Khảo sát dấu vân tay hóa học của cốm phương thuốc đào hồng tứ vật bằng sắc ký lớp mỏng

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ THẢO HÀ KHẢO SÁT DẤU VÂN TAY HÓA HỌC CỦA CỐM PHƢƠNG THUỐC ĐÀO HỒNG TỨ VẬT BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2020 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ THẢO HÀ Mã sinh viên: 1501130 KHẢO SÁT DẤU VÂN TAY HÓA HỌC CỦA CỐM PHƢƠNG THUỐC ĐÀO HỒNG TỨ VẬT BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn : PGS.TS Bùi Hồng Cƣờng Nơi thực : Bộ môn Dƣợc học cổ truyền HÀ NỘI - 2020 LỜI CẢM ƠN Trong q trình thực hồn thành khóa luận, em nhận đƣợc giúp đỡ quý báu thầy cô, chuyên gia lĩnh vực nghiên cứu bạn bè gia đình Trƣớc hết em xin cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Đào tạo đại học tồn thể thầy giáo Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội ln tạo điều kiện, tận tình dạy dỗ bảo cho em suốt năm học qua Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Bùi Hồng Cƣờng, ngƣời tận tình hƣớng dẫn, quan tâm, bảo tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình học tập thực khóa luận Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến DS Trần Văn Cƣơng Công ty cổ phần Dƣợc phẩm VCP, DS Đỗ Trung Hiếu Công ty cổ phần thƣơng mại dƣợc phẩm quốc tế WINSACOM cung cấp mẫu cốm thuốc, chất chuẩn hỗ trợ kinh phí cho em thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển thầy cô môn Dƣợc học cổ truyền tạo điều kiện thuận lợi cho em trình làm thực nghiệm Cuối lời cảm ơn sâu sắc nhất, em muốn gửi tới gia đình, ngƣời thân bạn bè bên cạnh, ủng hộ em suốt trình học tập Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2020 Sinh viên Lê Thảo Hà MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ KIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Phƣơng thuốc Đào hồng tứ vật 1.1.1 Công thức 1.1.2 Công năng, chủ trị, cách dùng phƣơng thuốc 1.1.3 Định tính sắc ký lớp mỏng so sánh với dƣợc liệu chuẩn Đƣơng quy Xuyên khung 1.2 Tổng quan vị thuốc cốm phƣơng thuốc Đào hồng tứ vật 1.2.1 Thục địa 1.2.2 Xuyên khung 1.2.3 Bạch thƣợc 1.2.4 Đƣơng quy 1.2.5 Đào nhân 1.2.6 Hồng hoa 10 1.3 Vài nét dấu vân tay hóa học 11 1.3.1 Dấu vân tay hóa học 11 1.3.2 Ứng dụng dấu vân tay hóa học 12 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Đối tƣợng, phƣơng tiện nghiên cứu 13 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 13 2.1.2 Thiết bị, máy móc 13 2.1.3 Hóa chất, chất chuẩn 14 2.2 Phƣơng pháp nghiên c ứu 14 2.2.1 Chuẩn bị mẫu 14 2.2.2 Điều kiện sắc ký 15 2.2.3 Hiện vết xử lý kết 15 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 16 3.1 Định tính Thục địa cốm phƣơng thuốc Đào hồng tứ vật sắc ký lớp mỏng 16 3.1.1 Khảo sát dung môi chiết Thục địa 16 3.1.2 Khảo sát hệ dung môi pha động 17 3.2 Định tính Xuyên khung cốm phƣơng thuốc Đào hồng tứ vật sắc ký lớp mỏng 19 3.2.1 Khảo sát dung môi chiết Xuyên khung 19 3.2.2 Khảo sát hệ dung môi pha động 20 3.3 Định tính Bạch thƣợc cốm phƣơng thuốc Đào hồng tứ vật sắc ký lớp mỏng 21 3.3.1 Khảo sát dung môi chiết Bạch thƣợc 22 3.3.2 Khảo sát hệ dung môi pha động 23 3.4 Định tính Đƣơng quy cốm phƣơng thuốc Đào hồng tứ vật sắc ký lớp mỏng 25 3.4.1 Khảo sát dung môi chiết Đƣơng quy 25 3.4.2 Khảo sát hệ dung môi pha động 26 3.5 Định tính Đào nhân cốm phƣơng thuốc Đào hồng tứ vật sắc ký lớp mỏng 28 3.5.1 Khảo sát dung môi chiết Đào nhân 28 3.5.2 Khảo sát hệ dung môi pha động 30 3.6 Định tính Hồng hoa cốm phƣơng thuốc Đào hồng tứ vật phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng 31 3.6.1 Khảo sát dung môi chiết Hồng hoa 31 3.6.2 Khảo sát hệ dung môi pha động 33 CHƢƠNG BÀN LUẬN 35 4.1 Khối lƣợng mẫu nghiên cứu 35 4.2 Phƣơng pháp chiết hệ pha động 35 4.3 Phƣơng pháp màu thuốc thử 35 4.4 Sắc ký đồ 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ……………………………………………………………………… 39 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ac Aceton HH Hồng hoa BT Bạch thƣợc HPLC High-performance Bu Butanol C Cốm Clo Chloroform layer chromatography _ D Dƣợc liệu chuẩn Sắc ký lớp mỏng hiệu liquid chromatography _ Sắc ký lỏng hiệu cao HPTLC High-performance thin- cao DL Dƣợc liệu LC-MS Liquid chromatography– DĐTQ Dƣợc điển Trung Quốc mass spectrometry _ Sắc DĐVN Dƣợc điển Việt Nam ký lỏng ghép khối phổ ĐHTV Đào hồng tứ vật Me Methanol ĐN Đào nhân P Placebo ĐQ Đƣơng quy PAE Chất chuẩn Paeoniflorin ĐT Định tính PL Phụ lục E Ethanol SKLM Sắc ký lớp mỏng EA Ethyl acetat TĐ Thục địa Et Ether TLC Thin layer chromatography _ Sắc ký GC-MS Gas chromatography- lớp mỏng mass spectrometry _ Sắc XK ký khí ghép khối phổ GS Gas chromatography Sắc ký khí _ Xuyên khung DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1.Công thức bào chế gói cốm phƣơng thuốc Đào hồng tứ vật 13 Bảng 3.1.Kết sắc ký lớp mỏng định tính vị thuốc Thục địa cốm phƣơng thuốc Đào hồng tứ vật sau màu thuốc thử 18 Bảng 3.2.Kết sắc ký lớp mỏng định tính vị thuốc Xuyên khung cốm phƣơng thuốc Đào hồng tứ vật bƣớc sóng 254 nm 21 Bảng 3.3.Kết sắc ký lớp mỏng định tính vị thuốc Bạch thƣợc cốm phƣơng thuốc Đào hồng tứ vật sau màu thuốc thử 25 Bảng 3.4.Kết sắc ký lớp mỏng định tính vị thuốc Đƣơng quy cốm phƣơng thuốc Đào hồng tứ vật bƣớc sóng 366 nm 28 Bảng 3.5.Kết sắc ký lớp mỏng định tính vị thuốc Đào nhân cốm phƣơng thuốc Đào hồng tứ vật sau màu thuốc thử 31 Bảng 3.6.Kết sắc ký lớp mỏng định tính vị thuốc Hồng hoa cốm phƣơng thuốc Đào hông tứ vật sau màu thuốc thử 34 Bảng 4.1.Các tiêu định tính xác định dấu vân tay hóa học cốm phƣơng thuốc Đào hồng tứ vật 37 DANH MỤC HÌNH Hình 3.1.Sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết Thục địa 17 Hình 3.2.Sắc ký đồ định tính Thục địa sau màu thuốc thử vanilin 2% ethanol acid sulfuric 18 Hình 3.3.Sắc ký đồ khảo sát dung mơi chiết Xuyên khung 20 Hình 3.4.Sắc ký đồ định tính Xuyên khung soi bƣớc sóng 254 nm 21 Hình 3.5.Sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết Bạch thƣợc 23 Hình 3.6.Sắc ký đồ định tính Bạch thƣợc sau màu thuốc thử vanilin 2% ethanol acid sulfuric 25 Hình 3.7.Sắc ký đồ khảo sát dung mơi chiết Đƣơng quy 26 Hình 3.8.Sắc ký đồ định tính Đƣơng quy soi bƣớc sóng 366 nm 28 Hình 3.9.Sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết Đào nhân 29 Hình 3.10.Sắc ký đồ định tính Đào nhân sau màu thuốc thử vanilin 2% ethanol acid sulfuric 31 Hình 3.11.Sắc ký đồ khảo sát dung mơi chiết Hồng hoa 32 Hình 3.12.Sắc ký đồ định tính Hồng hoa sau màu thuốc thử vanilin 2% ethanol acid sulfuric 34 ĐẶT VẤN ĐỀ Nền Y dƣợc học cổ truyền Phƣơng Đông với bề dày lịch sử hàng nghìn năm tạo nên kho tàng thuốc phong phú, góp phần to lớn việc chăm sóc bảo vệ sức khỏe ngƣời Ngày nay, kho tàng cịn đóng vai trị nguồn nghiên cứu để từ cho đời chế phẩm thuốc đại, đáp ứng tốt nhu cầu ngƣời bệnh Phƣơng thuốc Đào hồng tứ vật có xuất xứ từ sách Trung Quốc “Y tông kim giám” với công dƣỡng huyết hoạt huyết, chủ trị phụ nữ kinh nguyệt không đều, bế kinh, thống kinh, hành kinh khơng thoải mái mà có huyết cục, màu tía xám, Phƣơng thuốc đƣợc sử dụng rộng rãi Y học cổ truyền phƣơng Đông để điều trị rối loạn kinh nguyệt, đau bụng kinh, dùng kết hợp với thuốc khác nhƣ Thanh nhiệt điều huyết thang, Giải độc hoạt huyết thang [5] Tuy nhiên với nhịp sống đại việc sử dụng thuốc đông dƣợc theo cách sắc truyền thống bất tiện Thời gian sắc lâu với công đoạn phức tạp thời gian bảo quản ngắn rào cản không nhỏ để Đào hồng tứ vật thang đồng hành ngƣời bệnh trình điều trị Với mong muốn phát huy tính ƣu việt thuốc cổ truyền đồng thời tiện lợi sử dụng, việc nghiên cứu tiêu chuẩn hóa phƣơng thuốc với dạng bào chế đại vô cần thiết, cốm dạng thuốc dễ sử dụng, hấp thu nhanh dùng đƣợc bệnh nhân gặp vấn đề nuốt Hiện dạng cốm phƣơng thuốc Đào hồng tứ vật đƣợc bào chế thành cơng nhiên chƣa có nghiên cứu tiêu chuẩn hóa dạng bào chế Từ lí trên, đề tài “Khảo sát dấu vân tay hóa học cốm phƣơng thuốc Đào hồng tứ vật sắc ký lớp mỏng” đƣợc thực hiên với mục tiêu: “Định tính xác định tính đặc hiệu vị thuốc cốm phƣơng thuốc Đào hồng tứ vật sắc ký lớp mỏng” 12 Chen Zhejie, Zhang Chen, et al (2018), "A systematic review on the rhizome of Ligusticum chuanxiong Hort (Chuanxiong)", Food and Chemical Toxicology, 119, pp 309-325 13 Chinese pharmacopoeia commission (2015), Chinese pharmacopoeia, The Stationery Ofice, China, pp 37, 38, 95, 96, 260, 261, 322, 323, 374, 375, 389, 390, 1621 14 Chinese pharmacopoeia commission (2009), TLC Atlat of Chinese Crude Drugs in Pharmacopoeia of the People's Republic of Chinese , People's Medical Publishing house, China, pp 60, 174, 210 15 Devkota Laxmi, Rajbhandari Meena (2016), "Composition of Essential Oils in Turmeric Rhizome", Nepal Journal of Science and Technology, 16, pp 87 16 Han L., Ji Z., et al (2015), "Protective effects of tao-Hong-si-wu decoction on memory impairment and hippocampal damage in animal model of vascular dementia", Evid Based Complement Alternat Med, 2015, pp 195835 17 Jarikasem S., Thubthimthed S., et al (2003), " Esential oils from three Curcuma species collected in Thailand", III WOCMAP congress on Medicinal and Aromatic Plants, 3(Perspectives in Natural Product Chemistry 677), pp 37-41 18 Jia-Xi L., Chun-Xia Z., et al (2019), "Application of multiple chemical and biological approaches for quality assessment of Carthamus tinctorius L (safflower) by determining both the primary and secondary metabolites", Phytomedicine, 58, pp 152826 19 Kim M C., Lee C H., et al (2013), "Effects of anti-inflammatory and Rehmanniae radix pharmacopuncture on atopic dermatitis in NC/Nga mice", J Acupunct Meridian Stud, 6(2), pp 98-109 20 Li Shan-shan, Chen Zi-chao, et al (2012), "Effect of tao-hong-si-wu-tang, a traditional Chinese herbal medicine formula, on physical fatigue in mice", African journal of traditional, complementary, and alternative medicines : AJTCAM, 10(1), pp 60-65 21 Matsumoto Y., Sekimizu K (2016), "A hyperglycemic silkworm model for evaluating hypoglycemic activity of Rehmanniae Radix, an herbal medicine", Drug Discov Ther, 10(1), pp 14-8 22 Parker S., May B., et al (2016), "A Pharmacological Review of Bioactive Constituents of Paeonia lactiflora Pallas and Paeonia veitchii Lynch", Phytother Res, 30(9), pp 1445-73 23 Rhyu M R., Kim E Y., et al (2004), "Nitric oxide-mediated vasorelaxation by Rhizoma Ligustici wallichii in isolated rat thoracic aorta", Phytomedicine, 11(1), pp 51-55 24 Sinclair S (1998), "Chinese herbs: a clinical review of Astragalus, Ligusticum, and Schizandrae", Altern Med Rev, 3(5), pp 338-44 25 Tao T Q., Mao H M., et al (2019), "Efficacy and Safety Evaluation of Taohong Siwu Decoction for Patients with Angina Pectoris: A Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials", Chin J Integr Med, pp 50-56 26 Tu Yanhua, Xue Yingru, et al (2015), "Carthami flos: a review of its ethnopharmacology, pharmacology and clinical applications", Revista Brasileira de Farmacognosia, 25(5), pp 553-566 27 Wang K., Tang Z., et al (2016), "Protective effects of Angelica sinensis polysaccharide against hyperglycemia and liver injury in multiple low-dose streptozotocin-induced type diabetic BALB/c mice", Food Funct, 7(12), pp 4889-4897 28 Wei W L., Zeng R., et al (2016), "Angelica sinensis in China-A review of botanical profile, ethnopharmacology, phytochemistry and chemical analysis", J Ethnopharmacol, 190, pp 116-41 29 Wu Q., Chen G L., et al (2015), "Paeoniflorin inhibits macrophage-mediated lung cancer metastasis", Chin J Nat Med, 13(12), pp 925-32 30 Xu L., Zhang W., et al (2017), "Rehmannia glutinosa polysaccharide induced an anti-cancer effect by activating natural killer cells", Int J Biol Macromol, 105(Pt 1), pp 680-685 31 Yan Binjun, Shen Menglan, et al (2018), "Advancement in the chemical analysis of Paeoniae Radix (Shaoyao)", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 160, pp 276-288 32 Zhang Lei, Zou Y., et al (2015), "[Chemical constituents from aerial part of Rehmannia glutinosa]", Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 40(16), pp 3214-9 PHỤ LỤC Phụ lục Sắc ký đồ vị thuốc Phụ lục Phƣơng thuốc Đào hồng tứ vật _ Cốm vị thuốc Phụ lục Định tính vị dƣợc liệu phản ứng hóa học Phụ lục Phiếu kiểm nghiệm cốm vị thuốc Phụ lục Dƣợc liệu chuẩn PHỤ LỤC I SẮC KÝ ĐỒ SẮC KÝ LỚP MỎNG (CÁC VỊ THUỐC) Phụ lục 1.1.Sắc ký đồ định tính Thục địa bƣớc sóng 254 nm 366 nm (Khai triển hệ dung môi Toluen - ethyl acetat - acid acetic (12 : :1)) Phụ lục 1.2.Sắc ký đồ định tính Xun khung bƣớc sóng 366 nm quan sát ánh sáng thƣờng sau phun thuốc thử vanilin 2% ethanol acid sulfuric (Khai triển hệ dung môi Toluen - ethyl acetat - acid formic (5,4 : :1)) Phụ lục 1.3.Sắc ký đồ định tính Bạch thƣợc bƣớc sóng 254 nm 366 nm (Khai triển hệ dung môi Chloroform - ethyl acetat – methanol - amoniac (8 : : : 1)) Phụ lục 1.4.Sắc ký đồ định tính Đƣơng quy bƣớc sóng 254 nm quan sát ánh sáng thƣờng sau phun thuốc thử vanilin 2% ethanol acid sulfuric (Khai triển hệ dung môi Ethyl acetat - ethanol - nƣớc (8 : :1)) Phụ lục 1.5.Sắc ký đồ định tính Đào nhân bƣớc sóng 254 nm 366 nm (Khai triển hệ dung môi Toluen - ethyl acetat - acid formic (7 : :1)) Phụ lục 1.6.Sắc ký đồ định tính Hồng hoa bƣớc sóng 254 nm 366 nm (Khai triển hệ dung môi Toluen - ethyl acetat - acid formic (5 : : 1) PHỤ LỤC II PHƢƠNG THUỐC ĐÀO HỒNG TỨ VẬT_CỐM VỊ THUỐC Cốm Thục địa Cốm Bạch thƣợc Cốm Đào nhân Cốm Xuyên khung Cốm Đƣơng quy Cốm Hồng hoa PHỤ LỤC III: ĐỊNH TÍNH CÁC VỊ THUỐC BẰNG PHẢN ỨNG HĨA HỌC (DĐVN V) 4.1 Thục địa Khơng có định tính phản ứng hóa học 4.2 Xun khung A Lấy g bột dƣợc liệu làm ẩm amoniac (TT), để yên 30 min, thêm 20 ml chloroform (TT), ngâm h, lắc siêu âm 30 min, lọc Dịch lọc cho vào bình gạn, thêm ml dung dịch acid sulfuric 10 % (TT), lắc, để yên cho dung dịch tách thành lớp, gạn lấy dịch acid cho vào ống nghiệm, ống ml Ống 1: Thêm giọt thuốc thử Dragendorff (TT) có tùa màu đỏ gạch Ĩng 2: Thêm giọt thuốc thử Bouchardat (TT) có tủa nâu B Lấy g bột dƣợc liệu, thêm ml ether dầu hỏa (30 °C đến 60 °C) (TT), để yên 10 nhiệt độ phòng, lắc để yên Gạn lấy ml dịch chiết ether dầu hỏa đem bốc đến cắn khô, thêm giọt dung dịch acid 3,5-diniỉrohenzoic % methanol (TT) giọt methanol (TT) bão hòa kali hydroxyd (TT) xuất màu tím hồng 4.3 Bạch thƣợc Khơng có định tính phản ứng hóa học 4.4 Đƣơng quy Khơng có định tính phản ứng hóa học 4.5 Đào nhân Khơng có định tính phản ứng hóa học 4.6 Hồng hoa Ngâm g dƣợc liệu 10 ml ethanol 50 % (TT) khoảng 10 Gạn dịch ngâm (phẩn trên) vào cốc có mỏ, treo băng giấy lọc ngâm phần vảo dịch nàỵ Sau min, lấy băng giấy lọc ra, ngâm vào nƣớc nhắc Phần băng giấy lọc có màu vàng nhạt, phần dƣới băng giấy lọc có màu đỏ nhạt PHỤ LỤC IV PHIẾU KIỂM NGHIỆM CÁC CỐM VỊ THUỐC 5.1 Cốm Thục địa 5.2 Cốm Xuyên khung 5.3 Cốm Bạch thƣợc 5.4 Cốm Đƣơng quy 5.5 Cốm Đào nhân 5.6 Cốm Hồng hoa PHỤ LỤC V: DƢỢC LIỆU CHUẨN 5.1 Thục địa 5.2 Đƣơng quy 5.3 Bạch thƣợc 5.4 Xuyên khung 5.5 Đào nhân 5.5 Hồng hoa ... sắc ký lớp mỏng định tính vị thuốc Đào nhân cốm phƣơng thuốc Đào hồng tứ vật sau màu thuốc thử 31 Bảng 3.6.Kết sắc ký lớp mỏng định tính vị thuốc Hồng hoa cốm phƣơng thuốc Đào hông tứ vật. .. điều chế cốm phƣơng thuốc Đào hồng tứ vật Nhƣ sử dụng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng để xác định dấu vân tay hóa học vị thuốc cốm phƣơng thuốc Đào hồng tứ vật, nhiên khó xác định đƣợc vết sắc ký đồ... Định tính Đào nhân cốm phƣơng thuốc Đào hồng tứ vật sắc ký lớp mỏng 3.5.1 Khảo sát dung môi chiết Đào nhân  Mẫu nghiên cứu: Cốm phƣơng thuốc Đào hồng tứ vật (5,46 g) Cốm vị thuốc Đào nhân (0,20