Khảo sát dấu vân tay hóa học của cốm phương thuốc đởm đạo bài thạch bằng sắc ký lớp mỏng

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HỒNG KHẢO SÁT DẤU VÂN TAY HÓA HỌC CỦA CỐM PHƯƠNG THUỐC ĐỞM ĐẠO BÀI THẠCH BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2020 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HỒNG Mã sinh viên: 1501190 KHẢO SÁT DẤU VÂN TAY HÓA HỌC CỦA CỐM PHƯƠNG THUỐC ĐỞM ĐẠO BÀI THẠCH BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Bùi Hồng Cường Nơi thực hiện: Bộ môn Dược học cổ truyền HÀ NỘI - 2020 LỜI CẢM ƠN Trong trình thực hồn thành khóa luận, em nhận giúp đỡ quý báu thầy cô, bạn bè gia đình Trước hết em xin cảm ơn Ban giám hiệu, phịng Đào tạo đại học tồn thể thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội ln tạo điều kiện, tận tình dạy dỗ bảo cho em suốt năm học qua Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Bùi Hồng Cường, người tận tình hướng dẫn, quan tâm, bảo tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình học tập thực khóa luận Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến DS Trần Văn Cương Công ty cổ phần Dược phẩm VCP, DS Đỗ Trung Hiếu Công ty cổ phần thương mại dược phẩm quốc tế WINSACOM cung cấp mẫu cốm thuốc, dược liệu chuẩn hỗ trợ kinh phí cho em thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển thầy cô môn Dược học cổ truyền tạo điều kiện thuận lợi cho em trình làm thực nghiệm Cuối lời cảm ơn sâu sắc nhất, em muốn gửi tới gia đình, người thân bạn bè bên cạnh, ủng hộ em suốt trình học tập Hà Nội, ngày 22 tháng năm 2020 Sinh viên Nguyễn Thị Hồng MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan phương thuốc “Đởm đạo thạch” 1.1.1 Công thức 1.1.2 Công năng, chủ trị phương thuốc 1.1.3 Định tính sắc ký lớp mỏng .3 1.2 Tổng quan vị thuốc phương thuốc Đởm đạo thạch 1.2.1 Kim tiền thảo .3 1.2.2 Nhân trần 1.2.3 Uất kim 1.2.4 Mộc hương 1.2.5 Chỉ thực 10 1.2.6 Đại hoàng 11 1.3 Vài nét dấu vân tay hóa học 13 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Đối tượng, phương tiện nghiên cứu 14 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 14 2.1.2 Thiết bị, máy móc 14 2.1.3 Hóa chất, dược liệu chuẩn .14 2.1.4 Địa điểm nghiên cứu .14 2.2 Phương pháp nghiên cứu 15 2.2.1 Mẫu nghiên cứu 15 2.2.2 Chuẩn bị mẫu 16 2.2.3 Triển khai sắc ký 16 2.3 Xử lý kết 17 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 18 3.1 Định tính vị thuốc Kim tiền thảo cốm phương thuốc Đởm đạo thạch18 3.1.1 Khảo sát phương pháp chiết .18 3.1.2 Khảo sát hệ dung môi pha động .19 3.2 Định tính vị thuốc Nhân trần cốm phương thuốc Đởm đạo thạch 21 3.2.1 Khảo sát phương pháp chiết .21 3.2.2 Khảo sát hệ dung môi pha động .22 3.3 Định tính vị thuốc Uất kim cốm phương thuốc Đởm đạo thạch 24 3.3.1 Khảo sát phương pháp chiết .24 3.3.2 Khảo sát hệ dung môi pha động .25 3.4 Định tính vị thuốc Mộc hương cốm phương thuốc Đởm đạo thạch 27 3.4.1 Khảo sát phương pháp chiết .27 3.4.2 Khảo sát hệ dung môi pha động 28 3.5 Định tính vị thuốc Chỉ thực cốm phương thuốc Đởm đạo thạch 30 3.5.1 Khảo sát phương pháp chiết .30 3.5.2 Khảo sát hệ dung môi pha động .31 3.6 Định tính vị thuốc Đại hồng cốm phương thuốc Đởm đạo thạch .33 3.6.1 Khảo sát phương pháp chiết .33 3.6.2 Khảo sát hệ dung môi pha động 34 CHƯƠNG BÀN LUẬN 36 4.1 Về khảo sát phương pháp chuẩn bị mẫu điều kiện sắc ký 36 4.2 Về kết thực nghiệm định tính vị thuốc cốm phương thuốc Đởm đạo thạch sắc ký lớp mỏng 38 KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 40 Kết luận 40 Kiến nghị .40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT High-performance liquid chromatography Khối lượng C Cốm vị thuốc HPLC C-CT Cốm vị thuốc Chỉ thực KL C-DH Cốm vị thuốc Đại hoàng KTT C-KTT Cốm vị thuốc Kim tiền thảo LDL C-MH Cốm vị thuốc Mộc hương LH Kim tiền thảo Low density lipoprotein cholesterol Lysimachia christinae C-NT Cốm vị thuốc Nhân trần MH Mộc hương CT Chỉ thực NT Nhân trần C-UK Cốm vị thuốc Uất kim P Cốm placebo DDBT Đởm đạo thạch P-CT Cốm placebo Chỉ thực DĐTQ Dược điển Trung Quốc P-DH Cốm placebo Đại hoàng DĐVN Dược điển Việt Nam P-KTT Cốm placebo Kim tiền thảo DH Đại hoàng PL Phụ lục DL Dược liệu chuẩn P-MH Cốm placebo Mộc hương DL-CT Dược liệu chuẩn Chỉ thực P-NT Cốm placebo Nhân trần DL-DH Dược liệu chuẩn Đại hoàng PT Cốm phương thuốc DL-KTT Dược liệu chuẩn Kim tiền thảo P-UK Cốm placebo Uất kim DL-MH Dược liệu chuẩn Mộc hương SKĐ Sắc ký đồ DL-NT Dược liệu chuẩn Nhân trần SKLM Sắc ký lớp mỏng DL-UK Dược liệu chuẩn Uất kim TLC Thin layer chromatography GC Gas Chromatography High density lipoprotein cholesterol Helicobacter pylori TT Thuốc thử UK Uất kim HDL HP DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Công thức bào chế gói cốm phương thuốc Đởm đạo thạch .15 Bảng 2.2 Công thức bào chế cốm placebo vị dược liệu (đơn vị: g) 16 Bảng 3.1 Kết SKLM định tính vị dược liệu Kim tiền thảo cốm phương thuốc Đởm đạo thạch soi UV bước sóng 366 nm 20 Bảng 3.2 Kết SKLM định tính vị dược liệu Nhân trần cốm phương thuốc Đởm đạo thạch sau màu TT vanillin 23 Bảng 3.3 Kết SKLM định tính vị dược liệu Uất kim cốm phương thuốc Đởm đạo thạch sau màu TT vanillin 26 Bảng 3.4 Kết SKLM định tính vị dược liệu Mộc hương cốm phương thuốc Đởm đạo thạch sau màu TT vanillin 29 Bảng 3.5 Kết SKLM định tính vị dược liệu Chỉ thực cốm phương thuốc Đởm đạo thạch sau màu TT vanillin 32 Bảng 3.6 Kết SKLM định tính vị dược liệu Đại hồng cốm phương thuốc Đởm đạo thạch soi UV bước sóng 366 nm 35 Bảng 4.1 Kết khảo sát dấu vân tay hóa học cốm phương thuốc Đởm đạo thạch .39 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1 Sắc ký đồ khảo sát phương pháp chiết Kim tiền thảo 19 Hình 3.2 Sắc ký đồ định tính Kim tiền thảo soi UV bước sóng 366 nm 20 Hình 3.3 Sắc ký đồ khảo sát phương pháp chiết Nhân trần 22 Hình 3.4 Sắc ký đồ định tính Nhân trần sau màu với TT vanillin 23 Hình 3.5 Sắc ký đồ khảo sát phương pháp chiết Uất kim 25 Hình 3.6 Sắc ký đồ định tính Uất kim sau màu với TT vanillin 26 Hình 3.7 Sắc ký đồ khảo sát phương pháp chiết Mộc hương .28 Hình 3.8 Sắc ký đồ định tính Mộc hương sau màu với TT vanillin .29 Hình 3.9 Sắc ký đồ khảo sát phương pháp chiết Chỉ thực 31 Hình 3.10 Sắc ký đồ định tính Chỉ thực sau màu với TT vanillin 32 Hình 3.11 Sắc ký đồ khảo sát phương pháp chiết Đại hồng .34 Hình 3.12 Sắc ký đồ định tính Đại hồng soi UV bước sóng 366 nm 35 ĐẶT VẤN ĐỀ Sỏi mật bệnh phổ biến nước ta, nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm khuẩn gan mật, nguyên nhân hay gặp cấp cứu nội khoa ngoại khoa [1] Sỏi mật không điều trị kịp thời dẫn đến nhiều biến chứng nghiêm trọng: đau bụng dội, viêm đường mật, thủng túi mật, xuất huyết đường mật, áp xe gan, viêm tụy cấp, dẫn đến tử vong … [1], [30] Dựa phát triển y học đại, bệnh sỏi mật ngày có nhiều lựa chọn điều trị khác nhau, từ phẫu thuật, nội soi cắt bỏ túi mật đến điều trị không phẫu thuật dạng thuốc, liệu pháp tán sỏi laser, siêu âm [1] Các phương pháp đại có hiệu cao chưa giải triệt để tình trạng sỏi, tỷ lệ tái phát cao, đồng thời việc phẫu thuật gây nhiều nguy biến chứng cho bệnh nhân [5], [13] Vì lý trên, nhiều loại thảo dược hay phương thuốc cổ truyền đưa vào nghiên cứu để điều trị bệnh sỏi mật với hy vọng chúng an tồn, thải sỏi mật hiệu ngăn ngừa tái phát tình trạng [17], [30] Phương thuốc Đởm đạo thạch với thành phần Kim tiền thảo, Nhân trần, Uất kim, Chỉ thực, Mộc hương, Đại hồng có cơng nhiệt lợi thấp, hành khí thống, lợi mật phá sỏi, chủ trị chứng sỏi mật [8] Tác dụng điều trị sỏi mật cao lỏng phương thuốc nghiên cứu cho thấy có tác dụng làm mịn sỏi mật rõ rệt [7] Với mong muốn phát huy tính ưu việt phương thuốc tính tiện lợi sử dụng cho người bệnh, việc nghiên cứu bào chế tiêu chuẩn hóa phương thuốc cổ truyền với dạng bào chế đại vô cần thiết, cốm thuốc dạng bào chế dễ sử dụng, hòa tan tốt, hấp thu nhanh sử dụng đối tượng bệnh nhân gặp vấn đề nuốt Hiện nay, cốm phương thuốc Đởm đạo thạch bào chế từ cốm vị thuốc phương thuốc Tuy vậy, chưa có nghiên cứu tiêu chuẩn hóa dạng bào chế nên việc xác định có mặt dược liệu phương thuốc cần thiết Từ lý trên, đề tài “Khảo sát dấu vân tay hóa học cốm phương thuốc Đởm đạo thạch sắc ký lớp mỏng” thực với mục tiêu: Định tính khảo sát tính đặc hiệu vị thuốc cốm phương thuốc Đởm đạo thạch sắc ký lớp mỏng CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan phương thuốc “Đởm đạo thạch” 1.1.1 Công thức Kim tiền thảo 30g Mộc hương 9g Nhân trần 15g Chỉ thực 9g Uất kim 15g Sinh đại hoàng 6-9g - Xuất xứ phương thuốc: “Trung tây y kết hợp trị liệu cấp phúc chứng” [8] 1.1.2 Công năng, chủ trị phương thuốc - Cách dùng: Ngày dùng thang sắc lấy nước chia làm lần uống ngày Có thể sắc đặc thành cao, làm thành viên hồn, lần dùng 3g, ngày dùng 2-3 lần Mỗi đợt điều trị tháng, nghỉ tuần, lại dùng tiếp đợt khác [7] - Công năng: Thanh nhiệt lợi thấp, hành khí thống, lợi mật phá sỏi [8] - Chủ trị: Chứng sỏi mật [8] - Giải thích phương thuốc: Phương thuốc dùng nhiều Kim tiền thảo để lợi thấp nhiệt, lợi gan mật mà phá sỏi, làm qn dược; làm thần có Nhân trần tăng cường công hiệu lợi thấp nhiệt, lợi mật, làm cho thấp nhiệt bị khử theo nước tiểu Bệnh sỏi mật liên quan đến thiếu dương dương minh vừa dùng Uất kim hoạt huyết hành khí, giải uất, lợi mật, giảm đau, thối hồng; vừa lấy Đại hồng, Chỉ thực, Mộc hương thơng trệ tiêu tích, rửa tràng vị, khiến thấp nhiệt thoát theo phân, cộng làm tá sứ Toàn nhiệt lợi thấp, hành khí thống, lợi mật phá sỏi [8] - Bàn luận: Điểm cốt yếu biện chứng thuốc đau sườn sốt ớn rét, sắc mật nhuộm vàng, đại tiện trắng xám Hay dùng điều trị sỏi mật, sỏi đường dẫn mật gan, sỏi hệ tiết niệu, viêm gan hồng đản cấp tính Nếu đại tiện lỏng lỗng khử bỏ Đại hồng, gia thêm Phục linh, đau kịch liệt gia thêm Sao xuyên luyện tử, Diên hồ sách [8] - Tác dụng dược lý: Phương thuốc nới lỏng co thắt đường dẫn mật chó, tăng cường tiết dịch mật, đồng thời có tác dụng ức chế Staphylococus aureus, trực khuẩn thương hàn, phó thương hàn A, B, C biến hình sinh [8] Các tác giả Nguyễn Thị Dung, Nguyễn Văn Tường Đỗ Trung Đàm (Viện Dược liệu), nghiên cứu tác dụng làm mòn sỏi mật in vitro thuốc “Đởm đạo thạch thang” cách sử dụng viên sỏi mật chia làm hai lô cho Dung dịch đối chiếu: Curcumin chất chuẩn Pha tĩnh: Silicagel 60 F254 (Merck) Pha động: Chloroform : ethanol : acid acetic (95 : : 1) Hiện vết: quan sát đèn UV 365 nm phun thuốc thử vanillin - Cách 2: Dịch chấm sắc ký: Dược liệu nguyên liệu dược liệu chuẩn chiết cất kéo nước để thu tinh dầu Hòa tinh dầu với n-hexan theo tỷ lệ 1:5 Pha tĩnh: Silicagel 60 F254 (Merck) Pha động: Toluene – ethyl acetat (93 : 7) Hiện vết: Thuốc thử vanillin Yêu cầu: Các vết sắc ký đồ dung dịch thử phải tương ứng màu sắc vị trí với dung dịch đối chiếu PL3.4 Mộc hương Định tính sắc ký lớp mỏng, so sánh với dược liệu Mộc Hương chuẩn [4] Dung môi khai triển: Toluen – ethyl acetat (95 : 5) Dung dịch thử: Lấy g bột dược liệu, thêm 10 ml ethanol, đun hồi lưu cách thủy 10 phút, lọc Lấy dịch lọc làm dung dịch thử Dung dịch đối chiếu: Lấy g bột Mộc hương (mẫu chuẩn), chiết mơt tả phần dung dịch thử Thể tích chấm: 10 µl dung dịch Hiện vết: Phun hỗn hợp gồm 0,5 ml anisaldehyd trộn với 10 ml acid acetic khan, 85 ml methanol ml acid sulfuric Sấy mỏng 80 °C đến xuất vết, quan sát ánh sáng thường Yêu cầu: Trên sắc ký đồ dung dịch thử phải có vết màu vị trí với vết sắc ký đồ dung dịch đối chiếu PL3.5 Chỉ thực Định tính sắc ký lớp mỏng, so sánh với chất chuẩn synephrine [4] Dung môi khai triển: Ethyl acetat – methanol – amoniac (9: 1: 0,1) Dung dịch thử: Lấy g bột dược liệu, làm ẩm vừa dù amoniac, thêm 30 ml ethyl acetat, đun hồi lưu cách thủy 15 phút Lọc, lắc dịch lọc ethyl acetat với dung dịch acid hydrocloric 1% lần, lần 10 ml Gộp dịch acid, kiềm hóa amoniac đến pH 10, lắc với ethyl acetat lần, lần 20 ml Gộp dịch chiết ethyl acetat, đến cắn hịa cắn ml methanol dung dịch thử Dung dịch đối chiếu: Dung dịch synephrine chuẩn 0,3% methanol Thể tích chấm: 10µl dung dịch Hiện vết: Thuốc thử ninhydrin 0.5% ethanol Quan sát ánh sáng thường Yêu cầu: Trên sắc ký đồ dung dịch thử phải có vết có màu sắc (đỏ tía) giá trị Rf với vết synephrine dung dịch đối chiếu PL3.6 Đại hồng Định tính sắc ký lớp mỏng, so sánh với chất chuẩn emodin bột đại hồng mẫu chuẩn [4] Dung mơi khai triển: Toluen – ethylacetat – methanol – acid formic – nước (30 : 10 : : 0,5 : 5) (lắc kỹ, để tách lớp, lấy lớp trên) Dung dịch thử: Lấy 1,0g bột dược liệu, thêm 50 ml methanol, đun hồi lưu cách thủy giờ, lọc, cô cạn Thêm vào cắn 20 ml dung dịch acid HCl 10% 20 ml chloroform, đun hồi lưu cách thủy giờ, để nguội Chuyển dịch thu vào bình gạn, gạn lấy lớp chloroform Lớp nước lại lắc với chloroform thêm lần nữa, lần 20 ml Gộp dịch chiết chloroform trên, cách thủy đến cạn Hịa cắn thu ml ethanol dung dịch chấm sắc ký Dung dịch đối chiếu: Dung dịch emodin chuẩn 0,3 mg/ml ethanol, khơng có emodin chuẩn, lấy 1,0 g bột Đại hồng (mẫu chuẩn), chiết mơ tả phần dung dịch thử Thể tích chấm: µl dung dịch chất đối chiếu, 10 µl dung dịch thử 10 µl dung dịch dược liệu đối chiếu Hiện vết: Quan sát mỏng ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm Yêu cầu: Trên sắc ký đồ dung dịch thử phải có vết huỳnh quang màu vàng, có giá trị Rf với vết emodin; vết màu sắc giá trị Rf với vết sắc ký đồ dung dịch dược liệu đối chiếu Các vết huỳnh quang vàng chuyển thành màu hồng hơ amoniac PHỤ LỤC 4: HÌNH ẢNH DƯỢC LIỆU CHUẨN Kim tiền thảo Nhân trần Uất kim Mộc hương Chỉ thực Đại hoàng PHỤ LỤC PHIẾU KIỂM CỐM CÁC VỊ THUỐC PL5.1 Kiểm nghiệm cốm Kim tiền thảo PL5.2 Phiếu kiểm nghiệm cốm Nhân trần PL5.3 Phiếu kiểm nghiệm cốm Uất kim PL5.4 Phiếu kiểm nghiệm cốm Mộc hương PL5.5 Phiếu kiểm nghiệm cốm Chỉ thực PL5.6 Phiếu kiểm nghiệm cốm Đại hoàng PHỤ LỤC 6: PHIẾU KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU BÀO CHẾ CỐM PL6.1 Phiếu kiểm nghiệm dược liệu Kim tiền thảo PL6.2 Phiếu kiểm nghiệm dược liệu Nhân trần PL6.3 Phiếu kiểm nghiệm dược liệu Uất kim PL6.4 Phiếu kiểm nghiệm dược liệu Mộc hương PL6.5 Phiếu kiểm nghiệm dược liệu Chỉ thực PL6.6 Phiếu kiểm nghiệm dược liệu Đại hoàng ... ? ?Khảo sát dấu vân tay hóa học cốm phương thuốc Đởm đạo thạch sắc ký lớp mỏng? ?? thực với mục tiêu: Định tính khảo sát tính đặc hiệu vị thuốc cốm phương thuốc Đởm đạo thạch sắc ký lớp mỏng CHƯƠNG... đề xuất tiêu khảo sát dấu vân tay hóa học vị thuốc cốm phương thuốc Đởm đạo thạch tóm tắt bảng 4.1 38 Bảng 4.1 Kết khảo sát dấu vân tay hóa học cốm phương thuốc Đởm đạo thạch Vị thuốc Kim tiền... định dấu vân tay cốm phương thuốc Đởm đạo thạch sắc ký lớp mỏng Đề tài xin đưa kiến nghị: - Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện phương pháp xác định dấu vân tay hóa học cốm phương thuốc Đởm đạo thạch