Xây dựng hệ thống mã vạch dna (dna barcode) để nhận diện phân tử một số loài đăng lan (dendrobium spp ) khu vực tp hồ chí minh báo cáo tổng kết đề tài khoa học và công nghệ cấp cơ sở

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HCM BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ XÂY DỰNG HỆ THỐNG MÃ VẠCH DNA (DNA BARCODE) ĐỂ NHẬN DIỆN PHÂN TỬ MỘT SỐ LOÀI ĐĂNG LAN (Dendrobium spp.) KHU VỰC TP HỒ CHÍ MINH Mã số: CS.2015.19.38 Chủ nhiệm: ThS Nguyễn Như Hoa -Tp.HCM, 2017 - BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HCM BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ XÂY DỰNG HỆ THỐNG MÃ VẠCH DNA (DNA BARCODE) ĐỂ NHẬN DIỆN PHÂN TỬ MỘT SỐ LOÀI ĐĂNG LAN (Dendrobium spp.) KHU VỰC TP HỒ CHÍ MINH Mã số: CS.2015.19.38 Cơ quan chủ trì Chủ trì đề tài Trưởng Khoa Sinh học TS Phạm Văn Ngọt | ThS Nguyễn Như Hoa Danh sách người tham gia thực đề tài đơn vị phối hợp Chủ nhiệm: ThS Nguyễn Như Hoa, giảng viên Khoa Sinh học Trường ĐH Sư phạm Tp.HCM Cơ quan chủ trì: Khoa Sinh học, Trường ĐH Sư phạm Tp.HCM Đơn vị phối hợp chính: Trung tâm Cơng nghệ Sinh học Tp HCM MỤC LỤC Chương TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu lan Dendrobium 1.1.1 Vị trí phân loại .5 1.1.2 Sự phân bố .5 1.1.3 Sự đa dạng phong phú lan Dendrobium 1.1.4 Đặc điểm hình thái lan Dendrobium .9 1.2 Các loài Đăng lan nghiên cứu 12 1.2.1 Hoàng phi hạc (Dendrobium signatum Rchb f 1884) .12 1.2.2 Đại Ý Thảo (Dendrobium aphyllum (Roxb.) Fisher) 12 1.2.3 Hồng thảo Thái Bình (Dendrobium pulchellum Roxb ex Lindl.) 12 1.2.4 Long tu (Dendrobium primulinum Lindl.) 13 1.2.5 Giả hạc xuân di linh tím (Dendrobium anosmum var alba) 13 1.2.6 Xương cá (Dendrobium aloifolium (Bl.) Rchb f.) 13 1.2.7 Thập hoa (Dendrobium aduncum Wall Ex Lindl.) 13 1.2.8 Kim điệp vàng (Dendrobium capillipes Rchb.f.) 14 1.2.9 Hoàng thảo Ngọc Thạch (Dendrobium crystallinum Rchb f.) 14 1.2.10 Hồng thảo vơi (Dendrobium cretaceum Lindl.(D polyanthum Lindl.)) 14 1.3 Mã vạch DNA ứng dụng nhận diện loài 14 1.3.1 Các gen sử dụng để xây dựng mã vạch DNA 15 1.3.2 Các cơng trình xây dựng mã vạch DNA cho họ Lan 19 Chương PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .24 2.1 Vật liệu nghiên cứu 24 2.2 Phương pháp .24 2.2.1 Phương pháp thu thập bảo quản mẫu lan 24 2.2.2 Phương pháp giải phẫu hình thái 25 2.2.3 Tách chiết DNA tổng số 28 2.2.4 Kỹ thuật PCR .28 2.2.5 Phương pháp điện di gel agarose 29 2.2.6 Giải trình tự PCR 30 2.2.7 Hiệu chỉnh trình tự .30 2.2.8 Xây dựng phát sinh chủng loài .33 i Chương KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 35 3.1 Kết thu mẫu 35 3.2 Kết giải phẫu mơ tả hình thái 35 3.3 Kết tách chiết DNA tổng số 40 3.4 Kết xác định nhiệt độ bắt cặp mồi đặc hiệu phản ứng PCR 41 3.5 Khuếch đại vùng matK, ITS kỹ thuật PCR .43 3.6 Kết hiệu chỉnh trình tự phần mềm FinchTV SeaView .45 3.7 Kết so sánh trình tự mẫu với sở liệu Genbank nhằm kiểm tra độ tin cậy trình tự .47 3.8 Xây dựng phát sinh chủng loài trình tự matK ITS .51 ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ bp Base pair CBOL Consortium for the Barcode of Life CO1 Cytochrome c oxidase cpDNA Chloroplast DNA DNA Deoxyribonucleic acid ITS Internal transcribed spacer kb Kilo-base pair matK Maturase K PCR Polymerase Chain Reaction rbcL Ribulose - 1,5 – Biphosphate Carboxylase L rDNA Ribosomal DNA RNA Ribonucleic acid rpoB RNA polymerase - β rRNA Ribosomal RNA OD Optical density BLAST Basic Local Alignment Search Tool CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide Tm Melting Temperature UV Ultraviolet C Cymbidium D Dendrobium Tp HCM Thành phố Hồ Chí Minh NCBI National Center for Biotechnology Information iii DANH MỤC HÌNH ẢNH BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Ký hiệu, tên loài tên khoa học 10 loài Dendrobium nghiên cứu .24 Bảng 2.2 Cặp mồi sử dụng phản ứng khuếch đại trình tự mục tiêu kích thước trình tự khuếch đại .29 Bảng 3.1 Kết ghi nhận đặc điểm hình thái 10 loài Dendrobium nghiên cứu 35 Bảng 3.2 Kết định lượng DNA tổng số mẫu Dendrobium nghiên cứu Nano Drop .40 Bảng 3.3 Nhiệt độ bắt cặp mồi kích thước trình tự khuếch đại cặp mồi nghiên cứu .41 Bảng 3.4 Tóm tắt kết giải trình tự vùng matK (390F- 1326R) ITS (1F – 4R) sau hiệu chỉnh mẫu Dendrobium nghiên cứu .45 Bảng 3.5 Kết BLAST trình tự vùng matK 27/30 mẫu Dendrobium nghiên cứu với sở liệu Genbank 47 Bảng 3.6 Kết BLAST trình tự vùng ITS 27/30 mẫu Dendrobium nghiên cứu với sở liệu Genbank 49 Hình 1.1 Hình minh họa dạng Dendrobium Hình 1.2 Các nhóm Dendrobium Hình 1.3 Đặc điểm rễ, thân, giả hành, lá, hoa, hạt chi lan Dendrobium 11 Hình 1.4 Cấu trúc vùng ITS Dendrobium 19 Hình 2.1 Hình minh họa trình hiệu chỉnh trình tự giải mồi xi SeaView 31 Hình 2.2 Hình minh họa trình hiệu chỉnh trình tự giải mồi ngược SeaView 31 Hình 2.3 Hình minh họa trình thống trình tự SeaView .32 Hình 2.4 Giao diện trang chủ NCBI .32 Hình 2.5 Giao diện BLAST 33 Hình 2.6 Hình minh họa kết BLAST .33 Hình 2.7 Giao diện phần mềm MEGA6.06 34 Hình 3.1 Hình chụp 10 lồi Dendrobium nghiên cứu 39 Hình 3.2 Kết điện di DNA tổng số 10 mẫu Dendrobium .41 Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm khuếch đại vùng matK mẫu 2TT ngưỡng nhiệt độ từ 49oC tới 58oC .42 Hình 3.4 Kết điện di sản phẩm khuếch đại vùng ITS mẫu 2TT ngưỡng nhiệt độ từ 49oC tới 58oC .42 iv Hình 3.5 Kết điện di sản phẩm PCR vùng matK 30 mẫu lan Dendrobium 44 Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm PCR vùng ITS 30 mẫu lan Dendrobium .44 Hình 3.7 Vùng chọn lựa để phân tích phát sinh chủng loài liệu gồm 27 trình tự nghiên cứu vùng matK Dendrobium .51 Hình 3.8 Mơ hình phát sinh lồi vùng matK nhóm Dendrobium nghiên cứu 52 Hình 3.9 Vùng chọn lựa để phân tích phát sinh chủng loài liệu gồm 27 trình tự nghiên cứu vùng ITS Dendrobium 52 Hình 3.10 Mơ hình phát sinh lồi vùng ITS nhóm Dendrobium nghiên cứu 53 Hình 3.11 Mơ hình phát sinh lồi từ trình tự vùng matK ITS nhóm Dendrobium nghiên cứu 54 v TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU BẰNG TIẾNG VIỆT Tên đề tài: Xây dựng hệ thống mã vạch DNA (DNA barcode) để nhận diện phân tử số loài Đăng lan (Dendrobium spp.) khu vực Tp Hồ Chí Minh Mã số: CS.2015.19.38 Chủ nhiệm đề tài: ThS Nguyễn Như Hoa Tel: 0902 683 249 E-mail: hoann@hcmup.edu.vn Cơ quan chủ trì đề tài: Khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm Tp.HCM Cơ quan cá nhân phối hợp thực : Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp HCM Thời gian thực hiện: 11/2015 – 11/2016 Mục tiêu: Hệ thống hóa lồi lan nhằm mục đích bảo tồn để làm nguyên liệu ban đầu cho nghiên cứu sau Xác định trình tự DNA marker để tạo nên hệ thống mã vạch DNA giúp nhận diện phân tử mẫu lan phận giai đoạn phát triển mà không cần có hoa Nội dung chính: - Thu thập, hệ thống 10 loài Đăng lan khu vực HCM - Tách DNA tổng số cho 30 mẫu Đăng lan khu vực HCM - Khuếch đại vùng marker mục tiêu phản ứng PCR - Giải hiệu chỉnh trình tự chiều cho marker - Phân tích, xây dựng mã vạch DNA cho loài Kết đạt được: - Hệ thống mã vạch DNA cho lồi lan thu thập dựa trình tự DNA marker - Các báo cáo hội nghị đăng kỉ yếu: + Nguyễn Như Hoa, Trần Hồng Dũng, Dương Hoa Xơ, Huỳnh Hữu Đức (2016), Phân tích mối quan hệ phát sinh chủng lồi số giống lan Dendrobium dựa trình tự vùng ITS, Hội nghị CNSH tồn quốc khu vực phía Nam – lần thứ IV – năm 2016 SUMMARY Project Title: Construction DNA barcode to identify molecular some Dendrobium species (Dendrobium spp.) in Ho Chi Minh city Code number: CS.2015.19.38 Coordinator: MS Nguyễn Như Hoa Implementing Institution: Department of Biology, HCM City University of Pedagogy Cooperating Institution(s): Biotechnology Center HCM City Duration: from September -2015 to September -2016 Objectives: - Some orchids codified to preserve and provide materials for future research -Two markers sequenced to create barcode system helps identify molecular DNA samples spread in any department and any stage of development without flowers Main contents: - Systems 10 Dendrobium species in HCM city - Separation DNA total for 30 Dendrobium samples in HCM city - Amplifying the target marker by PCR - Sequencing and correction sequence for each marker - Analysis and construction of DNA barcodes for each species Results obtained: - DNA barcode system for the orchids were collected based on the DNA sequence of the markers - Publish academic reports using data collected from the research: + Nguyen Nhu Hoa, Tran Hoang Dung, Duong Hoa Xo, Huynh Huu Đuc (2016), Analysis phylogenetic relationship of Dendrobium based ITS region, The 4th national conference on biotechnology of Sothern Vietnam 2016 “Application of biotechnology” 18PN_ITS 21TT_ITS 21PN_ITS 28TT_ITS 28BC_ITS 35TT_ITS 35BC_ITS 35PN_ITS 37TT_ITS 37BC_ITS 37PN_ITS 2TT_matK 2BC_matK 2PN_matK 6TT_matK 6BC_matK 6PN_matK 10BC_matK 10PN_matK 12TT_matK 12BC_matK 12PN_matK 15BC_matK 15PN_matK 18TT_matK 18BC_matK 21TT_matK 21BC_matK 21PN_matK 28TT_matK 28BC_matK 28PN_matK 35BC_matK 35TT_matK 35PN_matK 37TT_matK 37BC_matK 37PN_matK Bảng align seaview trình tự vùng matK 27 mẫu nghiên cứu Bảng align seaview trình tự vùng ITS 27 mẫu nghiên cứu ... GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HCM BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ XÂY DỰNG HỆ THỐNG MÃ VẠCH DNA (DNA BARCODE) ĐỂ NHẬN DIỆN PHÂN TỬ MỘT SỐ LOÀI ĐĂNG LAN (Dendrobium. .. có hiệu quả, đề xuất ? ?Xây dựng hệ thống mã vạch DNA (DNA barcode) để nhận diện phân tử số loài Đăng lan (Dendrobium spp. ) khu vực Tp Hồ Chí Minh? ?? MỤC TIÊU ĐỀ TÀI Hệ thống hóa lồi lan nhằm mục... v TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU BẰNG TIẾNG VIỆT Tên đề tài: Xây dựng hệ thống mã vạch DNA (DNA barcode) để nhận diện phân tử số lồi Đăng lan (Dendrobium spp. ) khu vực Tp Hồ Chí Minh Mã số: CS.2015.19.38