PHÂN TÍCH VI SINH

46 CHƯƠNG 4 PHÂN TÍCH VI SINH 4.1. Đại cương về vi sinh vật 4.1.1. Đặc điểm chung của vi sinh vật Vi sinh vật(VSV) là tên gọi chung để chỉ tất cả các sinh vật có hình thể bé nhỏ, muốn thấy rõ được người ta phải sử dụng tới kính hiển vi. Virut là nhóm VSV đặc biệt, chúng nhỏ bé tới mức chỉ có thể quan sát được qua kính hiển vi điện tử. Virut chưa có cả cấu trúc tế bào. Các VSV khác thường là đơn bào hoặc đa bào nhưng có cấu trúc đơn giản và chưa phân hóa thành các cơ quan sinh dưỡng. VSV không phải là một nhóm riêng biệt trong sinh giới. Chúng thậm chí thuộc về nhiều giới sinh vật khác nhau. Giữa các nhóm có thể không có không có quan hệ mật thiết với nhau. Chúng có chung những đặc điểm sau đây: - Kích thước nhỏ bé. Mắt con người khó thấy được rõ những vật nhỏ hơn 1nm. Vậy mà VSV thường được đo bằng µ m, virut thường được đo bằng nm. Vì vi sinh vật có kích thước nhỏ bé cho nên diện tích bề mặt của một tập đoàn VSV hết sức lớn. Chẳng hạn số lượng cầu khuẩn chiếm thể tích 1cm 3 có diện tích bề mặt là 6m 2 . - Hấp thu nhiều, chuyển hóa nhanh. VSV tuy nhỏ bé nhất trong sinh vật nhưng năng lực hấp thu và chuyển hóa của chúng có thể vượt xa các sinh vật bậc cao. Chẳng hạn vi khuẩn lactic trong 1 giờ có thể phân giải một lượng đường lactoza nặng hơn 1.000 - 10.000 lần khối lượng của chúng. Nếu tính lượng O 2 mà mỗi mg chất khô của cơ thể sinh vật tiêu hao trong một giờ (biểu thị bằng 2 O Q ) thì ở mô lá hoặc mô rễ thực vật là 0,5 - 4, ở tổ chức gan và thận động vật là 10 - 20, còn ở nấm men rượu là 110, ở vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas là 1.200, ở vi khuẩn thuộc chi Azotobacter là 2.000. Năng lực chuyển hóa sinh hóa mạnh mẽ của vi sinh vật dẫn đến những tác dụng hết sức lớn lao của chúng trong thiên nhiên cũng như trong hoạt động sống của con người. - Sinh trưởng nhanh, phát triển mạnh. So với các sinh vật khác thì VSV có tốc độ sinh trưởng và sinh sôi nảy nở cực kỳ lớn. Vi khuẩn Escherichia coli lúc điều kiện thích hợp thì cứ khoảng 12 - 20 phút lại phân cắt một lần, nếu lấy thế hệ là 20 phút thì mỗi giờ phân cắt 3 lần, 24 giờ phân cắt từ một tế bào ban đầu sẽ sinh ra 4.722.366.500.000.000.000.000 tế bào. Tất nhiên, trong thực tế không thể tạo ra các điều kiện sinh trưởng lí tưởng như vậy được cho nên số lượng vi khuẩn thu được trong 1ml dịch nuôi cấy thường chỉ đạt tới mức độ 10 8 - 10 9 tế bào. Thời gian thế hệ của nấm men Saccharon cerevisiae là 120 phút. Khi nuôi cấy để thu nhận sinh khối (biomass) giàu protein phục vụ chăn nuôi, người ta nhận thấy tốc độ sinh tổng hợp của 47 nấm men này cao hơn của bò tới 100.000 lần. Thời gian thế hệ của tảo Chlorella là 7 giờ, của vi khuẩn lam Nostoc là 23 giờ. - Năng lực thích ứng mạnh và dễ phát sinh biến dị. Năng lực thích ứng của VSV vượt rất xa so với động vật và thực vật. Trong quá trình tiến hóa lâu dài, VSV đã tạo cho mình những cơ chế điều hòa trao đổi chất để thích ứng được với những điều kiện sống rất bất lợi. Người ta nhận thấy số lượng enzim thích ứng chiếm tới 10% lượng chứa protein trong tế bào sinh vật. Sự thích ứng của vi sinh vật nhiều khi vượt quá sự tưởng tượng của con người. Phần lớn vi sinh vật có thể giữ nguyên sức sống ở nhiệt độ của nitơ lỏng (-196 0 C), thậm chí ở nhiệt độ hidro lỏng (-253 0 C). Một số vi sinh vật có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 250 0 C, thậm chí 300 0 C. Một số vi sinh vật có thể thích nghi với nồng độ 32% NaCl (muối ăn), vi khuẩn Thiobacillus thioxidans có thể sinh trưởng ở pH = 0,5 trong khi vi khuẩn Thiobacillus denitrificans lại thích hợp phát triển ở pH = 10,7. Vi khuẩn Micro radiodurans có thể chịu được cường độ bức xạ tới 750.000 rad. Ở nơi sâu nhất trên đại dương (11.034m) nơi có áp lực tới 1103,4 atm vẫn thấy có VSV sinh sống. Nhiều VSV thích nghi với điều kiện sống hoàn toàn thiếu oxi (vi sinh vật yếm khí bắt buộc). Một số nấm sợi có thể phát triển thành váng ngay trong bể ngâm xác có nồng độ phenol rất cao. VSV rất dễ phát sinh biến dị bởi vì thường là đơn bào, đơn bội, sinh trưởng nhanh, số lượng nhiều, tiếp xúc trực tiếp với môi trường sống. Hình thức biến dị thường gặp là đột biến gen và dẫn đến những thay đổi về hình thái, cấu tạo, kiểu trao đổi chất, sản phẩm trao đổi chất, tính kháng nguyên, tính đề kháng, . Chẳng hạn khi mới tìm ra khả năng sinh chất kháng sinh của nấm sợi Penicillium chrysogenum, người ta chiết xuất tới sản lượng 20 đơn vị penixilin trong 1 ml dịch lên men. Ngày nay, trong các nhà máy sản xuất penixilin, người ta đã đạt tới năng suất 100.000đơn vị/ml. Bên cạnh những biến dị có lợi, vi sinh vật cũng thường sinh ra những biến dị có hại đối với nhân loại, chẳng hạn biến dị về tính kháng thuốc. Năm 1946, tỉ lệ các chủng Staphylocin aureus kháng thuốc phân lập được ở bệnh viện là khoảng 14%, đến năm 1996 đã tăng lên đến trên 97%. Người ta chỉ tiêm cho bệnh nhân mỗi ngày khoảng 100.000 đơn vị penixilin, hiện nay có lúc phải tiêm đến 10.000.000 – 20.000.000 đơn vị. - Phân bố rộng, chủng loại nhiều. VSV phân bố ở khắp mọi nơi trên Trái đất. Chúng có mặt trong cơ thể người, động vật, thực vật, trong đất, trong nước, trong không khí, trên mọi đồ dùng, vật liệu, từ biển khơi đến núi cao, đến độ cao tới 84km trong không khí hay khoan sâu tới 427m dưới các lớp đá trầm tích người ta vẫn phát hiện được vi khuẩn sống. Về chủng loại, trong khi toàn bộ giới động vật có khoảng 1,5 triệu loài, thực vật khoảng 0,5 triệu loài thì VSV cũng có tới trên 100 ngàn loài, bao gồm 69 ngàn loài nấm; 23 ngàn loài vi tảo; 2,5 ngàn loài vi khuẩn lam; 1,5 ngàn loài vi khuẩn; 1,2 ngàn loài virus và ricketxi . 48 Nhà vi sinh học Nga nổi tiếng đã viết “VSV mà ta biết đến hiện nay nhiều lắm cũng không quá được 10% tổng số VSV có sẵn trong thiên nhiên”. Chẳng hạn về nấm, trung bình mỗi năm bổ sung thêm 1.500 loài mới. Trong quá trình hoạt động sống, bên cạnh những đặc tính có ích, VSV cũng gây nhiều tác hại cho người, động vật, thực vật như : làm biến đổi chất lượng thuốc, hỏng thực phẩm, một số có khả năng gây bệnh hoặc sinh độc tố có hại Để phục vụ cho việc kiểm nghiệm thực phẩm và thuốc bằng các thử nghiệm VSV ta cần tìm hiểu một số đặc điểm chính của 2 nhóm vi sinh vật là vi khuẩn và vi nấm 4.1.2. Vi khuẩn (Bacteria) 4.1.2.1. Đặc điểm Vi khuẩn là những VSV đơn bào có cấu tạo tế bào tiền nhân(Procaryote), có kích thước rất nhỏ. Đường kính tế bào phần lớn thay đổi trong khoảng 0,2 - 2 µ m, chiều dài từ 2 - 8 µ m. Vi khuẩn có nhiều hình dạng khác nhau, như hình cầu, hình que, xoắn, dấu phẩy. Vi khuẩn chỉ sinh sản vô tính, một số tạo bào tử. Mỗi tế bào vi khuẩn chỉ có một bào tử. Một số vi khuẩn có khả năng di động nhờ sự có mặt của một hoặc nhiều lông. 4.1.2.2. Phân loại Việc phân loại vi khuẩn rất phức tạp, phải dựa vào nhiều đặc điểm, hình thái, sinh lý, sinh hóa để chia vi khuẩn thành các họ, chi, loài khác nhau. Với mục đích phục vụ cho công tác kiểm nghiệm thuốc và thực phẩm, ta không đi sâu vào nghiên cứu phân loại, nhưng cần tìm hiểu vi khuẩn, theo các nhóm dựa trên hình thể, tính chất bắt màu thuốc nhuộm Gram và khả năng hô hấp của chúng. - Theo hình thể: + Cầu khuẩn (Coccus): Vi khuẩn hình cầu, có thể đứng riêng rẽ (Micrococcus), thành từng đám (Staphylococcus), hoặc chuỗi hay xếp thành từng đôi. + Trực khuẩn (Bacillus): Vi khuẩn hình que ngắn đứng riêng lẻ hay thành chuỗi hoặc hình que hai đầu tròn. + Xoắn khuẩn (Spirillum): Vi khuẩn hình lò xo như Treponema Pallidum. + Phẩy khuẩn (Vibrio): Vi khuẩn hình dấu phẩy như Vibrio Cholerae - Theo tính chất bắt màu thuốc nhuộm Gram. + Vi khuẩn có màu tím sau khi nhuộm Gram: Vi khuẩn Gram + + Vi khuẩn có màu đỏ sau khi nhuộm Gram: Vi khuẩn Gram - 49 - Theo đặc tính của quá trình hô hấp + Sử dụng oxy tự do trong quá trình hô hấp: Vi khuẩn hiếu khí + Phát triển cả trong điều kiện hiếu khí và kị khí, có quá trình hô hấp nitrat: Vi khuẩn kị khí không bắt buộc. + Chỉ sống trong điều kiện kị khí, có quá trình hô hấp Sulfat: Vi khuẩn kị khí bắt buộc. 4.1.2.3. Sinh sản của vi khuẩn Vi khuẩn sinh sản bằng cách phân đôi tế bào. Sự phân chia tế bào xảy ra rất nhanh. Trong điều kiện môi trường thích hợp và không có các yếu tố kìm hãm thì một tế bào vi khuẩn sau 6 giờ có thể sinh ra 250.000 tế bào mới. Tuy nhiên, sự nhân lên của vi khuẩn không phải là vô tận, nó còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố. trong môi trường nuôi cấy, sự sinh sản của vi khuẩn sau một thời gian nhất định sẽ ngừng lại vì nhiều nguyên nhân như: thực ăn bị hết dần hoặc vi khuẩn có thể tiết ra những chất kìm hãm sự phát triển của chúng. Tốc độ phát triển của vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy tĩnh thay đổi theo thời gian và tuân theo một quy luật nhất định bao gồm 4 pha: Pha lag, pha logarit, pha ổn định và pha tử vong. Sự phát triển của vi khuẩn trong môi trường lỏng có thể quan sát sau khoảng 18-24 giờ nuôi cấy. Chúng có thể làm đục môi trường, tạo váng trên bề mặt hoặc lắng cặn ở đáy ống nghiệm. Trên các môi trường đặc, khuẩn lạc của các vi khuẩn thường nhỏ hơn khuẩn lạc của vi nấm, bề mặt nhẵn, bóng, ướt hoặc nhăn nheo, . Khuẩn lạc của vi khuẩn tạo sắc tố với các màu như: trắng (Staphylococcus albus), vàng (Staphylococcus aureus), hồng (Micrococcus), xanh (Pseudomonas aeruginosa), . Mỗi vi khuẩn có đặc tính riêng về hình dạng, kích thước, màu sắc khuẩn lạc. Các đặc tính này giúp cho việc xác định vi khuẩn trong quá trình kiểm nghiệm dược phẩm. 4.1.3. Vi nấm (Microfungi) 4.1.3.1. Đặc điểm: Vi nấm có cấu tạo tế bào nhân thật (Eucaryote). Tế bào vi nấm rất nhỏ, muốn quan sát cần dùng kính hiển vi. Nấm không có chất diệp lục, sống hoại sinh hoặc ký sinh, sinh sản vô tính hoặc hữu tính. Vi nấm bao gồm hai loại là nấm men và nấm mốc. Trong kiểm nghiệm vi sinh vật, cần phát hiện hai loại này có trong dược phẩm, thực phẩm. 4.1.3.2. Nấm men (Yeast): 50 Nấm men có cấu tạo đơn bào, sinh sản chủ yếu bằng nẩy chồi. Tế bào nấm men có kích thước, hình dạng khác nhau tùy loài. Chúng có thể hình cầu, bầu dục, hình quả chanh, hình ống, . Khuẩn lạc nấm men bao gồm nhiều cá thể thường thuộc một loài phát triển từ một cá thể mẹ tạo thành một khối. Khuẩn lạc nấm men thường to hơn khuẩn lạc vi khuẩn, bề mặt có nếp nhăn hoặc trơn nhẵn, không tạo sợi. Nấm men thường được sử dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm như làm bánh mỳ, bia, rượu, . Nhưng nhiều nấm men gây bệnh hoặc làm hỏng thực phẩm, thuốc. 4.1.3.3. Nấm mốc (Mold) Nấm mốc có cấu tạo sợi, sinh sản bằng bào tử, sống hoại sinh, chúng thường phát triển trên bề mặt cơ chất dưới dạng những lớp hình sợi, mạng nhện hoặc khối sợi bông. Sợi nấm rất nhỏ, đường kính trung bình 5 µ m, chiều dài có thể vài chục centimeters. Sợi nấm có vách ngăn hoăc không có vách ngăn. Toàn bộ sợi nấm và các nhánh phát triển từ một bào tử nấm rồi đan kết nhau thành một khối gọi là hệ sợi nấm. Trên môi trường thạch nuôi cấy, hệ sợi nấm phát triển thành một khối có tiết diện hình tròn hoặc gần tròn gọi là khuẩn lạc. Khuẩn lạc được đặc trưng bởi màu sắc của sợi nấm và của bào tử. Bề mặt khuẩn lạc có thể mượt, dạng hạt, dạng sợi hoặc xốp . Nấm sinh sản bằng bào tử: bào tử vô tính hoặc bào tử hữu tính. Sự sinh sản vô tính và hữu tính luôn đan kết nhau trong quá trình sinh trưởng của nấm. Vì vậy, nấm phát triển rất nhanh trên bề mặt các cơ chất. Nấm mốc thường gây nên những biến đổi về màu sắc, mùi vị, chất lượng của thuốc. Một số sinh các độc tố có hại cho người và động vật. 4.1.4. Sự ảnh hưởng của các yếu tố ngoại cảnh đối với quá trình phát triển của vi sinh vật Sinh trưởng và trao đổi chất của VSV liên quan chặt chẽ đến các điều kiện của môi trường bên ngoài. Các điều kiện này bao gồm hàng loạt các yếu tố khác nhau, tác động qua lại với nhau. Đa số các yếu tố đều có một đặc tính, tác dụng chung biểu hiện ở ba điểm hoạt động: tối thiểu, tối ưu, cực đại. Khi một yếu tố có tác dụng tối ưu, VSV phát triển với tốc độ cực đại. Nếu yếu tố này có tác dụng cực đại, VSV ngừng sinh trưởng và thường chết. 51 Các yếu tố bên ngoài có ảnh hưởng đến đời sống của VSV là vật lý, hóa học và sinh học, trong đó, các yếu tố vật lý là đáng chú ý nhất. Yếu tố vật lý bao gồm nhiệt độ, độ ẩm và ánh sáng. 4.1.4.1. Nhiệt độ: Nhiệt đố là yếu tố quan trong nhất đối với đời sống VSV. Mỗi loài VSV có một giới hạn nhiệt độ phát triển thích hợp. Nói chung đối với VSV, nhiệt độ phát triển thường từ 15 - 45 0 C. Ở nhiệt độ cao sẽ làm thay đổi quá trình trao đổi chất của VSV, VSV bị chết. Các tế bào sinh dưỡng thường bị chết ở nhiệt độ 60 0 C trong khoảng 20 - 30phút. Các bào tử chỉ bị tiêu diệt ở nhiệt độ 120 0 C trong khoảng 30 - 40phút. Tính chất này được ứng dụng trong việc tiệt trùng. Nhiệt độ thấp chỉ có tác dụng kìm hãm sự phát triển của VSV (trừ VSV ưa lạnh). 4.1.4.2. Độ ẩm: Hầu hết quá trình sống của VSV có liên quan đến nước. Khi thiếu nước xảy ra hiện tượng loại nước khỏi tế bào VSV, trao đổi chất bị giảm, tế bào sẽ chết. Vì vậy, để bảo quản thực phẩm, dược phẩm, dược liệu tránh khỏi tác động của VSV cần có một giới hạn độ ẩm nhất định. 4.1.4.3. Ánh sáng: Ánh sáng mặt trời gồm các tia bức xạ như: tử ngoại, hồng ngoại, gamma có tác dụng phá hủy tế bào VSV, đặc biệt là tia tử ngoại. Bức xạ UV bước sóng 260nm có tác dụng diệt khuẩn mạnh nhất. Dưới ảnh hưởng của UV, VSV bị chết hoặc đột biến tùy theo liều lượng. Để ngăn ngừa tác hại của VSV đối với thuốc, thực phẩm, các tác nhân vật lý trên cần được vận dụng trong quá trình sản xuất và bảo quản nhằm hạn chế tối đa số lượng VSV gây nhiễm ban đầu. Đồng thời các chế phẩm phải được quy định giới hạn VSV cho phép. 4.1.5. Môi trường nuôi cấy VSV Môi trường nuôi cấy là những chất dinh dưỡng thích hợp nhằm đảm bảo cho VSV sinh trưởng và phát triển. Môi trường cần có ba điều kiện sau: đầy đủ chất dinh dưỡng theo yêu cầu thí nghiệm, có pH trong khoảng quy định và phải vô trùng. Môi trường gồm ba loại: 52 - Môi trường tự nhiên: Nguyên liệu có nguồn gốc từ động vật hay thực vật (như cao thịt, cao men, tinh bột, .). Thành phần có thể thay đổi tùy theo nguồn gốc nguyên liệu. - Môi trường tổng hợp: bao gồm các hóa chất thuần khiết đã được quy định và thường hòa tan trong nước. - Môi trường bán tổng hợp: trong thành phần môi trường có cả nguyên liệu tự nhiên và tổng hợp. Độ chính xác của kết quả thí nghiệm phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng môi trường. 4.1.5.1. Phương pháp pha chế môi trường. Khi pha chế môi trường cần tiến hành qua 6 bước sau: - Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất: Dụng cụ pha chế môi trường tốt nhất là bằng men hoặc thủy tinh. Các dụng cụ phải rửa sạch hoặc tiệt trùng nóng trước khi sử dụng. Nguyên liệu pha chế môi trường phải đảm bảo chất lượng, hóa chất phải tinh khiết. - Cân đong nguyên liệu: Các nguyên liệu phải được cân đong chính xác, nhất là những hóa chất hoặc nguyên tố vi lượng có thể gây ức chế vi khuẩn (muối, mật, sắt, .) phải được cân bằng cân phân tích. - Hòa tan nguyên liệu: thường dùng nước cất hoặc nước khử khoáng để pha môi trường. Các hóa chất được hòa tan nóng, lạnh tùy theo tính chất của chúng. Môi trường không có thạch nên hòa tan lạnh hoặc nóng nhẹ. Môi trường có thạch cần đun cho thạch tan hoàn toàn sau đó mới cho các thành phần khác vào. - Điều chỉnh pH: Khi điều chỉnh pH của môi trường nên thực hiện ở nhiệt độ 45-50 0 C để pH ít bị thay đổi sau khi tiệt trùng. Các dung dịch NaOH 1N và HCl 1N thường được sử dụng để điều chỉnh pH. Sau khi điều chỉnh pH cần bổ sung nước cho đủ thể tích quy định. - Làm trong môi trường: Các môi trường lỏng (bao gồm các chất hòa tan) phải trong để dễ quan sát sự phát triển của VSV. Sau khi hòa tan các chất, nếu môi trường đục cần phải lọc vải gạc hoặc giấy. - Đóng ống tiệt trùng: Môi trường được cho vào ống nghiệm bình nón hoặc bình cầu, tùy theo yêu cầu thí nghiệm. Khi đóng ống, không được để môi trường dính vào miệng ống hoặc bình. Môi trường cần phải được tiệt trùng ngay sau khi đóng gói, nếu để lâu tạp khuẩn sẽ phát triển làm hỏng môi trường. Các môi trường thông thường được tiệt trùng ở 110 0 C trong 30 phút hoặc 120 0 C trong 20 phút. 53 Môi trường của các chất dễ bị phá hủy bởi nhiệt cần được tiệt trùng ở nhiệt độ thấp bằng phương pháp Tyndall, Pasteur, hoặc dùng lọc vi khuẩn. Môi trường được lấy ra khỏi nồi hấp ngay sau khi tiệt trùng xong. Nếu để lâu trong nồi hấp, môi trường bị đổi màu và giảm chất lượng. Người ta có thể pha chế môi trường bằng hỗn hợp bột môi trường có sẵn chứa đầy đủ các thành phần theo yêu cầu, chất lượng đảm bảo và ổn định. Khi làm thí nghiệm, môi trường được pha với nước theo tỷ lệ quy định nhưng phải dùng nước mới cất hoặc nước khử khoáng, trung tính để pha chế. 4.1.5.2. Bảo quản môi trường Môi trường bột khô được giữ ở nhiệt độ 10-12 0 C trong điều kiện khô, tránh ánh sáng. Môi trường đã pha chế được bảo quản ở 4-10 0 C trong 1-2 tháng tùy theo thành phần môi trường. 4.1.5.3. Các phương pháp tiệt trùng Tiệt trùng là một quá trình làm cho một vật hoặc một sản phẩm không còn VSV sống được. Tiệt trùng được thực hiện bằng phương pháp vật lý và hóa học. Chọn phương pháp tiệt trùng phụ thuộc vào tính chất lý hóa và độ bền vững của môi trường. - Tiệt trùng bằng nhiệt khô: Phương pháp này được sử dụng để tiệt trùng các dụng cụ thí nghiệm bền với nhiệt như bông băng, vải, gạc, dụng cụ thủy tinh. Điều kiện tiệt trùng là 180 0 C/ 30phút hoặc 170 0 C/ 1giờ hoặc 160 0 C/ 2 giờ. Các dụng cụ thủy tinh để đóng môi trường phải được tiệt trùng khô trước khi dùng - Tiệt trùng bằng hơi nước: Phương pháp dùng nhiệt ướt thường được dùng để tiệt trùng môi trường nuôi cấy và các dụng cụ phẫu thuật. Môi trường thường được tiệt trùng bằng nồi hấp ở 121 0 C/ 15phút. Các môi trường dễ bị hỏng bởi nhiệt như môi trường có đường, sữa, bia, máu, . cần tiệt trùng ở nhiệt độ thấp bằng các phương pháp sau: Tiệt trùng gián đoạn (phương pháp Tyndall): Môi trường được hấp 3 - 4 lần ở nhiệt độ không quá 100 0 C trong 30 - 40phút, cách nhau 24giờ. Giữa hai lần hấp cho môi trường vào ủ ở 28-32 0 C/ 24giờ cho bào tử nảy mầm. Các bào tử sống sót nảy mầm sẽ bị tiêu diệt ở lần hấp tiếp theo. Khử trùng nhiệt độ thấp (phương pháp Pasteur): Đun cách thủy môi trường 60 0 C/ 30phút hoặc 73 0 C/ 15phút sau đó làm lạnh đột ngột dưới 10 0 C. Phương pháp này không diệt được bào tử. - Phương pháp lọc: được dùng để tiệt trùng các chất dễ bị phá hủy bởi nhiệt. Cho chất lỏng chảy qua màng lọc có kích thước lỗ lọc ≤ 0,22 µ m. Phần chảy qua phễu 54 được đựng trong các dụng cụ vô trùng. Thiết bị lọc và màng lọc phải được tiệt trùng trước khi dùng. - Phương pháp dùng tia bức xạ: Tia tử ngoại được dùng nhiều nhất để tiệt trùng các buồng pha chế, tủ cấy VSV. Đèn tử ngoại phải được chiếu trực tiếp, thẳng góc với nơi làm thí nghiệm và liều lượng chiếu phải đủ với diện tích buồng. Tia UV ít có tác dụng diệt nấm, vì vậy khi khử trùng buồng pha chế cần phối hợp thêm phương pháp cùng hóa chất để khử nấm. 4.2. Xác định COLIFORMS Coliforms là một nhóm bao gồm một số vi khuẩn Gram âm không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc, có khả năng sinh hơi ở 37 0 C trong 24–48 giờ ở nhiệt độ nuôi cấy thích hợp. Vi khuẩn nhóm Coliforms bao gồm: E. Coli, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella, Serratia. Coliforms được xem là nhóm VSV chỉ thị, số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác, biểu thị cho mức độ không đảm bảo của quả trình sản xuất và tình trạng vệ sinh sản xuất. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng khi số Coliforms trong thực phẩm tăng cao thì khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác cũng cao. Coliforms chịu nhiêt (Coliforms ưa nhiệt, Coliforms phân) có khả năng lên men lactozơ sinh hơi trong khoảng 24 giờ ở nhiệt độ 44 0 C trong môi trường. Coliforms có khả năng sinh indol khi được ủ khoảng 24 giờ ở nhiệt độ 44,5 0 C trong canh trường Tryphon. Coliforms phân là một thành phần của hệ vi sinh đường ruột ở người và các động vật máu nóng khác. Xác đinh Coliforms và E.Coli cho biết mức độ ô nhiễm và tình trạng vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nước uống cũng như chỉ thị sự ô nhiễm phân trong sản phẩm. 4.2.1. Phương pháp MPN 4.2.1.1. Nguyên tắc Mẫu được pha loãng ít nhất ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp nhau mỗi độ pha loãng được cấy trong 3 (hoặc 5) ống nghiệm lặp lại có chứa môi trường tăng sinh chọn lọc có ống Durham. Sau thời gian nuôi cấy, quan sát, theo dõi và sinh hơi và đổi màu để định tính sự hiện diện của từng ống nghiệm: đây là các ống dương tính. Ghi nhận các ống dương tính ở mỗi độ pha loãng và cấy tiếp sang môi trường khẳng định BGBL 2%. Từ các ống nghiệm có phản ứng dương tính, tra bảng Mac Grady để suy ra số lượng Coliforms hiện diện trong 1g (1ml) mẫu phân tích. 4.2.1.2. Dụng cụ, thiết bị - Dụng cụ chuẩn bị mẫu - Ống Durham - Ống nghiệm - Pipet - Tủ sấy - Cồn 70 0 - Tủ hấp - Tủ ấm 55 - Tủ lạnh - Kéo, kẹp 4.2.1.3. Hóa chất, môi trường − Môi trường TLS (Trytose Lauryl Sulfat). − Môi trường canh thang lục sáng lactozơ mật bò 2% (Brilliant Green bile lactose Broth). − Môi trường lỏng đã được pha chế trước, cho vào ống nghiệm chứa ống Durham úp ngược. Sau khi khử trùng, chỉ sử dụng các ống nghiệm không có bọt khí bên trong ống Durham. 4.2.1.4. Tiến hành − Chuẩn bị dung dịch gốc và các dung dịch pha loãng. Pha loãng mẫu cho đến khi có nồng độ pha loãng 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 . − Gieo cấy: Cấy 1ml mẫu đã pha loãng ở nồng độ 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 vào các ống nghiệm có chứa môi trường TLS, mỗi độ pha loãng làm 3 ống nghiệm lặp lại. − Nuôi ủ: Đưa các ống đã cấy vào tủ ấm ở nhiệt độ 37 0 C 1 0 C trong thời gian 24 - 48 giờ. Quan sát và ghi nhận các ống có sinh khí và đục (kết quả dương tính). − Dùng que cấy vòng chuyển mẫu từ các ống nghiệm dương tính sang các ống nghiệm có chứa môi trường BGBL 2%. Để các ống đã cấy vào tủ ấm ở nhiệt độ 37 0 C 1 0 C trong thời gian 48 giờ. Với mỗi độ pha loãng, tính tổng số (kết quả dương tính). sinh khí và đục ((kết quả dương tính). 4.2.1.5. Kết quả Dựa vào số ống có kết quả dương tính của mỗi độ pha loãng, xác định số đặc trưng và sau đó là chỉ số MPN, từ đó tính được số Coliforms có trong 1g(1ml) mẫu phân tích. 4.2.2. Phương pháp đếm khuẩn lạc 4.2.2.1. Nguyên tắc Mẫu đã được đồng nhất hóa được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp có chứa lactozơ. Trên môi trường Endo có chứa natri sulfit và fucshin, có khả năng ức chế các vi khuẩn gram (+). Trong quá trình phát triển trên môi trường này, Coliforms lên men đường lactozơ tạo thành aldehyt và acid, aldehyt tác động đến phức chất fucshin- sulfit và giải phóng fucshin. Fucshin nhuộm các khuẩn lạc từ màu hồng đến màu đỏ cánh sen, tròn, bờ đều, có thể có ánh kim hoặc không. 4.2.2.2. Dụng cụ và thiết bị - Đĩa petri - Dụng cụ đồng nhất mẫu - Ống nghiệm - Pipet - Tủ sấy - Cồn 70 0 - Tủ hấp - Tủ ấm - Tủ lạnh - Kéo, kẹp 4.2.2.3. Hóa chất, môi trường - Môi trường thạch lactose lục đỏ sáng mật bò (Vilolet Bile Lactose Red Agar) - Môi trường EMB [...]... hành Nuôi c y tăng sinh: - Cân 25g m u (n u là s n ph m c) ho c 10ml m u (n u là s n ph m l ng) vào môi trư ng tăng sinh, l c u, yên 370C trong 24 gi - Sau 24 gi , Salmonella làm c môi trư ng tăng sinh, có th có c n và t o váng m ng, làm bi n màu môi trư ng Muller Kauffman t xanh l c sang vàng Phân l p: - C y ria canh trư ng t nh ng ng tăng sinh nghi ng lên ĩa petri ch a môi trư ng phân l p C n c y... hành Nuôi c y tăng sinh: - Cân 25g m u (n u là s n ph m c) ho c 10ml m u (n u là s n ph m l ng) vào môi trư ng tăng sinh, l c u, yên 370C trong 24 gi - Sau 24 gi , Shigella làm c môi trư ng tăng sinh, có th có c n và t o váng m ng, làm bi n màu môi trư ng Muller Kauffman t xanh l c sang vàng Phân l p: - C y ria canh trư ng t nh ng ng tăng sinh nghi ng lên ĩa petri ch a môi trư ng phân l p C n c y thưa... khu n l c dư i kính hi n vi là vi khu n Gram (+), t o thành t ng chùm như các chùm nho thì nghi ng có th là Môi trư ng Baird-Paker và nên làm ph n ng sinh hóa coagulase kh ng nh Phép th kh ng nh: ây là ph n ng r t quan tr ng xác nh Staphylococcus aureus Cho vào ng nghi m c nh (7mm) 0,5ml huy t tương th , dung que c y vòng chuy n vi khu n t nh ng khu n l c nghi ng trên môi trư ng phân l p L c u cho 2 môi... trên nhân v i 10 ho c 100 63 4.7 Xác nh tr c khu n SALMONELLA Salmonella là lo i tr c khu n, gram(-), y m khí tùy ti n, dài 2-3µm, không sinh bào t , lên men glucozơ và manitol sinh axit nhưng không lên men saccarozơ và lactozơ, không sinh Indol, không phân gi i ure, sinh H2S Salmonella có nhi u trong các lo i th t tươi s ng, cá, tr ng, s a, các lo i th c ăn cho gia súc 4.7.1 Nguyên t c S lư ng Salmonella... m l p l i có ch a môi trư ng tăng sinh ch n l c TLS Sau th i gian nuôi c y, quan sát và ghi nh n các ng dương tính và c y ti p sang môi trư ng EC Sau khi ã nuôi c y nhi t 440C thì theo dõi, ki m tra có sinh Indol không m s ng nghi m nuôi c y trên môi trư ng EC dương tính ng v i các ng có sinh Indol, tra b ng Mac Grady suy ra s lư ng E Coli hi n di n trong m u phân tích 4.3.1.2 D ng c , thi t b - D... cũng chưa th kh ng nh là không có Staphylococcus aureus trong m u phân tích vì vi khu n này lư ng r t nh Trong trư ng h p này nên tăng lư ng vi khu n này b ng cách nuôi c y trên môi trư ng Chapman l ng, sau ó m i nuôi c y trên môi trư ng th ch Chapman ch n l c Như v y ta có th xác nh ư c s lư ng ít nh t c a Staphylococcus aureus trong th tích s n ph m ban u 4.4.2 D ng c , thi t b - D ng c chu n b m u... u th y - Chu n b m u th c n thi t Trong trư ng h p d oán là lư ng vi khu n Staphylococcus aureus ít thì có th nuôi c y tăng sinh như sau: l y 1ml m u nguyên ch t hay dung d ch huy n phù (n u m u d ng r n) cho vào ng nghi m có ch a 9ml môi trư ng Chapman l ng và nuôi trong t m nhi t 370C trong th i gian 24gi N u có s phát tri n c a vi sinh v t (môi trư ng b c) thì ti p t c các thí nghi m ti p theo -... trư ng c ư c xem là dương tính Các khu n l c Clostridium Welchi trên môi trư ng này có màu en, tròn u 4.5.3 K t qu T t c các khu n l c en, to, nh m c trong ng nghi m u là vi khu n k khí sinh H2S 4.6 Xác nh t ng s VI KHU N HI U KHÍ SINH H2S 4.6.1 Môi trư ng, hóa ch t - Môi trư ng nư c pepton - Gi y có t m acetat chì 4.6.2 Ti n hành - Pha loãng m u: Tùy theo m c nhi m b n c a m u (ví d nư c m m) mà pha... kho ng khí trong n n th ch: có sinh hơi Trên môi trư ng MIU, Salmonella: - M c lan ra kh i ư ng c y th ng: có tính di ng - Không làm bi n màu môi trư ng: urea (-) Cho lên b m t môi trư ng MIU kho ng 0,5ml thu c th Kovacs, Salmonella: - Không làm thu c th : Indol (-) 4.7.5 K t qu Xác nh có Salmonella khi m u ch a vi khu n làm c môi trư ng tăng sinh t o khu n l c trên mô phân l p, có d ng tr c khu n gram... m i ng u treo m t m nh gi y t m chì acetat Chì acetat có c tính i v i vi khu n, vì v y không nên gi y ch m vào dung d ch mu i 370C trong 24 – 48 gi , n u có vi khu n hi u khí sinh H2S thì gi y t m chì acetat s có màu en 4.6.3 K t qu ng môi trư ng nuôi c y m u chưa pha loãng, n u gi y t m chì acetat có màu en thì ư c lư ng có 10000 vi khu n hi u khí H2S ng môi trư ng nuôi c y m u pha loãng 10-1, 10-2, . CHƯƠNG 4 PHÂN TÍCH VI SINH 4.1. Đại cương về vi sinh vật 4.1.1. Đặc điểm chung của vi sinh vật Vi sinh vật(VSV) là tên gọi chung để chỉ tất cả các sinh vật. ngàn loài vi tảo; 2,5 ngàn loài vi khuẩn lam; 1,5 ngàn loài vi khuẩn; 1,2 ngàn loài virus và ricketxi . 48 Nhà vi sinh học Nga nổi tiếng đã vi t “VSV