Tạo khối cầu đa bào ung thư biểu mô tuyến vú dòng MCF 7

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Đắc Tú TẠO KHỐI CẦU ĐA BÀO UNG THƯ BIỂU MƠ TUYẾN VÚ DỊNG MCF-7 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội - 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Đắc Tú TẠO KHỐI CẦU ĐA BÀO UNG THƯ BIỂU MƠ TUYẾN VÚ DỊNG MCF-7 Chun ngành : Sinh học Thực nghiệm Mã số : 60420114 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN: TS Hoàng Thị Mỹ Nhung Hà Nội - 2014 Luận văn cao học MỞ ĐẦU Sự đời loại thuốc có khả tiêu diệt ngăn chặn phát triển tế bào ác tính đồng thời khơng gây độc tính thấp với mơ lành mở hội cứu sống hàng chục triệu người giới phải chống chọi với bệnh ung thư hiểm nghèo Với mục tiêu đó, quy trình sàng lọc dược phẩm tất phịng thí ngiệm, viện nghiên cứu, cơng ty sản xuất dược phẩm giới phải tuân theo quy định tiêu chuẩn nghiêm ngặt quan tổ chức kiểm nghiệm dược phẩm Một quy trình kiểm ngiệm thuốc chống ung thư nói riêng loại thuốc khác nói chung kéo dài từ 10-30 năm, gồm nhiều giai đoạn khác nhau, từ phát thuốc, sàng lọc tiền lâm sàng, lâm sàng …với số lượng chất, đối tượng, mục đích thử nghiệm khác nhằm đảm bảo loại thuốc trở thành thương phẩm đạt hiệu điều trị cao có tác dụng phụ cho người bệnh Sàng lọc tiền lâm sàng dòng tế bào ni cấy đơn lớp in vitro (2D) đóng vai trị khơng thể thay giai đoạn kiểm nghiệm thuốc Với số lượng chất lên tới hàng vạn, mơ hình ni cấy tế bào đơn lớp cho phép nhanh chóng tìm nhóm chất có hiệu điều trị tốt Tuy nhiên, thực tế cho thấy nhiều chất có độc tính mơ hình đơn lớp lại khơng có tác dụng thử nghiệm đối tượng động vật khơng thể tiếp tục phát triển thành thuốc điều trị Vấn đề bắt nguồn từ việc tế bào đơn lớp thiếu hầu hết đặc điểm khối mô ung thư in vivo cấu trúc không gian, tương tác tế bào, tương tác môi trường… Chính vậy, việc phát triển mơ hình in vitro mơ xác cấu trúc đặc tính khối u thể làm tăng đáng kể hiệu sàng lọc, hạn chế số lượng thuốc phải thử nghiệm động vật thí nghiệm người tình nguyện, từ giảm tối thiểu thời gian chi phí cho việc phát triển loại Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học thuốc tránh trở ngại liên quan tới đạo đức khoa học với tổ chức bảo vệ động vật, tổ chức nhân quyển, tổ chức y khoa Để góp phần thực mục tiêu Việt Nam, chúng tơi tiến hành thực đề tài: “Tạo khối cầu đa bào ung thư biểu mơ tuyến vú dịng MCF-7” Với mục tiêu:  Tạo khối cầu đa bào ung thư từ dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến vú MCF-7  Nghiên cứu đặc điểm hình thái, cấu trúc, động học tăng trưởng khối cầu đa bào ung thư MCF-7 gây tạo  Sử dụng mô hình khối cầu đa bào ung thư MCF-7 để kiểm tra độc tính hệ thuốc nano (Ptx-Cur)-Co  Nghiên cứu xâm nhập phân bố hệ thuốc (Ptx-Cur)-Co vào bên khối cầu đa bào ung thư MCF-7 Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học 1.TỔNG QUAN 1.1.Sàng lọc thuốc 1.1.1.Quy trình sàng lọc thuốc 1.1.1.1.Quy trình sàng lọc thuốc tiêu chuẩn Tất loại thuốc từ phịng thí nghiệm đến trở thành sản phẩm thương mại phải trải qua quy trình đánh giá nghiêm ngặt tổ chức kiểm nghiệm dược phẩm với mục đích đảm bảo an tồn hiệu điều trị Đây đường kéo dài qua nhiều giai đoạn với thời gian từ vài năm vài chục năm Dưới quy trình sàng lọc chung theo quy chuẩn quan kiểm nghiệm dược phẩm uy tín giới (Hình 1) [72-74] Bước để công ty dược hay viện nghiên cứu phát triển loại thuốc tiến hành sàng lọc hợp chất có tiền từ hàng vạn hợp chất ban đầu mơ hình in vitro (drug discovery) Tiếp đó, hợp chất đưa vào thử nghiệm tiền lâm sàng (pre-clinical) mơ hình động vật với cấp độ tăng dần Trong giai đoạn này, tổ chức kiểm nghiệm dựa kết kiểm tra tiền lâm sàng để định chất có phép để đưa vào thử nghiệm người hay khơng Tồn giai đoạn diễn khoảng 6-7 năm Khi loại thuốc cho phép để tiến hành sàng lọc người bệnh hay gọi sàng lọc lâm sàng (clinical), phải trải qua giai đoạn thử nghiệm với quy mô tăng dần thời gian khoảng năm:  Giai đoạn I: tiến hành người khỏe mạnh nhằm kiểm tra tác dụng phụ thuốc chuyển hóa tiết thuốc thể  Giai đoạn II: tiến hành với mục đích kiểm tra hiệu thu thập số liệu sơ hoạt động thuốc người bệnh Bệnh nhân điều trị với loại thuốc Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học thử nghiệm so sánh với bệnh nhân không điều trị điều trị với loại thuốc khác song song với đánh giá tác dụng phụ  Giai đoạn III: kiểm tra tính an tồn hiệu tiếp tục tiến hành nhóm người bệnh khác nhau, liều lượng thuốc khác kết hợp điều trị với thuốc khác  Khi đạt yêu cầu ba giai đoạn trên, loại thuốc thử nghiệm phải hoàn thành số thủ tục pháp lý khoa học khoảng thời gian năm ruỡi để thức trở thành sản phẩm thương mại Hình Thời gian trung bình cho quy trình phát triển thuốc Quá trình sàng lọc dược phẩm diễn vài năm tới vài chục năm, từ hàng vạn chất ban đầu tuyển chọn vài chất đạt yêu cầu kiểm định[74] 1.1.1.2.Quy trình sàng lọc thuốc tiền lâm sàng Sàng lọc tiền lâm sàng giai đoạn quan trọng tồn quy trình, với mục đích xác định hiệu điều trị, độc tính, liệu dược động học, tiến hành hai đối tượng dịng tế bào ung thư ni cấy in vitro chuột mang khối Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học u hình thành từ dòng tế bào ung thư người Quá trình sàng lọc tiền lâm sàng chất có hoạt tính chống ung thư gồm giai đoạn sau [72]:  Giai đoạn 1: Các loại thuốc trước tiên thử nghiệm với ba dòng tế bào ung thư người với nồng độ thử nghiệm 48h Những chất có khả ức chế tăng trưởng hay nhiều dòng tế bào lựa chọn cho giai đoạn  Giai đoạn 2: Trong giai đoạn này, thuốc thử nghiệm tiếp xúc với khoảng 60 dòng tế bào ung thư người với phổ rộng bao gồm ung thư phổi, đại tràng, tuyến tiền liệt, buồng trứng, vú, thận với năm nồng độ cách biệt Nếu thuốc có khả tiêu diệt chọn lọc dòng tế bào ung thư định nhiều dòng tế bào khác với chế tác động hay có hiệu gây độc nồng độc thấp chuyển sang giai đoạn  Giai đoạn 3: Ở pha cuối sàng lọc tiền lâm sàng, chất có tiềm sử dụng để điều trị cho chuột mang khối u rắn da Những loại thuốc có khả tiêu diệt làm chậm trình phát triển khối u với độc tính tác dụng phụ thấp cho đối tượng thí nghiệm đưa lên sàng lọc người bệnh (lâm sàng) 1.1.2.Các mơ hình sàng lọc thuốc tiền lâm sàng Các mơ hình đóng vai trị vơ quan trọng việc sàng lọc dược phẩm Tùy vào giai đoạn trình sàng lọc thuốc, mơ hình lựa chọn cách thích hợp nhằm đảm bảo thử nghiệm tiến hành nhanh chóng, hiệu mà đảm bảo vấn đề đạo đức khoa học Với số lượng chất phải sàng lọc khâu lên tới hàng vạn việc sử dụng mơ hình in vitro tế bào đơn lớp, quan nuôi cấy cần thiết để nhanh chóng khu trú nhóm chất có hiệu thu thập số liệu sơ độc tính, tác dụng Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học không mong muốn chúng trước đưa lên mơ hình cấp độ cao Từ kết thu ban đầu, kiểm tra mơ hình động vật – mơ hình in vivo tiết kiệm thời gian, kinh phí nhiều thơng qua giảm thiểu số lượng chất, số lượng động vật tham gia thử nghiệm 1.1.2.1.Mơ hình in vitro Mơ hình ni cấy quan Đây loại mơ hình ni cấy cổ điển sử dụng từ năm 1950 Các quan tách khỏi thể, đem nuôi cấy in vitro Sau đó, chúng tương tác với hợp chất cần thử Ưu điểm mơ hình trì tính ngun vẹn mơ mối quan hệ tế bào với tế bào, nhờ mà có tính tương đồng với điều kiện in vivo Tuy nhiên, khó khăn khác biệt mẫu vật mà việc đánh giá hiệu thuốc có nhiều sai số, việc sử dụng mơ hình bị hạn chế, khó để áp dụng vào sàng lọc thuốc quy mơ lớn [4] Hình Ni cấy tinh hồn chuột để sản xuất tinh trùng in vitro (A) Các mảnh tinh hồn ni giá thể agarose mơi trường ni cấy có bổ sung KBR (B) Mơ tinh hồn ni cấy sau ngày Bar=20µm [38] Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học Mơ hình ni cấy tế bào đơn lớp (2D) Đây mơ hình ni cấy phổ biến tất phịng thí nghiệm thời giới nhiều thập kỷ qua Do thử nghiệm độc tính ban đầu tiến hành sinh thiết khối u nuôi cấy nhân tạo mơi trường có thành phần khơng xác định khiến q trình định lượng khó khăn Năm 1950, nhờ phát triển công nghệ nuôi cấy tế bào thành dạng đơn lớp 2D đĩa petri thủy tinh nhựa, kết hợp với phát triển mơi trường có thành phần xác định mặt hóa học nên quy trình sàng lọc thuốc tiến hành đơn giản tế bào nuôi cấy 2D Sử dụng loại thuốc nhuộm protein cho phép xác định mối quan hệ đáp ứng liều dòng tế bào khác với nồng độ thuốc thử khác [48] Các tế bào phân lập đem nuôi cấy in vitro thường phát triển thành dạng trôi bám dính hỗn hợp hai loại Các loại tế bào ung thư sống trôi tế bào u lympho, tế bào ung thư máu hay tế bào ung thư mơ liên kết sarcoma Đa số dịng tế bào sống dạng bám dính nguyên bào sợi, dịng tế bào ung thư biểu mơ Tuy nhiên có số tế bào sống dạng hỗn hợp bám dính, trơi tế bào ung thư biểu mô phổi 3LL [12, 30, 48] Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học Hình Hai dạng tế bào ni cấy (A) Dịng tế bào ung thư cổ tử cung người HeLa bám dính đơn lớp bề mặt giá thể (B) Dịng tế bào ni cấy dạng trơi Sp2 [71] Sử dụng mơ hình tế bào 2D sàng lọc có nhiều ưu điểm thời gian sàng lọc ngắn, cho phép thao tác với nhiều dòng tế bào, nhiều hợp chất khác với dải nồng độ rộng thời điểm Tuy nhiên, mơ hình có nhược điểm tương tác tế bào ung thư với hợp chất theo chiều, thiếu tương tác tế bào ung thư với hệ miễn dịch hệ miễn dịch với hợp chất Như vậy, mơ hình khơng mơ điều kiện in vivo thể [48] Mơ hình ni cấy ba chiều (3D) Mơ hình ni cấy 3D mơ hình mà tế bào tổ chức không gian ba chiều với hỗ trợ giá thể sinh học nhằm mô cách xác cấu trúc khối mô thực thể sinh học Trong mô hình 3D, tế bào khơng thể tương tác không gian chúng với tế bào xung quanh với giá thể sinh học, chất ngoại bào mà cịn thể xác phản ứng với điều kiện môi trường, thuốc thử nghiệm Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học 5.KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1.Kết luận Với kết thu được, đưa số kết luận sau:  Gây tạo thành công khối cầu đa bào ung thư từ dịng tế bào ung thư biểu mơ tuyến vú MCF-7 phương pháp giọt treo với mật độ tế bào từ 5x102-2x104 tế bào/giọt treo, nồng độ 5x103 tế bào thích hợp cho thử nghiệm  Xác định thời gian sống khối cầu đa bào ung thư MCF-7 khoảng 28 ngày, lõi hoại tử xuất vào khoảng ngày thứ 5-6, tăng trưởng kích thước khối diễn mạnh khoảng ngày 2-5  Hệ thuốc (Ptx-Cur)-Co có độc tính mạnh hợp chất thử nghiệm khối cầu đa bào ung thư MCF-7 với giá trị IC50 9,4µg/ml, mạnh 40 lần so với paclitaxel đơn độc  Đã nghiên cứu xâm nhập hệ thuốc vào khối cầu đa bào ung thư theo thời gian dựa khả phát huỳnh quang tự nhiên Curcumin 5.2.Kiến nghị Để hoàn thiện phát triển nghiên cứu này, đề xuất:  Tiến hành gây tạo mơ hình khối cầu đa bào ung thư dòng tế bào ung thư khác  Phát triển mơ hình ni cấy ba chiều phức tạp từ tảng mơ hình khối cầu đa bào ung thư MCF-7 Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm 75 Luận văn cao học TÀI LIỆU THAM KHẢO Barasoain I, Diaz JF, Andreu JM (2010), Chapter 19 - Fluorescent Taxoid Probes for Microtubule Research, Academic Press, Bjerkvig R (1992), "Spheroid culture in cancer research" Boca Raton Publisher, Vol (p pp.135-158 Bourrat-Floeck B, Groebe K, Mueller-Klieser W (1991), "Biological response of multicellular emt6 spheroids to exogenous lactate" International Journal of Cancer, 47 (5), p 792-799 Chakraborty, B.S (2001), "7 - Cancer drug development - Key regulatory considerations" Health Administrator, 20 (p pp 29-36 Charafe-Jauffret E, Ginestier C, Monville F, Finetti P, Adelaide J, Cervera N, Fekairi S, Xerri L, Jacquemier J, Birnbaum D, Bertucci F (2005), "Gene expression profiling of breast cell lines identifies potential new basal markers" Oncogene, 25 (15), p 2273-2284 Chignell CF, Bilskj P, Reszka KJ, Motten AG, Sik RH, Dahl TA (1994), "Spectral And Photochemical Properties Of Curcumin" Photochemistry and Photobiology, 59 (3), p 295-302 Choi H, Chun Y-S, Kim S-W, Kim M-S, Park J-W (2006), "Curcumin Inhibits Hypoxia-Inducible Factor-1 by Degrading Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator: A Mechanism of Tumor Growth Inhibition" Molecular Pharmacology, 70 (5), p 1664-1671 Choi M-R, Stanton-Maxey KJ, Stanley JK, Levin CS, Bardhan R, Akin D, Badve S, Sturgis J, Robinson JP, Bashir R, Halas NJ, Clare SE (2007), "A Cellular Trojan Horse for Delivery of Therapeutic Nanoparticles into Tumors" Nano Letters, (12), p 37593765 de Ridder L (1997), "Autologous confrontation of brain tumor derived spheroids with human dermal spheroids" Anticancer research, 17 (6B), p 4119-4120 10 Donghui Jing, Lye T Lock, Tzanakakis ES (2010), "Scalable Stirred-Suspension Bioreactor Culture of Human Pluripotent Stem Cells " Tissue Engineering, 16 (2) Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm 76 Luận văn cao học 11 Durand R (1976), "Cell Cycle Kinetics In An In Vitro Tumor Model" Cell Proliferation, (5), p 403-412 12 Freshney, R.I (2005), "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique" Willey Blackwell, 5th edition 13 Friedrich J, Ebner R, Kunz-Schughart LA (2007), "Experimental anti-tumor therapy in 3-D: Spheroids – old hat or new challenge?" International Journal of Radiation Biology, 83 (11-12), p 849-871 14 Friedrich J, Eder W, Castaneda J, Doss M, Huber E, Ebner R, Kunz-Schughart LA (2007), "A Reliable Tool to Determine Cell Viability in Complex 3-D Culture: The Acid Phosphatase Assay" Journal of Biomolecular Screening, 12 (7), p 925-937 15 Friedrich J, Seidel C, Ebner R, Kunz-Schughart LA (2009), "Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach" Nat Protocols, (3), p 309-324 16 Gurski LA, Jha AK, Zhang C, Jia X, Farach-Carson MC (2009), "Hyaluronic acidbased hydrogels as 3D matrices for in vitro evaluation of chemotherapeutic drugs using poorly adherent prostate cancer cells" Biomaterials, 30 (30), p 6076-6085 17 Hamer Philip C De W, Jonker A, Leenstra S, Ruijter JM, Noorden CJFV (2005), "Quantification of Viability in Organotypic Multicellular Spheroids of Human Malignant Glioma using Lactate Dehydrogenase Activity: A Rapid and Reliable Automated Assay" Journal of Histochemistry & Cytochemistry, 53 (1), p 23-34 18 Haycock JW (2010), "3D Cell Culture: A Review of Current Approaches and Techniques " Spinger Protocol, Methods in Molecular Biolog 695 (p 1-15 19 Hirschhaeuser F, Menne H, Dittfeld C, West J, Mueller-Klieser W, KunzSchughart LA (2010), "Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again" Journal of Biotechnology, 148 (1), p 3-15 20 Ho WY, Yeap SK, Ho CL, Rahim RA, Alitheen NB (2012), "Development of Multicellular Tumor Spheroid (MCTS) Culture from Breast Cancer Cell and a High Throughput Screening Method Using the MTT Assay" PLoS ONE, (9), p e44640 21 Hoai Nam N, Hong Ha Tran T, Duong Le Q, Toan Nguyen T, Nhu Hang Tran T, Mai Huong L, Phuong Thu H (2012), "Apoptosis induced by paclitaxel-loaded copolymer PLA–TPGS in Hep-G2 cells" Advances in Natural Sciences: Nanoscience and Nanotechnology, (4), p 045005 Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm 77 Luận văn cao học 22 Ivascu A, Kubbies M (2006), "Rapid Generation of Single-Tumor Spheroids for High-Throughput Cell Function and Toxicity Analysis" Journal of Biomolecular Screening, 11 (8), p 922-932 23 Kavallaris M, Verrills NM, Hill BT (2001), "Anticancer therapy with novel tubulin-interacting drugs" Drug Resistance Updates, (6), p 392-401 24 Kunz-Schughart LA, Freyer JP, Hofstaedter F, Ebner R (2004), "The Use of 3-D Cultures for High-Throughput Screening: The Multicellular Spheroid Model" Journal of Biomolecular Screening, (4), p 273-285 25 Kunz-Schughart LA, Kreutz M, Knuechel R (1998), "Multicellular spheroids: a three-dimensional in vitro culture system to study tumour biology" International Journal of Experimental Pathology, 79 (1), p 1-23 26 Landry J, Bernier D, Ouellet C, Goyette R, Marceau N (1985), "Spheroidal aggregate culture of rat liver cells: histotypic reorganization, biomatrix deposition, and maintenance of functional activities" The Journal of Cell Biology, 101 (3), p 914-923 27 Lee JS, Feijen J (2012), "Biodegradable polymersomes as carriers and release systems for paclitaxel using Oregon Green® 488 labeled paclitaxel as a model compound" Journal of Controlled Release, 158 (2), p 312-318 28 Lin R-Z, Chang H-Y (2008), "Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research" Biotechnology Journal, (9-10), p 11721184 29 Lu H-F, Lim WS, Wang J, Tang Z-Q, Zhang P-C, Leong KW, Chia SM, Yu H, Mao H-Q (2003), "Galactosylated PVDF membrane promotes hepatocyte attachment and functional maintenance" Biomaterials, 24 (27), p 4893-4903 30 Masters, J.R.W., (2002), "Cancer cell lines" Kluwer Academic Publishers, Vol I, II, III 31 Mayer B, Klement G, Kaneko M, Man S, Jothy S, Rak J, Kerbel RS (2001), "Multicellular gastric cancer spheroids recapitulate growth pattern and differentiation phenotype of human gastric carcinomas" Gastroenterology, 121 (4), p 839-852 32 Minchinton AI, Tannock IF (2006), "Drug penetration in solid tumours" Nat Rev Cancer, (8), p 583-592 Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm 78 Luận văn cao học 33 Mu L, Feng SS (2003), "A novel controlled release formulation for the anticancer drug paclitaxel (Taxol®): PLGA nanoparticles containing vitamin E TPGS" Journal of Controlled Release, 86 (1), p 33-48 34 Nicholson KM, Bibby MC, Phillips RM (1997), "Influence of drug exposure parameters on the activity of paclitaxel in multicellular spheroids" European Journal of Cancer, 33 (8), p 1291-1298 35 Pampaloni F, Reynaud EG, Stelzer EHK (2007), "The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue" Nat Rev Mol Cell Biol, (10), p 839-845 36 Phung YT, Barbone D, Broaddus VC, Ho aM (2011), "Generation of In Vitro Multicellular Spheroids for the Study of Monoclonal Antibody Therapy" Journal of cancer, p 37 Ross DT, Perou CM (2001), "A comparison of gene expression signatures from breast tumors and breast tissue derived cell lines" Disease Markers, 17 (2), p 99-109 38 Sato T, Katagiri K, Gohbara A, Inoue K, Ogonuki N, Ogura A, Kubota Y, Ogawa T (2011), "In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes" Nature, 471 (7339), p 504-507 39 Shah N, Jin K, Cruz L-A, Park S, Sadik H, Cho S, Goswami CP, Nakshatri H, Gupta R, Chang HY, Zhang Z, Cimino-Mathews A, Cope L, Umbricht C, Sukumar S (2013), "HOXB13 Mediates Tamoxifen Resistance and Invasiveness in Human Breast Cancer by Suppressing ERα and Inducing IL-6 Expression" Cancer Research, 73 (17), p 5449-5458 40 Shi J, Orth JD, Mitchison T (2008), "Cell Type Variation in Responses to Antimitotic Drugs that Target Microtubules and Kinesin-5" Cancer Research, 68 (9), p 3269-3276 41 Smalley KSM, Haass NK, Brafford PA, Lioni M, Flaherty KT, Herlyn M (2006), "Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases" Molecular Cancer Therapeutics, (5), p 11361144 42 Soule HD, Vazquez J, Long A, Albert S, Brennan M (1973), "A Human Cell Line From a Pleural Effusion Derived From a Breast Carcinoma" Journal of the National Cancer Institute, 51 (5), p 1409-1416 Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm 79 Luận văn cao học 43 Sutherland R, Carlsson J, Durand R, Yuhas J (1981), "Spheroids in Cancer Research" Cancer Research, 41 (7), p 2980-2984 44 Sutherland RM, MacDonald HR, Howell RL (1977), "Multicellular Spheroids: A New Model Target for In Vitro Studies of Immunity to Solid Tumor Allografts: Brief Communication" Journal of the National Cancer Institute, 58 (6), p 1849-1853 45 Sutherland RM, McCredie JA, Inch WR (1971), "Growth of Multicell Spheroids in Tissue Culture as a Model of Nodular Carcinomas" Journal of the National Cancer Institute, 46 (1), p 113-120 46 Takezawa T (2003), "A strategy for the development of tissue engineering scaffolds that regulate cell behavior" Biomaterials, 24 (13), p 2267-2275 47 Tammy T Chang, Hughes-Fulford M (2008), "Monolayer and Spheroid Culture of Human Liver Hepatocellular Carcinoma Cell Line Cells Demonstrate Distinct Global Gene Expression Patterns and Functional Phenotypes " Tissue Engineering, 15 (3), p 48 Teicher, B.A (1997), "Anticancer Drug Development Guide" p 49 Teicher BA (2001), "Tumour Models in Cancer Research, Cancer Drug Discovery and Deverlopment" ed B.A Teicher, Human Press, New Jersey, p 50 Thu HP, Quang DT, Trang MTT, Ha TTH, Nam NH, Phuc NX, Nguyet TTM, Thong PQ, Tuyet PTH, Oanh VTK, Huong LM (2013), "In Vitro Apoptosis Enhancement of Hep-G2 Cells by PLA–TPGS and PLA–PEG Block Copolymer Encapsulated Curcumin Nanoparticles" Chemistry Letters, 42 (3), p 255257 51 Tung Y-C, Hsiao AY, Allen SG, Torisawa Y-s, Ho M, Takayama S (2011), "High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array" Analyst, 136 (3), p 473-478 52 Maltzahn G, Park J-H, Agrawal A, Bandaru NK, Das SK, Sailor MJ, Bhatia SN (2009), "Computationally Guided Photothermal Tumor Therapy Using Long-Circulating Gold Nanorod Antennas" Cancer Research, 69 (9), p 3892-3900 53 Ward Jp, King Jr (1997), "Mathematical modelling of avascular-tumour growth" Mathematical Medicine and Biology, 14 (1), p 39-69 54 Wartenberg M, Budde P, de Marees M, Grunheck F, Tsang SY, Huang Y, Chen ZY, Hescheler J, Sauer H (0000), "Inhibition of Tumor-Induced Angiogenesis and MatrixNguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm 80 Luận văn cao học Metalloproteinase Expression in Confrontation Cultures of Embryoid Bodies and Tumor Spheroids by Plant Ingredients Used in Traditional Chinese Medicine" Lab Invest, 83 (1), p 87-98 55 Wartenberg M, Dönmez F, Ling Fc, Acker H, Hescheler J, Sauer H (2001), "Tumor-induced angiogenesis studied in confrontation cultures of multicellular tumor spheroids and embryoid bodies grown from pluripotent embryonic stem cells" The FASEB Journal, 15 (6), p 995-1005 56 Wu F-Y, Sun M-Z, Xiang Y-L, Wu Y-M, Tong D-Q (2010), "Curcumin as a colorimetric and fluorescent chemosensor for selective recognition of fluoride ion" Journal of Luminescence, 130 (2), p 304-308 57 Yen T Phung, Dario Barbone, V Courtney Broaddus, Ho1 M (2011), "Rapid Generation of In Vitro Multicellular Spheroids for the Study of Monoclonal Antibody Therapy " J Cancer, 2), p 507-514 58 Yuhas JM, Tarleton AE, Molzen KB (1978), "Multicellular Tumor Spheroid Formation by Breast Cancer Cells Isolated from Different Sites" Cancer Research, 38 (8), p 2486-2491 59 Zang, R., Li D., Tang I.-C., Wang J., S.-T Y (2012), "Cell-Based Assays in HighThroughput Screening for Drug Discovery" International Journal of Biotechnologyfor WellnessIndustries, 1), p pp 31-51 60 Zhang X, Wang W, Yu W, Xie Y, Zhang X, Zhang Y, Ma X (2005), "Development of an in Vitro Multicellular Tumor Spheroid Model Using Microencapsulation and Its Application in Anticancer Drug Screening and Testing" Biotechnology Progress, 21 (4), p 1289-1296 61 Meerloo J, Kaspers GL, Cloos J (2011), Cell Sensitivity Assays: The MTT Assay, Humana Press, 62 Hamilton G, Westmoreland C, George E (2001), "Effects of medium composition on the morphology and function of rat hepatocytes cultured as spheroids and monolayers" In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal, 37 (10), p 656-667 63 Hirschhaeuser F, Walenta S, Mueller-Klieser W (2010), "Efficacy of catumaxomab in tumor spheroid killing is mediated by its trifunctional mode of action" Cancer Immunology, Immunotherapy, 59 (11), p 1675-1684 Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm 81 Luận văn cao học 64 Khaitan D, Chandna S, Arya MB, Dwarakanath BS (2006), "Establishment and characterization of multicellular spheroids from a human glioma cell line; Implications for tumor therapy" Journal of Translational Medicine, (1), p 1-13 65 Lacroix M, Leclercq G (2004), "Relevance of Breast Cancer Cell Lines as Models for Breast Tumours: An Update" Breast Cancer Research and Treatment, 83 (3), p 249289 66 Laurent J, Frongia C, Cazales M, Mondesert O, Ducommun B, Lobjois V (2013), "Multicellular tumor spheroid models to explore cell cycle checkpoints in 3D" BMC Cancer, 13 (1), p 1-12 67 Matsushita T, Nakano K, Nishikura Y, Higuchi K, Kiyota A, Ueoka R (2003), "Spheroid formation and functional restoration of human fetal hepatocytes on poly-amino acid-coated dishes after serial proliferation" Cytotechnology, 42 (2), p 57-66 68 Olive P, Durand R (1994), "Drug and radiation resistance in spheroids: cell contact and kinetics" Cancer and Metastasis Reviews, 13 (2), p 121-138 69 Shukla P, Khanna V, Ali MM, Khan MY, Srimal R (2008), "Anti-ischemic Effect of Curcumin in Rat Brain" Neurochemical Research, 33 (6), p 1036-1043 70 Wu L, Carlo D, Lee L (2008), "Microfluidic self-assembly of tumor spheroids for anticancer drug discovery" Biomedical Microdevices, 10 (2), p 197-202 71 "http://www.atcc.org/Products/Cells%20and%20Microorganisms/Cell%20Lines.a spx" 72 "http://www.cancer.gov/cancertopics/factsheet/NCI/drugdiscovery" 73 "http://www.fda.gov/drugs/developmentapprovalprocess/howdrugsaredevelopedan dapproved/" 74 "http://www.fda.gov/drugs/resourcesforyou/consumers/ucm143534.htm" 75 "http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/P22310" Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm 82 Luận văn cao học MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU 1.TỔNG QUAN 1.1.Sàng lọc thuốc 1.1.1.Quy trình sàng lọc thuốc 1.1.2.Các mơ hình sàng lọc thuốc tiền lâm sàng 1.2.Mơ hình ni cấy khối cầu đa bào ung thư 11 1.2.1.Nuôi cấy ba chiều (3D) 11 1.2.2.Mơ hình ni cấy khối cầu đa bào ung thư 13 1.2.3.Các vấn đề kĩ thuật liên quan tới nuôi cấy khối cầu đa bào 19 2.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1.Đối tượng nghiên cứu 27 2.1.1.Dòng tế bào ung thư vú MCF-7 27 2.1.2.Hệ thuốc nano 28 2.1.3.Máy móc thiết bị vật tư tiêu hao 28 2.2.Phương pháp nghiên cứu 31 2.2.1.Hoạt hóa nhân ni tế bào 31 2.2.2.Gây tạo khối cầu đa bào ung thư 31 2.2.3.Nghiên cứu động học sinh trưởng khối cầu đa bào ung thư 33 2.2.4.Thử độc tính 34 2.2.5.Nghiên cứu khả xâm nhập thuốc vào mơ hình khối cầu đa bào 39 Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm i Luận văn cao học 3.KẾT QUẢ 40 3.1.Hoạt hóa nhân ni dịng tế bào ung thư vú MCF-7 40 3.2.Gây tạo nghiên cứu động học sinh trưởng khối cầu đa bào ung thư MCF-7 41 3.2.1.Kết tạo khối cầu đa bào ung thư MCF-7 41 3.2.2.Động học số đặc điểm sinh trưởng khối cầu đa bào ung thư MCF-7 45 3.3.Thử nghiệm độc tính ((Ptx-Cur)-Co 51 3.3.1.Độc tính mơ hình tế bào MCF-7 nuôi cấy đơn lớp 51 3.3.2.Độc tính mơ hình khối cầu đa bào ung thư MCF-7 54 3.4.Sự xâm nhập thuốc vào bên khối cầu đa bào ung thư MCF-7 66 4.BÀN LUẬN 69 5.KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 75 5.1.Kết luận 75 5.2.Kiến nghị 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO 76 Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm ii Luận văn cao học DANH MỤC HÌNH MINH HỌA Hình Thời gia trung bình cho quy trình phát triển thuốc Hình Ni cấy tinh hồn chuột để sản xuất tinh trùng in vitro Hình Hai dạngtế bào ni cấy Hình Mơ hình gây u chuột hủy miễn dịch 10 Hình Các mơ hình ni cấy ba chiều -3D 12 Hình Khối cầu đa bào ung thư vú MCF-7 13 Hình Sự tương đồng cấu trúc lớp tế bào tương tác với điều kiện mơi trường mơ hình khối cầu đa bào ung thư (phải) khối u in vivo (trái) 16 Hình Phương pháp giọt treo (hanging drop) 21 Hình Các phương pháp nuôi cấy khối cầu đa bào động 24 Hình 10 Tế bào MCF-7 40 Hình 11 Sự bám dính tế bào MCF-7 41 Hình 12 Sự liên kết tế bào MCF-7 giọt treo 42 Hình 13 Các khối cầu đa bào ung thư MCF-7 tạo thành nồng độ tế bào khác giọt treo 43 Hình 14 Khối spheroid dòng tế bào ung thư vú MCF-7 gây tạo với nồng độ 5x103 tế bào/giọt treo 44 Hình 15 Sự thay đổi hình dạng kích thước spheroid lõi hoại tử theo thời gian 46 Hình 16 Biểu đổ biến đổi thể tích khối spheroid lõi hoại tử theo thời gian 48 Hình 17 Sự thay đổi hình dạng trình tăng trưởng spheroid 49 Hình 18 Sự thay đổi tỷ lệ đường kính nhỏ /đường kính lớn spheroid(a/b) theo thời gian 50 Hình 19 Sự đào thải lõi hoại tử khối spheroid MCF-7 51 Hình 20 Đường cong đáp ứng liều dòng tế bào ung thư vú MCF-7 với chế phẩm thử nghiệm 53 Hình 21 Sự biến đổi hình thái kích thước khối spheroid thí nghiệm control, DMSO 0,1% qua ngày điều trị 56 Hình 22 Sự tương đồng cao tốc độ tăng trưởng thể tích khối spheroid thí nghiệm DMSO 0,1% đối chứng sinh học 57 Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm iii Luận văn cao học Hình 23 Những biến đổi cấu trúc viền sinh trưởng khối spheroid hai nồng độ paclitaxel 2µg/ml 0,4µg/ml ngày thứ 58 Hình 24 Cấu trúc viền khơng bình thường vị trí hoại tử xảy lớp sinh trưởng ngày thứ khôi spheroid hai nồng độ 2µg/ml 0,4µg/ml 58 Hình 25 Biểu đồ tăng trưởng thể tích tính theo % so với thời điểm ban đầu khối spheroid sinh trưởng nồng độ paclitaxel (µg/ml) 60 Hình 26 Những biến đổi viển sinh trưởng khối spheroid điều trị với (Ptx-Cur)Co ngày thử nghiệm 61 Hình 27 Sự hoại tử mạnh khối spheroid tác dụng (Ptx-Cur)-Co 2µg/ml 62 Hình 28 Đồ thị tăng trưởng thể tích tính theo % so với thời điểm ban đầu spheroid MCF-7 sinh trưởng nồng độ paclitaxel(µl) 63 Hình 29 Tác dụng ức chế vượt trội (Ptx-Cur)-Co so với Ptx so sánh hai nồng độ thuốc điều trị 0,0032µg/ml 64 Hình 30 Đường cong đáp ứng liều khối cầu đa bào ung thư vú MCF-7 tác động Ptx (PTX-Cur)-Co 65 Hình 31 Khả phát huỳnh quang màu xanh curcumin kích thích 66 Hình 32 Sự phân bố thuốc khối cầu đa bào sau 24h điều trị với thuốc 67 Hình 33 Hình ảnh chụp cắt lớp khối cầu điều trị với Paclitaxel (PtxCur)-Co sau 24h B 68 Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm iv Luận văn cao học DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Máy móc thiết bị sử dụng 28 Bảng 2: Dụng cụ vật tư tiêu hao 29 Bảng 3: Hóa chất sử dụng đề tài 30 Bảng 4: Dải nồng độ paclitaxel thử nghiệm mơ hình ni cấy tế bào MCF-7 đơn lớp 35 Bảng 5: Dải nồng độ curcumin thử nghiệm mơ hình nuôi cấy tế bào MCF-7 đơn lớp 36 Bảng 6: Dải nồng độ paclitaxel thử nghiệm mơ hình khối cầu đa bào MCF-7 38 Bảng 7: Tỉ lệ tạo khối tế bào bên giọt treo sau 36h 42 Bảng 8: Tỉ lệ tạo khối cầu đa bào phương pháp giọt treo 45 Bảng 9: Giá trị IC50 chất thử nghiệm dòng tế bào ung thư vú MCF-7 54 Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm v Luận văn cao học DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Viết đầy đủ Control Đối chứng sinh học DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMSO Dimethyl Sulfoxide FBS Fetal Bovine Serum FDA Food and Drung Administration IC50 Inhibitory Concentration 50% (Nồng độ ức chế tăng sinh 50%) MTT 3-[4,5-dimethylthiazol-2]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide MCF-7 Michigan Cancer Foundation -7 MTCS Multicellular Tumor Spheroid PBS Phosphate Buffered Saline RPMI Roswell Park Memorial Institute Ptx Paclitaxel Cur Curcumin (Ptx)-Co Hệ thuốc nano paclitaxel bọc PLA-TPGS (Ptx-Cur)-Co Hệ thuốc nano paclitaxel kết hợp curcumin bọc PLA-TPGS Ptx-Cur Paclitaxel trộn curcumin PLA Poly lactic acid TPGS D-α-Tocopherol polyethylene glycol succinate (vitamin E) Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm vi LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin gửi lời cám ơn lịng kính trọng tới PGS.TS Nguyễn Thị Quỳ, Giảng viên Cao cấp Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên Em ln trân trọng giúp đỡ, bảo nhiệt tình ưu mà cô dành cho em suốt quãng thời gian làm việc nghiên cứu khoa học nhóm Ung thư học Thực nghiệm vừa qua Xin chúc sức khỏe có nhiều niềm vui sống Em xin gửi lời cám ơn sâu sắc tới TS Hoàng Thị Mỹ Nhung, Giảng viên Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, người thầy đặc biệt mà em gặp Với cương vị người hướng dẫn, cô tạo điều kiện thuận lợi mặt để em hồn thành nghiên cứu Những điều mà em học hỏi từ cô suốt ba năm qua không đơn nằm luận văn này, không kiến thức khoa học mà cịn có cách sống, cách làm người, cách trở thành người thầy tốt Có hội làm việc trở thành sinh viên cô thực điều may mắn em Một lần xin bày tỏ lòng biết ơn tới giúp đỡ tình cảm đáng q Xin cám ơn ThS Bùi Vân Khánh, ThS Nguyễn Thị Như Trang tất thành viên nhóm Nghiên cứu Ung thư học Thực nghiệm, thầy cô Bộ môn Sinh học Tế bào, thành viên phịng Ni cấy Tế bào Động vật, phịng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym Protein giúp đỡ em nhiều q trình hồn thành luận văn Xin cảm ơn đề tài Trọng điểm Đại học Quốc gia Hà Nội mã số QGTĐ 10.28 cung cấp kinh phí thực luận văn Hà nội ngày tháng năm 2014 Nguyễn Đắc Tú ... tiến hành thực đề tài: ? ?Tạo khối cầu đa bào ung thư biểu mơ tuyến vú dịng MCF- 7? ?? Với mục tiêu:  Tạo khối cầu đa bào ung thư từ dịng tế bào ung thư biểu mơ tuyến vú MCF- 7  Nghiên cứu đặc điểm... trưởng khối cầu đa bào ung thư để đưa phác đồ điều trị thời điểm có lợi [2, 43] Sự di cư tế bào: Nhiều kết thực nghiệm khối cầu đa bào ung thư (các dòng tế bào biểu mô vú chuột EMT6, ung thư phổi... lọc thuốc quy mô lớn [2, 15, 51, 64] Hình Khối cầu đa bào ung thư vú MCF- 7 Khối cầu đa bào ung thư quan sát trường phản pha kính hiển vi quang học, bar=100µm (A), Tổ chức tế bào khối quan sát