Using cellulose binding module of CBM3A as the purification tag for secreted Endoglucanase A (CelA) in Bacillus subtilis.. Nguyen Hoang Ngoc Phuong Nguyen Thanh Phuoc Pham[r]
(1)Tạo dòng biểu hiện tiết khảo sát khả
năng sử dụng đuôi CBM3a để tinh chế
Endoglucanse A Bacillus subtilis
Nguyễn Hoàng Ngọc Phương
Nguyễn Thành Phước
Phạm Lương Thắng
Nguyễn Đức Hoàng Trần Linh Thước
Phan Thị Phượng Trang
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM
(Bài nhận ngày 27 tháng 07 năm 2015, nhận đăng ngày 06 tháng 05 năm 2016)
TÓM TẮT
Các phương pháp tinh chế protein tái tổ hợp
truyền thống có giá thành cao khơng phù hợp
khi áp dụng tinh chế protein dạng tiết với lượng
thể tích lớn Cellulose Binding Module 3a (CBM3a) thuộc phức hệ cellulosome từ chủng
Clostridium thermocellum module có lực cao với chất cellulose Như vậy, dung
hợp protein mục tiêu với CBM3a nhờ vào lực CBM3a với chất cellulose giúp tinh
chế protein mục tiêu với giá thành thấp
Các khảo sát ứng dụng CBM3a tinh chế
protein tái tổ hợp trước đa phần thực
hiện hệ thống biểu nội bào Việc thu nhận protein từ dịch tiết sử dụng chế phẩm
thơ từ dịch tiết giúp q trình sản xuất protein tái tổ hợp quy mô lớn thuận lợi đạt hiệu kinh tế cao Trong nghiên cứu này,
chúng sử dụng hệ thống plasmid pHT để khảo
sát tinh chế protein thị CelA (endoglucanase
A) dung hợp với CBM3a dạng tiết Bacillus subtilis WB800N Kết khảo sát cho thấy protein CelA tiết môi trường nuôi
cấy tinh chế thơng qua việc gắn kết CBM3a lên chất Regenerated Amorphous
Cellulose (RAC) Nghiên cứu làm tiền đề cho
các nghiên cứu sâu khả ứng dụng CBM3a làm đuôi tinh chế protein tái tổ hợp hệ thống biểu B subtilis.
Từ khóa: Bacillus subtilis, Cellulose Binding Module, Clostridium thermocellum, endoglucanase A, tinh chế protein
MỞ ĐẦU
Để thủy phân cellulose, vi khuẩn kị khí, ưa
nhiệt C thermocellum sử dụng phức hệ
cellulosome có cấu tạo gồm giá đỡ CipA enzyme phụ trợ [3] CBM3a module thuộc protein khung CipA giúp phức hệ cellulosome
gắn vào sợi cellulose Các biện pháp tinh chế
protein tái tổ hợp sử dụng phổ biến
thường có chi phí cao hiệu suất thấp giá thành vật liệu cao hóa chất đắt tiền Sajjad cộng [3] chứng minh CBM3a dung hợp với CelA hệ thống biểu nội bào Escherichia coli giữđược hoạt tính có
thểbám lên chất cellulose giá rẻ Regenerated
(2)nghiên cứu khác cho thấy tinh chế protein GFP dung hợp với CBM3a ởE coli cho hiệu suất tinh chế cao, g RAC có khảnăng hấp phụ 365 mg protein GFP dung hợp với CBM3a Việc tách protein tái tổ hợp khỏi RAC dễ dàng tốn chất có tính hoạt động bề mặt
ethylene glycol glycerol [5] Ngoài ra, có nghiên cứu chứng minh sử dụng CBM3-tag việc tinh chế protein dung hợp CBM3-intein-EGFP (enhanced green fluorescent protein) nấm men Pichia pastoris [11] Do đó,
CBM nghiên cứu để triển khai
ứng dụng sản xuất, tinh chế protein tái tổ
hợp đặc biệt qui mô sản xuất lớn tinh
chế protein từ dịch ni cấy tích lớn Hệ thống biểu ngoại bào B subtilis với ưu điểm như: (i) chủng vi sinh vật an tồn; (ii) có khảnăng lên men mật độ cao; (iii) có khảnăng hiệu tiết protein tế bào giúp dễ dàng cho việc tinh chế protein mục tiêu [1, 9, 10] Tuy nhiên, đuôi dung hợp thường
bị chủng chủ loại bỏ, chủng B subtilis
WB800N với đột biến bất hoạt protease ngoại
bào sử dụng nhằm tăng cường hiệu biểu
hiện Bên cạnhđó, promoter Pgrac cảm ứng cho
B subtilis [8] dung hợp từ promoter mạnh groESL có nguồn gốc từ B subtilis với lac operator (lacO) từE coli, sử dụng chất cảm ứng
là isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG),
cho khảnăng biểu protein mục tiêu lên đến 15 % protein tổng số, gấp 50 lần so với Pspac
[9] Để ứng dụng đặc tính bám chất
cellulose CBM3a tinh chế protein tái tổ
hợp hệ thống biểu B subtilis, trong nghiên cứu CBM3a dung hợp với protein CelA nhằm khảo sát khảnăng biểu tiết protein tái tổ hợp nghiên cứu đặc tính bám protein tái tổ hợp CBM3a-CelA lên
chất RAC Nghiên cứu làm tiền đề cho nghiên cứu ứng dụng đuôi tinh chế CBM3a biểu hiện, tinh chế protein tái tổ hợp dạng
nội bào ngoại bào hệ thống biểu B subtilis
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Chủng vi sinh vật, plasmid môi trường nuôi cấy
Chủng E coli OmniMAXTM(F′ {proAB+
lacIqlacZΔM15Tn10(TetR) Δ(ccdAB)} mcrAΔ
(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80(lacZ)ΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169endA1recA1supE44 thi-1gyrA96relA1tonApanD) (Invitrogen) [6] sử dụng làm chủng chủtrong bước dịng hóa Chủng B subtilis WB800N đột biến loại bỏ protease ngoại bào sử dụng để biểu protein mục tiêu dạng tiết, giúp giảm
phân hủy protein mục tiêu tiết mơi trường [7]
Plasmid pHT43 chứa trình tự tín hiệu tiết
SamyQ α-amylase, pHT43 không mang gen
cbm3a và celA được sử dụng làm đối chứng âm trình kiểm tra biểu protein tái tổ
hợp Plasmid pHT43-celA [4] (Hình 1) chứa trình tự tín hiệu tiết SamyQ gen celA được sử dụng
làm khung sườn để thiết kế plasmid pHT1733
chứa CelA dung hợp CBM3a Ngồi pHT43-celA cịn dùng làm mẫu đối chứng trình chứng minh đặc tính gắn CBM3a lên RAC
Tế bào nuôi cấy lắc môi trường
Luria Broth (LB) 37 oC, kháng sinh được thêm
vào với nồng độ tương ứng (Ampicillin 100 µg/mL E coli Chloramphenicol 10 µg/mL B subtilis) Tếbào trải
môi trường thạch chứa 0,5 % carboxymethyl
cellulose (CMC) để sàng lọc khảnăng tiết CelA-CBM3a
Sàng lọc biểu CelA-CBM3a
Sàng lọc chủng có khảnăng biểu protein tái tổ hợp
Chủng B subtilis WB800N mang plasmid tái
tổ hợp pHT1733 sàng lọc môi trường
(3)và chất CMC, ủ đĩa 30 oC 24 giờ,
nhuộm đĩa với thuốc thử Congo Red Chọn
khuẩn lạc có khả biểu protein tái tổ
hợp thơng qua vịng phân giải CMC xung quanh khuẩn lạc Thực tương tự với mẫu đối chứng (-) chủng B subtilis mang plasmid pHT43 không biểu CelA
Hình 1.Sơ đồ plasmid pHT43-celA
Biểu protein tái tổ hợp CelA-CBM3a
Chủng B subtilis WB800N mang plasmid tái
tổ hợp pHT1733 ni cấy mơi trường
LB có bổ sung kháng sinh chloramphenicol 30
oC lắc với tốc độ 250 vòng/phút, tiến hành
cảm ứng biểu IPTG (Isopropyl β -D-1-thiogalactopyranoside) OD600đạt 0,8 với
nồng độ 0,001 mM ; 0,01 mM; 0,1 mM mM
Mẫu thu giờ, 12 giờ, 18 24
sau cảm ứng Thực tương tự với mẫu đối chứng âm chủng B subtilis WB800N mang plasmid pHT43 Thí nghiệm lặp lại lần khuẩn lạc khác Mẫu sau thu ly tâm 13.000 vòng/ phút phút để loại bỏ
tế bào Xác định điều kiện biểu CelA-CBM3a tốt dựa hoạt tính thủy phân
chất CMC 0,5 % dung dịch đệm succinate
50 mM có bổ sung 10 mM CaCl2 phương
pháp DNS [4]
Chứng minh CelA-CBM3a biểu tiết từ B subtilis có khả bám lên chất RAC
Để chứng minh khả bám CelA-CBM3a lên chất cellulose, hút 1200 µL dịch ni cấy có chứa protein tái tổ hợp
CelA-CBM3a loại bỏ tếbào ký hiệu (S) vào
600 µL RAC 0,5 % pha đệm succinate 50 mM có bổ sung 10 mM CaCl2, ủtrong đá 30 phút
cho CelA-CBM3a bám lên RAC ức chế
hoạt tính phân cắt RAC CelA-CBM3a Ly tâm 6.000 g phút, thu phân đoạn: phân
đoạn dịch có CelA-CBM3a ký hiệu
là (S1) phân đoạn tủa chứa RAC
CelA-CBM3a bám lên RAC ký hiệu (P1) Tiến
hành đo hoạt tính thủy phân CMC 0,25 %
dịch nuôi cấy (S) phân đoạn dịch (S1)
bằng phương pháp DNS Hiệu số hoạt tính
thủy phân CMC dịch nuôi cấy (S) phân
đoạn dịch (S1) hoạt tính
CelA-CBM3a bám lên chất RAC pha tủa
(P1) Thực tương tự mẫu đối chứng CelA không dung hợp với CBM3a Ngoài ra,
hiện diện CelA-CBM3a pha tủa với RAC (P1) pha tan (S1) xác định
bằng phương pháp Western Blot với kháng thểsơ
cấp kháng thể thỏ anti-CelA kháng thể thứ
cấp kháng thể anti-rabbit IgG-HRP từ thỏ, phát vạch lai với kháng thể phản ứng tạo màu với tetramethylpentadecane (TMPD)
Tinh chế CelA-CBM3a dựa lực CBM3a RAC
Phương pháp thực tương tựnhư phương
pháp chứng minh hoạt tính gắn CBM3a lên RAC Thể tích dịch ni cấy 500 mL Phân
đoạn tủa (P1) chứa RAC CelA-CBM3a rửa lần với đệm succinate 50 mM có bổ sung 10 mM CaCl2 để loại bỏ protein tạp Các phân
đoạn rửa thu nhận tủa
Trichloroacetic acid TCA 10 % (W1, W2, W3) nhằm kiểm tra mức độ rửa trôi CelA-CBM3a pHT43-celA 9404 bps 2000 4000 6000 8000 MunI NheI SacI EcoRV ApaI Afl III KpnI BamHI AflIII EcoRV PstI EcoRV AatII SmaI Afl III AflIII SexAI AflIII ClaI XhoI BsaIAhdI AflIII SphIAflII Cm LacI PgroES SamyQ ORF-1 cel A dockerin type I
ORF-3 ORF-1
ORF-2 Amp
(4)ra khỏi RAC Protein CelA-CBM3a hấp phụ
bề mặt RAC dung ly glycerol 100 %
bằng cách huyền phù phân đoạn tủa sau rửa
trong đệm succinate 50 mM có bổ sung 10 mM
CaCl2 cho thể tích 30 mL thêm
glycerol 100 % vào với thể tích gấp lần thể tích huyền phù RAC Ly tâm 18.000 g 15 phút
và thu phân đoạn: phân đoạn dịch
protein CelA-CBM3a dung ly khỏi RAC ký hiệu (P2A); phân đoạn tủa gồm RAC số CelA-CBM3a bám lại RAC ký hiệu (P2R) Các phân đoạn xử lý
để thực điện di SDS-PAGE Western
blot
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Thiết kế plasmid tái tổ hợp pHT1733 mang gen celA dung hợp với cbm3a
Plasmid pHT1733 thiết kế từ việc chèn
gen cbm3a từC thermocellum ATCC27405 vào plasmid pHT43-celA vị trí cắt enzyme cắt giới hạn BsrGIvà SmaI tạo đoạn dung hợp samyQ-celA-cbm3a Vùng trình tự đoạn chèn cbm3a plasmid tái tổ hợp pHT1733
được kiểm tra phương pháp giải trình tự cho kết quảtương đồng 100 % với trình tự thiết kế lý thuyết (Hình Hình P1phầnPhụ lục)
Plasmid pHT1733 dùng để biến nạp vào
chủng chủ biểu B subtilis WB800N nhằm biểu protein CelA-CBM3a dạng tiết
môi trường nuôi cấy nhờ tín hiệu tiết SamyQ
Hình 2 Sơ đồ plasmid pHT1733
Sàng lọc biểu CelA-CBM3a
Khi cấy đồng thời chủng B subtilis WB800N mang plasmid tái tổ hợp pHT1733
plasmid đối chứng (-) pHT43 đĩa
mơi trường LB-Agar-Cm có bổ sung 0,25 %
CMC 0,1 mM IPTG, ủở 30 oC 24 giờ,
nhuộm đĩa với thuốc thử Congo Red Kết
trên Hình cho thấy khuẩn lạc vi khuẩn mang plasmid pHT1733 tạo vòng phân giải CMC lớn
so với đối chứng (-) Chứng tỏđã chọn lọc
chủng B subtilis WB800N mang plasmid pHT1733 cho phép biểu protein CelA-CBM3a dạng tiết mơi trường ni cấy
Hình 3. Kết sàng lọc chủng có khả tiết
enzyme phân cắt CMC tạo vòng phân giải CMC
pHT43 : khuẩn lạc B subtilis WB800N mang plasmid pHT43 không biểu enzyme làm mẫu đối chứng
() ; pHT1733 : khuẩn lạc B subtilis WB800N mang plasmid pHT1733 cho phép biểu enzyme CelA
-CBM3a dạng tiết
Đểthu lượng protein tái tổ hợp
CelA-CBM3a đủđể nghiên cứu khảo sát đặc tính bám
của CBM3a lên chất RAC, cần khảo sát điều
kiện cảm ứng biểu phù hợp cho chủng B subtilis WB800N mang plasmid pHT1733
được sàng lọc bên Nhiệt độ nuôi cấy 30 oC
ứng với điều kiện sản xuất chọn để khảo sát
với nồng độ chất cảm ứng thay đổi mM; 0,01
mM; 0,1 mM mM cảm ứng Kết Hình 4Acho thấy hoạt tính phân giải CMC
chủng B subtilis WB800N mang plasmid pHT1733 ln cho hoạt tính phân giải CMC cao
hơn mẫu đối chứng nồng độ chất cảm ứng
IPTG 0,1 mM nồng độ tốt cho việc cảm
ứng biểu CelA-CBM3a Ở điều kiện cảm
(5)nhau hoạt tính enzyme có khác
khơng nhiều Thời gian cảm ứng tốt 18 (Hình 4B) Như thí nghiệm tiếp theo,
chủng nuôi cấy 30 oC, cảm ứng bằng 0,1
mM IPTG 18
Hình 4. Khảo sát điều kiện cảm ứng biểu CelA-CBM3a dạng tiết sử dụng chủng B subtilis WB800N thông
qua hoạt tính phân cắt CMC A: Tổng đường khử (mg/mL) trung bình khuẩn lạc ni cấy 30oC nồng
độ IPTG đến mM thời điểm thu mẫu sau cảm ứng giờ; B: Tổng đường khử (mg/mL) trung bình khuẩn lạc nuôi cấy 30oC, nồng độ IPTG 0,1 mM thời điểm khác nhau.
Chứng minh CelA-CBM3a biểu tiết từ B subtilis có khả bám lên chất RAC
Dịch nuôi cấy kiểm tra khơng có khả
năng thủy phân chất RAC nhiệt độ oC (kết
quả khơng trình bày), điều kiện để tiến hành thí nghiệm ủ dịch ni cấy với RAC cho CBM3a-CelA gắn lên RAC mà không phân cắt RAC Từng phân đoạn enzyme xác định lại
hàm lượng enzyme thơng qua hoạt tính
enzyme chất CMC 0,25 % Kết Hình
5A cho thấy sau ủ với RAC, phân đoạn dịch (S1) hoạt tính mẫu dịch tiết chứa CelA mẫu dịch tiết chứa CelA-CBM3a
đều cho hoạt tính enzyme phân cắt CMC giảm so
với mẫu trước ủ với RAC Điều chứng tỏ
cả loại enzyme có khảnăng gắn với
chất RAC nên sốenzyme bị lắng xuống với RAC pha tủa (P1) nên làm giảm
lượng enzyme pha tan (S1) Tuy nhiên hoạt tính pha tan S1 sau ủ với RAC mẫu
đối chứng chứa enzyme CelA giảm 21 % so
với hoạt tính enzyme trước ủ với RAC, hoạt
tính bám CelA lên chất RAC trường hợp có lẽlà tương tác enzyme
chất Trong đó, hoạt tính pha tan S1 sau
khi ủ với RAC mẫu chứa enzyme CelA-CBM3a giảm đến 78 % so với hoạt tính enzyme
trước ủ với RAC, hoạt tính bám CelA lên
cơ chất RAC trường hợp so với mẫu
đối chứng (CelA) tương tác CBM3a lên
cơ chất RAC CBM3a CBM3a-CelA có
hoạt tính bám RAC xác định lần
bằng phương pháp Western blot (Hình 5B)
Kết Western blot Hình 5Bcho thấy khác biệt rõ khảnăng bám
CBM3a-CelA lên chất RAC so với trường hợp CelA
(6)RAC (S1) phân đoạn tủa sau ủ với RAC (P1) mẫu đối chứng âm (-) không chứa CelA
đều không cho tín hiệu với kháng thể kháng CelA (Hình 5B, (-)) Kết cho thấy kháng thể
kháng CelA không bắt chéo với protein khác tiết từ chủng B subtilis WB800N
Trong đó, phân đoạn dịch sau ủ với
RAC (S1) phân đoạn tủa sau ủ với RAC
(P1) mẫu chứa CelA CBM3a-CelA cho tín hiệu lai màng lai Tuy nhiên, tín hiệu lai khác biệt phân đoạn mẫu
Đối với mẫu chứa CelA tín hiệu lai xuất cả2 phân đoạn S1 P1, mẫu chứa CBM3a-CelA tín hiệu lai xuất
trong phân đoạn tủa với RAC (P1) tín hiệu
thấp phân đoạn dịch S1
A B
Hình Chứng minh tính bám CelA-CBM3a biểu tiết từ B subtilislên chất RAC.(A) độ giảm hoạt tính
phân giải CMC (%) dịch nuôi cấy chứa enzyme sau ủ với RAC so với mẫu trước ủ với RAC; (B)
Western blot với kháng thể kháng CelA; M: thang protein chuẩn; S1: phân đoạn dịch dịch nuôi cấy sau ủ với RAC; P1: phân đoạn tủa chứa RAC enzyme bám với RAC sau ủ dịch nuôi cấy với RAC; (-) mẫu đối
chứng âm không chứa enzyme CelA CBM3a
Như vậy, tương tác CelA RAC
không bền chặt trường hợp CelA-CBM3a Do CelA liên kết với chất để thực phản ứng, cịn CelA-CBM3a ngồi tương tác
giữa CelA RAC cịn có tương tác CBM3a gắn chuyên biệt hiệu với chất RAC
Tinh chế CelA - CBM3a dựa lực CBM3a RAC
CBM3a chứng minh liên kết
mạnh với chất RAC, nhiên tương tác
có dễdàng đểứng dụng tinh chế trực tiếp protein tái tổ hợp từ dịch ni cấy thể tích lớn liên kết có đủ bền đểđảm bảo độ bám dính protein mục tiêu qua bước rửa nghiêm
ngặt để đạt độ tinh cao protein
mục tiêu sau tinh chế hay khơng cần chứng minh qua thử nghiệm tinh chế protein tái tổ hợp CelA-CBM3a hạt RAC Kết
SDS-PAGE Western blot Hình 6B cho thấy, so với dịch ni cấy trước ủ RAC (S) lượng protein CelA CBM3a-CelA giảm
nhiều so với phân đọan dịch sau ủ với
RAC (S1) Trong đó, giếng S1 dịch ni
cấy chứa CBM3a-CelA không phát protein mục tiêu Chứng tỏ protein mục tiêu gắn hoàn toàn lên RAC Trong giếng S1 dịch nuôi cấy chứa CelA cho tín hiệu lai rõ
79%
22%
0% 20% 40% 60% 80% 100%
CelA CBM3a-CelA
(7)Ởcác phân đoạn rửa (W1, W3), có mẫu chứa CelA cho tín hiệu lai với kháng thể kháng CelA tất phân đoạn rửa Như vậy, CelA có khảnăng gắn lên RAC liên kết không chặt chẽ (tương tác enzyme-cơ
chất phản ứng) nên CelA dễ dàng bị tách khỏi RAC trình rửa Ngược lại, tín hiệu lai khơng xuất ởcác phân đoạn rửa mẫu
chứa CBM3a-CelA, mà xuất vạch lai
trong phân đoạn dung ly (S2A) phân đoạn tủa
RAC lại sau dung ly (P2R) Như vậy, CBM3a giúp cho protein tái tổ hợp CelA-CBM3a bám chặt đặc hiệu lên chất RAC Vì thế, CBM3a có thểứng dụng tinh chế protein tái tổ hợp
A
B
Hình 6. Kết thí nghiệm chứng minh khả ứng dụng đuôi CBM3a tinh chế protein tái tổ hợp
chất RAC.(A) Kết SDS-PAGE (B) Western blot với kháng thể kháng CelA; M: thang protein chuẩn; S: phân đoạn dịch nuôi cấy trước ủ với RAC; S1: phân đoạn dịch sau ủ với RAC; W1, W3: phân đoạn sau
khi rửa; S2A: phân đoạn protein dung ly khỏi RAC glycerol; P2R: phân đoạn protein bám lại RAC sau dung ly glycerol
KẾT LUẬN
Nghiên cứu tạo plasmid
pHT1733 mang đoạn gen cbm3a dung hợp với
celA Protein tái tổ hợp CBM3a-CelA biểu dạng tiết có hoạt tính thủy phân
cellulose vơ định hình, đặc biệt dung hợp
CBM3a có lực cao với chất RAC Đây
tiền đề có ý nghĩa việc xây dựng phương
pháp tinh chế protein tái tổ hợp thông qua đuôi
tinh chế CBM3a chất RAC, nhằm giảm
chi phí đơn giản hóa q trình sản xuất protein
tái tổ hợp với quy mô lớn, đặc biệt protein tái tổ hợp tiết môi trường nuôi cấy với thể tích
lớn Tuy nhiên, để ứng dụng tinh chế
CBM3a cho hệ thống biểu tinh chế protein tái tổ hợp B subtilis cần có nhiều khảo sát protein thị khác
hệ thống biểu nội bào ngoại bào
Lời cảm ơn: Một phần nghiên cứu đề tài tài trợ Đại học Quốc gia Tp Hồ
(8)Using cellulose binding module of CBM3A as the purification tag for secreted Endoglucanase A (CelA) in Bacillus subtilis
Nguyen Hoang Ngoc Phuong Nguyen Thanh Phuoc Pham Luong Thang Nguyen Duc Hoang Tran Linh Thuoc Phan Thi Phuong Trang
University of Science, VNU-HCM
ABSTRACT
Traditional methods of recombinant protein purification are uneconomic and inconvenient to the secreted proteins at large-volume CBM3a, a module from cellulosome’s scaffoldin of Clostridium thermocellum, directs the binding of the cellulase complex on the cheap cellulose substrate Most of previous studies about CBM3a fused with cellulases as the purification tag were conducted in intracellular Escherichia coli system In this research, we used the
extracellular Bacillus subtilis WB800N expression system to investigate the CBM3a-tag fused with endoglucanase CelA into plasmid pHT The results indicated that protein CelA was secrected and purified by CBM3a-tag binding on the Regenerated Amorphous Cellulose (RAC) subtrate This can be used for further improvement in protein purification tag designing
Key words: Bacillus subtilis, Cellulose Binding Module, Clostridium thermocellum, endoglucanase A,
protein purification
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] C.R Harwood, Bacillus subtilis and its relatives: molecular biological and industrial workhorses,Trends Biotechnol, 10, 247-256 (1992)
[2] M Sajjad, M.I Mahmood Khan, R Zafar, S Ahmad, U Niazi, M.W Akhtar, Influence of positioning of carbohydrate binding module on the activity of endoglucanase CelA of Clostridium thermocellum, J Biotechnol, 161, 3, 206-212 (2012)
[3] C.M Fontes, H.J Gilbert, Cellulosomes: highly efficient nanomachines designed to deconstruct plant cell wall complex
carbohydrates, Annu Rev Biochem, 79, 655-681 (2010)
[4] T.K Ghose, Measurement of cellulase activities, Pure and Applied Chemistry, 59, 2, 12 (1987)
[5] J Hong, X Ye, Y Wang, Y.H Zhang, Bioseparation of recombinant cellulose-binding module-proteins by affinity adsorption on an ultra-high-capacity cellulosic adsorbent, Anal Chim Acta, 621, 2, 193-199 (2008)
(9)proteins on the cell wall, AMB Express, 1, 1, 22 (2011)
[7] T.T Phan, H.D Nguyen, W Schumann, Novel plasmid-based expression vectors for intra- and extracellular production of recombinant proteins in Bacillus subtilis, Protein Expr Purif, 46, 2, 189-195 (2006) [8] M Schallmey, A Singh, O.P Ward, Developments in the use of Bacillus species for industrial production, Can J Microbiol, 50, 1, 1-17 (2004)
[9] W Schumann, Production of recombinant proteins in Bacillus subtilis, Adv Appl Microbiol, 62, 137-189 (2007)
(10)PHỤ LỤC
Hình P1. Kết giải trình tự plasmid pHT1733 mồi ON314 nằm đoạn gene cbm3a dung hợp đầu 3’