình 4.1-4.10)

3.4.3 Đánh giá khả kích kháng bệnh thán thư C gloeosporioides gây của oligochitosan-silica nano ớt trồng đồng ruộng

3.4.3.1 Về tiêu tỷ lệ bệnh

* Đối với oligochitosan: Qua Bảng 3.27 cho thấy, nghiệm thức có phun oligochitosan có tác động đến tỷ lệ bệnh Có kìm hãm ảnh hưởng bệnh đến ớt nên tỷ lệ bệnh so với nghiệm thức không phun oligochitosan Điều thể rõ từ ngày sau xử lý đến 21 ngày sau xử lý phun oligochitosan, hai thí nghiệm đối chứng cho tỷ lệ bệnh cao (6,9 – 8,5% thời điểm ngày sau xử lý 16,3 – 19,9% 21 ngày sau xử lý) Trong đó, nghiệm thức có xử lý phun oligochitosan có tỷ lệ bệnh thấp so với đối chứng phun 25 ppm oligochitosan cho tỷ lệ bệnh thấp (chỉ đạt 3,8 % thời điểm ngày sau xử lý 12,3% thời điểm 21 ngày sau xử lý (thấp so với hai đối chứng giai đoạn sau 21 ngày xử lý từ 4,0 - 7,6%)

* Đối với nano silica: Qua Bảng 3.27 cho thấy, từ ngày sau xử lý đến 21 ngày sau xử lý, nghiệm thức có phun nano silica có tỷ lệ bệnh thấp so với hai đối chứng (không phun nano silica) Điều cho thấy, nano silica có tác động đến khả kìm hãm bệnh thán thư Nghiệm thức có phun nano silica cao khả kìm hãm bệnh tốt nghiệm thức cho kết tỷ lệ bệnh thán thư thấp phun silica nano nồng độ 100 ppm (chỉ có tỷ lệ bệnh 3,6% thời điểm ngày sau xử lý 9,6% thời điểm 21 ngày sau xử lý)

(140)

thời điểm sau 21 ngày xử lý Sự sai khác có ý nghĩa thống kê mức độ tin cậy 99%

tỷ lệ nhiễm bệnh thán thư (%) ớt trồng đồng ruộng

Oligochitosan

ĐC (-) 8,5 a 17,2 a 19,9 a

ĐC (+) 6,9 ab 15,2 ab 16,3 ab

25 ppm 3,8 c 11,5 b 12,3 b

50 ppm 4,8 bc 12,8 b 13,4 b

100 ppm 5,2 bc 13,1 b 13,0 b

CV (%) 13,0 9,6 10,0

Ft 17,7** 8,6** 13,4**

Nano silica

ĐC (-) 7,4 a 12,8 a 16,0 a

ĐC (+) 6,9 a 11,6 a 13,7 ab

25 ppm 5,6 ab 9,4 ab 11,6 bc

50 ppm 4,7 bc 7,2 bc 9,6 c

100 ppm 3,6 c 5,8 c 8,2 c

CV (%) 11,5 12,8 10,9

Ft 17,5** 18,0** 17,5**

ĐC (-) 5,9 a 14,5 a 18,4 a

ĐC (+) 5,8 a 13,2 ab 14,9 b

25 ppm 4,3 ab 10,6 abc 12,8 bc

50 ppm 1,2 c 7,4 c 11,4 c

100 ppm 3,4 b 9,8 bc 12,3 bc

CV (%) 16,9 12,7 7,3

Ft 23,7** 12,0** 22,8**

* Ghi hú: Trong cột, trị số có ký tự kèm khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê; ** khác biệt có ý nghĩa thống kê NSXL: Ngày sau xử lý

Như vậy, sau xử lý oligochitosan-silica nano từ đến 21 ngày, nghiệm thức có khác biệt rõ rệt Trong đó, nghiệm thức phun 50 ppm oligochitosan-silica nano cho tỷ lệ bệnh thấp

3.4.3.2 Về tiêu số bệnh

(141)

chứng cho số bệnh cao so với thí nghiệm có phun oligochitosan, nghiệm thức có số bệnh thấp phun oligochitosan nồng độ 25 50 ppm (đạt 1,23% 1,30%, thấp hai đối chứng từ 0,28 dến 0,47%) Nhưng thời điểm 21 ngày sau xử lý, nghiệm thức phun oligochitosan nồng độ 25 ppm cho số bệnh thấp nhất, đạt 2,10 % (thấp hai đối chứng từ 0,37 đến 0,63%)

chỉ số bệnh thán thư (%) ớt trồng đồng ruộng

Oligochitosan

ĐC (-) 1,70 a 2,43 a 2,73 a

ĐC (+) 1,58 b 2,27 ab 2,47 ab

25 ppm 1,23 d 1,97 c 2,10 c

50 ppm 1,30 d 2,13 bc 2,20 bc

100 ppm 1,47 c 2,03 bc 2,17 bc

CV (%) 2,34 4,12 4,66

Ft 99,14** 13,13** 17,61**

Nano silica

ĐC (-) 1,53 a 2,20 a 2,50 a

ĐC (+) 1,53 a 2,13 a 2,37 a

25 ppm 1,50 ab 1,87 b 2,10 b

50 ppm 1,30 bc 1,57 c 1,93 b

100 ppm 1,17 c 1,43 c 1,73 c

CV (%) 7,73 3,58 4,54

Ft 6,96* 79,00** 31,32**

ĐC (-) 1,43 a 2,33 a 2,67 a

ĐC (+) 1,47 a 2,23 ab 2,40 ab

25 ppm 1,27 ab 2,00 abc 2,20 bc

50 ppm 0,93 c 1,67 c 2,00 c

100 ppm 1,17 bc 1,77 bc 2,13 bc

CV (%) 7,14 8,71 4,31

Ft 17,63** 8,19** 20,97**

(142)

* Đối với nano silica: Qua bảng 3.28 cho thấy, số bệnh nghiệm thức phun nano silica 100 ppm cho kết cao hai đối chứng (không phun nano silica), đạt 1,17% thời điểm ngày sau xử lý 1,73% thời điểm 21 ngày sau xử lý Điều đồng nghĩa với việc phun nano silica có tác động đến số bệnh thán thư Silica hịa tan kích hoạt chế phòng vệ chống lại Pythium cách tăng cường hoạt động enzyme chitinase, peroxidase polyphenoloxydase tích tụ hợp chất phenolic

* Đối với oligochitosan-silica nano: Qua kết bảng 3.28 cho thấy, thời điểm từ đến 21 ngày sau xử lý, nghiệm thức có sai khác có ý nghĩa mặt thống kê, hai đối chứng có số bệnh cao so với nghiệm thức lại (cao từ 0,20 đến 0,67% so với nghiệm thức có phun oligochitosan-silica nano) Nghiệm thức phun oligochitosan-silica nano nồng độ 50 ppm cho số bệnh thấp (đạt 0,93% ngày sau xử lý 2,00% 21 ngày sau xử lý

* Đối với oligochitosan: Qua kết Bảng 3.29 cho thấy, số trái/cây có tác động phun oligochitosan Trong đó, nghiệm thức phun oligochitosan nồng độ 25 ppm cho số trái/cây tốt hai đối chứng (đạt 967,3 trái/cây, cao hai đối chứng 120,0 trái/cây 97,0 trái/cây) Như vậy, kết có tác động đến suất ớt sau Về chiều dài trái, đường kính trái, nghiệm thức có dao động khơng có khác biệt mặt thống kê Về trọng lượng trung bình/100 trái, nghiệm thức, phun oligochitosan nồng độ 25 ppm cho kết cao so với thí nghiệm lại, đạt 55,9 g/100 trái (cao hai đối chứng 3,8 g/100 trái 3,4 g/100 trái)

Về suất lý thuyết, nghiệm thức khác có suất lý thuyết khác có ý nghĩa xử lý thống kê độ tin cậy 99% Nghiệm thức cho kết tốt phun oligochitosan nồng độ 25 ppm (đạt 1.081,8 kg/1.000 m2, cao hai đối chứng 199,3 kg/1.000 m2 168,1 kg/1.000 m2) Về suất thực

thu, nghiệm thức cho suất thực thu tốt phun oligochitosan nồng độ 25 ppm (đạt 883,1 kg/1.000 m2, cao hai đối chứng 190,5 kg/1.000 m2

(143)

Như vậy, qua tiêu yếu tố cấu thành suất suất, cho thấy oligochitosan có tác động rõ đến sinh trưởng phát triển ớt Các nồng độ oligochitosan khác có tác động khác nhau, phun oligochitosan nồng độ 25 ppm cho kết tốt

các yếu tố cấu thành suất suất ớt trồng đồng ruộng

Nghiệm thức Số trái/cây (trái) Chiều dài trái (mm) Đường kính trái (mm) Trọng lượng trung bình 100 trái (g)

Năng suất lý thuyết/1000m2 (kg) Năng suất thực thu/1000m2 (kg) Oligo chitos an

ĐC (-) 847,0 c 53,4 8,3 52,1 b 882,5 b 692,6 c

ĐC (+) 870,3 bc 55,2 8,4 52,5 b 913,7 b 729,8 c

25 ppm 967,3 a 57,4 8,6 55,9 a 1081,8 a 883,1 a

50 ppm 914,3 ab 56,0 8,5 52,9 b 967,9 b 780,1 b

100 ppm 913,7 ab 55,3 8,5 52,2 b 953,3 b 779,3 b

CV (%) 3,5 7,1 3,6 2,1 3,5 2,2

Ft 6,6* 0,4ns 0,4ns 22,1** 15,5** 51,7**

Nano silica

ĐC (-) 875,0 d 54,9 8,3 50,3 c 880,6 c 710,4 d

ĐC (+) 913,7 c 54,7 8,2 50,7 bc 926,0 b 723,8 c

25 ppm 954,0 b 55,3 8,3 53,0 ab 1012,0 a 805,9 b

50 ppm 990,0 a 55,7 8,3 52,2 abc 1033,4 a 833,6 b

100 ppm 1011,7 a 56,5 8,4 53,6 a 1085,2 a 969,9 a

CV (%) 2,9 4,7 3,6 2,4 2,6 2,6

Ft 143,9** 0,24ns 0,21ns 4,2* 30,4** 73,3**

Oligo chitos an – silica nano

ĐC (-) 845,3 b 52,9 8,3 50,0 c 845,5 c 670,9 d

ĐC (+) 912,3 ab 55,0 8,2 50,3 bc 917,2 bc 752,7 c

25 ppm 953,0 ab 56,0 8,4 52,7 ab 1004,5 ab 813,1 b

50 ppm 1031,0 a 57,3 8,6 52,4 abc 1081,1 a 874,7 a

100 ppm 993,7 a 57,0 8,4 53,9 a 1072,1 a 809,3 b

CV (%) 4,3 6,7 1,7 1,8 4,7 2,5

Ft 9,3** 0,7ns 3,2ns 9,8** 14,4** 44,7**

(144)

* Đối với nano silica: Qua Bảng 3.29 cho thấy, số trái/cây có dao động nghiệm thức Trong đó, nghiệm thức phun nano silica 100 ppm cho số trái/cây cao so với hai đối chứng (đạt 1.011,7 trái/cây, cao đối chứng 136,7 98,0 trái/cây)

Về chiều dài trái, đường kính trái, nghiệm thức có dao động khơng có khác biệt mặt thống kê Về trọng lượng trung bình/100 trái, nghiệm thức có phun nano silica cho kết tốt so với thí nghiệm khơng phun nano silica, phun nano silica 100 ppm cho kết tốt nhất, đạt 53,6 g/100 trái (cao hai đối chứng từ 2,9 đến 3,3 g/100 trái) Về suất lý thuyết, nghiệm thức có khác biệt mặt thống kê Nghiệm thức phun nano silica nồng độ 25, 50 100 ppm cho suất lý thuyết tốt so với hai đối chứng, đạt 1.012,0 kg/1.000 m2; 1.033,4 kg/1.000 m2 1.085,2 kg/1.000 m2 (cao so với hai đối chứng từ 131,4 kg/1.000 m2 đến 159,2 kg/1.000 m2)

Về suất thực thu, nghiệm thức có dao động suất thực thu, từ 710,4 kg/1.000 m2 đến 969,9 kg/1.000 m2 Thí nghiệm có suất thực thu thấp hai đối chứng, đạt 710,4 723,8 kg/1.000 m2 và nghiệm thức có

suất cao phun nano silica nồng độ 100 ppm, đạt 969,9 kg/1.000 m2 (cao

hơn so với hai đối chứng từ 246,1 đến 259,5 kg/1.000 m2)

Như vậy, qua tiêu theo dõi nghiệm thức, nghiệm thức có phun nano silica có tác động đến tình hình sinh trưởng phát triển ớt Trong đó, phun nano silica nồng độ 100 ppm cho kết tốt

(145)

nghĩa yếu tố ảnh hưởng lớn đến suất ớt sau Về chiều dài trái, đường kính trái, thí nghiệm có dao động khơng có khác biệt mặt thống kê Về trọng lượng trung bình/100 trái, thí nghiệm khác có khác trọng lượng trái, phun oligochitosan-silica nano trọng lượng trái sai khác có ý nghĩa đối chứng (khơng phun oligochitosan-silica nano) Trong đó, phun oligochitosan-silica nano nồng độ 100 ppm cho trọng lượng/100 trái tốt (đạt 53,9 g/100 trái, cao so với đối chứng 3,9 g/100 trái 3,6 g/100 trái) Kết có ý nghĩa việc định suất sau

Về suất lý thuyết, nghiệm thức có dao động suất lý thuyết, từ 845,5 đến 1081,1 kg/1.000 m2 Sự dao động có ý nghĩa mặt thống kê Trong

đó, hai đối chứng khơng phun oligochitosan-silica nano có suất lý thuyết thấp (chỉ đạt 845,5 kg/1.000 m2 ĐC (-) 917,2 kg/1.000 m2 ĐC (+), cịn nghiệm thức có phun oligochitosan-silica nano cho kết cao đối chứng, cao phun oligochitosan-silica nano nồng độ 50 100 ppm (đạt 1.081,1 kg/1.000 m2 1.072,1 kg/1.000 m2 cao hai đối chứng từ 154,9 kg/1.000 m2 đến 235,6 kg/1.000 m2) Như vậy, có tác động oligochitosan-silica nano đến

suất ớt Về suất thực thu, nghiệm thức có khác biệt rõ rệt mặt thống kê Trong thí nghiệm có phun oligochitosan -silica nano có suất thực thu cao hai đối chứng (không phun oligochitosan-silica nano) Đây điều thể rõ từ suất lý thuyết đến suất thực thu Trong đó, phun oligochitosan- silica nano nồng độ 50 ppm cho kết suất thực thu cao (đạt 874,7 kg/1.000 m2, cao hai đối chứng từ 122,0 đến 203,8 kg/1.000 m2)

Như vậy, qua tiêu cấu thành suất suất cho thấy, phun oligochitosan-silica nano từ 25 đến 100 ppm có ảnh hưởng đến suất ớt sau thu hoạch Trong đó, kết đạt tốt phun oligochitosan-silica nano nồng độ 50 ppm

(146)

quả tốt Đối với nano silica, có tác động đến tình hình bệnh thán thư tình hình sinh trưởng phát triển ớt Trong đó, phun nano silica nồng độ 100 ppm cho kết tốt Đối với oligochitosan-silica nano, phun oligochitosan– silica nano từ 25 đến 100 ppm có tác động đến tính kháng bệnh có ảnh hưởng đến suất ớt sau thu hoạch Trong đó, kết đạt tốt phun oligochitosan-silica nano nồng độ 50 ppm

3.4.4 Đánh giá khả kích kháng bệnh thán thư C truncatum gây oligochitosan-silica nano ớt trồng đồng ruộng

3.4.4.1 Chỉ tiêu bệnh

* Đối với oligochitosan: Qua Bảng 3.30 cho thấy, tỷ lệ bệnh thán thư có khác biệt thí nghiệm, từ lúc trái cịn xanh đến lúc chín có khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê sinh học Trong đó, thí nghiệm phun oligochitosan nồng độ 25, 50 100 ppm có tỷ lệ bệnh thấp so với hai đối chứng (không phun oligochitosan) tỷ lệ bệnh có 3,13 – 4,17% thời điểm trái xanh 23,93 – 26,80% thời điểm trái chín (thấp so với hai đối chứng từ 1,94 đến 9,34% giai đoạn) Về số bệnh, thí nghiệm có dao động sai khác mặt thống kê Ở thời điểm trái xanh trái chín, phun oligochitosan nồng độ 25, 50 100 ppm cho số bệnh thấp hai đối chứng (không phun oligochitosan), đạt 1,27 - 1,37% thời điểm trái xanh 2,77 – 2,87% thời điểm trái chín (thấp từ 0,10 đến 0,36% thời điểm trái xanh 0,33 – 0,63% thời điểm trái chín)

(147)

2,26% thời điểm trái chín (thấp từ 0,10 đến 0,43% thời điểm trái xanh 0,50 đến 1,07% thời điểm trái chín)

* Đối với oligochitosan-silica nano: Qua Bảng 3.30 cho thấy, tỷ lệ bệnh thán thư có khác biệt thí nghiệm, từ lúc trái cịn xanh đến lúc chín có khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê sinh học Trong đó, thí nghiệm có phun oligochitosan-silica nano nồng độ 50 100 ppm cho tỷ lệ bệnh thấp nhất, đạt 2,30 2,90% thời điểm trái xanh 21,73 22,53%, thời điểm trái chín (thấp so với hai đối chứng từ 2,77 đến 12,36%) Như vậy, tỷ lệ bệnh giảm phun oligochitosan-silica nano ớt nồng độ từ 50 ppm Đây điều quan trọng nhằm hạn chế bệnh thán thư giúp ớt sinh trưởng phát triển tốt

(148)

tỷ lệ nhiễm bệnh số bệnh thán thư (%) ớt trồng đồng ruộng

Tỷ lệ bệnh (%) Chỉ số bệnh(2) (%)

Thời điểm trái xanh (21

ngày sau xử lý)

lý)

Thời điểm trái (21 ngày

sau xử lý)

lý)

Oligochitosan

ĐC (-) 6,30 a 33,27 a 1,63 a 3,40 a

ĐC (+) 5,07 ab 27,87 b 1,47 b 3,20 a

25 ppm 3,13 b 23,93 b 1,27 c 2,77 b

50 ppm 3,73 b 24,73 b 1,30 bc 2,80 b

100 ppm 4,17 b 26,80 b 1,37 bc 2,87 b

CV (%) 16,29 10,30 4,30 3,57

Ft 8,63** 5,12* 17,91** 20,35**

Nano silica

ĐC (-) 4,20 a 30,17 a 1,30 a 3,33 a

ĐC (+) 3,83 ab 27,00 ab 1,23 a 2,87 b

25 ppm 2,97 bc 24,83 abc 1,17 a 2,60 bc

50 ppm 2,83 bc 21,60 c 1,13 ab 2,37 c

100 ppm 2,20 c 19,87 c 0,97 c 2,26 c

CV (%) 11,08 8,69 5,34 4,66

Ft 15,37** 11,11** 12,35** 35,28**

ĐC (-) 6,17 a 34,09 a 1,63 a 3,47 a

ĐC (+) 5,73 a 27,93a 1,57 a 3,10 b

25 ppm 4,50 b 25,70 bc 1,47 a 2,77 b

50 ppm 2,30c 21,73 c 1,10 b 2,63 c

100 ppm 2,90 c 22,53 c 1,13 b 2,77 bc

CV (%) 5,72 5,47 5,77 4,11

Ft 141,46** 35,61** 29,11** 23,36**

* Ghi chú: Trong cột, trị số có ký tự kèm khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê; ** khác biệt có ý nghĩa thống kê NSXL: Ngày sau xử lý; số liệu xử lý (2) chuyển đổi theo công thức √x 3.4.4.2 Các yếu tố cấu thành suất suất

(149)

kết tốt so với hai đối chứng (đạt 969,7 trái/cây), cao so với hai đối chứng không phun oligochitosan 61,0 trái/cây 43,0 trái/cây

Về chiều dài trái đường kính trái, nghiệm thức có dao động dao động khơng có khác biệt thống kê sinh học Về trọng lượng trung bình/100 trái, nghiệm thức phun oligochitosan nồng độ 25 ppm cho kết lớn so với nghiệm thức đối chứng, đạt 54,8 g/100 trái (cao hai đối chứng từ 2,9 đến 3,9 g/100 trái)

Về suất lý thuyết, nghiệm thức có khác biệt mặt thống kê Nghiệm thức cho suất lý thuyết cao nghiệm thức phun oligochitosan nồng độ 25 ppm (1.062,4 kg/1.000 m2, cao hai đối chứng từ 100,5 kg/1.000 m2

đến 146,8 kg/1.000 m2) Về suất thực thu, nghiệm thức có dao động

về suất thực thu, từ 724,4 kg/1.000 m2 đến 888,4 kg/1.000 m2 Thí nghiệm phun oligochitosan nồng độ 25 ppm cho suất thực thu cao so với hai đối chứng, đạt 888,4 kg/1.000 m2 (cao so với hai đối chứng từ 76,6 đến 164,0 kg/1.000 m2)

Như vậy, qua tiêu theo dõi nghiệm thức, phun oligochitosan có tác động đến tình hình sinh trưởng phát triển ớt Trong đó, phun oligochitosan nồng độ 25 ppm cho kết tốt

* Đối với nano silica: Qua Bảng 3.31 cho thấy, số trái/cây có dao động thí nghiệm, từ 882,3 đến 1.008,0 trái/cây Trong đó, thí nghiệm phun nano silica nồng độ 50 100 ppm có số trái/cây cao hai đối chứng, đạt 998,7 1.008,0 trái/cây (cao so với hai đối chứng từ 106,4 đến 125,7 trái/cây)

Về chiều dài trái đường kính trái, thí nghiệm có dao động dao động khơng có khác biệt thống kê sinh học.Về trọng lượng trung bình/100 trái, thí nghiệm phun nano silica nồng độ 100 ppm cho kết tốt nhất, đạt 53,9 g/100 trái (cao hai đối chứng từ 2,1 đến 3,1 g/100 trái)

Về suất lý thuyết, thí nghiệm có khác biệt mặt thống kê Thí nghiệm phun nano silica nồng độ 50 100 ppm cho suất lý thuyết tốt so với hai đối chứng, đạt 1.055,9 kg/1.000 m2 và 1.086,0 kg/1.000 m2 (cao từ 131,4

đến 189,0 kg/1.000 m2)

(150)

nano silica nồng độ 100 ppm, đạt 908,9 kg/1.000 m2 (cao so với hai đối chứng từ 174,4 đến 187,0 kg/1.000 m2)

Như vậy, qua tiêu theo dõi thí nghiệm, thí nghiệm có phun nano silica có tác động đến tình hình sinh trưởng phát triển ớt Trong đó, phun nano silica nồng độ 100 ppm cho kết tốt

* Đối với oligochitosan-silica nano: Qua Bảng 3.31 cho thấy, số trái/cây có dao động thí nghiệm, dao động từ 937,7 đến 995,3 trái/cây Trong đó, thí nghiệm phun oligochitosan-silica nano nồng độ 50 ppm cho số trái cao (đạt 995,3 trái/cây), cao hai đối chứng 57,6 trái/cây 33,6 trái/cây Về chiều dài trái đường kính trái, thí nghiệm có dao động dao động khơng có khác biệt thống kê sinh học Về trọng lượng trung bình/100 trái, thí nghiệm có phun oligochitosan- silica nano cho kết tốt so với hai đối chứng (không phun oligochitosan- silica nano), thí nghiệm phun oligochitosan-silica nano nồng độ 50 ppm cho kết tốt nhất, đạt 54,8 g/100 trái (cao hai đối chứng từ 2,8 đến 3,0 g/100 trái)

Về suất lý thuyết, thí nghiệm có khác biệt mặt thống kê Thí nghiệm phun oligochitosan-silica nano nồng độ 50 ppm cho suất lý thuyết tốt so với đối chứng, đạt 1.091,1 kg/1.000 m2 (cao từ 90,3 đến 119,6

kg/1.000 m2)

Về suất thực thu, thí nghiệm có dao động suất thực thu, từ 778,1 đến 904,4 kg/1.000 m2 Trong đó, thí nghiệm có suất cao

phun oligochitosan-silica nano nồng độ 50 ppm, đạt 904,4 kg/1.000 m2, (cao so

với hai đối chứng từ 105,4 đến 126,3 kg/1.000 m2)

(151)

các yếu tố cấu thành suất suất ớt trồng đồng ruộng

Nghiệm thức Số trái/cây (trái) Chiều dài trái (mm) Đường kính trái (mm) Trọng lượng trung bình 100 trái (g)

Năng suất lý thuyết/1000m2 (kg) Năng suất thực thu/1000m2 (kg) Oligo chitos an

ĐC (-) 898,7 c 52,2 8,3 50,9 b 915,6 b 724,4 b

ĐC (+) 926,7 bc 53,2 8,3 51,9 b 961,9 b 755,8 b

25 ppm 969,7 a 53,5 8,5 54,8 a 1062,4 a 888,4 a

50 ppm 942,7 ab 54,5 8,3 51,9 b 978,5 b 754,6 b

100 ppm 936,3 b 54,0 8,3 51,8 b 969,4 b 763,3 b

CV (%) 2,1 4,3 2,8 1,7 2,6 2,5

Ft 18,0** 0,4ns 0,3ns 8,4** 13,3** 32,8**

Nano silica

ĐC (-) 882,3 b 52,8 8,2 50,8 c 897,0 c 721,9 c

ĐC (+) 892,3 b 52,7 8,2 51,8 bc 924,5 bc 734,5 c

25 ppm 936,7 b 53,3 8,4 52,3 b 979,9 b 778,5 bc

50 ppm 998,7 a 53,3 8,3 52,9 ab 1055,9 a 847,3 ab

100 ppm 1008,0 a 53,4 8,4 53,9 a 1086,0 a 908,9 a

CV (%) 2,3 3,7 3,5 2,8 2,5 3,6

Ft 21,6** 0,1ns 0,4ns 24,3** 33,4** 22,8**

Oligo chitos an – silica nano

ĐC (-) 937,7 c 54,0 8,2 51,8 c 971,5 c 778,1 c

ĐC (+) 961,7 bc 55,4 8,3 52,0 bc 1000,8 bc 799,0 c

25 ppm 972,3 ab 54,9 8,3 53,1 abc 1032,8 abc 838,6 bc

50 ppm 995,3 a 55,5 8,3 54,8 a 1091,1 a 904,4 a

100 ppm 985,0 ab 55,3 8,2 53,8 ab 1059,2 ab 864,0 ab

CV (%) 1,6 5,8 2,8 1,7 3,1 2,7

Ft 6,0* 0,1ns 0,1ns 5,7* 6,7* 15,5**

Trong cột, trị số có ký tự kèm khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê; ** khác biệt có ý nghĩa thống kê; * khác biệt có ý nghĩa thống kê; ns: không sai khác mặt thống kê NSXL: Ngày sau xử lý

(152)

sạch Hiệu phòng bệnh loại chế phẩm sản xuất luận án tương đương so với phương pháp sử dụng thuốc hóa học truyền thống Do vậy, khả ứng dụng sản phẩm chế tạo luận án vào thực tiễn lớn Tuy nhiên cần phải tiếp tục thử nghiệm diện rộng

Tóm lại, qua tiêu theo dõi thí nghiệm, thí nghiệm có phun oligochitosan có tác động đến khả kháng bệnh thán thư tình hình sinh trưởng phát triển ớt Trong đó, phun oligochitosan nồng độ 25 ppm cho kết tốt Đối với nano silica, có tác động đến tính kháng bệnh thán thư tình hình sinh trưởng phát triển ớt Trong đó, phun nano silica nồng độ 50 100 ppm cho kết tốt Đối với oligochitosan-silica nano, thí nghiệm có tác động đến tính kháng bệnh thán thư trái tình hình sinh trưởng phát triển ớt Trong đó, phun oligochitosan- silica nano nồng độ 50 ppm cho kết tốt Hình ảnh thí nghiệm đồng ruộng minh họa phụ lục (Hình 4.11-4.20)

(153)

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

KẾT LUẬN

Đã phân lập định danh 20 mẫu nấm bệnh thán thư ớt tiến hành định danh hình thái dựa theo Sutton (1992), mẫu phân lập thuộc hai nhóm phức hợp lồi Colletotrichum gloeosporioides C truncatum Kết phân loại dựa trình tự vùng gen chuyên biệt thực mẫu nấm có độc lực cao (L3, TN-Tr2, TN-Th1, HCM-TN-Tr2, HCM-L2, ĐT-Th1)

Đã thu phân đoạn oligochitosan có phân từ thấp (7,7 kDa; 4,6 kDa 2,5 kDa) kiểm tra hoạt tính kháng nấm bệnh cao phân đoạn oligochitosan (0,5 - 1%) điều chế thành cơng hạt nano silica kích thước 30 nm từ vỏ trấu dùng làm vật liệu cho chế tạo hỗn hợp dung dịch oligochitosan-silica nano bền pH 7,5 với chất làm đặc HEC (1%) khảo sát số đặc trưng tính chất vật liệu oligochitosan, silica nano hỗn hợp oligochitosan-silica nano

Kết bước đầu hiệu ứng tăng trưởng yếu tố có liên quan đến kích kháng bệnh vật liệu cho thấy thể ứng kích kháng bệnh tốt thông qua biểu hoạt chất liên quan đến tính kích kháng hoạt tính enzyme chitinase, β1,3 glucanase, tích lũy capsidiol hay salicylic acid jasmonic acid, cụ thể phun oligochitosan-silica nano nồng độ 50 - 100 ppm 21 ngày sau xử lý

Kết đánh giá tính kích kháng bệnh thán thư điều kiện nhà màng:

+ Đối với nấm C gloeosporioides: Qua tiêu theo dõi bệnh tiêu cấu thành suất suất, kết đạt tốt phun oligochitosan 25 ppm nano silica 100 ppm oligochitosan-silica nano 50 ppm

+Đối với nấm C truncatum: Qua tiêu theo dõi bệnh tiêu cấu thành suất suất, kết đạt tốt phun oligochitosan 25 ppm; nano silica 50-100 ppm oligochitosan-silica nano 50 ppm

(154)

+ Đối với nấm C gloeosporioides: Qua tiêu theo dõi bệnh tiêu cấu thành suất suất, kết đạt tốt phun oligochitosan 25 ppm; nano silica 50, 100 ppm oligochitosan-silica nano 50 ppm

+ Đối với nấm C truncatum: Qua tiêu theo dõi bệnh tiêu cấu thành suất suất, kết đạt tốt phun oligochitosan 25 ppm; nano silica 100 ppm; oligochitosan-silica nano 50 ppm

ĐỀ NGHỊ

Bước đầu ứng dụng sử dụng oligochitosan-silica nano kích kháng bệnh thán thư Colletotrichum spp ớt thiên Trong trình trồng ớt nhà màng hay đồng ruộng, phun oligochitosan-silica nano nồng độ 50 ppm Tiến hành phun oligochitosan-silica nano lần cách ngày, thời điểm phun lần đầu vào khoảng thời gian chuẩn bị hoa (25 ngày sau trồng - NST) để hạn chế bệnh thánh thư gây hại lá, tráivà giúp làm tăng suất ớt

(155)

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

- Luận án hồn thiện quy trình sản xuất oligochitosan-silica nano ứng dụng sản xuất quy mô công nghiệp:

+ Tạo oligochitosan có khối lượng phân tử nhỏ (7,7; 4,6 2,5 kDa) phương pháp chiếu xạ dung dịch 4% chitosan/0,5% H2O2 dung dịch 2% chitosan/0,5%

H2O2;

+ Tạo vật liệu nano silica có độ tinh khiết cao phương pháp thiêu kết vỏ trấu xử lý loại bỏ thành phần khoáng

+ Tạo oligochitosan-silica nano bền pH gần trung tính (pH ~ 7,5)

- Luận án ứng dụng oligochitosan-silica nano tạo kích kháng bệnh thán thư nấm C gloeosporioides C truncatum ớt thiên trồng Tp Hồ Chí Minh

DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ

1 Pham Dinh Dzung, Dang Van Phu, Bui Duy Du, Le Si Ngoc, Nguyen Ngoc Duy, Hoang Dac Hiet, Dang Huu Nghia, Nguyen Tien Thang, Bui Van Le, Nguyen Quoc Hien, Effect of foliar application of oligochitosan with different molecar weight on

growth promotion and fruit yield enhancement of chili plant, Plant Production Science,

2017, 20 (1), 1-7

2 Pham Dinh Dzung, Le Thanh Hung, Le Si Ngoc, Hoang Dac Hiet, Bui Van Le, Nguyen Tien Thang, Dang Van Phu, Nguyen Ngoc Duy, Nguyen Quoc Hien,

Induction of anthracnose disease resistance on chili fruit by treatment of oligochitosan—nano hybrid material, Agrictural Sciences, 2017, (10), 1105-1113

3 Phạm Đình Dũng, Nguyễn Tiến Thắng, Dương Hoa Xô, Lê Quang Luân, Nghiên

cứu hiệu lực kháng nấm Collectotrichum capsici gây bệnh thán thư ớt phân đoạn oligochitosan chế tạo phương pháp chiếu xạ kết hợp xử lý hóa học,

Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 2017, 15 (1), 105-112

(156)

husk on the growth enhancement of chili plant, Tạp chí Khoa học Công nghệ -

(157)

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] P Tripodi and S Kumar, The Capsicum Crop: An Introduction, In The Capsicum Genome, Compendium of Plant Genomes, N Ramchiary and C Kole (eds.), 2019, Springer Nature Switzerland

[2] R.L Jarret, F.R Costa Batista, T Berke, Y.Y Chou, A Hulse-Kemp, N Ochoa-Alejo, P Tripodi, A Veres, C.C Garcia, G Csillery, Y.K Huang, E Kiss, Z Kovacs, and M Kondrak, Capsicum-An Abbreviated Compendium, J Amer Soc Hort Sci, 2019, 144(1):3-22

[3] A S Antonio., L S M Wiedemanna and V F Veiga Junior, The genus

Capsicum: a phytochemical review of bioactive secondary metabolites, RSC

Adv., 2018, 8, 25767–25784

[4] FAOSTAT (2011) Production Data (http://faostat.fao.org)

[5] P.F Cannon, U Damm, P.R Johnston, B.S Weir, Colletotrichum – current

status and future directions, Studies in Mycology, 2012, 73 (1), 181-213

[6] B S Weir, P R Johnston, U Damm, The Colletotrichum gloeosporioides species

complex, Studies in Mycology, 2012, 73 (1), 115-180

[7] D D De Silva, P K Ades, P W Crous, P.D Hyde, P W J Taylor, Life styles of

Colletotrichum species and implications for plant biosecurity, Fungal Biology

Review, 2017, 31, 155-168

[8] R Dean, J A K Van, Z A Pretorius, K.E Hammond-Kosack, A P Di, J J Rudd, M Dickman, K Regine, E Jeff, F D Gary, Review The Top 10

fungal pathogens in molecular plant pathology, Molecular Plant Pathology,

2012, 13 (4), 414- 430

[9] Nguyễn Duy Hưng, Hà Viết Cường Hoàng Chúng Lằm, Phát loài

colletotrichum gây bệnh thán thư ớt phản ứng chuỗi polymerase, Tạp chí

Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2018, 16(12): 1025-1038

[10] G Monique, B D Tom, ITS primers with enhanced specificity for

basidiomycetes application to the identification of mycorrhizae and rusts,

(158)

[11] L Fangling, T GuitingTang, Z Xiaojuan, L Ying, S Xiaofang, Q Xiaobo, Z.You, X Jing, C Huabao, C Xiaoli, Z Sirong, G Guoshu, Molecular and

phenotypic characterization of Colletotrichum species associated with anthracnose disease in peppers from Sichuan Province- China, Scientific

Reports, 2016, 6, 1-17

[12] D D De Silva, P K Ades, P W Crous, P W J Taylor, Colletotrichum species

associated with chili anthracnose in Australia, Plant Pathology, 2017, 66(2),

254-267

[13] R.S Jayawardena, K.D Hyde, U Damm, L Cai, M Liu, X.H Li, W Zhang, W.S Zhao, J.Y Yan, Notes on currently accepted species of Colletotrichum, Mycosphere, 2016, (8), 1192-1260

[14] Y.Z Diao, C Zhang, F Liu, W.Z Wang, L Liu, L Cai and X.L Liu,

Colletotrichum species causing anthracnose disease of chili in China,

Persoonia, 2017 38: 20-37

[15] M.M Oo, G.T Lim, H Jang , and S.K Oh, Characterization and Pathogenicity

of New Record of Anthracnose on Various Chili Varieties Caused by Colletotrichum scovillei in Korea, Mycobiology, 2017, 45(3): 184-191

[16] D D De Silva, P K Ades, P W Crous, Z G Johannes, A Nasruddin, O.M Mongkolporn and P.W.J Taylor, Identification, prevalence and pathogenicity of

Colletotrichum species causing anthracnose of Capsicum annuum in Asia, IMA

Fungus 2019, 10:8,1-32

[17] S Amrita, R Raghuwanshi, K.G Vijai, H.B Singh, Chilli Anthracnose: The

Epidemiology and Management, Frontiers in Microbiology, 2016, 7(1527), 1-18

[18] L.D Don, Van T.T., T.T P Vy, P T M Kieu, Colletotrichum spp Attacking on

Chilli Pepper Growing in Vietnam Country report In: Oh DG, Kim KT (Eds),

Abstract of the first International Symposium on Chilli Anthracnose, National Hortictural Research Institute, Rural Development of Administration, 2007, p 24 South Korea

[19] O Mongkolporn, Anthracnose disease in Capsicum, In Capsicum: Breeding

Strategies for Anthracnose Resistance Orarat Mongkolporn (Ed) 2019, CRC

(159)

[20] O Mongkolporn, Breeding for anthracnose resistance in Capsicum, in Capsicum:

Breeding Strategies for Anthracnose Resistance Orarat Mongkolporn (Ed)

2019, CRC press p73-84

[21] M Banya, S Garg and N.L Meena, A review: Chilli anthracnose, its spread and

Management, Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry 2020; 9(4):

1432-1438

[22] L Chien-Yao, C Mei-Ya, C Yuh-Kun, W Tien-Cheng, S Zong-Ming, K Ker-Chung, C P F Linda, C Kuang-Ren, L Miin-Huey, Characterization of three

Colletotrichum acutatum isolates from Capsicum spp., European Journal of

Plant Pathology, 2012, 133 (3), 599-608

[23] B.P Birari, R.M Gade and R.K Chuodhari, Antifungal efficacy of plant extracts,

biocontrol agents against Colletotrichum capsici causing anthracnose of chilli,

Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry 2018; 7(5): 1368-1373

[24] M Anees, M Abid, S Rehman, A.N Nadeem, N.M Ashraf, L Zhang, K.Y Kim, Antifungal activity of various chitinolytic bacteria against Colletotrichum

in pepper, Plant Protection Science, 2019, 55(2): 109-115

[25] Lê Hoàng, Lệ Thủy Phạm Văn Kim, Phân loài nấm Colletotrichum gây bệnh

thán thư xoài sầu riêng Đồng Sông Cửu Long thử hiệu lực của sáu loại thuốc lồi nấm này, Tạp chí Khoa học Đại học Cần

Thơ, 2008, 10, 21-40

[26] Trần Thị Thu Thủy, Lê Thị Ngọc Xn, Ngơ Thành Trí, Phan Thị Hồng Thúy, Lê Thanh Tồn, Phạm Hồng Oanh, Huỳnh Minh Châu, Kích thích tính kháng

bệnh thán thư rau xử lý số hóa chất, Tạp chí Khoa học

Trường Đại học Cần Thơ, 2010, 16b, 138-146

[27] Nguyễn Thụy Đan Huyền, Lê Thanh Long, Trần Thị Thu Hà, Phạm Thị Ngọc Lan, Ảnh hưởng Oligochitosan đến nấm Colletotrichum gloeosporioides

gây bệnh thán thư ớt sau thu hoạch, Tạp chí Nơng nghiệp & Phát triển

Nông thôn, 2013, 21, 47-53

(160)

Colletotrichum Acutatum L2 gây hại cà chua sau thu hoạch, Tạp chí Khoa

học Phát triển, 2015, 13(8), 1481-1487

[29] Trần Ngọc Hùng Nguyễn Thị Liên Thương, Nghiên cứu tạo chế phẩm từ

Trichoderma sp kiểm soát bệnh thán thư Colletotrichum spp gây cây ớt (Capsicum frutescens), Tạp chí Khoa học đại học Cần Thơ, 2016, 45,

86-92

[30] E.J Andersen, S Ali, E Byamukama, Y Yen, M.P Nepal, Disease resistance

mechanisms in plants, Genes, 2018, 9, 339

[31] Y Shen, N Liu, C Li, X Wang, X Xu, W Chen, G Xing, and W Zheng, The

early response during the interaction of fungal phytopathogen and host plant,

Open Biol, 2017, 7:1-8

[32] C Garcion, O Lamotte, J.L Cacas, and J.P Métraux, Mechanisms of Defence to

Pathogens: Biochemistry and Physiology, Induced Resistance for Plant Defense: In A Sustainable Approach to Crop Protection, Walters D,R, Newton

A,C and Gary D, by John Wiley & Sons, 2014, p106-136

[33] Q.M Gao, S Zhu, P Kachroo, and A Kachroo, Signal regulators of systemic

acquired resistance, Frontiers in Plant Science, 2015, 6, 228: 1-12

[34] Q.M Imran, B.W Yun, Pathogen-induced Defense Strategies in Plants, J Crop Sci Biotech, 2020, 23 (2) : 97-105

[35] N.A Abdul Malik, I.S Kumar and K Nadarajah, Elicitor and Receptor

Molecules: Orchestrators of Plant Defense and Immunity, Int J Mol Sci

2020, 21, 963:1-34

[36] S Kawasaki, K Yamada, S.Yoshimura, and K Yamaguchi, Chitin

receptor-mediated activation of MAP kinases and ROS production in rice and Arabidopsis, Plant Signaling & Behavior, 2017, 12 (9), e1361076:1-5

[37] A Jamiołkowska, Natural Compounds as Elicitors of Plant Resistance Against

Diseases and New Biocontrol Strategies, Agronomy, 2020, 10, 173:1-11

[38] V.P Santos, N.S.S Marques, P.C.S Maia, M.A.B Lima, L.O Franco

and G.M Takaki, Seafood Waste as Attractive Source of Chitin and Chitosan

(161)

[39] T Pusztahely, Chitin and chitin-related compounds in plant-fungal interactions, Mycology, 2018, 9(3):189-201

[40] N Permatasari, T.N Sucahya, and A.B Nandiyanto, Review: Agricultural

Wastes as a Source of Silica Material, Indonesian Journal of Science &

Technology, 2016, (1): 82-106

[41] N Leroy, F Tombeur, W Walgraffe, J.T Cornélis and F.J Verheggen, Silicon

and Plant Natural Defenses against Insect Pests: Impact on Plant Volatile Organic Compounds and Cascade Effects on Multitrophic Interactions, Plants,

2019, 8, 444:1-11

[42] D Katiyar, A Hemantaranjan, B Singh, N A Bhanu, Chitosan as a promising

natural compound to enhance potential physiological responses in plant: a review, Indian Journal of Plant Physiology, 2015, 20 (1), 1-9

[43] S.N Das, J Madhuprakash, P V S R N Sarma, P Purushotham, K Suma, K Manjeet, S Rambabu, N E Gueddari, B M Moerschbacher, A R Podile,

Biotechnological approaches for field applications of chitooligosaccharides (COS) to induce innate immunity in plants, Critical Reviews in Biotechnology,

2013, 1-15

[44] C Wang, G Wang, C Zhang, P Zhu, H Dai, N Yu, Z He, L Xu, E Wang,

OsCERK1-Mediated Chitin Perception and Immune Signaling Requires Receptor-like Cytoplasmic Kinase 185 to Activate an MAPK Cascade in Rice,

Molecar Plant, 2017, 10, 619-633

[45] T Kawasaki, K Yamada, S Yoshimura, K Yamaguchi, Chitin receptor-mediated

activation of MAP kinases and ROS production in rice and Arabidopsis, Plant

Signaling & Behavior, 2017, 12 (9), 1-5

[46] R Sharif, M Mujtaba, M U Rahman, A Shalmani, H Ahmad, T Anwar, D Tianchan, X Wang, The Mtifunctional Role of Chitosan in Hortictural Crops; A Review, Moleces, 2018, 23, 872 (1-20)

[47] A Hidangmayum, P Dwivedi, D Katiyar, A Hemantaranjan, Application of

chitosan on plant responses with special reference to abiotic stress, Physiology

(162)

[48] I Aranaz, N Acosta, C Civera, B Elorza, J Mingo, C Castro, M L Gandía, A H Caballero, Cosmetics and Cosmeceutical Applications of Chitin, Chitosan

and Their Derivatives, Polymers, 2019, 10, 2-25

[49] B Farhadihosseinabadi, A Zarebkohan, M Eftekhary, M Heiat, M M Moghaddam, M Gholipourmalekabadi, Crosstalk between chitosan and cell

signaling pathways, Cellar and Molecar Life Sciences, 2019, 76(14),

2697-2718

[50] H Yin, Y Du, Z Dong, Chitin Oligosaccharide and Chitosan Oligosaccharide:

Two Similar but Different Plant Elicitors, Frontiers in Plant Science, 2016, 7,

1-4

[51] S Chandra, N Chakarborty, A Dasgupta, J Sarkar, K Panda, K Acharya,

Chitosan nanoparticle: a positive modator of innate immune responses in plants, Scientific Reports, 2015, 5, 1-13

[52] A.N Hernández-Lauzardo, M.G Velázquez-del Valle, M.G Guerra-Sánchez,

Current status of action mode and effect of chitosan against phytopathogens fungi, African Journal of Microbiology Research, 2011, (25), 4243-4247

[53] C C Juan, C V Pierre, Preparation of chitooligosaccharides with degree of

polymerization higher than by acid of enzymatic degradation of chitosan,

Biochemical Engineering Journal, 2005, 25 (2), 165-172

[54] A B Berit, H B Ellinor, N.L Anne, S Morten, V M Kjell, E H G Vincent,

Production of chitooligosaccharides and their potential applications in medicine, Marine Drugs, 2010, (5), 1482-1517

[55] Y Azra, P S Linggar, S Emma, H R Anita, The effect of sonication on the

characteristic of chitosan, Proceeding of International Conference on Chemical

and Material Engineering, 2012, 1-5

[56] A Aziz, P Trotel-Aziz, L Dhuicq, M Couderchet, G Vernet, Chitosan

oligomers and copper sfate induce grapevine defense reactons and resistance to gray mold and downy mildew, Phythopathology, 2006, 96 (11), 1188-1194

[57] M Lian-Ju, L Y Yue, W.L Lan, L M Xue, L Ting, B Ning, Germination and

(163)

oligochitosan., International Journal of Agricture & Biology, 2014, 16 (4),

766-770

[58] V Saharan, G Sharma, M Yadav, M.K Choudhary, S.S Sharma, A Pal, R Raliya, P Biswas, Synthesis and in vitro antifungal efficacy of Cu-chitosan

nanoparticlesagainst pathogenic fungi of tomato, International Journal of

Biological Macromoleces, 2015, 75, 346-353

[59] N Sakr, The role of silicon (Si) in increasing plant resistance againstfungal

diseases, Hellenic Plant Protection Journal, 2016, 9, 1-15

[60] J A Bhat, S M Shivaraj, P Singh, D B Navadagi, D K Tripathi, P K Dash, A U Solanke, H Sonah, R Deshmukh, Role of Silicon in Mitigation of Heavy

Metal Stresses in Crop Plants, Plants 2019, 8, 1-20

[61] J V Bockhaven, D.D Vleesschauwer, M Hofte, Towards establishing

broad-spectrum disease resistance in plants: silicon leads the way, Journal of

Experimental Botany, 2013, 64 (5), 1281-1293

[62] M Wang, L Gao, S Dong, Y Sun, Q Shen, S Guo, Role of Silicon on Plant–

Pathogen Interactions, Frontiers in Plant Science, 2017, 8, 1-14

[63] E Epstein, Silicon: Its manifold roles in plants, Annals of Applied Biology, 2009, 155 (2), 155-160

[64] J V Bockhaven, L Spichal, O Novak, M Strnad, T Asano, S Kikuchi, M Hofte, D D Vleesschauwer, Silicon induces resistance to the brown spot

fungus Cochliobolus miyabeanus by preventing the pathogen from hijacking the rice ethylene pathway, New Phytologist, 2015, 206 (2), 761-773

[65] L A Terry, D.C Joyce, Elicitors of induced disease resistance in postharvest

hortictural crops: a brief review, Postharvest Biology and Technology, 2004,

32(1), 1-13

[66] G Domiciano, I Cacique, C Freitas, M Filippi, F.M DaMatta, F Vale, F Rodrigues, Alterations in gas exchange and oxidative metabolism in rice leaves

infected by Pyricaria oryzae are attenuated by silicon, Phytopathology, 2015,

105 (6), 738-747

(164)

antioxidative system in common bean plants infected by Colletotrichum lindemuthianum and supplied with silicon, Tropical Plant Pathology, 2014, 39

(1), 035- 042

[68] I Tsigos, A Martinou, D Kafetzopoos, V Bouriotis, Chitin deacetylases: new,

versatile tools in biotechnology, Trends in Biotechnology, 2000, 18 (7), 305-

312

[69] K Kurita, Controlled functionalization of the polysaccharide chitin, Progress in Polymer Science, 2001, 26 (9), 1921-1971

[70] S V Nemtsev, A.I Gamzazade, S.V Rogozhin, V.M Bykova, V.P Bykov,

Deacetylation of chitin under homogeneous conditions, Applied Biochemistry

and Microbiology, 2002, 38 (56), 521-526

[71] H KeJin, H Jinlian, W Kwok, H Kwok‐Ping, Y Kwok-Wing, Screening of fungi

for chitosan producers, and copper adsorption capacity of fungal chitosan and chitosanaceous materials, Carbohydrate Polymers, 2004, 58 (1), 45-52

[72] N Nwe, W.F Stevens, Production of fungal chitosan by solid substrate

fermentation followed by enzymatic extraction, Biotechnology Letters, 2002, 24

(2), 131-134

[73] W Tao, Z Svetlana, F A Draughon, C S William, S E Carl, Physicochemical

properties and bioactivity of fungal chitin and chitosan, Journal of Agrictural

and Food Chemistry, 2005, 53 (10), 3888- 3894

[74] K Vellingiri, T Ramachandran, M Senthilkumar, Eco-friendly application of

nano chitosan in antimicrobial coatings in the textile industry, Nanoscience and

Nanotechnology Letters, 2013, 5(5), 519-529

[75] Bùi Phước Phúc, Hà Thúc Huy, Nguyễn Quốc Hiến, Nghiên cứu chế tạo

oligochitosan từ vỏ tôm mai mực chiếu xạ gamma Co-60, Tạp chí Khoa

học Trường Đại học An Giang, 2014, (3), 1-5

[76] Trần Xuân Mậu, Điều chế oligo-chitosan ứng dụng làm chất kích thích nẩy

mầm hạt lúa, Tạp chí khoa học cơng nghệ, Trường Đại học Khoa học Huế,

(165)

[77] S Chandrasekhar, K G Satyanarayana, P N Pramada, P Raghavan, T N Gupta, Review processing, properties and applications of reactive silica from

rice husk—an overview, Journal of Materials Science, 2003, 38(15), 3159-3168

[78] L R Khot, S Sankaran, J M Maja, R Ehsani, E W Schuster, Applications of

nanomaterials in agrictural production and crop protection: a review, Crop

Protection, 2012, 35, 64-70

[79] H Shiwen, W Ling, L Lianmeng, H Yuxuan, L Lu, Nanotechnology in

agricture, livestock, and aquacture in China A review, Agronomy for

Sustainable Development, 2015, 35(2), 369- 400

[80] N Q Hien, D V Phu, N N Duy, N T K Lan, Degradation of chitosan in

solution by gamma irradiation in the presence of hydrogen peroxide,

Carbohydrate Polymers, 2012, 87(1), 935-938

[81] Le Van Hai, Ha Thuc Chi Nhan, Ha Thuc Huy, Synthesis of silica nanoparticles

from Vietnamese rice husk by sol–gel method, Nanoscale Research Letters,

2013, (1), 58

[82] Nguyễn Trí Tuấn, Nguyễn Hữu Minh Phú, Hồ Ngọc Tri Tân, Phạm Thị Bích Thảo, Nguyễn Thị Kim Chi, Lê Văn Nhạn, Nguyễn Trọng Tuân, Trịnh Xuân Anh, Tổng hợp hạt Nano SiO2 từ tro vỏ trấu phương pháp kết tủa, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 2014, 32, 120-124

[83] T Witoon, M Chareonpanich, Interaction of chitosan with tetraethyl orthosilicate

on the formation of silica nanoparticles: Effect of pH and chitosan concentration, Ceramics International, 2012, 38(7), 5999-6007

[84] A Al-Mla, F Al-Sagheer, Determination of Kinetic Parameters for the

Degradation of Chitosan/Silica Hybrid Nano Composites, Journal of Polymers

and the Environment, 2013, 21(2), 504-511

[85] T M Budnyak, I V Pylypchuk, V A Tertykh, E S Yanovska, D Kolodynska,

Synthesis and adsorption properties of chitosan-silica nanocomposite prepared by sol-gel method, Nanoscale research letters, 2015, 10(1), 1-10

[86] T Sun, C L Wu, H Hao, Y Dai, J R Li, Preparation and preservation

(166)

[87] Nguyễn Quốc Hiến, Nghiên cứu xử lý hóa học kết hợp với xạ chế tạo chất

kích kháng bệnh sinh học dùng nơng nghiệp cho lúa mía, Báo

cáo tổng kết đề tài KH-CN cấp Bộ, mã số: BO/06/07-01, 2009, TP HCM [88] M Xianghong, Y Lingyu, F K John, T Shiping, Effects of chitosan and

oligochitosan on growth of two fungal pathogens and physiological properties in pear fruit, Carbohydrate Polymers, 2010, 81 (1), 70-75

[89] A Asgar, Control of anthracnos by chitosan through stimation of defence-related

enzymes in Eksotika II Papaya (Carica papaya L.) fruit, Journal of Biology and

Life Science, 2012, (1), 114-126

[90] Võ Thị Mai Hương, Trần Thị Kim Cúc, Nghiên Cứu Ảnh Hưởng Của Chitosan

Oligosaccharide Lên Sinh Trưởng Và Năng Suất Cây Lạc Giống Lạc L14,

Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế, 2012, 73 (4), 125-135

[91] J K Park, Characterization of potential antibacterial activity of high-degree

polymerized Chitooligosaccharides, European Journal of Natural and Applied

Sciences, 2013, 1(2), 47 -58

[92] W Qing, Z Jin-hua, W Qian, N Yang, G Li-pu, Inhibitory effect of chitosan on

grow of the fungal phytopathogen, Sclerotinia sclerotiorum, and Sclerotinia rot of carrot, Journal of Integrative Agricture, 2015, 14 (4), 691- 697

[93] P Chowdappa., G Shivakumar, C.S Chethana, S Madhura, Antifungal activity of

chitosan-silver nanoparticle composite against Colletotrichum gloeosporioides associated with mango anthracnose, African Journal of Microbiology Research,

2014, (17), 1803-1812

[94] Lê Quang Luân, Nguyễn Huỳnh Phương Uyên, Phan Hồ Giang, Nghiên cứu hiệu

ứng kháng nấm phytophthora capsici gây bệnh chết nhanh hồ tiêu chế phẩm nano bạc-chitosan chế tạo phương pháp chiếu xạ, Tạp chí Sinh

học, 2014, 36 (1), 152-157

[95] R Suriyaprabha, G Karunakaran, R Yuvakkumar, P Prabu, V Rajendran, N Kannan, Growth and physiological responses of maize (Zea mays L.) to porous

silica nanoparticles in soil, Journal of Nanoparticle Research, 2012, 14 (12),

(167)

[96] H M El-bendary, A A El-Helaly, First record nanotechnology in agrictural:

Silica nano-particles a potential new insecticide for pest control, Applied

Science Report, 2013, (3), 241-246

[97] Nguyễn Thị Bích Ngọc, Nguyễn Hồi Châu, Trần Xuân Tin, Lê Mai Nhất, Phạm Thị Dung, Ngô Thị Thanh Hường, Đỗ Duy Hưng, Nghiên cứu hiệu hạt

nano bạc ức chế số chủng nấm thực vật (Fusarium oxysporum, Colletotrichum, Rhizoctonia solani Corynespora cassicola) phịng thí nghiệm, Tạp chí Khoa học Công nghệ Việt Nam, 2015, 5, 58

[98] A.A El-Helaly, H.M El-Bendary, A A El-Wahab, M El-Sheikh, S Elnagar,

The silica-nano particles treatment of squash foliage and survival and development of Spodoptera littoralis (Bosid.) larvae, Journal of Entomology

and Zoology Studies, 2016, 4(1), 175-180

[99] P.P Than, R Jeewon, K.D Hyde, S Pongsupasamit, O Mongkolporn, P.W.J Taylor, Characterization and pathogenicity of Colletotrichum species

associated with anthracnose disease on chilli (Capsicum spp.) in Thailand,

Plant Pathology, 2008, 57(3), 562-572

[100] T.K Goh, Single-spore isolation using a hand-mafe glass neddle, Fungal Diversity, 1999, 2, 47-63

[101] P Montri, P.W.J Taylor, O Mogkolporn, Pathotypes of Colletotrichum capsici,

the causal agent of chili anthracnose, in Thailand, Plant Disease, 2009, 93,

17-20

[102] Vũ Triệu Mân Lê Lương Tề, Bệnh nông nghiệp, NXB Nông Nghiệp, 1998

[103] B.C Sutton, The genus Glomerella and its anamorph Colletotrichum In Colletotrichum biology, pathology and control (eds, LA Bailey and MJ Jeger) CAB International, Wallingford, 1992, 1-26

[104] S.B Lee, M.G Milgroom, J.W Taylor, A rapid high yield mini-prep method for

isolation of total genomic DNA from fungi Fungal Genet Newsl, 1988, 35,

(168)

[105] T J White, T Bruns, S Lee, J Taylor, Amplification and direct sequencing of

fungal ribosomal RNA Genes for phylogenetics, PCR- Protocols and

Applications Academic Press, 1990, 3, 315-322

[106] C Ignazio, L M Kohn, A method for designing primer sets for speciation studies

in filamentous ascomycetes, Mycologia, 1999, 91 (3), 553-556

[107] J C Guerber, B Liu, J C Correll, P R Johnston, Characterization of diversity

in Colletotrichum acutatum sensu lato by sequence analysis of two gene introns, mtDNA and intron RFLPs, and mating compatibility, Mycologia, 2003,

95(5), 872-95

[108] N L Glass, G C Donaldson, Development of Primer Sets Designed for Use with

the PCR To Amplify Conserved Genes from Filamentous Ascomycetes, Applied

and Environmental Microbiology, 1995, 61(4), 1323-1330

[109] J Brugnerotto, J Lizardi, F M Goycoolea, W Arguelles-Monal, J Desbrieres, M Rinaudo, An infrared investigation in relation with chitin and chitosan

characterization, Polymer, 2001, 42, 3569-3580

[110] N Nantawanit, B Panijpan, A Chanchaichaovivat, P Ruenwongsa, Induction of

defense response against Colletotrichum capsici in chili fruit by the yeast Pichia guilliermondii strain R13, Journal Biological Control, 2010, 52,

145-152

[111] L Petra, L Jan, Z Zbynek, P Zbynek, M Vladimir, K.Tomas, Determination of

Capsidiol in Tobacco Cells Cture by HPLC, Journal of Chromatographic

Science, 2010, 48, 436-440

[112] S Guillem, J Olga, C Eva,T Isabel, 2006, Simtaneous quantitative

LC–ESI-MS/MS analyses of salicylic acid and jasmonic acid in crude extracts of Cucumis sativus under biotic stress, Phytochemistry, 2006, 67, 395-401

[113] N N Duy, D V Phu, N T Anh, N Q Hien, Synergistic degradation to prepare

oligochitosan by γ-irradiation of chitosan solution in the presence of hydrogen peroxide, Radiation Physics and Chemistry, 2011, 80, 848-853

[114] N Q Hien, D V Phu, N N Duy, N T K Lan, Degradation of chitosan in

solution bygamma irradiation in the presence of hydrogen peroxide,

(169)

[115] R T Woods, A K Pikaev, Applied Radiation Chemistry: Radiation Processing, Wiley, New York, 1994, 341-342

[116] P anski, C V Sonntag, OH-radical-induced chain scission of chitosan in the

absenceand presence of dioxygen, Journal of the Chemistry Society, Perkin

Transactions, 2000, 2, 2022-2028

[117] S.K Kim, N Rajapakse, Enzymatic production and biological activities of

chitosan oligosaccharides (COS): A review, Carbohydrate Polymers, 2005, 62,

357-368

[118] L.T Long, N.T.T Tien, N.H Trang, T.T.T Ha, N.M Hieu, Study on Antifungal

ability of water soluble chitosan against green mold infection in harvested oranges, Journal of Agrictural Science, 2014, 6(8), 205-213

[119] S Bautista-Baños, A.N Hernández-Lauzardo, M.G Velázquez-del Valle, M Hernández-López, E Ait Barka, E Bosquez-Molina, C.L Wilson, Chitosan as

a potential natural compound to control pre and postharvest diseases of hortictural commodities, Crop Protection, 2006, 25(2), 108-118

[120] A.N Hernández-Lauzardo, M.G Velázquez-del Valle, M.G Guerra-Sánchez,

Current status of action mode and effect of chitosan against phytopathogens fungi, Microbiology Research, 2011, 5, 4243-4247

[121] J Liu, S.P Tian, X.H Meng, Y Xu, Control effects of chitosan on postharvest

diseases and physiological response of tomato fruit, Postharvest Biology and

Technology, 2007, 44, 300-306

[122] M XiangChun, T Yanxia, Z AiYu, H Xuemei, Z Zhaoqi, Effect of

oligochitosan on development of Colletotrichum musae in vitro and in situ and its role in protection of banana fruits, Fruits, 2012, 67 (3), 147-155

[123] S.N Kikov, S.A Lisovskaya, P.V Zelenikhin, E.A Bezrodnykh, D.R Shakirova, I.V Blagodatskikh, V.E Tikhonov, Antifungal activity of

oligochitosans (short chain chitosans) against some Candida species and clinical isolates of Candida albicans: molecar weight-activity relationship,

(170)

[124] L Yang, P Zhao, L Wang, I Filippus, X Meng, Synergistic effect of

oligochitosan and silicon on inhibition of Monilinia fructicola infections,

Journal of the science of food and agricture, 2010, 90(4), 630-634

[125] M Xianghong, Y Lingyu, F.K John, Shiping Tian Effects of chitosan and

oligochitosan on growth of two fungal pathogens and physiological properties in pear fruit, Carbohydrate Polymers, 2010, 81(1), 70-75

[126] V D Meena, M L Dotaniya, Vassanda Coumar, S Rajendiran, Ajay, S Kundu, A Subba Rao, A Case for Silicon Fertilization to Improve Crop Yields in

Tropical Soils, Proceedings of the National Academy of Sciences, 2014, 84 (3),

505-518

[127] W Wang, J C Martin, N Zhang, L Sun, Harvesting silica nanoparticles from

rice husks, Journal of Nanoparticle Research, 2011, 13, 6981-6990

[128] J Athinarayanan, V S Periasamy, M Alhazmi, K A Alshatwi, A.A Alshatwi,

Synthesis of biogenic silica nanoparticles from rice husks for biomedical applications, Ceramics International, 2015, 41, 275-281

[129] V.P Della, I Kuhn, D Hotza, Rice husk ash as an alternate source for active

silica production, Materials Letters, 2002, 57(4), 818-821

[130] L Yan, Y L Jeremy Y., L Jingjing, Y Jingfang, L Zhiping, W Weixing, S Luyi, Synthesis of Gold Nanoparticles on Rice Husk Silica for Catalysis

Applications, Industrial & Engineering Chemistry Research, 2015, 54 (21),

5656-5663

[131] C Real, M.D Alcala, J.M Criado, Preparation of silica from rice husks, Journal of the American Ceramic Society, 1996, 79(8), 2012-2016

[132] W Wang, J.C Martin, N Zhang, C Ma, A Han, L Sun, Harvesting silica

nanoparticles from rice husks, Journal of Nanoparticle Research, 2011, 13(12),

6981-6990

[133] V.B Carmona, R.M Oliveira, W.T.L Silva, L.H.C Mattoso, J.M Marconcini,

Nanosilica from rice husk: extraction and characterization, Industrial Crops

and Products, 2013, 43, 291-296

[134] A Tiraferri, P Maroni, D C Rodríguez, M Borkovec, Mechanism of chitosan

(171)

[135] H A Borei, M F M El-Samahy, A Galal Ola, A F Thabet, The efficiency of

silica nanoparticles in control cotton leafworm, Spodoptera littoralis Boisd (Lepidoptera: Noctuidae) in soybean under laboratory conditions, Global

Journal of Agricture and Food Safety Sciences, 2014, (2), 161-168

[136] F.A Rodrigues, D.J McNally, L.E Datnoff, J.B Jones, C Labbé, N Benhamou, J.G Menzies, R.R Bélanger, Silicon enhances the accumation of diterpenoid

phytoalexins in rice: a potential mechanism for blast resistance, Biochemistry

and Cell Biology, 2004, 94 (2), 177-183

[137] L M Kiirika, F Stahl, K Wydra, Phenotypic and molecar characterization of

resistance induction by single and combined application of chitosan and silicon in tomato against Ralstonia solanacearum, Physiological and molecar plant

pathology, 2013, 81, 1-12

[138] Y Shibata, M Ojika, A Sugiyama, K Yazaki, D.A Jones, K Kawakita, D Takemoto, The Fl-Size ABCG Transporters Nb-ABCG1 and Nb-ABCG2

Function in Pre- and Postinvasion Defense against Phytophthora infestans in Nicotiana benthamiana, Plant Cell, 2016, 28(5), 1163-81

[139] H.G Park, Problems of Anthracnose in Pepper and Prospects for its

Management In: Oh DG, Kim KT, editors Abstracts of the First International

Symposium on Chilli Anthracnose Republic of Korea: National Hortictural Research Institute, Rural Development of Administration, 2007, p 19, Korea [140] R.B Belanger, P.A Bowen, D.L Ehret, J.G Menzies, Soluble silicon: Its role in

crop and disease management of greenhouse crops, Plant Disease, 1995, 79,

329-336

[141] Y Heng, Z Xiaoming, D Yuguang, Oligochitosan: A plant diseases vaccine-A