gây bệnh thán thư trên cây ớt chỉ thiên (Capsicum frutescens L.). - Nội dung 3: Đánh giá khả năng kích kháng đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum gloeosporioides và C.. gâ[r]
(1)VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -
PHẠM ĐÌNH DŨNG
NGHIÊN CỨU TẠO OLIGOCHITOSAN-SILICA NANO VÀ KHẢO SÁT TÍNH KÍCH KHÁNG BỆNH THÁN THƯ DO NẤM Colletotrichum spp GÂY HẠI
CÂY ỚT (Capsicum frutescens L.)
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 42 02 01
TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CƠNG NGHỆ SINH HỌC
(2)nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam
Người hướng dẫn khoa học 1: PGS TS NGUYỄN TIẾN THẮNG
Người hướng dẫn khoa học 2: PGS TS BÙI VĂN LỆ
Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: …
Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 20…
Có thể tìm hiểu luận án tại:
(3)MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết luận án
Ớt (Capsicum sp.) gia vị trồng vùng nhiệt đới, tiêu thụ khắp giới có giá trị kinh tế cao Tuy nhiên, dịch bệnh nấm, virus vi khuẩn gây ớt vấn đề gây trở ngại lớn đến trình canh tác Trong loại bệnh ớt, bệnh nấm bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng làm tổn thất từ 10 - 80% sản lượng ớt Việt Nam nước giới Ấn Độ, Thái Lan, Hàn Quốc Các loại bệnh nấm thường gặp ớt bệnh héo (Rhizoctonia solani), bệnh thán thư (Colletotrichum spp.), bệnh mốc xám (Botrytis cinerea), bệnh héo vàng (Fusarium oxysporum), bệnh sương mai (Phythopthora capsici), bệnh thán thư nấm
Colletotrichum spp gây loại bệnh phổ biến gây thiệt hại
nghiêm trọng ớt Bệnh thán thư ớt nấm Colletotrichum spp gây ra, nấm gây hại cành, lá, trái Trên vỏ trái vết bệnh lúc đầu đốm hình trịn úng nước lỏm vào bên trong, sau lan rộng dần, nặng nhiều vết hoà lẫn với bao gần hết vỏ trái khô dần chuyển sang màu nâu xám hay xám, bên có nhiều vịng đồng tâm có chấm nhỏ li ti màu đen, làm cho trái teo quắt lại khơng ăn gây rụng trái, gây thiệt hại làm giảm suất 70 - 80%
(4)đang áp dụng rộng rãi giới với mục đích giảm thiểu tối đa việc sử dụng hóa chất độc hại sử dụng giống chuyển gen Chitin silic hai nguồn nguyên liệu phổ biến tự nhiên Nhiều nghiên cứu cho thấy chitosan, oligochitosan (dẫn suất chitin) với silic silica nano dùng riêng lẻ phối hợp có hoạt tính sinh học kháng khuẩn, kháng nấm làm tăng khả chống chịu bệnh đa số loài thực vật, giúp tiết số enzyme, hoạt chất chống lại xâm nhập nấm, vi khuẩn gây bệnh; kích thích tăng trưởng phát triển trồng
Xuất phát từ lý đề tài ‘Nghiên cứu tạo oligochitosan-silica nano khảo sát tính kích kháng bệnh thán thư nấm Colletotrichum spp gây hại ớt (Capsicum frutescens L.)’ thực
2 Mục tiêu nghiên cứu luận án
- Phân lập, khảo sát khả gây bệnh định danh loài nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư ớt thiên trồng Thành phố Hồ Chí Minh, Đồng Tháp Tây Ninh - Tạo oligochitosan-silica nano sở phân đoạn chitosan có trọng lượng phân từ thấp với hạt nano silica có độ ổn định hiệu kích kháng cao bệnh thán thư ớt
- Đánh giá khả phòng trừ bệnh thán thư nấm
Colletotrichum spp gây ớt điều kiện phịng thí
nghiệm, nhà màng đồng ruộng oligochitosan-silica nano tạo
3 Các nội dung nghiên cứu luận án Luận án gồm nội dung sau:
- Nội dung 1: Phân lập, khảo sát khả gây bệnh mẫu phân lặp định danh hình thái, đặc điểm phân tử lồi nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư ớt thiên (Capsicum frutescens L.)
- Nội dung 2: Hồn thiện cơng nghệ tạo oligochitosan-silica nano
(5)gây oligochitosan-silica nano tạo ớt điều kiện phịng thí nghiệm
- Nội dung 4: Đánh giá khả kích kháng bệnh thán thư nấm C gloeosporioides C truncatum gây oligochitosan-silica nano tạo ớt trồng điều kiện nhà màng đồng
CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung ớt
Cây ớt (Capsicum sp.) thuộc họ cà (Solanaceae) có nguồn gốc từ Châu Mỹ, có dạng bụi nhỏ, thường cao 60-80 cm cao đến m; thân nhẵn, có nhiều cành; Lá mọc so le, hình thn dài, đầu nhọn; Hoa mọc đơn độc kẽ Ớt dễ trồng, khơng kén đất thích hợp với nhiều vùng sinh thái Trong vỏ ớt có chứa alkaloid capsaicin Cây ớt địi hỏi khí hậu ấm áp độ ẩm cao cho tăng trưởng thời tiết khơ q trình trưởng thành Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng phát triển ớt từ 18-30oC Nhiệt độ cao 32oC
thấp 15oC tăng trưởng hoa dễ rụng (Tripodi vả
Kumar, 2019) Chi (genus) ớt có khoảng 25-30 lồi có năm lồi (Capsicum frutescens L., C annuum L., C chinense Jacq, C pubescens Keep C baccatum L.) hóa và canh tác Hiện nay, C frutescens L loài trồng phổ biến kế C annuum L (Jaret cộng 2019) 1.2 Sơ lược nấm Colletotrichum spp bệnh thán thư trên ớt
1.2.1 Giới thiệu chung nấm Colletotrichum spp
(6)max (L.) Merr.), cà chua (Solanum lycopesicum) (Dean cộng 2012; Cannon cộng 2012) Hính 1.2
Hình 1.2 Chu trình gây bệnh nấm Colletotrichum spp
thực vật (A, B) phân loại nấm (C)
1.3 Tổng quan Cơ chế kháng kích kháng bệnh thực vật
1.3.1 Cơ chế kháng bệnh thực vật:
Có chế kháng bệnh thực vật: chế thuộc cấu trúc mơ học chế thuộc sinh hóa học (Andersen cộng 2018) Cơ chế kháng bệnh mặt mơ học có chế, tùy thuộc vào cách xâm nhập nấm gây bệnh (Shen cộng 2017) Đối với chế kháng bệnh thuộc sinh hóa học chế kháng bệnh phản ứng vi trí xâm nhiễm (Localized Acquired Resistance hay LAR) sau lan truyền đến hệ thống thực vật (Systemic Acquired Resistance hay SAR) (Gao cộng 2015) SAR (kháng hệ thống) liên kết với tác động gây nhiểm PAMPs hay DAMPs cịn MAMPs liên kết với tính kháng cảm ứng thực vật hay ISR (Induced Systemic Resistance) SAR ISR giúp thực vật chống lại công tác nhân gây bệnh (Virus, nấm, vi khuẩn hay trùng, động vật ăn cỏ, hóa chất) Các nghiên cứu sinh
Bào tử nang phát triển
(7)học phân tử cho biết elicitor hormone thực vật acid salicylic (SA), acid jasmonic (JA) Ethylen (ET) đóng vai trị quan trọng kiểm sốt mạng lưới tín hiệu tạo tính kháng thực vật SA tham gia đường SAR cịn JA, ET theo đường ISR (Imran Yun 2020)
1.3.2 Chất kích kháng bệnh (elicitor) thực vật
(8)oligosaccharide bao gồm oligoglucan, oligochitin, oligochitosan oligogalacturonic Chúng thường phân tử từ cấu tạo vách tế bào (glucan, chitin, flagellin vi khuẩn hay lipopolysaccharide (LPS), hay chất xâm nhập công tác nhân gây bệnh Một vài elicitor có chức chưa rõ Trong tương tác gây bệnh thực vật, elicitor cảm ứng sản xuất enzyme phân hủy vách tế bào, phóng thích phân đoạn pectic, oligogalacturonides (OGAs) đóng vai trị nội elicitor (Abdul-Malik cộng 2020) Hình 1.4
Hình 1.4 Cơ chế kháng bệnh nấm thực vật (A) chế
kích kháng chitin (B)
(9)1.4 Chitin/Chitosan Silic kích kháng bệnh trồng
1.4.1 Vai trò chitin/chitosan kích kháng bệnh
(10)và oligochitin cho kích kháng bệnh thực vật cho thấy chế kích kháng bệnh chitin thơng qua đường PTI với vai trò thụ quan kinase chitin tương tác chitin thực vật (Hình 1.4B) Chitin liên kết với tiểu phần thụ quan CEBiP (Chitin elicitor binding protein, motif lysine hay LYM) CERK1 (Chitin elicitor receptor kinase 1) màng tế bào mở đầu đường truyền tín hiệu RLCK (Receptor Like cytoplasmic Kinase) dẫn truyền đến RLCK185 qua phosphoryl hóa MAPKK (Mitogen activated ptotein kinase) theo tầng để cảm ứng tính kháng bệnh thực vật từ chitin Một chế tương tự tìm thấy thụ quan PBL27
Arabidopsis thaliana Trong thí nghiệm phân đoạn
oligochitin (DP = - 8) tìm thấy thích hợp cho đường truyền tín hiệu Arabidopsis thaliana (Kawasaki cộng 2017) Kết dựa mơ hình thực khẳng định vai trị kích kháng thực vật chitin
1.4.2 Vai trị Silic kích kháng bệnh
(11)enzyme phòng vệ liên quan polyphenoloxidase, peroxidase, phenylalanine ammonialyase, chitinase, β-1,3-glucanase …; gia tăng hợp chất kháng nấm, sản phẩm chuyển hoá phenolic (lignin), flavonoid, phytoalexin protein liên quan bệnh thực vật; kích hoạt số gen phịng bệnh thực vật (Epstein 2009)
1.5 Chế tạo oligochitosan, nano silica ứng dụng kích kháng bệnh
Sự kết hợp chitosan/oligochitosan với kim loại khác vàng, bạc hay kẽm (hạt nano) cho thấy có nhiều hiệu hiệu ứng phối hợp áp dụng rộng rải nhiều lĩnh vực khác y học, thực phẩm nông nghiệp
CHƯƠNG NỘI DUNG & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nội dung nghiên cứu
* Nội dung 1: Phân lập, khảo sát khả gây bệnh mẫu phân lặp định danh hình thái, đặc điểm phân tử lồi nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư ớt thiên
- Phân lập nấm gây bệnh thán thư ớt
-Thí nghiệm 1: Đánh giá khả gây bệnh mẫu phân lập nấm bệnh điều kiện phịng thí nghiệm
-Thí nghiệm 2: Đánh giá khả gây bệnh mẫu phân lập nấm bệnh điều kiện nhà màng
- Định danh hình thái sinh học phân tử loài nấm
Colletotrichum spp gây bệnh thán thư ớt phân lập
* Nội dung 2: Hồn thiện cơng nghệ tạo oligochitosan-silica nano
- Điều chế phân đoạn oligochitosan
- Đánh giá khả ức chế nấm bệnh thán thư C
gloeosporioides phân đoạn oligochitosan điều chế
- Điều chế hạt nano silica từ vỏ trấu - Điều chế oligochitosan-silica nano
(12)oligochitosan-silica nano ớt điều kiện phịng thí nghiệm
- Thí nghiệm 4: đánh giá khả kích kháng nấm C
gloeosporioides C truncatum oligochitosan
- Thí nghiệm 6: đánh giá khả kích kháng nấm C
gloeosporioides C truncatum nano silica
- Thí nghiệm 8: đánh giá khả kích kháng nấm C
gloeosporioides C truncatum oligochitosan-silica nano
* Nội dung 4: Đánh giá khả kích kháng bệnh thán thư do nấm C gloeosporioides C truncatum gây oligochitosan-silica nano ớt trồng điều kiện nhà màng đồng ruộng
- Thí nghiệm 10: đánh giá khả kích kháng nấm C
gloeosporioides C truncatum oligochitosan điều
kiện nhà màng
- Thí nghiệm 11 12: đánh giá khả kích kháng nấm C
gloeosporioides C truncatum nano silica điều kiện
nhà màng
- Thí nghiệm 13 14: đánh giá khả kích kháng nấm C
gloeosporioides C truncatum oligochitosan-silica nano
trong điều kiện nhà màng
- Thí nghiệm 15 16: đánh giá khả kích kháng nấm C
gloeosporioides C truncatum oligochitosan điều
kiện đồng ruộng
- Thí nghiệm 17 18: đánh giá khả kích kháng nấm C
gloeosporioides C truncatum nano silica điều kiện
đồng ruộng
- Thí nghiệm 19 20: đánh giá khả kích kháng nấm C
gloeosporioides C truncatum oligochitosan-silica nano
trong điều kiện đồng ruộng
Nội dung chi tiết theo sơ đồ sau:
Nội dung
Nội dung
Kết tốt từ ND 1,
(13)2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Nội dung Phân lập, khảo sát khả gây bệnh định danh chủng nấm gây bệnh thán thư nấm Colletotrichum spp ớt
2.2.1.1 Phương pháp phân lập nấm gây bệnh thán thư ớt
- Phân lập nấm sử dụng môi trường PDA
2.2.1.2 Đánh giá khả gây bệnh chủng nấm bệnh đã phân lập điều kiện phịng thí nghiệm nhà màng
- Khả gây bệnh chủng nấm bệnh đánh giá theo cấp độ bệnh lá/trái theo QCVN 01-160:2014/BNNPTNT
2.2.1.3 Định danh hình thái sinh học phân tử chủng nấm gây bệnh
-Định danh hình thái chủng nấm bệnh dựa theo Sutton (1992) Định danh sinh học phân tử kỹ thuật PCR dựa vào tham khảo trình tự mồi khuếch đại vủng gene đặc trưng của nấm ( ITS4,5; GPDH; TUB2; GS; CHS CAL)
2.2.2 Nội dung2 Hồn thiện cơng nghệ tạo oligochitosan-silica nano (SiO2)
2.2.2.1 Điều chế phân đoạn oligochitosan có trọng lượng phân tử thấp phương pháp xạ tia xác định liều lượng chiếu xạ tia ɣ Co60 kết hợp với H2O2
Phương pháp điều chế phân đoạn oligochitosan có trọng lượng phân tử thấp (2,5 kDa-10 kDa), khảo sát số đặc trưng tính chất phân đoạn (IR XRD)
Phương pháp đánh giá khả ức chế nấm bệnh phân đoạn oligochitosan cách đo hoạt lực ức chế đưởng kính (mm) khuẩn lạc nấm Colletotrichum sp phát triển môi trường PDA có hay khơng có bổ sung phân đoạn oligochitosan điều chế
2.2.2.2 Điều chế hạt silica nano từ nguồn vỏ trấu
Phương pháp nung nhiệt độ cao 700oC kế hợp HCl 5-10%
(14)2.2.2.3 Điều chế hỗn hợp oligochitosan-silica nano
Dùng phương pháp phối trộn nguyên liệu oligochitosan silica nano độ bền pH thích hợp (5; 6,5; 7,5; 8,5) kết hợp với chất tạo đặc HEC (Hydroxylethylcellulose) khảo sát tính chất chế phẩm tạo hành (TEM, FT-IR)
2.2.3 Nội dung3 Đánh giá khả kích kháng bệnh nấm Colletotrichum spp oligochitosan-silica nano ớt trong điều kiện phòng thí nghiệm
2.2.3.1 Đánh giá tình hình bệnh thán thư nấm Colletotricum spp ớt
- Thí nghiệm xác định yếu tố ảnh hưởng đến hiệu kích kháng bệnh phịng thí nghiệm thực vỉ xốp loại 50 lỗ (55 cm x30 cm x5 cm) Cây giai đoạn chuyển sang ly nhựa trồng phòng sinh trưởng điều kiện 16 sáng/ngày với nhiệt độ khoảng 28oC±2oC Cây
ớt xử lý nấm bệnh chế phẩm theo nghiệm thức trước phân tích
2.2.4 Nội dung Đánh giá khả kháng nấm Colletotrichum spp oligochitosan-silica nano ớt trong điều kiện nhà màng đồng ruộng
Thí nghiệm nhà màng đồng ruộng bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, yếu tố lần lặp lại Mỗi nghiệm thức bố trí 30 ớt/lần lặp lại Số thí nghiệm nghiệm thức x lần lặp lại = 15 ô Mỗi thí nghiệm có diện tích 20 m2, tổng diện tích thí nghiệm 900 m2
2.2.5 Xử lý số liệu
Số liệu phân tích phương sai ANOVA trắc nghiệm phân hạng Duncan với xác suất tin cậy P < 0,01 chương trình SAS 9.1
(15)CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Phân lập, khảo sát khả gây bệnh định danh loài nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư ớt thiên (Capsicum frutescens L.)
Tổng cộng thu thập 20 mẫu bệnh thán thư hại ớt (trên thân, trái) ruộng ớt sản xuất Củ Chi (Thành phố Hồ Chí Minh), Thanh Bình (Tỉnh Đồng Tháp) Tân Châu (Tỉnh Tây Ninh) Kết ghi nhận cho thấy có 20 mẫu phân lập nấm Colletotrichum spp dựa khóa phân loại Sutton (1992) [103] với đặc điểm: hệ sợi nấm khí sinh mọc bung mặt thạch hay mọc sát mặt thạch Tản nấm có dạng hình hoa hay hình trịn Tản nấm có màu trắng, cam nhạt đến màu hồng hay màu nâu xám đến xám đen; mép gợn sóng hay mép cong trịn Xuất hạch nấm màu đen bề mặt hệ sợi nấm Bào tử có dạng từ hình trụ, hai đầu trịn, đầu nhọn đầu tròn hay hai đầu nhọn, đến dạng bào tử hình thoi nhọn hai đầu hay bào tử có dạng hình liềm Ổ bào tử dạng giọt dầu màu cam đến đen Đĩa cành có khơng có lơng gai Bào tử nảy mầm sau 12 giờ, hình thành giác bám sau 24 giờ, giác bám có dạng hình trịn, hình trụ, hình thùy, hình trứng ngược hay bất định, có khơng có phân thùy Lúc hình thành giác bám khơng màu sau có màu nâu đến nâu đen, bề mặt trơn hay gồ ghề Kết lây nhiễm chủng nấm Colletotrichum spp phân lập mẫu trái điều kiện phịng thí nghiệm cho thấy có 20 chủng nấm
Colletotrichum spp gây bệnh trái điều kiện gây
vết thương có mẫu nấm gây bệnh điều kiện không gây vết thương sau ngày NSLN TN-Tr2 TN-L3, TN-Th1, ĐT-Th1.Kết lây nhiễm chủng nấm
Colletotrichum spp phân lập mẫu cho thấy,
(16)năng gây bệnh chủng nấm Colletotrichum spp giống ớt thiên điều kiện nhà màng cho thấy mẫu phân lập TN–L3, HCM-Tr2, TN-Tr2, HCM-L2, TN-Th1 ĐT-Th1 có khả gây bệnh ớt thí nghiệm cao Sự khác biệt nghiệm thức thí nghiệm có ý nghĩa mặt thống kê
TN-Tr2 HCM-Tr2
Hình 3.2 Đặc trưng hình thái Colletotrichum gloeosporioides qua mẫu
TN-Th1 HCM-L2 ĐT-Th1
Hình 3.3 Đặc trưng hình thái Colletotrichum truncatum qua
các mẫu
(17)học phân tử cho kết mẫu phân lập TN-Tr2 HCM-Tr2 thuộc phức hợp loài Colletotrichum gloeosporioides mẫu phân lập TN-Th1, TN-L3, HCM-L2 ĐT-Th1
Colletotrichum truncatum
Bảng 3.6 Kết định danh lồi Colletotrichum spp dựa vào
trình tự vùng gen
Tên mẫu/
Vùng gen TN-Tr2 (1) HCM-Tr2 (2) ĐT-TH1 (3) TN-TH1 (4) HCM-L2 (5) TN-L3 (6)
ITS (I) C.gloeosporioides C scovillei C truncatum C truncatum C truncatum C truncatum
ACTIN (A) C siamense C siamense C truncatum C truncatum C truncatum C truncatum
GAPDH (G) C siamense C scovillei C truncatum C truncatum C truncatum C truncatum
TUBULIN (T) C siamense C scovillei C truncatum C truncatum C truncatum C truncatum
GS (S) C gloeosporioides C acutatum C truncatum C truncatum C truncatum C truncatum
CHS (C) C fructicola C scovillei C truncatum C truncatum C truncatum C truncatum
CAL (L) C siamense C scovillei C siamense C siamense C siamense C siamense
3.2 Hồn thiện cơng nghệ tạo oligochitosan-silica nano
3.2.1 Điều chế oligochitosan có trọng lượng phân tử thấp bằng phương pháp xác định liều lượng chiếu xạ tia ɣ Co60 kết hợp với H2O2
Khi tăng liều xạ, khối lượng phân tử (KLPT) chitosan giảm xuống mẫu dung dịch chitosan 4% có khơng có H2O2 (Bảng 3.7) Khi có mặt H2O2, mức độ suy giảm
KLPT chitosan nhanh so với dung dịch khơng có H2O2
và mức độ suy giảm tăng hàm lượng H2O2 tăng từ 0,5 đến
1% Từ kết Bảng 3.7, chọn 02 mẫu oligochitosan từ dung dịch chitosan 4%/H2O2 1%, chiếu xạ liều 10,5 17,5
kGy có KLPT tương ứng 7,7 kDa 4,6 kDa dùng cho thí nghiệm ức chế nấm bệnh thực vật
Bảng 3.7 Sự suy giảm KLPT chitosan dung dịch 4%
có khơng có H2O2 theo liều xạ
Liều xạ, kGy CTS 4% CTS 4%/H2O2 0,5% CTS 4%/H2O2 1%
0 44,500 44,500 44,500
3,5 19,000 17,900 16,700
7,0 14,800 12,600 10,500
10,5 12,300 9,000 7,700
14,0 10,500 6,600 5,500
17,5 9,100 5,500 4,600
(18)Bảng 3.8 Độ ĐĐA% số đa phân tán (PI) chitosan
Liều xạ, kGy
CTS 4% CTS 4%/H2O2 0,5% CTS 4%/H2O2 1%
ĐĐA % PI ĐĐA % PI ĐĐA % PI
0 91,3 3,37 91,3 3,37 91,3 3,37
3,5 90,2 2,63 89,9 2,78 89,6 2,69
7,0 89,4 2,60 89,1 2,52 88,5 2,55
10,5 89,0 2,56 88,6 2,48 87,7 2,31
14,0 88,7 2,49 88,0 2,18 86,2 1,95
17,5 88,5 2,43 87,6 1,97 85,9 1,81
21,0 88,3 2,30 87,2 1,88 85,6 1,71
Kết Bảng 3.8 cho thấy mẫu chitosan 4%/H2O2 1%,
liều xạ 21 kGy, ĐĐA giảm từ 91,3% chitosan trước chiếu xạ xuống thấp 85,6% KLPT chitosan oligochitosan nhỏ số PI thấp chứng tỏ độ phân tán hẹp đồng mẫu chitosan ban đầu (PI=3,37) Với nồng độ chitosan nhỏ hơn, cụ thể 2% mức độ suy giảm KLPT theo liều xạ nhanh so với dung dịch chitosan nồng độ cao (4%) Từ kết bảng 3.9, lựa chọn mẫu oligochitosan có KLPT 2,5 kDa nhận liều xạ 21 kGy dùng để thí nghiệm kích kháng ớt
Bảng 3.9 KLPT (Mw), PI ĐĐA chitosan dung
dịch 2%/ H2O2 0,5% theo liều xạ
Liều xạ, kGy KLPT, Mw ĐĐA % PI
0,0 44.500 91,3 3,37
3,5 11.900 90,7 2,90
7,0 6.300 89,4 2,33
10,5 4.400 88,1 1,63
14,0 3.500 87,6 1,40
17,5 2.900 86,4 1,32
21,0 2.500 85,9 1,25
(19)Đã lựa chọn 03 mẫu oligochitosan với KLPT là: 7,7 kDa; 4,6 kDa 2,5 kDa để làm thí nghiệm kích kháng bệnh tăng trưởng ớt Mẫu oligochitosan dùng để tạo hỗn hợp vật liệu lai với nano (SiO2) chế tạo từ vỏ trấu Các
kết khảo sát cho thấy phân đoạn Oligochitosan (4,6 kDa) nồng độ 0,1% có khả ức chế nấm Colletotrichum spp thích hợp ba phân đoạn Oligochitosan khảo sát
Hình 3.6 Phổ hồng ngoại (IR) nhiễu xạ tia X (XRD)
mẫu chitosan (a) phân đoạn oligochitosan 7,7 kDa (b); 4,6 kDa (c) 2,5 kDa (d)
3.2.2 Điều chế hạt nano silica (SiO2) từ nguồn vỏ trấu
Vỏ trấu xử lý với axít nung tạo nano SiO2 màu trắng
độ tinh khiết cao Hiệu suất tạo nano SiO2 từ vỏ trấu xử lý
thống kê là: 10,21± 0,38% (Bảng 3.15) Kích thước hạt nano SiO2 chế tạo khoảng 10-30 nm
Bảng 3.15 Hiệu suất tạo nano silica từ vỏ trấu xử lý với axít
5%
Mẫu Vỏ trấu (g) nano-SiO2 (g) Hiệu suất (%)
1 0,5105 10,33
2 0,5022 10,04
3 0,5128 10,26
Kết (theo Hình 3.8A, B) cho thấy kích thước hạt nano silica chế tạo nung vỏ trấu 700oC, khoảng 10 -
(20)nhiễu xạ tia X nano silica Hình 3.8D cho thấy có đỉnh 2 ~22o Thí nghiệm dùng vỏ trấu (không phải than đốt
từ vỏ trấu) xử lý với acid HCl trước nung, tạp chất oxíd kim loại loại bỏ Mặc dù nano silica tạp chất Al2O3 (k đỉnh 1.486 keV) với hàm
lượng ~0,7% tính theo thành phần nguyên tử Các giá trị k Silicon (Si) oxy (O) phổ EDX tương ứng 1,739 0,525 keV (Hình 3.8E) Kết nầy tương tự với cấu trúc vơ định hình nano silica nhận từ nung vỏ trấu
Hình 3.8 Hình chụp TEM (A, B); phân bố kích thước hạt đo
bằng phương pháp tán xạ laser (C); giản đồ XRD (D) EDX (E) hạt nano silica điều chế
Kết luận: Đã chế tạo nano silica theo phương pháp nung vỏ trấu xử lý với acid để loại bỏ tạp chất chủ yếu ion kim loại Kích thước hạt nano silica nhận khoảng 10 - 30 nm với đặc trưng cấu trúc pha vơ định hình có đỉnh nhiễu xạ tia X góc 2 ~22o Sản phẩm nano silica nhận
(21)dùng cho thí nghiệm kích kháng bệnh tăng trưởng ớt
3.2.3 Điều chế hỗn hợp oligochitosan-silica nano
Quan sát kết phối trộn nano silica với oligochitosan tạo gel xảy (Hình 3.9A giữa) Tuy nhiên gel tạo thành có độ bền khác tùy thuộc theo điều chỉnh pH hỗn hợp dung dịch oligochitosan-silica nano Kết cho thấy pH thấp 6,5 hỗn hợp dung dịch oligochitosan-silica nano tạo gel không tốt bị lắng, pH 7,5 tạo gel bền đồng (Hình 3.9D) Kết quan sát hiệu ứng pH phù hợp vớp kết nghiên cứu Tiraferri cộng (2014) ảnh hưởng pH lên mức độ hấp phụ chitosan lên bề silica Nhằm gia tăng độ ổn định gel dung dịch hỗn hợp oligochitosan-silica nano cho mục đích ứng dụng thực tiễn, HEC thêm vào với nồng độ 1% (w/v) (Hình 3.8E) Quan sát theo thời gian cho thấy dung dịch hỗn hợp oligochitosan-silica nano thêm 1% HEC có độ ổn định gel tốt so với hỗn hợp không thêm HEC Ảnh TEM Hình 3.9G cho thấy nano silica phân bố dung dịch oligochitosan với kích thước có phần biến dạng so với nano silica dạng tinh khiết Phổ FTIR silica nano Hình 3.8B cho thấy giải số sóng khoảng 3416-3454/cm đặc trưng cho dao động co giãn nhóm silanol bề mặt (Si−O−H) silica hấp thụ nước (Yan cộng 2015) Đặc trưng dao động bất đối xứng khung silica (Si−O−Si) bao gồm dao động co giãn bất đối xứng (asymmetric stretching vibration) đỉnh 1.101/cm, dao động co giãn đối xứng (symmetric stretching vibration) đỉnh 802/cm dao động uốn (bending vibration) đỉnh 467/cm Ngồi ra, Phổ FTIR cịn xuất đỉnh 1.635/cm, theo tác giả cơng trình (Wang cộng 2011) đỉnh đặc trưng cho giao động uốn liên kết H−O−H liên quan đến phân tử nước bị bẫy (trapped water moleces) cấu trúc matrix nano silica
(22)động co giãn bất đối xứng nhóm (C−O−C) đặc trưng đỉnh 1.153/cm đỉnh dao động co giãn nhóm (C−O) đặc trưng chung cho polysacarit xuất đỉnh 1.031 1.074/cm Nhóm (OH) dao động đặc trưng vùng số sóng 3.420 – 3.450/cm
Phổ FTIR hỗn hợp oligochitosan-silica nano Hình 3.9F cho thấy xuất đỉnh 1.083/cm 781/cm đặc trưng cho liên kết Si−O−C, đỉnh không xuất phổ FTIR oligochitosan nano silica Ngoài phổ đồ FTIR hỗn hợp oligochitosan-silica nano (Hình 3.9I) cịn xuất thêm đỉnh 927/cm đặc trưng cho liên kết Si−O−H trình tạo liên kết hydro nhóm silanol nano silica nhóm –NH2, −OH oligochitosan (Kim
Rajapakse, 2005) Nói chung đưa silica nano vào dung dịch oligochitosan cường độ đỉnh đặc trưng chitosan bao gồm nhóm (N−H) giảm số sóng thấp so với oilgochitosan tinh khiết tương tác bề mặt oilgochitosan với pha vơ nano silica
Hình 3.9 Sự phối trộn tạo gel tạo chế phẩm (A), khảo sát độ
bền gel theo pH 5; 6,5; 7,5; 8,5 (D) thành phẩm pH 7,5 1% HEC (E) Các tính chất chế phẩm tạo thành hình chụp TEM
(23)3.3 Khả kích kháng bệnh thán thư nấm
Colletotrichum gloeosporioides C truncatum gây
oligochitosan-silica nano ớt trồng điều kiện phòng thí nghiệm
Kết cho thấy phun oligochitosan nồng độ 25 đến 100 ppm cho kết tỷ lệ bệnh số bệnh thấp so với hai đối chứng Điều khẳng định rằng, oligochitosan có ảnh hưởng rõ đến tỷ lệ bệnh thán thư ớt, phun oligochitosan nồng độ 25 ppm giai đoạn 14 ngày sau xử lý cho tỷ lệ bệnh thấp giai đoạn 21 ngày sau xử lý, tỷ lệ bệnh lại có xu hướng tăng nhẹ trở lại Về silica nano oligochitosan-silica nano có ảnh hưởng rõ đến bệnh thán thư từ nồng độ 25-100 ppm cho tỷ lệ bệnh số bệnh thấp hai đối chứng Điều khẳng định oligochitosan-silica nano có tác động đến tỷ lệ bệnh số bệnh thán thư, tùy giai đoạn xử lý khác có tác động khác
3.4 Khả kích kháng bệnh thán thư nấm
Colletotrichum gloeosporioides Colletotrichum truncatum
gây oligochitosan-silica nano ớt trồng điều kiện nhà màng đồng ruộng
Đánh giá khả kích kháng bệnh thán thư gây nấm C
gloeosporioides C truncatum ớt
oligochitosan-silica nano suốt thời điểm sinh trưởng phát triển ớt trồng nhà màng đồng ruộng điều cần thiết Đặc biệt thời điểm có trái định đến suất chất lượng sản phẩm trái ớt sau thu hoạch
3.4.1 Khả kích kháng bệnh thán thư C gloeosporioides gây oligochitosan-silica nano ớt trồng điều kiện nhà màng
Kết khảo sát khả ức chế nấm bệnh C
gloeosporioides qua khảo sát chi tiêu tỉ lệ bệnh, số
(24)silica nano nồng độ 50 ppm 100 ppm cho kết tốt nhất; phun oligochitosan-silica nano từ 25-100 ppm có tính kháng bệnh có ảnh hưởng đến suất ớt sau thu hoạch, đó, kết đạt tốt phun oligochitosan-silica nano nồng độ 50 ppm
3.4.2 Khả kích kháng bệnh thán thư Colletotrichum truncatum gây oligochitosan-silica nano ớt trồng điều kiện nhà màng
Qua tiêu theo dõi thí nghiệm, phun oligochitosan có tác động đến tình hình bệnh thán thư suất ớt Trong đó, phun oligochitosan nồng độ 25 ppm cho kết tốt qua tiêu theo dõi Đối với nano silica, phun nano silica có tác động đến tình hình bệnh thán thư tình hình sinh trưởng phát triển ớt Trong đó, phun nano silica nồng độ 100 ppm cho kết tốt Khi phun oligochitosan-silica nano có tác động đến tình hình bệnh thán thư trái tình hình sinh trưởng phát triển ớt Trong đó, phun oligochitosan-silica nano nồng độ 50 ppm cho kết tốt
3.4.3 Đánh giá khả kích kháng bệnh thán thư C gloeosporioides gây oligochitosan-silica nano ớt trồng đồng ruộng
Qua tiêu bệnh tiêu yếu tố cấu thành suất suất cho thấy: Oligochitosan có tác động rõ đến tính kháng bệnh thán thư tác động đến sinh trưởng phát triển ớt Các nồng độ oligochitosan khác có tác động khác nhau, phun oligochitosan nồng độ 25 ppm cho kết tốt
(25)3.4.4 Đánh giá khả kích kháng bệnh thán thư C truncatum gây oligochitosan-silica nano ớt trồng đồng ruộng
Qua tiêu theo dõi thí nghiệm, thí nghiệm có phun oligochitosan, nano silica oligochitosan- silica nano có tác động đến tình hình sinh trưởng phát triển ớt Trong đó, phun oligochitosan nồng độ 25 ppm cho kết tốt Đối với nano silica, có tác động đến tính kháng bệnh thán thư tình hình sinh trưởng phát triển ớt Trong đó, phun nano silica nồng độ 50 100 ppm cho kết tốt Đối với oligochitosan-silica nano, thí nghiệm có tác động đến tính kháng bệnh thán thư trái tình hình sinh trưởng phát triển ớt; phun oligochitosan- silica nano nồng độ 50 ppm cho kết tốt
Theo kết nghiên cứu thu được, việc ứng dụng vật liệu oligochitosan-silica nano thực tiễn khả thi Việc sử dụng loại vật liệu có tính kích kháng thực vật xu hướng nông nghiệp để ứng dụng sản xuất Hiệu phòng bệnh loại chế phẩm sản xuất luận án tương đương so với phương pháp sử dụng thuốc hóa học truyền thống Do vậy, khả ứng dụng sản phẩm chế tạo luận án vào thực tiễn lớn Tuy nhiên cần phải tiếp tục thử nghiệm diện rộng
(26)KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN
Đã phân lập định danh 20 mẫu nấm bệnh thán thư ớt tiến hành định danh hình thái dựa theo Sutton (1992), mẫu phân lập thuộc hai nhóm phức hợp lồi Colletotrichum
gloeosporioides C truncatum Kết phân loại dựa
trình tự vùng gen chuyên biệt thực mẫu nấm có độc lực cao (TN-L3, TN-Tr2, TN-Th1, HCM-Tr2, HCM-L2, ĐT-Th1)
Đã thu phân đoạn oligochitosan có phân từ thấp (7,7 kDa; 4,6 kDa 2,5 kDa) kiểm tra hoạt tính kháng nấm bệnh cao phân đoạn oligochitosan (0,5 - 1%) điều chế thành công hạt nano silica kích thước 30 nm từ vỏ trấu dùng làm vật liệu cho chế tạo hỗn hợp dung dịch oligochitosan-silica nano bền pH 7,5 với chất làm đặc HEC (1%) khảo sát số đặc trưng tính chất vật liệu oligochitosan, silica nano hỗn hợp oligochitosan-silica nano
Kết bước đầu hiệu ứng tăng trưởng yếu tố có liên quan đến kích kháng bệnh vật liệu cho thấy thể ứng kích kháng bệnh tốt thơng qua biểu hoạt chất liên quan đến tính kích kháng hoạt tính enzyme chitinase, β1,3 glucanase, tích lũy capsidiol hay salicylic acid jasmonic acid, cụ thể phun oligochitosan-silica nano nồng độ 50 - 100 ppm 21 ngày sau xử lý
Kết đánh giá tính kích kháng bệnh thán thư điều kiện nhà màng:
+ Đối với nấm C gloeosporioides: Qua tiêu theo dõi bệnh tiêu cấu thành suất suất, kết đạt tốt phun oligochitosan 25 ppm nano silica 100 ppm oligochitosan-silica nano 50 ppm
(27)Kết đánh giá tính kích kháng bệnh thán thư trồng đồng ruộng:
+ Đối với nấm C gloeosporioides: Qua tiêu theo dõi bệnh tiêu cấu thành suất suất, kết đạt tốt phun oligochitosan 25 ppm; nano silica 50, 100 ppm oligochitosan-silica nano 50 ppm + Đối với nấm C truncatum: Qua tiêu theo dõi bệnh tiêu cấu thành suất suất, kết đạt tốt phun oligochitosan 25 ppm; nano silica 100 ppm; oligochitosan-silica nano 50 ppm
ĐỀ NGHỊ
Bước đầu ứng dụng sử dụng oligochitosan-silica nano kích kháng bệnh thán thư Colletotrichum spp ớt thiên Trong trình trồng ớt nhà màng hay đồng ruộng, phun oligochitosan-silica nano nồng độ 50 ppm Tiến hành phun oligochitosan-silica nano lần cách ngày, thời điểm phun lần đầu vào khoảng thời gian chuẩn bị hoa (25 ngày sau trồng - NST) để hạn chế bệnh thánh thư gây hại lá, trái giúp làm tăng suất ớt
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
- Luận án hoàn thiện quy trình sản xuất oligochitosan-silica nano ứng dụng sản xuất quy mô công nghiệp:
+ Tạo oligochitosan có khối lượng phân tử nhỏ (7,7; 4,6 2,5 kDa) phương pháp chiếu xạ dung dịch 4% chitosan/0,5% H2O2 dung dịch 2% chitosan/0,5% H2O2;
+ Tạo vật liệu nano silica có độ tinh khiết cao phương pháp thiêu kết vỏ trấu xử lý loại bỏ thành phần khoáng + Tạo oligochitosan-silica nano bền pH gần trung tính (pH ~ 7,5)
- Luận án ứng dụng oligochitosan-silica nano tạo kích kháng bệnh thán thư nấm C gloeosporioides C
truncatum ớt thiên trồng Thành phố Hồ Chí
(28)DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1 Pham Dinh Dzung, Dang Van Phu, Bui Duy Du, Le Si Ngoc, Nguyen Ngoc Duy, Hoang Dac Hiet, Dang Huu Nghia, Nguyen Tien Thang, Bui Van Le, Nguyen Quoc Hien, Effect of foliar
application of oligochitosan with different molecar weight on growth promotion and fruit yield enhancement of chili plant,
Plant Production Science, 2017, 20 (1), 1-7
2 Pham Dinh Dzung, Le Thanh Hung, Le Si Ngoc, Hoang Dac Hiet, Bui Van Le, Nguyen Tien Thang, Dang Van Phu, Nguyen Ngoc Duy, Nguyen Quoc Hien, Induction of anthracnose
disease resistance on chili fruit by treatment of oligochitosan— nano hybrid material, Agrictural Sciences, 2017, (10),
1105-1113
3 Phạm Đình Dũng, Nguyễn Tiến Thắng, Dương Hoa Xô, Lê Quang Luân, Nghiên cứu hiệu lực kháng nấm Collectotrichum
capsici gây bệnh thán thư ớt phân đoạn oligochitosan chế tạo phương pháp chiếu xạ kết hợp xử lý hóa học, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 2017, 15 (1), 105-112
4 Pham Dinh Dung, Le Si Ngoc, Nguyen Ngoc Thuy, Lu Thi Minh Truc, Bui Van Le, Dang Van Phu, Nguyen Ngoc Duy, Nguyen Quoc Hien, Effect of nanosilica from rice husk on the
growth enhancement of chili plant, Tạp chí Khoa học Công