mộc miết tử

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y - DƯỢC THÁI NGUYÊN BỘ MÔN DƯỢC LÝ ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU: ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CẤP VÀ TÁC DỤNG KÍCH ỨNG DA CỦA CỒN THUỐC MỘC MIẾT TỬ TRÊN THỰC NGHIỆM THÁI NGUYÊN – 2021 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT WHO : World Health Organization ĐVTN : Động vật thí nghiệm OECD : Tổ chức Hợp tác Phát triển Kinh tế TIC : Nồng độ kích ứng ngưỡng LD50 : liều chết trung bình LD100 : liều chết tuyệt đối LD0 : CP : chế phẩm (thuốc thử); Ch : Chứng (Thuốc tham chiếu) Qs :Quan sát liều liều chết MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT MỤC LỤC DANH MỤC BIỂU ĐỒ DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1.Tổng quan dược liệu 1.1.1 Tổng quan dược liệu mộc miết tử 1.1.2 Tổng quan cồn mộc miết tử dùng 1.1.3 Tổng quan cồn thuốc đối chứng 1.2 Tổng quan phương pháp nghiên cứu 1.2.1 Nghiên cứu độc tính cấp 1.2.2 Nghiên cứu kích ứng da 10 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .12 2.1 Chất liệu nghiên cứu .12 2.1.1.Thuốc nghiên cứu 12 2.1.2.Thuốc tham chiếu 12 2.1.3 Hóa chất 12 2.1.4 Phương tiện máy móc dùng nghiên cứu .13 2.2 Đối tượng nghiên cứu thực nghiệm 13 2.3 Địa điểm nghiên cứu .14 2.4 Phương pháp nghiên cứu 14 2.4.1 Nghiên cứu độc tính cấp 14 2.4.2 Nghiên cứu kích ứng da 15 2.5 Xử lý số liệu 16 CHƯƠNG III: DỰ KIẾN KẾT QUẢ 17 3.1.Thử độc tính cấp cồn mộc miết tử .17 3.2.Thử độc tác dụng kích ứng da cồn thuốc mộc miết tử .19 KẾT LUẬN, ĐỀ XUẤT HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 22 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC BIỂU ĐỒ Đồ thị 3.1: Mối quan hệ liều dùng tỷ lệ chết chuột DANH MỤC BẢNG Bảng 2: Thể tích tối đa dung dịch thuốc sử dụng cho động vật Bảng 3.1.1: Mối tương quan liều dùng cồn thuốc mộc miết tử số lượng chuột chết Bảng 3.1.2: Tỷ lệ chuột chết mức liều Bảng 3.1.3: Độc tính Lớp học:Hodge thang đo STRERN tuyến đường phơi nhiễm Bảng 3.2.1 Mức độ phản ứng da thỏ Bảng 3.2.2: Mức độ kích ứng da cồn mộc miết tử thực nghiệm DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cấu tạo giải phẫu gấc Hình 1.2: Cồn xoa bóp mộc miết tử-quế chi Hình 1.3: Các loại saponin mộc miết tử Hình 1.4: Thành phần dược liệu quế chi Hình 3.1: Mơ hình hóa tiến hành thử độc tính cấp Hình 3.2: Mơ hình hóa tiến hành thử độc tính cấp Hình 3.3: Mơ bệnh học da thỏ ĐẶT VẤN ĐỀ Gấc thực phẩm đặc biệt Việt Nam, có danh pháp khoa học Momordica cochinchinensis, thuộc chi mướp đắng Hoa có sắc vàng Quả hình trịn, sắc xanh, chín chuyển sang đỏ cam Vỏ gấc có gai rậm Bổ trái thường có sáu múi, thịt gấc màu đỏ cam, hạt màu nâu thẫm Ở Việt Nam có khoảng loài thường gọi gấc nếp, gấc tẻ gấc lai[1] Trái gấc sử dụng ẩm thực lẫn y học Trong đó, đơng y gọi hạt gấc Mộc miết tử (con ba ba gỗ) dẹt, hình gần trịn, vỏ cứng, mép có cưa, hai mặt có đường vân lõm xuống, trơng tựa ba ba nhỏ Theo y học cổ truyền, nhân hạt gấc vị đắng, ngọt, tính ơn, độc, vào kinh can đại tràng [2].Mộc miết tử thường dùng dạng cồn thuốc, có công dụng nhằm giảm đau, chống viêm trường hợp bị sưng đau chấn thương trường hợp viêm khớp mạn tính cấp tính… [3].Thành phần cồn chủ yếu mộc miết tử quế chi, ethanol Sản phẩm tiến hành thử tác dụng giảm đau, chống viêm động vật thí nghiệm cho kết tốt Sản phẩm dùng cách xoa bóp ngồi trực tiếp lên vùng sưng đau, nhiều lần ngày Tuy nhiên,các thuốc dùng da khơng phải có lợi, nhiều thuốc mỹ phẩm, bơi len da, gây độc,gây kích ứng làm hại cho thể Ngay thuốc dùng nhờ tác dụng kích ứng da, kích ứng mức gây hại cho thể,như gây phồng rộp hoại tử da [4] Do vậy, cần nghiên cứu độc tính,tác dụng kích ứng da,tránh kích ứng vượt ngưỡng cần thiết gây hại cho thể Xuất phát từ thực tế chúng tơi tiến hành đề tài nghiên cứu “Đánh giá độc tính cấp tác dụng kích ứng da cồn thuốc mộc miết tử thực nghiệm” với mục tiêu sau: Đánh giá độc tính cấp cồn thuốc mộc miết tử thực nghiệm Đánh giá tác dụng kích ứng da cồn thuốc mộc miết tử thực nghiệm Nghiên cứu góp phần vào việc tác dụng không mong muốn gặp phải sử dụng cồn mộc miết tử, đồng thời xác định ngưỡng gây độc kích ứng mộc miết tử phục vụ cho công tác bào chế kiểm nghệm dược phẩm Các phương pháp nghiên cứu tác dụng kích ứng da thường dựa vào nghiệm pháp Draize (1944), có cải tiến bổ sung Luduena & Hoppe (1952) Finkelstein (1963) Một số phương pháp là: 1.2.2.1.Thử tác dụng kích ứng da thuốc nghiên cứu với thuốc tham chiếu Trong trường hợp này,tùy theo thuốc nghiên cứu dạng (dạng lỏng, mềm, dạng bột ), thường chọn thuốc tham chiếu có dạng tương tự dạng thuốc nghiên cứu Tất nhiên, trường hợp này, chế phẩm thuốc tham chiếu loại thuốc có tác dụng kích ứng da mức độ chấp nhận 1.2.2.2.Thử tác dụng kích ứng da thuốc nghiên cứu so với thuốc kích ứng chuẩn Trong trường hợp tùy theo thuốc nghiên cứu dạng mà chọn thuốc kích ứng chuẩn cho thích hợp, thng thường chun luận thử có ghi rõ Tác dụng kích ứng da thuốc theo quy định phải có tác dụng kích ứng thấp nồng độ kích ứng ngưỡng TIC dung dịch chuẩn Nồng độ kích ứng ngưỡng TIC nồng độ (%) lớn thuốc gây mức đọ kích ứng nhẹ thương đương điểm 10 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Chất liệu nghiên cứu 2.1.1.Thuốc nghiên cứu Công thức cồn thuốc Mộc miết tử: Mộc miết tử 10 g Tá dược (Ethanol 96%, nước) vừa đủ 100 ml 2.1.2.Thuốc tham chiếu Mộc miết tử 7,7 g Quế chi 2,3 g Tá dược (Ethanol 96%, nước) .vừa đủ 100 ml Thuốc bào chế theo quy trình khép kín khoa Dược – Đại học Y Dược Thái Nguyên Thuốc đóng dạng chai nhựa 100ml/chai Tác dụng: Chữa tụ máu, bong gân, chữa đau nhức khớp, vai gáy, tê thấp Chữa sưng vú, cương vú phụ nữ sau sinh Chữa quai bị 2.1.3 Hóa chất - Dung dịch xét nghiệm máu ABX Minidil LMG hãng ABX - Diagnostics, định lượng máy Vet abcTM Animal Blood Counter - Kít định lượng enzym chất chuyển hóa máu: ALT(alanin aminotransferas), AST (aspartat aminotransferas), bilirubin toàn phần, albumin, cholesterol toàn phần, creatinin hãng Hospitex Diagnostics (Italy) hãng DIALAB GmbH (Áo) - Các hóa chất đủ tiêu chuẩn phịng thí nghiệm – Trường Đại học Y Dược Thái Ngun -Dung mơi pha lỗng thuốc: nước cất - Thuốc mê - Formaldehyd 20% - Thuốc chuẩn để đối chiếu - Xanh trypan - Hố chất làm rụng lơng (nếu có) 11 2.1.4 Phương tiện máy móc dùng nghiên cứu - Máy Hot plate model - DS37 hãng Ugo - Basile (Italy) - Máy đo phản ứng đau phương pháp rê kim, sản xuất UgoBasil series 16881 (Italy) - Máy đo phản ứng đau phƣơng pháp tail - flick, sản xuất Ugo- Basile - series 16881 (Italy) - Thước đo độ dày (Độ xác: 0,01mm): Insize 2132 - 20 Insize, Áo - Máy đo viêm: Plethysmometer No7250 hãng Ugo- Basile (Italy) - Kính hiển vi quang học Olympus CH20 (Nhật), kính lúp - Thiết bị sinh thiết (biopsy punch) đường kính mm - Cân điện tử (độ xác 0,001g) Nhật - Máy xét nghiệm sinh hóa XC - 55 (Trung Quốc) - Bàn mổ để cố định động vật - Bơm tiêm, kim tiêm loại - Dao cạo dụng cụ để cạo lông động vật - Bút chì để khoanh vùng thử - Bông - Kẹp - Gạc miếng x 2cm 2, x 2,5cm - Cối, chày sứ - Ống đong - Cốc thuỷ tinh để pha thuốc - Kéo 2.2 Đối tượng nghiên cứu thực nghiệm - Chuột nhắt trắng chủng Swiss, số lượng 90 con, hai giống khỏe mạnh, cân nặng từ 18 -22g, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp - Thỏ chủng Newzealand White, lông trắng, số lượng con, trọng lượng từ 1,8 2,5kg, Trung tâm chăn nuôi Dê Thỏ Sơn Tây cung cấp 2.3 Địa điểm nghiên cứu - Bộ môn Dược lý – Đại học Y-Dược Thái Nguyên 12 - Bộ môn Sinh lý học – Đại học Y-Dược Thái Nguyên - Bộ môn Y sinh học-Di truyền – Đại học Y-Dược Thái Nguyên - Bộ môn Mô-Phôi – Đại học Y-Dược Thái Nguyên - Khoa Sinh hóa – Bệnh viện trường ĐH Y-Dược Thái Nguyên 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Nghiên cứu độc tính cấp Nghiên cứu độc tính cấp theo đường tiêm da (đường gần chế phẩm dùng đường bơi ngồi da lâm sàng) Xác định LD50 thuốc thử chuột nhắt trắng đường tiêm da gáy theo phương pháp Litchfield - Wilcoxon, hướng dẫn OECD WHO [13], [14], [15] Lồi động vật Thẻ tích tối đa dùng(ml/kg) theo đường dùng Tiêm tĩnh Tiêm bắp mạch Tiêm bụng hốc Tiêm Uống Trực tràng da Chuột nhắt 25 2,5 50 50 50 2,5 Chuột cống 10 20-50 50 50 Thỏ 2-4 0,2 8 0,4 Mèo 1,7-3,3 0,3 6,7 3,3 16,7 0,33 Chó 1-2 0,5 5,0 1,0 1,0 0,3 Khỉ 1,7-3,3 0,8 8,3 0,8 8,3 0,5 Bảng 2: Thể tích tối đa dung dịch thuốc sử dụng cho động vật [8] Từ bảng 2, lựa chọn mức liều tối đa tiêm cho động vật 50ml/kg tương đương 1ml/chuột nhắt 20g Ngoại suy liều để tính liều cụ thể cá thể chuột Tiến hành: Trước tiến hành thí nghiệm, cho chuột nhịn ăn qua đêm Các chuột nhắt trắng lô cạo lông da gáy với diện tích 1,5cm-2cm (1x1,5) Từng lơ chuột nhắt trắng, lơ 10 con, tiêm da gáy mẫu thuốc nghiên cứu theo liều tăng dần Tìm liều cao khơng gây chết chuột (0%), liều thấp gây chết chuột hoàn toàn (100%) liều trung gian Chuột tiêm da thuốc thử sau gáy với liều tối đa dung nạp tiêm với liều tăng dần Liều tiêm tính theo kg thể trọng chuột Theo dõi tình trạng chung chuột số lượng chuột chết lơ 72 Sau tiếp tục theo dõi tình trạng chuột đến hết ngày thứ sau tiêm thuốc mẫu nghiên cứu (ăn uống, hoạt động lại, 13 leo trèo, hoạt động tiết…) Trong trình theo dõi, có chuột chết phải mổ xác để đánh giá tổn thương đại thể Từ vẽ đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính liều lượng số chuột chết liều dùng để xác định LD 50 thuốc thử theo đường tiêm da theo đồ thị y= ax (trong y liều dùng, x số chuột chết) 2.4.2 Nghiên cứu kích ứng da Mơ hình nghiên cứu thiết kế tiến hành dựa hướng dẫn OECD (Organisation for Economic Co-operation and Development: Tổ chức Hợp tác Phát triển Kinh tế) việc đánh giá kích ứng da dành cho sản phẩm dược phẩm mỹ phẩm dùng da [14] Phương pháp nghiên cứu áp dụng phương pháp thử tác dụng kích ứng da thuốc nghiên cứu với thuốc tham chiếu Quy trình tiến hành: Thỏ nuôi lồng riêng, cho ăn chế độ ăn riêng, giữ nhiệt độ phòng vòng tuần trước tiến hành nghiên cứu Trước ngày nghiên cứu 24 giờ, thỏ cạo lông phần lưng hông Chia phần da cạo lông làm phần, chọn phần có diện tích khoảng 6cm (2,5cm x2,5 cm) thỏ sử dụng để bôi chế phẩm nghiên cứu, phần da bôi thuốc tham chiếu đựợc sử dụng làm đối chứng Chỉ nghiên cứu viên bôi thuốc đồng da thỏ cho phần bôi thuốc nghiên cứu phần bôi thuốc tham chiếu, thay găng sau lần bôi để hạn chế sai số Đắp gạc (diện tích 6cm 2) lên hai phần bôi thuốc phần dùng làm chứng Lưng thỏ băng (không băng chặt) Sau giờ, tháo bỏ tất băng gạc khỏi lưng thỏ rửa thuốc cách nhẹ nhàng nước [16] Đánh giá tính điểm số ban đỏ (erythema), phù nề (oedema) thời điểm giờ, 24, 48, 72 sau loại bỏ thuốc Nếu có tổn thương, theo dõi thỏ 14 ngày để đánh giá khả phục hồi Khi tổn thương hồi phục ngừng theo dõi 2.5 Xử lý số liệu Các số liệu thu được xử lý phần mềm Excel 2010 SPSS 22.0, sử dụng thuật tốn thống kê thích hợp (Student's t-test, Paired t-test, Mann-Whitney U test, Chi-square test) với số liệu thu Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê p