Tài liệu ứng dụng vi sinh vật trong sản xuất cồn

Trong thôøi gian ñöôøng hoùa xuaát hieän hoaït tính cuûa men Phosphatase, men naøy giaûi phoùng Phospho trong caáu truùc cuûa maïch tinh boät. Haøm löôïng phospho hoøa tan cuõng taêng le[r]

MUÏC LUÏC

Phần 1:Giới thiệu chung

Phần 2: Sơ đồ quy trình

Phần 3:Ứng dụng VSV cơng đoạn đường hóa dịch cháo

I-Giới thiệu chung nấm mốc

1-Cấu tạo sợi nấm

2-Sinh saûn nấm

II-Những lồi nấm thường dùng

1-Rhizopus 11

2-Mucor 11

3-Aspergillus 12

III- Ni cấy mốc đường hóa : chế phẩm enzym đường hóa 16

IV- Đường hố tinh bột: 21

1-Tác dụng enzym amylase lên mạch tinh boät 21

2- Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình đường hóa tinh bột 23

Phần 4:Ứng dụng VSV công đoạn lên men dịch đường 31

A-Naám men 31

I-Saccharomyces cerevisiae 31

1-Đặc điểm 31

2-Một số chủng Saccharomyces cerevisiae thường dùng 32

3-Nghiên cứu so sánh khả lên men chủng 12 với chủng MTB vài chủng khác có nước ta 33

5-Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển nấm men

Saccharomyces cerevisiae 36

II- Cơ chế lên men rượu 40

1- Cơ chế hóa sinh học q trình lên men 41

2- Tiến hành lên men rượu 44

III- Nhận xét, đánh giá phương pháp lên men 46

IV- Hiệu suất trình lên men từ nấm men 48

B-Vi khuaån 48

I.Giới thiệu chung 48

II.Các vi khuẩn lên men cồn 49

1.Zymomonas mobilis 50

a.Đặc điểm 50

b.Điều kiện phát triển 52

c Nuôi cấy 53

d- Quá trình lên men 55

e-Hiệu suất trình 55

2.Clostridium 57

a.Đặc điểm 57

b.Điều kiện phát triển 58

Phần 5: Hiệu suất tổn thất sản xuất 62

PHẦN 1: GIỚI THIỆU CHUNG

Công nghệ cồn etylic khoa học phương pháp trình chế biến nguyên liệu chứa tinh bột, đường, xenluloza, etylen thành sản phẩm etylic hay etanol

Quy trình cơng nghệ sản xuất cồn etylic chia thành cơng đọan gồm : chuẩn bị dịch đường lên men; gây men giống, lên men dịch đường xử lý dịch lên men

Chuẩn bị dịch lên men:

- Nếu ngun liệu chứa tinh bột cơng đọan gồm nghiền, nấu, đường hóa làm lạnh đến nhiệt độ lên men

- Nếu nguyên liệu mật rỉ chuẩn bị dịch lên men gồm pha lõang sơ bộ, xử lý mật rỉ, bổ sung nguồn dinh dưỡng, tách cặn pha loãng tới nồng độ gây men lên men

Gây men giống lên men: muốn lên men trước hết cần phát triển men giống tới chất lượng số lượng cần thiết, thường 10% thể tích thùng lên men Sau đưa men giống dịch đường vào thùng khống chế điều kiện xác định để nâùm men chuyển hóa đường thành rượu CO2 Dịch nhận sau lên men gọi giấm chín

Xử lý dịch lên men: cơng đoạn có liên quan tới kiến thức lý học và

chuyển khối Thực chất dùng hệ thống chưng luyện phù hợp để tách rượu chất dễ bay khỏi giấm chín, sau đem tinh luyện để nhận cồn sản phẩm, thỏa mãn tiêu chuẩn yêu cầu tiêu dùng Sản phẩm thu sau xử lý bao gồm cồn thực phẩm, cồn đầu, dầu fusel ancol cao phân tử

nấm men thô dùng cho chăn nuôi, chế biến lọai kháng sinh… Ở số nước, người ta đem cô đặc bã rượu tới nồng độ chất khô định bổ sung trực tiếp vào phần ăn vật ni Trong bã rượu từ rỉ đường cịn thu nhận glyxerin, axít glutamic Trong năm gần bã rượu từ mật rỉ nghiên cứu đưa vào phụ gia vật liệu xây dựng

PHẦN 2: SƠ ĐỒ QUY TRÌNH

Tinh bột

Xử lý nguyên liệu

Quá trình dịch hóa

Đường hóa

Lên men rượu

Chưng cất

Tinh chế

Mật rỉ

Xử lý nguyên liệu Nguyên

liệu

Nấm men

Chuẩn bị dịch lên men

Lên men rượu

Tinh chế O2

Chế phẩm

amylase nấm mốc

Nấm men

Chưng cất

PHẦN 3: ỨNG DỤNG CỦA VSV TRONG CÔNG ĐOẠN ĐƯỜNG HÓA DỊCH CHÁO

Nấu xong, tinh bột dịch cháo chuyển sang trạng thái hòa tan chưa thể lên men trực tiếp để biến thành rượu được, mà phải trải qua trình thủy phân xúc tác amylase để biến thành đường Quá trình gọi q trình đường hóa, có vai trị quan trọng cơng nghệ sản xuất cồn ethylic Nó định phần lớn hiệu suất thu hồi rượu giảm bớt gia tăng đường tinh bột sót lại sau lên men

Muốn đạt hiệu cao trình thủy phân tinh bột phải chọn tác nhân đường hóa tốt Hiện nay, người ta dùng amylase nhận từ ni cấy vi sinh vật, nấm mốc sử dụng nhiều nhất, sau đến vi khuẩn, cuối nấm men Endomycopsip Các yếu tố cần ý nuôi cấy vi sinh vật chọn giống, môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, độ ẩm, pH, oxy)

I-GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NẤM MỐC

Nấm mốc (mold) tên chung để lọai nấm hiển vi có cấu tạo sợi Chúng thuộc loại thực vật hạ đẳng, có bào tử, khơng có diệp lục tố, khơng có khả tổng hợp chất hữu từ khí carbonic mà sử dụng trực tiếp chất hữu có sẵn để sinh sống

Nấm mốc mọc tốt mơi trường có nhiều khơng khí, chúng thường phát triển lớp bề mặt chất, dạng lớp lún phún hình sợi, lớp mang nhện hay khối sợi Trong chất, chúng sinh trưởng khoang hổng chứa khơng khí Nhiều loại nấm mốc có giá trị lớn công nghiệp, trái lại nhiều loại nấm lại gây nhiều thiệt hại công nghiệp, công nghiệp thực phẩm, y học

1-Cấu tạo sợi nấm

Đa số nấm có hình sợi phân nhánh, đan kết lại với thành khối sợi, sợi riêng lẻ gọi sợi nấm (khuẩn ty thể, mycelium) Có loại sợi nấm: sợi nấm có màng ngăn ngang sợi nấm khơng có màng ngăn ngang; trường hợp sau, tịan hệ sợi nấm tế bào phân nhánh phức tạp Chiều rộng sợi nấm thay đổi từ 5-50μm

Một số sợi nấm sinh trưởng cách đâm sâu vào chất hút chất dinh dưỡng (khuẩn ty chất), phần hệ sợi nấm phát triển bề mặt chất (khuẩn ty ký sinh), phần sợi nấm nằm ngồi nhiều hay tùy theo lồi mơi trường Ở nhiều lồi, sợi hệ sợi nấm nằm bên chất quan sinh sản Ở số nấm khác, sợi nấm đan kết lại dàu đặc với tạo thành thể

Cấu tạo tế bào nấm không khác với cấu tạo sinh vật khác Màng tế bào cấu tạo cellulose; nhiều loại nấm, màng tế bào có chứa kitin Trong tế bào chất có khơng bào chất khác Các chất dự trữ thường gặp nấm glycozen, hạt volutin giọt mỡ Tế bào nấm có 1,2 nhiều nhân Ở nấm, tượng nhiều nhân phổ biến

2-Sinh sản nấm

sợi nấm Trong phịng thí nghiệm thường dùng phương pháp để nhân giống phân lập

Một số nấm sinh sản oidi (bào tử bột) Trong trường hợp này, sợi nấm bị cắt thành phần nhỏ đơn bào tế bào phát triển thành hệ nấm Sợi nấm bị cắt ra, từ xuống, tượng tiến hành tịan hệ sợi nấm

Ở loài nấm khác, bào tử lại hình thành tế bào riêng biệt nằm đầu sợi nấm Những bào tử thường có kích thước lớn, hình cầu, gọi bọc bào tử (sporangium) hay bào tử nang, sợi nấm mang gọi cuống bọc bào từ (cuống bào tử nang) Cuống bọc bào từ thường phát triển bọc bào tử làm thành trụ có nhiều hình dạng khác nhau, gọi lõi (columelle) hay nang trụ

Trong sinh sản hữu tính, nấm tạo nang (asque) mang nang bào tử (ascospore), đảm (basidi) mang đảm bào tử (basisospore), quan sinh sản đặc biệt

NHỮNG LOAØI NẤM THƯỜNG DÙNG 1 Rhizopus :

Rhizopus có nhiều loại: Rhi japonicus, Rhi Orysee, Rhi pekaII, Rhi Tonkinensis…

Rhizopus có đặc điểm sinh trưởng “giả chi” để lan rộng bề

mặt Ở điểm tiếp xúc với mơi trường đặc, thành ống nghiệm… có chùm rễ giả Ở chỗ có giả căn, thân bò tiếp tục phát triển sinh tử nang chứa nhiều bào tử Bào tử sinh từ nang trụ bầu cuống Vì phần nang trụ tiếp xúc với vách nang, soi kính, nửa nang lộn ngược mà cuống nang trụ cán ô Lúc non, bào tử nang trắng, lúc già màu đen, bên có nhiều bào tử Bào tử hình trứng hay hình bán cầu, mặt thường có nếp nhăn, kích thước -8μm.Nhiệt độ phát triển thích hợp 32-340C.

Rhizopus sinh sản hữu tính tiếp hợp gặp Chủ yếu sinh

Rhizopus, Absidi thường thấy củ, hạt ẩm, bánh mì, cơm, xơi …để

trong khơng khí vài ngày Bằng mắt thường thấy khuẩn ty chúng “tấm” mạng nhện, bào tử nang lúc non trắng, già đen nhạt có chấm nhỏ Bào tử dễ bay khơng khí, gặp điều kiện thuận lợi nảy mầm

Rhizopus thường nuôi cấy, phát triển môi trường dịch thể

giàu dinh dưỡng có thơng khí, hệ enzym amylase tương đối hòan chỉnh, nên thường dùng sản xuất rượu theo phương pháp amilose nuôi cấy nấm mốc lỏng (phương pháp bề sâu)

2 Mucor

Mucor Rhizopus giống Song phân biệt giữa Mucor Rhizopus điểm : Mucor khơng giả căn, cuống bào tử

nang sinh chỗ có nang trụ khơng có hình bán cầu, khơng sát với vách bào tử nang

Khuẩn ty Mucor có loại (+) (-) màu trắng phân nhánh, giống hình thái, khác sinh lý Từ lọai khuẩn ty sinh sản vơ tính Từ loại khuẩn ty sinh sản hữu tính theo kiểu tiếp hợp bào tử nang đa hạch, sau bào tử nội sinh

Trong sản xuất thường gặp loại : Mucor rouxii, Mucor mucedo,

Mucor javanicus, Mucor hydrophilus… Nhưng sử dụng phổ biến sản

Ở Mucor rouxii, ngồi hệ men amylase cịn có enzym rượu hóa nên trong điều kiện yếm khí, enzym Mucor rouxii biến đường thành rượu Hiện tượng hay gặp trình sản xuất nấm mốc bề mặt mơi trường chất rắn có tinh bột giữ nhiệt độ cao (39-400C).

Mucor rouxii phát triển mạnh môi trường thạch Csepek, khuẩn

ty phân nhánh nhiều, không vách ngăn, đa nhân, khuẩn lạc cao, không nếp nhăn, bán vào nắp hộp lồng (petrie) Đặc biệt cuống bào tử nang phân nhánh khơng có thứ tự định Bào tử nang thường tròn, đường kính 60-80 μm Nang trụ 20-25 μm Bào tử trịn, đường kính 6-7 μm

Khuẩn ty lúc non màu trắng, già có màu xám nhạt Bào tử nang từ màu trắng chuyển dần sang màu vàng, đỏ xám, đen, làm cho màu khuẩn lạc xám dần Mặt khuẩn lạc khơng có nếp nhăn, khơng màu

3 Aspergilus

Aspergilus tìm thấy dễ dàng khắp nơi, chất.

Vào khoảng năm 1877, Nhật, người ta phát sử dụng

Aspergilus vào sản xuất rượu, phân giải acid…

Aspergilus gồm nhiều loại, công nghiệp sản xuất

rượu thường dùng loại : Asp.flavus, Asp.orysee, Asp.batatae,

Aspergilus có đặc điểm sau : khuẩn ty không màu hay vành nhạt Có

2 loại : khuẩn ty ký sinh phát triển mặt môi trường khuẩn ty dinh dưỡng ăn sâu vào môi trường Khuẩn ty phân nhiều nhánh, có nhiều ngăn tế bào tế bào có nhân Nang nang bào tử thể màu vàng kim Khi Aspergilus hình thành đính bào tử dễ phân biệt với các mốc khác Cuống đính bào tử dài thẳng, khơng phân nhánh mà đầu phình to tạo thành chop nang

Màu sắc có thay đổi tùy điều kiện mơi trường, thời gian nuôi cấy… môi trường định (ví dụ mơi trường Csepek); màu khuẩn lạc dấu hiệu để phân loại Asp nhạy nguyên tố vi lượng, tạo ra màu sắc đặc biệt khuẩn lạc Mulder xác định : Asp Niger có màu sẫm mơi trường có Cu2+ với nồng độ 0,00025%; nồng độ

thấp hơn, màu khuẩn lạc nhạt dần Khi khơng có đồng, đính bào tử có màu vàng (bình thường đen hay nâu)

 Aspergilus Orysee : ni thạch Csepek vùng bào tử có màu vàng lục trội màu vàng Vùng khơng có bào tử hẹp trắng Khuẩn lạc khơng có nếp nhăn khơng rõ rệt Bào tử nang đầu trịn 40-60 μm, cuống đính bào từ dài 0,8-1,5mm, đường kính 8-12 μm, thấy mắt thường Đính bào tử hình bầu dục hay lê, kích thước 4-6×5-7 μm Tế bào chai đặc trưng Aspergilus dễ thấy Bào tử nang lúc non trắng, lúc già vàng lục, già màu sẫm Đính bào tử trần dễ bay Mốc sinh enzym amylase, invectase, maltase, protease catalase Hoạt tính men amylase, protease cao Mốc phát triển khoảng nhiệt độ 15 - 400C, tối thích 30 - 320C Mốc sử

dụng nhiều rộng rãi công nghiệp sản xuất rượu, tương, chao, thuộc da, nước chấm lên men v.v…

 Aspergilus Flavus : ni thạch Csepek mặt vùng bào tử có màu lục vàng, trội màu lục Khuẩn lạc thấp, đính bào tử nằm sát mặt thạch, cuống ngắn Mặt khuẩn lạc thường không màu, vàng nhạt Bào tử nang đầu tròn 40 - 60 μm Cuống đính bào tử ngắn 0,3 - 0,5mm Đính bào tử trịn hay bầu dục 3,5 - μm Tế bào chân rõ dễ thấy Bào tử dễ bay Aspergilus

orysee giống Asp Flavus, khác kích thước lớn hơn, khuẩn

A.Orysee, đặc biệt protease hoạt động chế phẩm tinh khiết

của enzym dùng làm tác nhân ổn định bia Ở số môi trường có chất béo (trên lạc), mốc sinh độc tố aflatoxin Có số tác giả xếp hai giống mốc thuộc nhóm

A.orysee-flavus.

 Aspergillus niger : thường gọi mốc đen Trên môi trường thạch Csepek, khuẩn lạc tròn, xốp, vùng bào tử màu nâu đen đen Khuẩn lạc có nếp nhăn rõ Vùng khuẩn lạc sau ngày (2 -4mm) cao xung quanh Mặt thường không màu, vàng nhạt, thấy rõ nếp nhăn từ tâm khuẩn lạc

Bào tử nang đầu tròn, lớn (100 - 160 μm) Cuống đính bào tử dài 0,5 - 1,5mm hơn, đường kính - 17 μm, thấy rõ mắt thường Cuống nhỏ hay thể hình chai, có hai lớp hình lăng trụ Lớp đầu dài lớn 15 - 25×3 - μm Đính bào tử trịn, đường kính - μm Tế bào chân dễ nhận thấy

Mốc sinh enzym amylase, invectase, maltase, protease, pectinase, glucooxydase Mốc dùng sản xuất rượu , sản xuất acid citric, acid fumaric Protease mốc họat động pH 2,5 - 3,5 cịn protease A orysee khơng hoạt động vùng pH Trên giới, 90% sản lượng acid citric sản xuất phương pháp lên men

 Aspergillus usami (sử dụng nhà máy rượu Hà Nội) chủng niger đột biến tia phóng xạ Coban 60 Qua nghiên cứu chúng tơi nhận thấy Asp.Usami nhà máy rượu có đặc điểm:

 Đính bào tử to, già có màu nâu đen

 Hệ men amylase tương đối đầy đủ, nuôi môi trường rắn (cám, trấu, bột ngơ) điều kiện thích hợp, sau 36 - 40 giờ, khả tích lũy men cao Ngồi tích lũy amylase, Asp.usami cịn sinh lượng acid lớn (2 -3% mơi trường), amylase Asp.usami có thể thủy phân tinh bột pH - 4,5 Mặt khác amylase

Asp.usami giữ hoạt tính nhiệt độ cao 600C ±

10C.

Asgergillus awamori Asgergillus usami gần với A.niger có khả

năng sinh nhiều dextrinase glucomylase, amylase sinh trung bình Mốc dùng nhiều cơng nghiệp rượu để đường hóa tinh bột

III- NI CẤY MỐC ĐƯỜNG HĨA : CÁC CHẾ PHẨM ENZYM ĐƯỜNG HĨA

Ni cấy mốc để sản xuất tương xì dầu nước phương Đơng có từ thời cổ xưa Năm 1884 J.Takamine (Nhật Bản) nuôi cấy

A.orysee gạo, sau thay gạo cám mì thu chế phẩm enzym

dùng rộng rãi sản xuất rượu Mỹ theo quy trình cơng nghệ Takamine dùng phổ biến giới để đường hóa nguồn nguyên liệu tinh bột trước lên men rượu

Hiện công nghiệp rượu thường dùng chủng khác của mốc nhóm A.orysee, A.niger, A.awamoni, A.usami, A.batatae theo hai phương pháp nuôi cấy bề mặt ni cấy chìm

 Phương pháp ni cấy bề mặt : Khuẩn ty thể nấm mốc tạo thành lớp mỏng bề mặt môi trường ni cấy, lớp khuẩn ty dày từ - 5cm ; môi trường rắn, khuẩn ty thể xuyên sâu vào chỗ hổng môi trường Trong công nghiệp sản xuất rượu, áp dụng phương pháp nuôi cấy nấm mốc bề mặt môi trường dinh dưỡng chất rắn, có thơng khơng khí khơng thơng khí Đối với phương pháp ni cấy bề mặt môi trường lỏng, áp dụng công nghiệp sản xuất acid citric

 Phương pháp nuôi cấy nấm mốc bề sâu: Nấm mốc nuôi cấy môi trường dinh dưỡng dịch thể, có thơng khơng khí Khuẩn ty thể hình thành phân bố lơ lửng mơi trường Đặc biệt, q trình ni cấy, men amylase khuyếch tán môi trường

Phương pháp ni cấy bề mặt nấm mốc đường hóa thường dùng cám mì làm chất Cám mì cần phải lớn có 20% tinh bột Cám thêm formalin acid clohydric để tăng hiệu trùng áp lực nước nóng atm khoảng 1-2

Nói chung ni cấy mốc đường hóa theo phương pháp đường hóa gồm giai đoạn:

 Chuẩn bị giống nhân giống để thu mốc trung gian;

 Nuôi cấy mốc khay, mành, nong, nia… giá buồng ni mốc có điều kiện thích hợp để mốc sinh enzym tối đa;

 Đập nhỏ, sấy đóng gói mốc cám khơ

Mốc giống A awamori giữ phịng thí nghiệm môi trường thạch – malt chỗ tối 180C Cứ tháng lần cấy truyền môi

trường nước malt có 7% chất khơ với 3% thạch 0,09% acid citric

Mốc trước đưa vào sản xuất cấy môi trường thạch – malt - ngày chuyển vài bình tam giác 500ml có 10g cám mì làm ẩm 6ml nước acid hóa qua trùng Ni buồng ấm 300C ngày, sau chuyển sang nuôi khay nhôm mành

với điều kiện tương tự đến mốc sinh bào tử nhiều Mốc cám thu gọi mốc trung gian dùng để cấy trộn vào môi trường sản xuất

Môi trường sản xuất chuẩn bị tương tự san khay mành, nong… Chiều dày lớp môi trường 2,5 - 3cm Tỷ lệ mốc cấy chuyền tiếp khoảng 0,2 - 0,4%

Nuôi mốc khay buồng 28 - 320C có thơng gió giữ

độ ẩm khơng khí 90 - 95% Thời gian ni mốc từ 24 - 26 đến 30 - 36 kết thúc mốc đến giai đoạn bào tử Trong trình ni cần lật bẻ nhỏ cám hệ sợi mốc phát triển làm chât kết thành bánh

Mốc cám sau ni cấy có độ ẩm 40 - 50% cần phải sấy khô không 450C đến độ ẩm 10 - 12%, nghiền nhỏ Mốc cám khô

đựng bao thùng kín, bảo quản chổ mát (dưới 200C) để

Qua nghiên cứu thực tế thấy dùng cám mì làm chất rắn ni cấy mốc đường thu kết cao Trường hợp khơng có cám mì thay mơi trường có thành phần sau:

 Mơi trường bột ngô : bột ngô nhỏ mịn, vàng – 75%; trấu nhỏ có

1/8 - 1/10 vỏ lúa - 25%; (NH4)2SO4 - 0,5%

 Môi trường cám bổi: cám gạo có 0,5% (NH4)2SO4

Q trình ni cấy mốc môi trường tương tự mơi trường cám mì

Phương pháp ni cấy chìm thường dùng mốc A.niger, A.usami,

A.batatae-61 Quá trình ni cấy gồm giai đọan :

 Chuẩn bị giống nhân giống

 Pha chế mơi trường dinh dưỡng

 Nuôi cấy mốc thùng men, thu dịch men có hoạt lực cao

Mốc giống dùng từ ống nghiệm từ mốc cám bình tam giác nhân giống phương pháp bề mặt Nhân giống qua cấp bình tam giác cấp thùng nhân giống có sục khí Mơi trường nhân giống gồm: dịch lọc bã rượu từ nguyên liệu tinh bột bổ sung 1,5 bột mì bột ngơ (có dùng - 3% cám); 0,5

cao ngô; 0,5% KNO3; 0,1 - 0,2% MgO 0,2% Ca2CO3; pH=5,6 - 5,8

Môi trường than trùng - 1,5 atm/giờ Trong bình tam giác 750 có 130 - 150 ml mơi trường Nhân giống bình tam giác máy lắc 200 - 220 v/phút 30 - 320C khoảng 72 giờ, sau nhân giống tiếp trong

các nồi vỏ có khuấy sục khí (40 - 60 m3/h) 30 - 320C khoảng 24

-30

Môi trường dinh dưỡng nuôi mốc để sinh enzym sau:

 Bột 1,5 - 2%

 Cao ngô 0,5%

 MgO CaCO3 0,2%

 pH 5,6 - 5,8%

Trong mơi trường cần có 1,2 - 1,7g% chất khử (khơng tính pentose) N tổng: 220 - 280 mg%

Môi trường trùng 1,5 - atm khoảng 45 - 60 phút Tiếp theo tỷ lệ - 5% (đối với A.batatae cần 1%)

Q trình ni mốc cần phải sục khí (15 - 20 m3/giờ) khuấy, có

thể 18 đầu khơng cần khuấy mốc phát triển, độ nhớt thấp, cần sục khí đủ trộn môi trường Thởi gian nuôi cấy khoảng 60 - 72 30 - 320C.

Dịch men sau nuôi cấy thêm 0,25 formalin làm chất bảo vệ dùng để đường hóa dịch cháo nhiệt độ 56 - 570C với tỷ lệ 75 - 100%

(tùy thuộc vào hoạt lực enzym)

Đánh giá chất lượng đường hóa theo hoạt lực amylase, dextrinase, glucoamylase protease

IV- ĐƯỜNG HỐ TINH BỘT:

Khối nấu khơng thể trực tiếp lên men rượu (vì nấm men khơng có phức hệ Enzym Amylase) mà phải thủy phân sơ tinh bột phức hệ Enzym Amylase nấm mốc malt Trong sản xuất, trình gọi đường hóa tinh bột ( hay đường hóa); bán sản phẩm nhận – dịch đường hóa Trong sản xuất rượu từ nguyên liệu có chứa tinh bột, đường hóa q trình cơng nghệ quan trọng ảnh hưởng đến trình lên men, hiệu suất tổng thu hồi, chất lượng sản phẩm, chu kỳ sản xuất…

Khi nói đến q trình đường hóa, kể giai đoạn làm nguội khối nấu từ nhiệt độ 105 - 110oC xuống nhiệt độ thích hợp cho tác dụng

của men Amylase (60 ± 2oC) làm nguội dịch đường hóa đến nhiệt độ

thích hợp cho lên men (33 - 36oC).

1-Tác dụng enzym amylase lên mạch tinh bột:

Sản phẩm trung gian cuối tạo phụ thuộc cấu trúc mạch Amilose Amilopectin vào phức hệ men Amylase sử dụng

Trong cấu trúc mạch Amilopectin củ tinh bột loại hạt, khơng thấy có liên kết acid Phosphoric (H3PO4) vị trí  - 6Glucoside

ở tinh bột khoai tây lại có mối liên kết đó:

Phức hệ Enzym Amylase nấm mốc khác với phức hệ men Amylase malt Trong phức hệ men Amylase Malt, khơng thấy có men Glucoamylase (glA), nên sản phẩm cuối q trình lên đường hóa tinh bột men Amylase thóc tạo Malt Maltose, lượng đường Glucose men  - Amylase tạo không đáng kể Ngược lại, thủy phân tinh bột phức hệ men Amylase số loài nấm mốc, sản phẩm cuối đường Glucose

Dextrin có phân tử lượng khác nhau, Glucose, Maltose, Oligosacchrit khác

Men Oligo - 1,6Glucozidase cắt đứt liên kết  - 1,6Glucozid phạm vi Dextrin, Isomaltase cắt đứt liên kết Disaccharide mà (đường Isomaltose)

Quan sát tượng xảy trình đường hóa tinh bột men Amylase, ta thấy:

 Độ nhớt dung dịch giảm dần

 Khả khử (đối với dung dịch oxy hóa) tăng lên

 Phản ứng định tính với Iod thay đổi từ màu xanh, tím xanh, đỏ nâu, đến không màu

2- Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình đường hóa tinh bột:

a) Nồng độ men:

Trong sản xuất, tốc độ thủy phân, tinh bột hàm số tác dụng tổng cộng men Amylase nấm mốc malt Trong phức hệ men Amylase nấm mốc malt có men khác nhau, số lượng khác nhau, hoạt tính khác

Những điểm đưa tới thủy phân tinh bột khác (về mức độ đường hóa, tốc độ đường hóa sản phẩm cuối q trình đường hóa) Tinh bột hồ hóa triệt để, nồng độ tinh bột 12%, pH - 5, đường hóa nhiệt độ 57oC thời gian 30 phút, sau làm nguội tới 30oC tiếp

tục phân tích hàm lượng đường sinh suốt thời gian làm đường hóa, có kết phân tích nhiều lần khơng thay đổi

Kết thí nghiệm thể bảng sau:

dung, % Sau 12h Sau 24h 36 - 48h

2

6.42 6.42 8.70 9.50

8.45 8.95 8.95 10.23

9.20 10.46 10.50 _

Những thí nghiệm tương tự với tỷ lệ men sử dụng - 10% đạt 9,5 - 10% lượng đường sinh ( Với hàm lượng tinh bột ban đầu cao hàm lượng đường sinh cao tương ứng) Vì vậy, nói đến ảnh hưởng nồng độ men tức nói đến hoạt tính, số lượng cân đối phức hệ Amylase

b) Aûnh hưởng nhiệt độ:

Tốc độ phản ứng men phần lớn phẩn ứng hóa học tăng lên tăng nhiệt độ Tính phụ thuộc số vận tốc với nhiệt độ, thể phương trình Arenius:

(dlnK)/(dT)=E/(RT2)

Trong đó: T nhiệt độ tuyệt đối,oK

R số chất khí

Sau lấy tích phân phương trình giới hạn T1 T2 ta có

E = ((lnK1-lnK2)RT1T2) / (T1-T2)

Đặc trưng phản ứng thủy phân tinh bột Amylase diễn phạm vi nhiệt độ tương đối hẹp, giới hạn 35 - 63oC ( là

khoảng nhiệt độ tối thích Enzym Amylase) Nếu đường hóa nhiệt độ cao to

ap Dextrinase lượng

Dextrin tạo nhiều Maltose sinh ít, hiệu suất trình thủy phân bị giảm

Tác dụng nhiệt độ lên Enzym tức thời, Enzym giữ hoạt tính cao thời gian ngắn

Đơi khi, q trình làm nguội từ 105 - 109oC xuồng nhiệt độ

thấp (55 - 60oC) ta thêm vào Enzym để tiến hành phân cắt sơ

bộ, làm loãng khối nấu, dễ đưa chúng vào máy làm nguôi

Nếu đường hóa nhiệt độ khoảng 40 - 50oC thực khơng có lợi

c) Aûnh hưởng pH:

Bản chất men gần giống chất Protein, hầu hết Protein hợp chất lưỡng tính Các Enzym có chất Protein với trung tâm hoạt động

Ion H+ tác dụng vào trung tâm hoạt động nhóm bên 1

cách trực tiếp hay gián tiếp (nhóm bên nhóm amin NH2 hay nhóm

carboxylic COOH)

Qua nghiên cứu hệ Enzym Amylase ta thấy pH tối thích – 5, pH = hay pH = 10 Enzym bị vơ hoạt

Aûnh hưởng pH Enzym phụ thuộc vào nhiệt độ yếu tố khác ( nhiệt độ tăng pHap tăng hướng phía kiềm)

Độ pH khối nấu phụ thuộc yếu tố:

 Bản thân nguyên liệu nấu (tinh bột nước)

 Các chất phụ trợ trình nấu (H2SO4, acid lactic…)

Bởi ngun liệu có độ acid thường khoảng từ 0.2 - 0.5o

tương đương pH nguên liệu 4.9 - 5.6, pH khơng thích hợp khơng với pH tối thích Enzym Amylase nấu nguyên liệu người ta hay cho thêm vào acid vô (H2SO4 hay HCl) hay acid hữu

cơ acid Lactic nuôi cấy riêng, hay sử dụng bã rượu để nấu nguyên liệu

Nhiều nghiên cứu cho thấy rõ ràng dùng acid Lactic để điều chỉnh pH q trình nấu đường hóa nâng cao hiệu suất tổng thu hồi rượu - 3% so với dùng acid vô vơ HCl hay H2SO4

Ngồi việc điều chỉnh pH thích hợp acid Lactic nguồân thức ăn cho nấm men sau

Trong q trình đường hóa Amylase Malt, chất Hemicellulose Pectin khối nấu không bị thay đổi nhiều mặt hóa học Nhưng đường hóa Amylase nấm mốc chất có biến đổi đáng kể Trong nấm mốc, ngồi Enzym Amylase cịn có thêm Enzym Pectinase, Xitase……giúp thủy phân Pectin, Hemicellulose, phần Cellulose tạo chất đường tương ứng lên men Saccharose hay đường không lên men Arabinose, Xylose Do tạo nhiều sản phẩm phụ q trình đường hóa

Sự biến đổi chất đạm q trình đường hóa có ý nghĩa quan trọng Trong Malt nấm mốc có men Protease pH thích hợp cho Protease Malt 4.5 - 5.0; Peptidase 7.3 - 7.9 Ở pH nhiệt độ 60oC, Protease tương đối bền vững Nhiệt độ tối thích

của Peptidase 45 - 47oC, nhiệt độ tăng lên, làm đình nhanh

chóng men Peptidase Tuy nhiên, điều kiện khơng thích hợp vậy, q trình đường hóa, Peptidase làm tăng hàm lượng acid amin dung dịch đường hóa tăng lên 2.3-3 lần so với ban đầu khối nấu (20%N dạng hòa tan)

Nhiệt độ nấu nguyên liệu có ảnh hưởng đến phân cắt Albumin Sau đường hóa khối nấu lúa mì, dạng đạm hịa tan số lượng Nitơ sau:

Nhiệt độ nấu, oC Nitơ hịa tan, % so tổng số

Tổng số Thành phần Albumin

100 200 300

32.8 40.0 41.9

Như nhiệt độ nấu nguyên liệu cao thì, trình đường hóa, phân cắt Albumin giảm Nhưng , ngun liệu ngơ q trình ngược lại:

Nhiệt độ nấu Nito hòa tan, % tồng số

Tổng số Trong Albumin

100 135

16.5 36.0

7.5 9.1

Men Protease nấm mốc (trừ Asp Awamori) hoạt động thích hợp môi trường acid yếu pH thấp

Trong thời gian đường hóa xuất hoạt tính men Phosphatase, men giải phóng Phospho cấu trúc mạch tinh bột Hàm lượng phospho hòa tan tăng lên có tác dụng tốt trình sinh trưởng nấm men, nâng cao tính đệm dung dịch đường hòa giảm pH trình lên men rượu

e) Những yếu tố ảnh hưởng khác:

e.1) Aûnh hưởng chất sát trùng Na2SiF6: để hạn chế ngăn

chặn nhiễm khuẩn trình đường hóa, nhà máy sản xuất rượu thường dùng chất sát trùng formol, Na2SiF6 ….với tỷ lệ 0.02

-0.025% so với khối lượng Các chất sát trùng cho vào dung dịch nấm mốc hay dịch sữa Malt, cho đồng thời vào khối nấu dịch men Amylase

khi sử dụng phức hệ Enzym tách ( sử dụng dạng canh trường)

e.2) Aûnh hưởng nồng độ rượu : trình bày trên, q trình đường hóa thời gian ngắn, tinh bột khơng hồn tồn bị thủy phân, mà q trình thủy phân tinh bột cịn tiếp tục đến kết thúc trình lên men rượu Vì vậy, cần xét thêm ảnh hưởng nồng độ cồn phức hệ men Amylase

Iarovanko cộng nghiên cứu rút kết luận sau:

Thời gian đường

hóa(thủy phân),

Mẫu đối chứng

Đường Glucose tạo thành,%

Nồng độ rượu cho vào, % v

4 10

12 24 36 50 4.47 5.12 6.35 6.82 5.15 6.18 6.43 6.82 4.00 5.92 6.35 6.82 4.66 6.18 5.97 7.04

e.3) Thời gian đường hóa : chọn thời gian đường hóa thích hợp khơng có ý nghĩa mặt lý thuyết mà cịn có ý nghĩa lớn sản xuất thực tiễn Việc lựa chọn thời gian đường hóa cịn phụ thuộc vào phương pháp làm nguội khối nấu phương pháp đường hóa Thời gian làm nguội đường hóa định suất thiết bị, chất lượng dung dịch đường hóa hiệu suất tổng thu hồi

trong khoảng thời gian từ 15 - 120 phút, đường lên men dịch đường hóa khơng tăng, nồng độ chất tan chung dung dịch lại tăng cách rõ rệt Sau 15 phút đường hóa, nồng độ chất tan 13.8% sau 120 phút nồng độ chất tan 14.8%, đường lên men khơng tăng Như vậy, thời gian đường hóa nâng cao hàm lượng chất khơ hịa tan ( chủ yếu đạm hịa tan) nâng cao tính đệm dung dịch Song, kéo dài thời gian đường hóa nhiệt độ 55 - 58oC làm giảm hoạt

tính Enzym Amylase, khả nhiễm khuẩn tăng lên hiệu suất tổng thu hồi giảm

Trong thí nghiệm ảnh hưởng việc kéo dài thời gian đường hóa đến hoạt tính men Amylase chủng Asp.orysee sau:

Sau giai đoạn đường hóa, xác định hoạt tính men Amylase( chủ yếu AC DC) sau:

Thời gian đường hóa đơn vị AC đơn vị DC

102.0 100% 114.0 100% 100.1 106.0 30 98.3 90.3

60 90.2 88.4% 52.8

51.7%

Như thời gian đường hóa tốt phút, cho hiệu suất tổng thu hồi tăng 37lit cồn/tấn tinh bột so với đường hóa 60 phút

PHẦN 4: ỨNG DỤNG CỦA VSV TRONG CÔNG ĐOẠN LÊN MEN DỊCH ĐƯỜNG

A-NAÁM MEN

Nấm men tác nhân gây trình lên men ethanol Thường sử dụng nấm men thuộc họ Saccharomycetaceac, lồi S.cerevisiae

I-SACCHAROMYCES CEREVISIAE

1-Đặc điểm

- Hình dạng: tế bào hình bầu dục môi trường giàu chất dinh dưỡng Trong điều kiện yếm khí, tế bào có hình trịn; ngược lại, điều kiện hiếu khí tế bào kéo dài

- Kích thước thay đổi khoảng 2,5 - 10 µm × 4,5 -21µm

- Chu kì sống: Các tế bào dinh dưỡng đơn bội (n) tiếp hợp với để tạo thành tế bào dinh dưỡng lưỡng bội (2n) Sau trình giảm phân sinh bào tử túi (thường bào tử túi) Bình thường khơng có sinh sản hữu tính, chúng liên tục nảy chồi để sinh sôi nảy nở

- Saccharomyces cerevisiae thuộc loại nấm men lên men Trong

quá trình lên men, tế bào chúng lơ lửng dung dịch lên men tập trung bề mặt Nhờ tăng diện tích tiếp xúc với chất, trình lên men xảy nhanh chóng mạnh mẽ

-Lên men nhiều loại đường (glucose, fructose, saccharose, maltose, 1/3 rafinose, dextrin …)v nhiều loại nguyên liệu khác ( gạo, ngô, khoai, sắn… với lượng đường dung dịch 12 – 14%, có 16 – 18%)

- Chịu thuốc sát trùng Na2SiF6 nồng độ 0,02 – 0,025% nên có

thể lên men điều kiện bắt buộc phải dùng thuốc sát trùng

- Sinh sản theo kiểu nảy chồi, có khả sinh bào tử, sống kị khí khơng bắt buộc

2-M ột số ch ủng Saccharomyces cerevisiae thường dùng :

- Chủng XII phân lập từ nấm men bánh mì 1902 Tế bào hình trịn

hoặc oval, có kích thước lớn mập chủng khác (5-8) Chu kỳ sinh trưởng hệ 1giờ 39 phút.Sinh sản cách nảy chồi Ở điều kiện khắc nghiệt, nhiệt độ 250C vịng ngày cụ thể tạo

thành bào tử (1 – bào tử) Trong tế bào già thường chứa nhiều glycogen metaxromatin Nấm men chủng XII sinh sản mạnh 12 đầu nuơi cấy sau đĩ chậm dần lên men mạnh Chúng cĩ khả lên men mạnh glucose, matose, fructose, galactose, saccharose, maltose 1/3 rafinose Chủng không lên men đường lactose, kxilose, arabinose, inulin Nồng độ rượu dịch lên men đạt tới 13% V Theo giáo sư Manxep chủng XII xem tốt lên men dịch đường từ tinh bột nhà máy rượu Liên Xơ cũ

-Chủng XV có tính chất tương tự chủng XII hay dùng để lên men dịch đường hỗn hợp gồm tinh bột rỉ đường

- Chủng số II (do Linder tách từ 1889 nhà máy rượu) Đây chủng ứng dụng sản xuất rượu ngành sản xuất

khác Tế bào dài, hình đứng, lớn sinh sản cách nảy chồi Ở 25oC

trong 30 ni cấy tạo thành bào tử (thường tế bào có bào tử); lên men loại đường chủng XII khả sinh sản

- Chủng B, M.10, sử dụng rộng rãi sản xuất rượu từ mật rỉ Tế bào hình trụ, hình oval với kích thước tế bào 3,9-9,7 x 39-8,9 ; có khả lên men rượu tốt, đồng thời có đặc tính lên men bánh mì cao

- Chủng M (thu vào 1905) Ghenebec phân lập từ hỗn hợp chủng nấm men Chủng dùng để lên men môi trường chứa hỗn hợp đường khác Chúng bền ổn định, thích nghi điều kiện khơng bình thường thực tế sản xuất

- Chủng MTB (Ở nước ta trước 1975, nhà máy rượu dùng chủng nhà máy rượu Hà Nội cung cấp) Chủng có khả sinh sản nhanh cho hiệu suất lên men tương đối tốt

- Chủng IA : Iacubopski phân lập từ thùng lên men từ rỉ đường. Lên men đường glucose, maltose, fructose, saccharose, galactose 1/3 rafinose Chủng IA khả lên men dextrin lactose đường C

3-Nghiên cứu so sánh khả lên men chủng 12 với chủng

MTB vài chủng khác có nước ta.

Trạng thái sinh lý nấm men sau 20 ni cấy:

Chủng nấm men Tế bào chết, % Tế bào nảy chồi,

%

Số tế bào 1ml x 106

MTB T 33 XII 3,6 4,8 6,7 2,5 12,0 8,5 10,3 14,9 164,2 160,8 140,2 103,7

Số lượng tế bào ml tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng men giống Tuy nhiên, dùng chủng men khác để lên men dịch đường, không nên dừng lại số tế bà ml mà phải thêm vào số dịch lên men cuối độ cồn, hàm lượng đường tinh bột sót giấm chín…

Để xét xem chủng có khả cho hiệu suất lên men cao, người ta tiến hành thí nghiệm tiếp cách nuôi cấy chủng men giống điều kiện nhau, sau 20 đem làm men giống với số lượng 10% so với dịch đường lên men Sau 72 lên men, người ta đem phân tích tiêu giấm chín tính lượng CO2 q

trình lên men

Kết trung bình đợt thí nghiệm số chủng nấm men

Các tiêu Chủng nấm men

XII MTB T 33

Nồng độ đường hóa , %khối lượng Chất khử tính theo Glucose, g/l Độ chua, g H2SO4/l

pH dịch đường hóa

Lượng CO2 thoát sau 72 giờ, g/200ml

Độ chua giấm chín, g H2SO4/l pH giấm chín

Chất khử sót giấm chín, g/l Nồng độ rượu, %V

14,0 30,3 1,06 4,95 12,69 1,51 4,66 9,21 7,12 14,0 30,3 1,06 4,95 11,85 1,67 4,50 10,6 6.73 14,0 30,3 1,06 4,95 11,21 1,85 4,55 11,27 6,45 14,0 30,3 1,06 4,95 10,89 1,92 4,42 11,55 6.30

Theo dõi trình lên men vào số liệu thu được, ta thấy chủng XII cho hiệu suất kên men cao so với chủng đem so sánh

Cần ý : chủng tốt nơi chưa hẳn thích nghi ở

một nơi khác trước áp dụng cần nghiên cứu kĩ đặc tính sinh lí khả sinh sản sản lượng sản phẩm tạo thành

Trong sản xuất có trường hợp ngẫu nhiên người ta tìm chủng tơt cách phân lập từ thùng lên men Chủng XII IA nhận đường kể

Điều kiện lên men:

- Cơ chất (nguồn C): tinh bột, rỉ đường - Nồng độ đường: 10 – 16%

- pH: –

- Nhiệt độ: 28 – 300C

- Nhu cầu oxy: Giai đoạn đầu lên men cần cung cấp một

lượng nhỏ O2 thành phần cần thiết sinh tổng hợp chất

béo chưa bão hòa lipid Áp suất O2 vào khoảng 0,05 – 0,10 mmHg

Đến giai đoạn sau không cung cấp oxy

- Nhu cầu dinh dưỡng:

+ Cần lượng tương đối chất dinh dưỡng dùng tổng hợp ethanol, gồm C, H, O, N Nó tỉ lệ thuận với thành phần tế bào nấm men

+ Các nguyên tố P, S, K, Mg cần lượng hơn, dùng để tổng hợp thành phần thứ yếu

+ Các muối vô ( Mn, Co, Cu, Zn) nhân tố sinh trưởng hữu ( acid amin, acid nucleic, vitamine…) yêu cầu dạng vết

- Nấm men mẫn cảm với ức chế ethanol Với nồng độ cồn

5-Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển nấm men Saccharomyces cerevisiae

a.Ảnh hưởng nhiệt độ

Nhiệt độ tối ưu nấm men saccharomyces khoảng 28 – 320C.

Tuy nhiên bắt đầu lên men nhiệt độ thấp khả lên men cao

và kéo dài Mặt khác làm lạnh dịch đường tới 20-220C hạn chế sự

phát triển tạp khuẩn

Sau – 10 giờ, nhiệt độ lên men tăng đến 28 – 300C, tiếp cần

làm lạnh để ổn định nhiệt độ giới hạn tối ưu

Ở nhiệt độ cao hoạt tính nấm men giảm nhanh, chủ yếu dễ bị

nhiễm lactic nấm men hoang dại Ở nhiệt độ 300C men hoang dại phát

triển nhanh Saccharomyces – lần, nhiệt độ 35 -380C chúng

phát triển nhanh gấp đến lần

Khi lên men 29,50C, tổn thất tạo men 7,37 %, 17,50C tổn thất

do tạo men 5,32 % lên men dịch đường 100C tổn thất tạo

men chiếm 4,42 % lượng đường có dung dịch

Khi lên men nhiệt độ cao tạo nhiều esther, aldehyde tổn thất rượu theo CO2 tăng

b.Ảnh hưởng pH

Nồng độ ion H+ canh trường có ảnh hưởng lớn đến hoạt động

của nấm men Chúng có khả làm thay đổi diện tích chất vỏ tế bào, làm tăng hay giảm mức độ thẩm thấu chất dinh dưỡng chiều hướng trình lên men Mỗi vi sinh vật hoạt động tốt pH định

Trong điều kiện lên men rượu, pH tối ưu để tạo alcohol ethylic 4,5 – 5,0 Đối với dịch đường từ nguyên liệu tinh bột thường khống chế pH = 4,8 – 5,2; nhằm giữ cho amylase tiếp tục chuyển hóa tinh bột dextrin thành đường lên men

Ở pH 4,2 nấm men phát triển chậm so với pH = 4,5 – 5,0 tạp khuẩn không phát triển Tới lúc nấm men phát triển nhiều đủ mạnh ta tăng pH đến tối ưu cho nấm men phát triển nhanh Lúc điều kiện tốt cho tạp khuẩn nấm men nhiều đủ mạnh để lấn át nên tạp khuẩn khó gây tác hại cho lên men

Phương pháp áp dụng để gây men điều kiện sản xuất gọi nuôi cấy nấm men khiết tự nhiên

Khi cho acid sulfuric vào đường dịch, chúng khơng dạng tự mà liên kết hóa học với muối giải phóng acid hữu cơ, phosphoric tự do, chủ yếu dạng KH2SO4 NaH2PO4

Giữa ion H + lượng acid có tương quan định mỗi

dung dịch đó, ví dụ pH độ chua dịch đường hóa từ ngơ lớn từ sắn Trong thực tế sản xuất sở có điều kiện đo pH, mà thường xác định độ chua Đối với dung dịch pH xem gần ổn định độ chua lại thay đổi nhiều phụ thuộc vào mức độ nhiễm khuẩn nguyên liệu dịch lên men Khi nhiễm khuẩn tạo acid hữu có độ phân ly thấp nên làm thay đổi pH Vì sản xuất rượu khơng xác định pH mà xác định độ chua Độ chua biểu diễn theo độ hay theo gam acid / lít

Một độ chua biểu diễn 1ml dung dịch NaOH 2N vừa đủ để trung hòa acid tự chứa 20 ml dịch biểu diễn độ chua gam

H2SO4/lít dịch, 10 chua = 2,45 g /l

c.Ảnh hưởng nồng độ lên dịch men

Nồng độ dịch đường cao làm tăng áp suất, cân trạng thái sinh lý nấm men Kết cồn nhiều ức chế tạp khuẩn mà nấm men, dẫn đến tổn thất phải kéo dài thời gian lên men

Nồng độ dịch đường thấp làm giảm suất thiết bị lên men, tốn chưng cất, tăng tổn thất rượu bã rượu nước thải

d.Ảnh hưởng số hóa chất chất sát trùng

Trong điều kiện sản xuất, dù có vệ sinh đến khó đảm bảo vơ trùng tuyệt đối, cần phải dùng chất sát trùng để ngăn ngừa hạn chế tạp khuẩn

Có thể dùng hóa chất khác clorua vơi, formalin, fluosilicat natri Tùy theo chất lượng hóa chất mà dùng nhiều hay ít, cốt hạn chế phát triển tạp khuẩn không làm ảnh hưởng xấu đến hoạt động nấm men Khi dùng formalin hay fluosilicat natri, nồng độ không vượt 0,02% so với dịch lên men

Ảnh hưởng số acid tới nấm men:

Acid Nồng độ Thời gian tiêu diệt,

giờ Làm ngừng sinh

trưởng

Tiêu diệt men

% Mol/l % Mol/l

HCl 0,14 0,038 0,72 0,195 0,46

H2SO4 0,39 0,039 1,30 0,123 2,04

H3PO4 0,30 0,031 2,00 0,204 1,28

CH3COOH 0,75 0,125 3,00 0,500 1,25

Acid lactic 0,90 0,100 3,00 0,333 1,27

Tùy theo tính chất mức độ phân ly acid mà tác hại chúng lên nấm men khơng giống

Ngồi ra, dịch đường lên men chứa lượng furfurol, melanoidin, gây ảnh hưởng tới nấm men

Furfurol hạn chế khả nảy chồi kích thước tế bào, tạo hạt không bào Furfurol chứa nhiều mật rỉ làm giảm khả tạo rượu tăng tạp chất, giảm hoạt độ maltase zymase nấm men

Khi dịch chứa – triệu tế bào/ml 0,002% furfurol ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng sinh lý dịch lên men; dịch lên men chứa 90 triệu / ml 0,006% furfurol ảnh hưởng tới sinh lý nấm men

mg / 100ml (0,0015 – 0,002%) Trong điều kiện lên men với tỉ lệ men giống lớm 10%, ảnh hưởng furfurol xem khơng đáng kể

Melanoidin có ảnh hưởng khơng giống chủng men Nó ảnh hưởng xấu đến sinh sản chủng B IA, 12 đầu chủng r-176 r-202, melanoidin ảnh hưởng suốt thời gian 24 giờ, số tế bào 1,3 – lần so với môi trường chứa 0,005 – 0,3g/100 ml Caramela không bị hấp thụ bề mặt nấm men với nồng độ 0,005% làm nhiều tế bào bị chết

e.Ảnh hưởng sục khí

Sục khí để hịa tan oxy vào dịch đường, giúp cho nấm men phát triển nhanh Tuy nhiên, sục khí không cần thiết dịch đường từ nguyên liệu tinh bột Sục khí làm tăng lượng đường bay Mặt khác dư dẫn đến tạo nhiều sinh khối aldehyde, làm giảm hiệu suất lên men rượu Thực tế khơng cần sục khí vào dịch đường Một lượng nhỏ oxy hòa tan thời gian khuấy làm lạnh, đủ đảm bảo cho sinh trưởng phát triển lên men Với tỉ lệ men giống 10%, sau 50 lên men nồng độ biểu kiến dịch giảm tới số lượng không đổi với hầu hết thùng lên men Sau 70 – 72 nồng độ rượu giấm chín đạt trung bình 9% V, đường sót vào khoảng 0,3 – 0,5 %

f.Ảnh hưởng nguồn nitơ bổ sung

Ở nước ta, cồn sản xuất chủ yếu từ nguyên liệu sắn Do sắn chứa protid nên lượng nitơ dịch đường hóa khơng đảm bảo cho phát triển nấm men

Bổ sung nitơ vào dịch lên men

Các tiêu Mẫu kiểm chứng không bổ sung nitơ

Nguồn nitơ từ

(NH4)2SO4 (NH2)2CO

- Nồng độ chất khô dịch đường , %

16,5 16,5 16,5

tính theo maltose g/ 100ml

4,09 4,09 4,09

- pH dịch đường

hóa 5,26 5,26 5,26

- pH giấm chín 4,55 4,00 4,93

- Tăng độ chua 0,31 0,42 0,12

- Độ khô biểu kiến giấm chín

-0,35 -0,40 -0,77

- Chất khử sót, %

0,43 0,34 0,14

- Tinh bột sót, %

0,05 0,046 0,042

- Nồng độ rượu giấm chín, %V

9,66 9,78 10,04

- Hiệu suất rượu so với lý thuyết, %

91,21 92,35 94,80

Bổ sung nitơ với số lượng 30 mg/100ml rút ngắn thời gian từ 84 xuống 60 giờ, đồng thời lên men tốt đạt hiệu cao mẫu đối chứng Trong nguồn nitơ từ ure cho kết tốt

II- CƠ CHẾ LÊN MEN RƯỢU:

Dịch men gồm nhiều tế bào men riêng biệt, gam men ướt có độ

ẩm khoảng 70-75 % chứa tới 14 tỉ tế bào Bề mặt tế bào chiếm 5.10

-5mm2 Như gam men ép có bề mặt tổng cộng khoảng 7000 cm2 Nhờ

có bề mặt lớn nên nấm men hấp thụ đường chất dinh dưỡng nhanh

Đường hóa xong, dịch đường làm lạnh tới 28-32oC bơm

Hai chất khuyếch tán tan vào môi trường xung quanh Rượu linh động nên hịa tan nhanh dịch lên men, cịn khí cacbonic hòa tan khuếch tán chậm

Lúc đầu hịa tan hồn tồn, tạo thành bọt khí bám quanh tế bào men lớn dần tới mức lực đẩy Archimede lớn khối lượng tế bào men cộng bọt khí

Lúc tế bào bọt khí dần lên, tới bề mặt bọt khí tan vỡ hợp thành tiếng rào rào (men ăn)

Bọt khí tan, tế bào men chìm dần, tiếp xúc với dịch đường để hấp thụ lên men lại sản sinh rượu khí carbonic

Như vậy, tế bào nấm men từ chỗ vi sinh vật không chuyển động biến thành tế bào chuyển động q trình lên men Nhờ mà tăng nhanh tốc độ chuyển hóa đường thành rượu

Khi đường chất dinh dưỡng canh trường cịn ít, lượng lớn tế bào nấm men lắng xuống đáy thùng, dịch lên men dần

1- Cơ chế hóa sinh học q trình lên men

1 Do xúc tác glucokinase, glucose kết hợp với gốc phosphat phân tử ATP (adenoxintriphosphat) tế bào nấm men để tạo thành glucose-6-phosphat ADP:

C6H12O6 +ATP CH2O(H2PO3)(CHOH)4CHO + ADP

2 Gluco-6-phosphat tác dụng enzyme đồng phân gluco phosphat isomerase biến thành fructo phosphat:

CH2O(H2PO3)(CHOH)4CHO CH2O(H2PO3)

(CHOH)3COCH2OH

3 Dưới tác dụng enzime phosphofructokinase, phân tử ATP thứ hai đính thêm gốc phosphat vào fructo-6-phosphat để tạo thành fructo-1,6-diphosphat phân tử ADP thứ hai:

CH2O(H2PO3)(CHOH)3COCH2OH + ATP

CH2O(H2PO3)

(CHOH)3COCH2O(H2PO3) +ADP

[Giai đoạn thực nối liên kết cao thành dạng dễ biến đổi tác dụng enzime]

4 Mạch cacbon fructodiphosphat thành hai phân tử triose: aldehyde phosphoglyceric phosphodioxyacetone (xúc tác: aldolase):

CH2O(H2PO3)CO(CHOH)3CH2O(H2PO3)

CH2O(H2PO3)COCH2OH

+CH2O(H2PO3)CHOHCHO

5 Sản phẩm trình trước aldehyde phosphoglyceric dịch lên men chúng chứa tượng đồng phân tác dụng enzime triphosphat isomerase:

CH2O(H2PO3)COCH2OH CH2O(H2PO3)CHOHCHO

6 Hai phân tử aldehyde phosphoglyceric bị oxi hóa Phản ứng có tham gia acid phosphoric canh trường nhờ xúc tác enzyme triphosphatdehydronase, coenzime NAD (Nicotinamid-Adenin-dinucleotid) Phân tử 3-phosphoglyceroaldehyde kết hợp với phosphat, hidro chuyển sang coenzime NAD:

2CH2O(H2PO3)CHOHCHO + 2H3PO4 +2NAD

2CH2O(H2PO3)CHOHCOO~H2PO3 +

2NADH2

[Năng lượng giải phóng oxy hóa 3-phosphoglyceroaldehyde sễ tióch tụ liên kết cao acid 1,3-diphosphoglyceric tạo thành]

7 Với tham gia phosphoglyceratkinase, gốc phosphat chứa cao acid 1,diphosphoglyceric chuyển vào phân tử Kết 3-phosphoglyceric tạo thành , Adp nhận thêm lượng biến thành, ADP nhận thêm lượng biến thành ATP:

2CH2(H2PO3)CHOHCOO~(H2PO3) + 2ADP

2CH2O(H2PO3)CHOHCOOH + 2ATP

2CH2O(H2PO3)CHOHCOOH

2CH2OHCHO(H2PO3)COOH

9 Dưới tác dụngcủa enolase, acid 2-phosphoglyceric nước biến thành acid phosphopyrovic:

2CH2OHCHO(H2PO3)COOH 2CH3CO(H2PO3)COOH

+ 2H2O

10 Acid phosphopyrovic không bền nên dễ bị gốc acid phosphoric enzime pyrovatkinase acid pyrovic tạo thành:

2CH2=CO~(H2PO3)COOH + 2ADP 2CH3CO-COOH +

2ATP

11 Acid pyrovic bị decacbocyl để tạo thành aldehyde acetic: 2CH3CO-COOH 2CO2 + 2CH3CHO

12 Aldehyde acetic bị khử NADH2: 2CH3CHO + 2NADH2 2CH3CH2OH + 2NAD

Tóm lại, Phương trình tổng qt q trình lên men sau:

C6H12O6 2CO2 + 2CH3CH2OH

Trong trình lên men rượu, phân tử gam glucose giải phóng khoảng 50 kcal Năng lượng nấm men sử dụng chừng 20 kcal Số cịn lại thải canh trường làm tăng nhiêt độ dịch lên men Theo Euler, nhiệt chiếm 28 kcal/ phân tử glucose

2- Tiến hành lên men rượu

a Động học trình lên men

Tốc độ trình lên men xác định trực tiếp lượng

đường lên men, gián tiếp tính lượng rượu tạo thành lượng CO2

thoát đơn vị thời gian Cũng xác định nhanh cách đo nồng độ biểu kiến dịch lên men

Lên men chia thành giai đoạn: lên men sơ bộ, lên men lên men phụ

Trong giai đoạn đầu, thời gian kéo dài gần 60 giờ, đặc trưng cho thời kì tiềm phát, lượng đường lên men

Giai đoạn thứ hai kéo dài từ khoảng thứ 60 đến thứ 120, sinh trưởng nấm men lên men tăng nhanh, đạt tới cực đại- đặc trưng cho thời kì lên men

Giai đoạn ba đăc trưng cho lên men phụ kéo dài, tốc độ lên men chậm lượng đường dịch cịn ít, dextrin chưa kịp biến thành đường

Trong điều kiện sản xuất, lượng men giống đưa vào nhiều (8-10%) nên tốc độ lên men xảy nhanh Trung bình giai đoạn lên men chính, nồng độ đường giảm 1% Thời gian tiềm phát phụ thuộc vào lượng men giống đưa vào, thường từ 5-8 Tiếp chuyển sang lên men chính, cuối lên men phụ Thời gian lên men phụ dài hay ngắn phụ thuộc chủ yéu vào lượng enzime có khả phân cắt nối α-1,6 glucoside Vì dextrin lên men sau thủy phân thành glucose maltose (điều không xảy với lên men rỉ đường)

Tốc độ lên men phụ thuộc vào lượng men giống, tốc độ lên men phụ thuộc vào số α-1,6 glucoside hoạt độ enzime thủy phân

b Ph ương pháp lên men

Lên men tiến hành theo sơ đồ gián đoạn, bán liên tục liên tục

 Lên men gián đoạn

Thùng phải vệ sinh đường ống van phải sát trùng thường xuyên Sau tồn trùng nước Thời gian giữ 95- 1000C kéo dài 50-60 phút Thanh trùng xong thùng làm

lạnh đến 300C, tháo ngưng đóng van đáy Men giống dịch

thùng lên men kéo dài từ 6-8 Nhờ tỉ lệ men giống lúc đầu tăng hạn chế phát triển tạp khuẩn

Sau đổ đầy thùng ta lên men lấy đường lên men đem lọc để xác định độ chua Đồng thời theo dõi nhiệt độ khống chế thấp 330C Về cuối nhiệt độ giảm đến 280C.

Lên men xem bình thường sau 50 giờ, độ đường biểu kiến dịch lên men xuống tới (với rỉ đường khác), độ chua khơng tăng q 0,8 gam H2SO4/lít so với độ chua dịch đường trước lên

men

Trường hơp độ chua lên men tăng nhanh, độ đường biểu kiến giảm chậm phải nghĩ tới nhiễm khuẩn, cần kiểm tra vi sinh vật xử lí kịp thời

Lên men xem kết thúc sau độ đường biểu kiến không giảm giảm 0,1-0,2 %

Lên men gián đoạn thùng riêng biệt có ưu điểm dễ làm, nhiễm dễ xử lí suất thu từ m3 thiết bị thấp Tuy nhiên,

phương pháp áp dụng chủ yếu nước ta cho hiệu suất

 Lên men liên tục

Đặc điểm lên men liên tục dịch đường men giống cho vào thùng đầu (thùng lên men chính) ln chứa lượng lớn tế bào ml dịch Khi đầy thùng đầu dịch men chảy tiếp sang thùng bên cạnh cuối thùng chứa giấm chín

Ưu điểm bật sơ đồ lên men liên tục dùng lượng lớn men giống nên lên men xảy nhanh, hạn chế phát triển tạp khuẩn Khác với lên men gián đoạn lượng giống ban đầu 12-15 triệu tế bào/ml nên lên men xảy chậm

Lên men liên tục phương pháp tiến cho hiệu cao Tuy nhiên áp dụng cần tính tốn cẩn thận có biện pháp công nghệ phù hợp, không phản tác dụng, dễ nhiễm khuẩn hàng loạt dẫn đến giảm hiệu suất lên men

Lên men liên tục kết thúc sau 60-62 giờ, lên men gián đoạn phải kéo dài tới 72

 Lên men cải tiến – bán liên tục

Để tăng cường tỉ lệ lên men giống mà không cần thêm thiết bị gây men, ta thực hiên dùng lượng men thùng lên men mạnh giai đoạn lên men chính, cách dùng acid sulfuric đưa pH 4,0-4,2; kết hợp với bơm tuần hồn làm lạnh Sau 1-2 tan bơm ½ dịch lên men sang thùng khác để làm men giống Tiếp từ từ thêm dịch đường vào hai thùng đầy lên men tiếp

III- NHẬN XÉT, ĐÁNH GIÁ CÁC PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN: 1.Phương thức lên men gián đoạn

Thông thường thời gian đòi hỏi cho việc sử dụng hòan tòan chất từ 36-48 Nhiệt độ giữ 20- 30oC pH ban đầu điều chỉnh

tới 4,5 Tùy thuộc vào chất nguyên liệu hidrat C, hệ số chuyển hĩa nằm vào khỏang 90- 95% số lý thuyết với nồng độ etanol cuối đạt 10-16 % (w/v) Cơng nghệ lên men gián đoạn vận hành nhiều khứ cĩ thể vận hành dễ dàng, địi hỏi thấp khử trùng triệt để, khơng cần nhân cơng cĩ tay nghề cao, khơng cĩ nguy tổn hại tài nguyên liệu dễ xử lý Tuy nhiên nhược điểm vốn cĩ hệ thống hiệu suất lên men thấp thời gian quay vịng cao độ dài pha lag kéo dài dẫn đến yêu cầu phải cĩ cải tiến

tế bào nấm men dậm đạc (23,6g/l) rút ngắn thời gian lên men hịan tịan dung dịch glucoza có nồng độ ban đầu 22% xuống cịn Độ sống sót tế bào trường hợp lên men nhanh bị giảm nhanh nồng độ etanol cao tế bào Hạ nhiệt độ lên men tăng nồng độ oxi hạn chế mức độ kìm hãm song lại hao hụt suất lên men

2.Phương thức lên men liên tục

Lên men liên tục loại bỏ hao tốn thời gian lên men tĩnh Đó thời gian dành cho việc tẩy rửa làm thiết bị, tái nạp môi trường, thời gian tiêu tốn cho pha lag Ngồi ra, vi sinh vật ln giữ pha sinh trưởng lũy thừa nên suất tính theo thời gian tổng số yêu cầu tăng lên

Hai nhược điểm chủ yếu hệ thống liên tục là:

o Nhiễm tạp đột biến xảy lòng dịch lên men thể lạ xâm nhập từ bên ngồi vào

o Khó khăn việc giữ tốc độ lên men cao Sở dĩ tốc độ lên men hệ thống thường thấp tế bào bị chết nhiều thiếu oxi Để khắc phục người ta thêm số chất tween 80, ecgosterol, hay axit linolenic vào môi trường lên men cho nấm men cho nấm men sinh trưởng đđiều kiện hiếu khí trước giai đọan lên men kỵ khí

Hiệu suất etanol nồi lên men liên tục đơn giản thường bị giới hạn kìm hãm etanol nồng độ tế bào thấp Khi nồng độ đường dung dịch nạp tăng, hiệu suất etanol giảm hiệu kìm hãm sản phẩm Ở nồng độ hidrat C thấp, kìm hãm dường giảm song nồng độ sinh khối tế bào giảm Do suất lên men tối ưu đạt nồng độ glucoza nạp khoảng 10%

IV- HIỆU SUẤT QUÁ TRÌNH LÊN MEN TỪ NẤM MEN:

được lên men Do vậy, mặt trọng lượng gam glucoza lý thuyết tạo 0,51 g rượu Tuy nhiên sản lượng đạt thực tế thường không vượt 90-95% số lý thuyết Sở dĩ phần chất dinh dưỡng sử dụng để tổng hợp sinh khối cho phản ứng liên quan tới trì tế bào Cũng cịn có phản ứng phụ xảy ( thường dẫn tới glyxerol va sucxinat) tiêu thụ tới 4-5 % chất tổng số Nếu loại trừ phản ứng sản lượng etanol tăng thêm 2,7 %

B-VI KHUAÅN

I-GIỚI THIỆU CHUNG

Trong số vi sinh vật có khả sản xuất ethanol, nấm men Saccharomyces cerevisiae, Zymomonas mobilis sinh vật có

triển vọng Nó chuyển hoá phần lớn glucose thành CO2 ethanol,

phát triển nhanh nấm men thể khả sản sinh ethanol cao suốt trình lên men So với nấm men vi sinh vật tạo tỉ lệ ethanol cao hẳn điều có ý nghĩa quan trọng Zymomonas

mobilis vi sinh vật kị khí khác với nấm men,nó khơng cần đến sự

bổ sung oxy để tồn phát triển Quá trình sả n xuất ethanol

Zymomonas mobilis tạo sản phẩm phụ hơn, đặc biệt rượu tạp Thao

tác gen Zymomonas mobilis đơn giản hẳn nấm men Điều

này mang đến hội mở rộng dãy nguyên liệu sản xuất ethanol: từ lignocellulose hay từ tiêu hoá trực tiếp tinh bột Kỹ thuật lên men ethanol sử dụng Zymomonas mobilis đặc biệt ý tương lai khả sản xuất vi khuẩn cao hẳn so với nấm men

II-CÁC VI KHUẨN LÊN MEN CỒN

sinh vật tạo thành ethanol sản phẩm chủ yếu (ít mol ethanol mol glucose sử dụng)

Tên vi khuẩn m mol Ethanol sản xuất

M mol Glucose chuyển hoá

Clostridium sporogenes up to 4.15 a)

Clostridium indolis

(pathogenic) 1.96 a)

Clostridium sphenoides 1.8 a) (1.8) b) Clostridium sordelli

(pathogenic) 1.7

Zymomonas mobilis 1.9

(syn Anaerobica) (anaerobe)

Zymomonas mobilis

Ssp Pomaceas 1.7

Spirochaeta aurantia 1.5 (0.8)

Spirochaeta stenostrepta 0.84 (1.46)

Spirochaeta litoralis 1.1 (1.4)

Erwinia amylovora 1.2

Leuconostoc mesenteroides 1.1

Streptococcus lactis 1.0

Sarcina ventriculi

khuẩn khác Nghiên cứu Naim Kosaric lượng đường hấp thu lượng ethanol sinh cao dùng môi trường glucose

1 ZYMOMONAS MOBILIS

Zymomonas mobilis vi khuẩn thuộc giống Zymomonas có khả

năng sản xuất ethanol vượt trội nấm men số mặt Nó phân lập lần từ đồ uống có chứa cồn, rượu cọ (palm wine) châu Phi hay loại rượu Mehico : rượu thùa (pulque), ngồi cịn từ chất lấy từ rượu táo hay bia người châu Âu

a.Đặc điểm:

Zymomonas vi khuẩn Gram (-),kỵ khí, hình que.

Dài từ -6 m rộng từ 1- 1.5m, xuất hầu hết dạng cặp

Kích thước chiều rộng lớn Zymomonas thể rõ qua kính hiển vi, hầu hết vi khuẩn khác chiều rộng khoảng 0.5-0.75m

Hầu hết giống (70%) không di động được, phần (30%) di động với 1-4 tiên mao phân cực.Khả di động bị số giống

Hình dạng: 45% giống hình hoa thị, 33% dạng chuỗi, 62% tế bào có sợi nhỏ, có số giống có chiều dài tới 28m

Thành phần tế bào

Thành phần Tỷ lệ (khối lượng khô)

Protein

Giai đoạn phát triển Giai đoạn tĩnh RNA

DNA

Carbohydrates

Poly--hydroxybutyrate Polyphosphate

Sulfur Ammonia Amino acids ATP

Pha log Pha tử vong

65-69% 54% 17-22% 2.7% 4-5% 0% 0% 0.5%

0.1-0.5mol/mg 0.02-0.2mol/mg

1-5g/mg 0-0.4g/mg

b.Điều kiện phát triển:

Sự phát triển nhịêt độ khác nhau:

Ở 30oC số giống không phát triển, 40oC quan sát thấy

sự phát triển.Vi khuẩn Z.mobilis phát triển 36oC.Nhiệt độ có ảnh

hưởng lớn đến lên men vi khuẩn Ở nhiệt độ 14-18oC lên men xảy

ra sau ngày, nhiệt độ 16-26oC lên men xảy sau ngày nhưng

một số trường hợp khác nhiệt độ thuận lợi cho trình lên men 25-31oC Ở nhiệt độ cao vi khuẩn bị tiêu diệt 550C vi khuẩn bị chết

Bảng: Sự phát triển giống Zymomonas điều kiện nhiệt độ khác

Nhiệt độ % giống phát triển

30 34 36 38 40 100 97 97 74

Sự phát triển giá trị pH khác

pH % giống phát triển

3.05 3.5 3.7 3.85 5-7 7.5 8.0 43 71 90 100 87

Phát triển có mặt ethanol: xảy ra,

Zymomonas chịu rượu, lập từ đồ uống có chứa – 10% cồn, tập trung 5,5% ethanol chất lỏng vô hại với Zymomonas. tại 7.7 10% ethanol 73 47% chủng Zymomonas phát triển.

Phát triển tập trung cao glucose: Klyuver và

Hoppenbrouwers qua sát lồi lên men rượu thùa(mehicơ) sống môi trường lên men với 25% glucose

Kiểm tra vài mơi trường lỏng có chứa 2% dịch chiết nấm men tập trung khác glucose với 20% glucose vi khuẩn phát triển

trong 34h, với 30% glucose 88% vi khuẩn sống – ngày( chủng Z1

Phát triển có mặt KCN: sử dụng dung dịch chuẩn chứa

0,0075% KCN , chủng ATCC 29192, NCIB 8777, NCIB 10565, CP3, CP4, và Ag 11 không phát triển chủng Zymomonas ATCC10988, 410, NCIN 8227 409 phát triển sau ngày, 12 chủng khác bị ức chế tập trung KCN phát triển sau – ngày

Phát triển môi trường chứa NaCl: dung dịch chuẩn

chứa 0.5% NaCl Zymomonas mobilis không phát triển, cịn mơi trường có 2% NaCl khơng có chủng Zymomonas phát triển cả.

c Ni cấy

Mơi trường ni cấy có chứa glucose(50g/l),dịch chiết nấm men Difco(5g/l) muối khoáng Trong suốt trình phát triển, pH mơi trường thay đổi từ 5,6-5,7 lúc bắt đầu đến khoảng 4,5-4,8 lúc kết thúc nuôi cấy Để nghiên cứu hô hấp tổng hợp ATP điểu kiện không lớn lên vi khuẩn, tế bào phát triển kị khí theo hàm mũ thu hoạch máy li tâm, rửa ngâm đệm kali phosphat 50mM (pH 6-9), bổ sung thêm 5mM magie sunfat, lượng sinh khối từ 3-5 mg(khối lượng khô)/ml

Tiếp tục nuôi cấy :Làm việc với 800ml, 30oC, bơm 1l/phút dung

dịch, tốc dộ quay 410 vịng/phút Mơi trường phát triển giống cho q trình ni cấy, trừ tập trung glucose 25g/l, pH giữ ổn định 6.0, thêm vào 10% KOH hoà tan, kali cyanide hoà tan thêm vào riêng ( cyanide không bền môi trường acid yếu

d Con đường lên men:

Zymomonas mobilis chuyển hoá đường thành pyruvat qua đường

ED (Entner-Doudorolff) Pyruvat sau lên men tạo ethanol CO2

sản phẩm ( tương tự nấm men )

Sự thuận lợi Z mobilis so với S cerevisiae mặt sản xuất bioethanol là:

 Đường hấp thu sản lượng ethanol cao

 Khí tạo thành

 Không phụ thuộc vào điều chỉnh lượng oxi thêm vào suốt trình lên men

 Tuân theo vận động gen

Mặc dù có giới hạn khắt khe so với nấm men: tận dụng loại chất giới hạn glucose, fructose sucrose Sử dụng phương pháp công nghệ sinh học, nhà khoa học tìm cách khắc phục điều Cái khác Z mobilis chắn chắn chúng có khả năng sử dụng pentose nguồn cacbon để phát triển

Con đường ED: Glucose bị phosphoryl hóa sau bị oxy hóa tới 6-P-gluconat Tại điểm này, loại nước xảy tạo thành 2-keto-3-deoxy-6-P-gluconat (KDPG), chất sau bị thuỷ phân nhờ KDPG-aldolase Từ mol glucose tạo thành mol pyruvat sinh mol ATP

Các nghiên cứu nuôi chủng Zymomonas mobilis ZM4 môi trường nhân tạo chứa glucose, fructose saccharose cho thấy

loài vi khuẩn khơng có khả năngchuyển hố loại đường theo bất

kì đường khác đường ED Dẫn liệu động học sinh trưởng lồi vi khuẩn trình bày theo bảng sau:

Bảng-Các thông số động học sinh trưởng chủng Zymomonas

mobilis ZM4 môi trường nuôi cấy tĩnh với nguồn carbon khác

nhau (nồng độ ban đầu 250g/l-theo N Kosaric ctv., 1983)

Thông số Cơ chất

Glucose Fructose Saccharose

Tốc độ sinh trưởng(h-1) 0,18 0,10 0,14

Tốc độ tiêu thụ chất(g/g/h) 11,3 10,4 10,0

Tốc độ tạo thành etanol(g/g/h) 5,4 5,1 4,6

Tốc độ tạo thành etanol(g/g/h) 0,015 0,009 0,014

Sản lượng etanol(g/g) 0,48 0,48 0,46

Sản lượng etanol(% so với lí thuyết)94,1 94,1 90,2

Thời gian có tốc độ cực đại(h) 0-19 0-28 0-15

Theo bảng tốc độ hấp thu đường sản sinh ethanol đạt cực đại sử dụng môi trường chứa glucose Sự kiềm hãm chất không biểu nghiêm trọng lồi vi khuẩn sinh trưởng nồng độ 40% glucose

Khi lên men nước mía, chủng Zymomonas mobilis Z7 có khả năng kết thúc lên men 100-200g/l saccharose với hiệu 59–88% vòng 20–29h Tốc độ sản sinh etanol dao động từ 2,2–5,3 g/l/h thí nghiệm loại lít Các kết phù hợp với động học lên men môi trường bán tổng hợp điều kiện tương tự Điều cofacto cần thiết, ion kim loại nồng độ C, N, P đầy đủ cho trình lên men ethanol vi khuẩn thực

Bảng _Các thông số động học Z.mobils Saccharomyces cerevisae môi trường chứa 250g glucose điều kiện ni cấy

tĩnh khơng thơng khí (30oC, pH5,0 – theo N.Kosaric ctv_1983)

Các thông số động học Z mobilis S uvarum

Tốc độ sinh trưởng riêng(l/h) 0,13 0,055

Tốc độ hấp thu glucose riêng(g/g/h) 5,5 2,1

Tốc độ tạo thành etanol

riêng(g/g/h) 2,5 2,1

Sản lượng tế bào(g/g)

0,019 0,033

Sản lượng etanol (g/g) 0,47 0,44

Sản lượng etanol tương đối(%) 92,5 86

Nồng độ etanol cực đại(g/l) 102 108

Bảng cho thấy điều kiện nuơi tĩnh (gián đoạn),

Zymomonas mobilis lên men hiệu Saccharomyces uvarum Các

hơn nấm men), tốc độ sinh ethanol riêng phần (2,9 lần cao hơn) tốc độ hấp thu glucose riêng phần (2,6 lần cao hơn)

Trong lên men nấm men, oxy cần thiết để tổng hợp thành tế bào, ổn định cấu trúc lipid, trì q trình tế bào nói chung Tuy nhiên, điều kiện hiếu khí dẫn đến việc giảm thu hoạch cồn tăng nồng độ sinh khối hiệu ứng Pasteur Vì nhiều vi khuẩn kỵ khí nên đạt suất cồn cao sinh khối thấp Nồng độ tế bào vi khuẩn thấp hậu việc lượng giành cho sinh trưởng đạt thấp (1ATP glucose tiêu thụ theo đường ED so với 2ATP theo đường EM nấm men)

Sơ đồ đường ED

e Nguyên liệu môi trường lên men

Zymomonas mobilis nuôi cấy môi trường glucose

(glucose 80g/dm3,ph ần chi ết men 10 g/dm3, KH

2PO4 1g/dm3, (NH4)2SO4

1g/dm3, MgSO

4.7H2O 0.5 g/dm3

Môi trường glucose ( glucose 80 đến 250 g/dm3, phần chiết men 10 g/dm3,

KH2PO4 1g/dm3, (NH4)2SO4 g/dm3, v MgSO4.7H2O 0.5 g/dm3 sử

dụng thí nghiệm

Quá trình lên men thực bình Erlenmeyer chứa 0.2 dm3 mơi trường 0.2 chất để chủng ( 80 g/dm3 môi trường glucose sau 24

f Hiệu suất trình:

Chay et al cho giống sản xuất ethanol tốt từ đường hóa những chất lỏng nhiều đường giống vi khuẩn Z mobilis S.

diastaticus Toran-Diaz et al nghiên cứu ảnh hưởng chất thủy phân

bằng acid chất thủy phân enzyme sản xuất ethanol giống ZM4 ZM4F vi khuẩn Z mobilis Chúng đạt khả sản xuất ethanol : 4,8 g/g/h với Z mobilis phát triển dịch hoa hướng

dương, cao nấm men Kluyveromyces Hơn nữa, họ quan sát dịch

của hoa hướng dương lên men mà khơng cấn điều kiện dinh dưỡng

Gần đây, Lawford et al chứng tỏ chất lỏng ngâm bắp, sản phẩm bắp, chất có ảnh hưởng đáng kể cho việc sản xuất ethanol vi khuẩn Z mobilis CP4

Torres Baratti nghiên cứu lên men thủy phân bột lúa mì bằng Z mobilis Họ cho lên men loạt , nộng độ đường cao 223 g/l lên men đến 105 g/l 70 Phần trăm lượng lý thuyết 92% Mẫu lên men Z mobilis ATCC10988, ATCC 12526 NRRL B4286 môi trường tổng hợp, dịch mía mật đường cho ta giống NRRL B4286 sản xuất lượng ethanol lớn môi trường tổng hợp, giống ATCC 12526 ATCC 10988 tốt dịch mía Tuy nhiên, tất giống lên men mật đường

Khi Z mobilis S cerevisiae kết hợp khả chúng để sản xuất ethanol từ glucose tinh bột thuỷ phân, sinh cao so với Z.

mobilis.Chưng cất Z mobolis cho thấy sản phẩm phụ ethanol

thấp lần so với S cerevisiae lượng ethanol sản xuất lúa mạch đen

Một số quy trình lên men rượu khác nhau, việc tiếp tục trình sử dụng AMG cell thuận lợi nhất, với hoạt động ổn định 40 ngày Sản xuất ethanol từ hoa hướng dương sử dụng ZM4F của Z mobilis nghiên cứu Allais et al Kết họ rằng thể tích xản suất 67.2g/l/h với lượng ethanol cuối cô đặc 42g/l từ 100g/l đường ban đầu Doelle mô tả quy trình liên tục sản xuất ethanol từ tinh bột thuỷ phân Quá trình sử dụng Z.mobilis pha lên

men cồn đơn giản Ông ta nhận xác nhận chất lượng tinh bột thuỷ phân

không quuyết định đến thành cơng q trình lên men, cho

năng suất chuyển hoá 92% Một q trình sản xuất ethanol c ơng

nghiệp từ tinh bột lúa mỳ thuỷ phân sử dụng Z mobilis mô tả bởi Sahm Bringer-Meyer Những khám phá cho thấy chủng Z.

mobilis sản xuất 60 g ethanol /l khoảng thời gian 39 ngày sử dụng.

Biofiml reactor( kỹ thuật việc giử cố định tế bào vi khuẩn thông thường nhúng polyme tế bào để chúng dính chặt vào bề mặt S thành lập cộng đồng vi khuẩn kháng cự cao tế bào thực khuẩn lẫn chất kháng sinh) với polypropylene plastic susport sử dụng để sản xuất ethanol, kết

quả cho thấy tỷ lệ ethanol sản xuất cô cạn

biofilm reactor cao nuôi cấy dung dịch lỏng Việc liên tục lên men sử dụng hỗn hợp nuôi cấy gồm Z mobilis S cerevisiae, sản xuất 54.3g/l ethanol

1.CLOSTRIDIUM

a-Đặc điểm

Clostridium phát từ năm 1893, loại vi khuẩn kỵ khí,

tự dưỡng, sống tự đất.Vi khuẩn G+, có hình que, cịn non có khả

Quá trình phát triển qua giai đoạn:

Giai đoạn 1: Các tế bào tạo thành hình sợi kéo dài Giai đoạn 2: Giai đoạn tách hình sợi ra

Giai đoạn 3: Giai đoạn có tế bào hoạt động mạnh

Giai đoạn 4: Giai đoạn tạo thành nha bào Đây giai đoạn phát dục

không ổn định nên hình thành bào tử có tính đề kháng cao.Bào tử hình thành bên nên gọi nội bào tử

Bào tử có hình cầu, hình bầu dục hay hình oval, kích thước từ 0.2-2 .Bào tử nằm đầu tế bào Do kích thước bào tử lớn nên làm biến dạng tế bào vi khuẩn.Bào tử suốt, cấu tạo bới màng bao bọc, khối bào tương đặc.Tế bào vi khuẩn bọc bào tử vài vài ngày, tuỳ điều kiện cụ thể mà chúng bị tan ra.Bào tử có sức đề kháng cao, chịu điều kiện môi trường bất lợi chất dinh dưỡng cạn kiệt, chất độc hại nhiều, nhiệt độ cao hay có thay đổi điều kiện sinh trưởng…

Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử phát triển thành vi khuẩn (bào tử nảy mầm).Bào tử dài ra, vi khuẩn non thoát đầu thân

Giai đo ạn 5: Giai đoạn

sinh sản

Clostridium có khả đồng hoá nhiều nguồn Cacbon khác như

b.Điều kiện phát triển:

P K nguyên tố cần thiết cho phát triển cố định Nitơ của Clostridium Ngoài ra, nguyên tố vi lượng khác Mo, Co, Cu, Mn cần thiết Clostridium

Clostridium có khả phát triển pH = 4.7 – 8.5 Bào tử của

chúng chịu đựng nhiệt độ cao, sống 800C.

Một số lồi cịn chịu nhiệt độ 1000C 30’

Trong loài Clostridium, loài dùng sản xuất rượu là

Clostridium ljungdahlii Vi khuẩn có tỉ lệ G + C khoảng 22-23%.

Chúng phát triển khí tổng hợp để sản xuất acetate ethanol từ chất thể khí Chúng phát triển nhờ tổng hợp CO chất khí áp suất tuyệt đối khoảng 0.8 – 1.8 atm Tỉ lệ tế bào sản phẩm tạo thành 0.015g tế bào/g CO 0.41g acetate/g CO Sự cô đặc ethanol tăng cao có mặt H2 CO2 ban đầu pha lỏng Khơng có ức chế

PHẦN 5: HIỆU SUẤT VÀ TỔN THẤT TRONG SẢN XUẤT

Để đánh giá hiệu làm việc tồn cơng đoạn trình sản xuất, người a dùng khái niệm hiệu suất tổng thu hồi Đó tồn lượng cồn nhận sản xuất từ lượng nguyên liệu xác định (thường tính theo 100kg đường tinh bột ) chia cho lượng cồn nhận theo phương trình lý thuyết biểu thị theo % Tỷ số gọi hiệu suất thực tế ký hiệu ηt Hiệu suất gồm hiệu suất nấu

đường hóa lên men ( kể nghiền nguyên liệu), ký hiệu ηm hiệu

suất chưng caát ηc

ηt = ηc ηm

Lượng cồn nhận theo lý thuyết tính theo phương trình Gaylussac: C6H12O6 2C2H5OH + CO2

180,1 92,1 88

Từ phương trình suy ra, 100 kg đường đơn giản ( glucose, fructose, …) lên men cho ta 51,14 kg cồn etylic 48,66 kg CO2

Đem chia cho khối lượng riêng cồn 20o C, d204 = 0,78927, ta có : 51,14/ 0,78927 = 64,794 l 100%

Nếu tính cho 100kg đường đơi ( maltose, saccharose) cần nhân với hệ số 1,0526, với tinh bột nhân 1,11104 kết xem bảng sau

Nguồn glucid Lượng cồn thu từ 100kg

Theo lít Theo kg

Tinh bột Đường đôi Đường đơn

71,998 68,20 64,794

56,818 53,83 51,14

nhau, từ 75- 93% Với phát triển khoa học công nghệ, hiệu thực tế ngày tiệm cận với lý thuyết không đạt tới 100%

Để nâng cao trách nhiệm người vận hành dễ kiểm tra sản xuất, người ta chia hiệu suất lên men hiệu suất chưng cất vào số liệu nguyên liệu hàm lượng đường tinh bột đưa vào sản xuất lượng giấm chín nồng độ cồn sau lên men, người ta tính hiệu suất thu sau lên men giao cho phân xưởng chưng luyện Ví dụ: Sau ca đưa vào sản xuất 10 ngun liệu có hàm lượng tinh bột trung bình 65% Lượng giấm thu tương ứng 48 m3 với nồng

độ cồn 8,8% V Hiệu suất sau lên men :

(48 000 x 8,8 = 4224) %= 90,27 % 10000kg x 0,65 x71,99l

Từ 4224 lít cồn chứa 48000 lít giấm, sau cất thu 126 lít cồn đầu với nồng độ 90% 4050 lít cồn tinh chế với nồng độ 96% Hiệu suất chưng cất

ηc = 126 x 0,9 + 4050 x 0,96 % = 94,73%

4224

Hiệu suất tổng thu hồi thực tế là:

ηt = ηc ηm = 90,27 % x 94,73 % = 85,24 %

Trong sản xuất nhiều nơi khơng tính hiệu suất thực tế so với lý thuyết mà tính tiêu hao nguyên liệu cho lít cồn Cách tính đơn giản xác Vì chất lượng ngun liệu nhiều khơng đồng theo thời gian nhà máy Khi tính tiêu hao kg nguyên liệu cho lít cồn cần kèm theo: % tinh bột nguyên liệu ( đường nên quy theo tinh bột ngược lại) Nồng độ cồn cần thống 100%

hàm lượng đường 54%.Lượng đường tiêu tốn cho 1l cồn 100% V cở sở A 4kg x 0,5=2kg.Hiệu suất tổng thu hồi thực tế:

% = 77,16 %

2 x 0,6478

Tiêu tốn đường cho 1l cồn sở B: 3,8 x 0,54 = 2,052

Hiệu suất tổng thu hồi:

% = 75,21 %

2,052 x 0,6457

Như nhìn ta tưởng sở sản xuất B làm ăn có hiệu thực chất hiệu suất tổng thu hồi lại so với sở sản xuất A

Hiêu suất tổng thu hồi cồn từ sắn nơi làm ăn có hiệu nước ta vào khoảng 82 đến 85 % Tiêu hao sắn có hàm lượng tinh bột 62 đến 65 %, vào khoang 2,6 đến 2,8kg/l qui 100%

Trong trình sản xuất có dạng tổn thất sau: 1- Tổn thất nghiền, vận chuyển nội 0,2 đến 0,3%;

2- Tổn thất nấu, đường hóa lên men đến 12% ( tinh bột sót, đường sót, tạo men)

3- Tổn thất không xác định, đổ ngoài, đọng lại thiết bị, đường ống bay theo CO2 từ đến 2%

4- Tổn thất chưng cất, bay hơi, cồn cịn sót lại bã rượu, nước thải xác định theo công thức sau:

B = % M

B- tổn thất cồn theo bã rượu nước thải, %

A- hàm lượng cồn bã nước thải, kg/m3,thường 0,015 đến 0,03%

n- hệ số chuyển % khối lượng rượu thành tinh bột ( n= 1,8529) V- thể tích giấm đem cất ca ngày m3

m- hệ số pha loãng cho nước ngưng tụ, thường 1; 1,15;1,2 M- lượng tinh bột ứng với V m3 giấm cất, kg

Lượng cồn tổn thất chưng luyện nứơc tiên tiến vào khoảng đến 2%, ta tổn thất lớn, từ đến 10% có nơi cịn cao

5- Ở kể tổn thất chung cho lên men từ 6đến 12% Riêng tổn thất nhiễm khuẩn làm tăng độ chua so với bình thường xác định theo cơng thức sau:

4,5 x N x V x 100

D = %

M

4,5- lượng đường tăng 10 chua (10 chua tương đương với 2,45g

H2SO4/l, kg/m3)

N- số độ chua tăng mức quy định

Ví dụ: Độ chua trước lên men 0,3o, theo quy định sau lên men độ

chua tăng 0,2, tức tới 0,5o ( tương đương 1,23g/l); do

dịch lên men bị nhiễm khuẩn nên sau lên men độ chua tăng tới 0,8 Do lượng đường bị nhiễm bằng:

D = 4,5( 0,8- 0,5) x 48 000 x 100 =1%

Tổng cộng lượng tinh bột đường tổn thất dây chuyền sản xuất nước tiên tiến vào khoảng 10%; nước ta vào khoảng 15-40 %

Giảm tổn thất vơ hình hữu hình nhằm nâng cao dần hiệu suất tổng thu hồi việc làm có ý nghĩa kinh tế kỹ thuật quan trọng Đây việc phải làm thường xuyên liên tục sở sản xuất Chỉ có sở sâu để nắm bắt kỹ thuật công nghệ, nâng dần hiệu suất thu hồi chất lượng sản phẩm, rút ngắn khỏang cách mặt xí nghiệp nước ta với nước tiên tiến

Nếu nâng cao hiệu suất thực tế 2% so với sở sản xuất ứng với sở có suất 5000l cồn / ngày, ngày sở thu thêm khoảng 100 lít cồn Một năm thu thêm 30 000 lít mà khơng tốn thêm Với giá bán cồn tinh bột 15 000 đ/lít hàng năm nhà máy thu thêmkhoảng 450 triệu đồng Với sở sản xuất lớn Rượu Hà Nội Bình Tây hiệu kinh tế cịn cao nhiều Do ta cần quan tâm đền hiệu kinh tế tăng hiệu suất tổng thu hồi

1- Công nghệ sản xuất & kiểm tra cồn etylic - NXB Khoa học kỹ thuật-PGS TS Nguyễn Đình Thưởng, TS Nguyễn Thanh Hằng -Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội

2- Vi sinh vật học - Nguyễn Laân Dũng (chủ biên) - NXB Giáo Dục 3- Công nghệ lên men ứng dụng công nghệ thực phẩm - Bùi Ái - ĐHQG TPHCM – ĐH Bách Khoa