Nghiên cứu này đề cập đến việc đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch của các dạng thành phẩm vắcxin dại khác nhau. Các sản phẩm này đều được đánh giá so sánh về đáp ứng miễn dịch với các nhóm chứng tiêm nước muối sinh lý và tiêm với một vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero đã được thương mại hóa cho hiệu quả phòng bệnh tốt trên người (Verorab của Sanofi-Pasteur, Pháp).
2020 JOURNAL OF COMMUNITY MEDICINE ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TỒN VÀ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA VẮC XIN DẠI TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM Đỗ Tuấn Đạt1, Nguyễn Văn Khải2, Nguyễn Văn Chuyên3 Tóm tắt: Vắc xin dại sống giảm độc lực tứ giá nuôi cấy tế bào Vero nhóm nghiên cứu sản xuất quy mơ phịng thí nghiệm đánh giá tính an tồn tính sinh miễn dịch động vật thí nghiệm Kết cho thấy, vắc xin đạt u cầu tính an tồn, cho đáp ứng miễn dịch tốt có hiệu bảo vệ thử nghiệm mơ hình động vật khác Các loạt vắc xin nghiên cứu đạt yêu cầu tính an tồn chung chất gây sốt kiểm tra chuột thỏ Vắcxin dại nuôi cấy tế bào Vero dạng đông khô hấp phụ với nhôm phosphate đạt yêu cầu tính an tồn kiểm tra động vật thực nghiệm Kháng thể tăng cao vào ngày thứ 21 sau giảm thấp vào ngày thứ 28 Kháng thể tiếp tục tăng cao ngày thứ 56 sau tiêm liều vắcxin thứ ba Tỷ lệ có đáp ứng miễn dịch nhóm tiêm vắcxin tương đương nhau, nhiên, nhóm tiêm vắcxin Verorab có hiệu giá kháng thể cao so với nhóm tiêm vắcxin VERAPVAX VERALVAX Kết đánh giá tiền lâm sàng vắc xin dại mơ hình động vật khác có tính tham khảo tốt trước đưa định để thử nghiệm lâm sàng vắc xin người sau Từ khóa: Tính an tồn, đáp ứng miễn dịch, vắc xin dại Summary ASSESSMENT OF SAFETY AND IMMUNE RESPONSE OF RABIES VACCINES TO EXPERIMENTAL ANIMALS The live attenuated rabies vaccine on Vero cell cultures produced by the research team at a laboratory scale has been evaluated for safety and immunogenicity in laboratory animals The results showed that this vaccine all met the requirements for safety, good immune response and protective effect when tested on different animal models The studied series of vaccines have met the requirements for the general safety and fevercausing substances when tested on rats and rabbits The rabies vaccine on Vero cell culture in both lyophilized and adsorbed forms with aluminum phosphate met the safety requirements in testing on experimental animals Antibodies are highest on day 21 and then low on day 28 Antibodies continue to rise until day 56 after a third dose of vaccine is given The rate of immunological response between the vaccination groups was similar, however, the Verorab vaccination group had higher antibody titres compared with the vaccinated groups VERAPVAX and VERALVAX The results of a pre-clinical assessment of dengue vaccine on different animal models will be very good for reference before making decisions for future human vaccine clinical trials Keywords: Safety, immune response, rabies vaccine I Đặt vấn đề Bệnh dại lưu hành lây lan Việt Nam nhiều năm nay, số người tiêm VX phòng dại lên đến gần nửa triệu người với tỷ lệ tiêm phòng xấp xỉ 500/100.000 dân, cao giới tốn phí 300 tỷ đồng tiền VX hàng năm [1] Các thử nghiệm an toàn vắcxin dại thiết kế nhằm phát chất hay đặc tính có hại cho đối tượng tiêm việc lây nhiễm tác nhân ngoại lai, virút chưa bất hoạt độc tính Yêu cầu thử nghiệm trình bày khuyến cáo TCYTTG cho vắcxin dại nuôi cấy tế bào [2] Từng quốc gia hay khu vực có yêu cầu đặc trưng riêng nhiên dựa yêu cầu chung TCYTTG đề Các thử nghiệm kiểm tra chất Công ty Vắc xin Sinh phẩm số (VABIOTECH) Đại học Y dược Hải Phịng Học viện Qn y Chịu trách nhiệm chính: Nguyễn Văn Chuyên; Email: nguyenvanchuyenk40@gmail.com Ngày nhận bài: 23/09/2020 106 Tập 60 - Số 7-2020 Website: yhoccongdong.vn Ngày phản biện: 30/09/2020 Ngày duyệt đăng: 08/10/2020 EC N KH G NG VI N S C NGHIÊN CỨU KHOA HỌC lượng tế bào tiến hành loạt sản xuất chủng giống loạt sản xuất vắcxin Đối với vắcxin dại phát triển với mục đính sử dụng cho người việc đánh giá đáp ứng miễn dịch tiền lâm sàng cần thiết Khi tiến hành thử nghiệm này, cần có so sánh hiệu đáp ứng miễn dịch vắcxin với vắcxin biết rõ công hiệu có hiệu phịng bệnh tốt người Nghiên cứu đề cập đến việc đánh giá tính an toàn đáp ứng miễn dịch dạng thành phẩm vắcxin dại khác Các sản phẩm đánh giá so sánh đáp ứng miễn dịch với nhóm chứng tiêm nước muối sinh lý tiêm với vắcxin dại nuôi cấy tế bào Vero thương mại hóa cho hiệu phịng bệnh tốt người (Verorab Sanofi-Pasteur, Pháp) Số liệu báo phần kết nghiên cứu đề tài cấp Nhà nước: Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học bệnh dại dịch tễ học phân tử vi rút dại - đề xuất chủng vi rút dại để sản xuất vắc xin, Mã số: KC.10.41/16-20 ii Phương pháp nghiên cứu 2.1 Phương pháp kiểm tra tính an toàn đặc hiệu vắc xin a Nguyên vật liệu trang thiết bị * Dụng cụ: Ống ly tâm 15 ml, bơm tiêm nhựa 1ml, hộp đựng đá * Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng: Giống chuột Swiss, Giới: chuột đực cái, trọng lượng: 12-14 g, số lượng: 10 / loạt mẫu thử b Các bước tiến hành * Chuẩn bị chuột - Chuột trước tiêm phải theo dõi cách ly ngày Trong thời gian cách ly hàng ngày theo dõi tình trạng sức khỏe ghi vào sổ theo dõi Chọn chuột trọng lượng 12-14g: 10 con/1 loạt mẫu thử Đánh dấu chuột, dãn nhãn lên lồng chuột với các chi tiết: Loạt vắc-xin, dấu chuột ngày tiêm * Tiêm chuột - Sát trùng vị trí tiêm Dùng bơm tiêm 1ml lấy vắcxin hộn Với liều tiêm: 0,03ml/1 chuột Đường tiêm: Não * Theo dõi chuột - Thời gian theo dõi động vật thí nghiệm 14 ngày Hàng ngày theo dõi tình trạng sức khỏe cân trọng lượng nhóm chuột vào ngày cuối c Kết Tính kết - Tính % trọng lượng tăng từng nhóm chuột: % tăng trọng = ( P14 / PO ) x 100% Trong đó: P14: trọng lượng 10 chuột ngày thứ 14 PO: trọng lượng 10 chuột ngày tiêm d Tiêu chuẩn chấp thuận: Không có chuột chết suốt thời gian theo dõi 100% chuột sống khỏe mạnh, không liệt, không có dấu hiệu bệnh lý tăng cân 2.2 Phương pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch vắcxin chuột Thử nghiệm để đánh giá hiệu đáp ứng miễn dịch vắcxin dại chuột thử nghiệm ức chế điểm huỳnh quang nhanh (RFFIT) phát kháng thể trung hòa virút dại mẫu huyết a Nguyên vật liệu trang thiết bị Dụng cụ: Tuýp pha loãng mẫu 1,5 ml, phiến Teflon giếng, kính đậy phiến, hộp lồng 15 cm để ủ phiến, Phiến 96 giếng để pha lỗng, đầu cơn: 20-1000 ml, giấy thấm, Pipet loại, cóng rửa phiến, hộp đựng đá Hóa chất: Chai ni cấy tế bào MNA, MEM 10% FBS, dung dịch Trysin, dung dịch PBS, dung dịch đệm phủ phiến, dung dịch cộng hợp thỏ kháng nucleocapsit virút dại gắn huỳnh quang, aceton lạnh, nước pha tiêm Mẫu thử: Chủng virút dại thử thách CVS -11, huyết kháng dại chuẩn (2 IU/ml), huyết mẫu thử: ml Trang thiết bị: Tủ ấm 370C, máy trộn, nồi cách thủy, kính hiển vi soi tế bào, kính hiển vi huỳnh quang, hốt vô trùng b Tiến hành - Bất hoạt mẫu huyết thử: Mẫu huyết thử bất hoạt nhiệt độ 560C 30 phút - Chuẩn bị phiến mẫu huyết chứng: Chuẩn bị phiến 96 giếng, mẫu huyết chứng pha loãng hàng dãy dọc phiến - Các mẫu huyết pha loãng theo độ pha từ 1/5 đến 1/625 - Chuyển mẫu huyết pha loãng vào giếng phiến thử Mỗi phiến nhỏ độ pha loãng 1/25; 1/125; 1/625 - Chuẩn bị phiến mẫu huyết thử: Pha loãng nhỏ mẫu vào phiến mẫu huyết chứng * Pha loãng chuẩn bị phiến virút chứng - Chủng virút thử thách CVS-11 pha loãng MEM 10% FBS để đạt nồng độ 50FFD50/0,1 ml - Tiếp tục pha loãng 10 lần mẫu virút chứng thêm độ pha loãng 1/10 1/100 để đạt nồng độ 5FFD50/0,1 ml 0,5FFD50/0,1 ml Tập 60 - Số 7-2020 Website: yhoccongdong.vn 107 2020 JOURNAL OF COMMUNITY MEDICINE - Chuyển mẫu virút chứng pha loãng vào giếng phiến chứng virút * Trung hòa huyết với virút thử thách - Nhỏ mẫu virút có nồng độ 50FFD50 vào tất giếng phiến mẫu huyết thử huyết chứng - Ủ tất phiến nhiệt độ 370C 90 phút * Chuẩn bị ủ tế bào MNA với mẫu thử - Tách chai tế bào MNA nuôi cấy ngày môi trường MEM 10% FBS trypsin để tạo thành hỗn dịch tế bào - Đếm số lượng tế bào có hỗn dịch Pha lỗng hỗn dịch tế bào để đạt nồng độ theo yêu cầu - Cho hỗn dịch tế bào vào giếng tất phiến mẫu có virút thử thách phiến khơng có virút chứng tế bào - Ủ tất phiến nhiệt độ 370C 20 Thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang phát nucleocapsit virút dại thử thách * Cố định virút - Đổ có giếng phiến - Nhúng phiến cóng đựng dung dịch PBS sau nhúng tiếp vào cóng đựng acetone lạnh - Vớt phiến để khô tự nhiên * Nhuộm phiến - Nhỏ dung dịch cộng hợp thỏ kháng nucleocapsit virút dại gắn huỳnh quang vào giếng phiến - Ủ tất phiến hộp lồng có giấy thấm làm ẩm nhiệt độ 370C 30 phút * Rửa phiến - Đổ có giếng phiến - Rửa phiến dung dịch PBS - Để khô phiến * Phủ phiến - Nhỏ dung dịch đệm phủ phiến vào giếng - Đậy phiến kính * Đọc phiến - Soi phiến kính hiển vi huỳnh quang vật kính 20x ghi kết vào phiếu ghi sơ đồ phiến Mỗi giếng phiến soi vi trường cho hết tồn diện tích giếng Vi trường nhiễm vi trường soi thấy hình ảnh virút dại bắt màu xanh huỳnh quang tế bào Vero có màu đỏ c Kết - Tính kết quả: Tính số vi trường nhiễm tổng số vi trường soi giếng Kết tính theo phương pháp Reed – Muench - Cơng thức: Lg(1/FFD50) = Trong đó: A: Độ pha lỗng mẫu có mức độ nhiễm sát 50% a: % vi trường nhiễm sát 50% b: % vi trường nhiễm sát 50% k =1 (logarit hệ số pha loãng bậc 10) d Giá trị thử nghiệm tiêu chuẩn chấp thuận - Phiến mẫu chứng huyết thanh, chứng virút chứng tế bào phải đạt yêu cầu thử nghiệm Hiệu giá kháng thể trung hòa virút dại huyết từ 0,5 IU/ml trở lên coi dương tính III Kết nghiên cứu bàn luận 3.1 Tính an tồn vắcxin dại nuôi cấy tế bào động vật thực nghiệm Kết tính an tồn chung an tồn đặc hiệu vắcxin dại ni cấy tế bào Vero đánh giá vắcxin thành phẩm dạng đông khô (VERAPVAX) vắcxin thành phẩm dạng lỏng hấp phụ nhơm (VERALVAX) trình bày Bảng Bảng Kết kiểm tra chất gây sốt vắcxin dại nuôi cấy tế bào Vero dạng đông khô (VERAPVAX) Kết kiểm tra vắc xin thành phẩm sở Trong phần trình bày kết kiểm tra chất gây sốt vắcxin dại nuôi cấy tế bào Vero dạng lỏng hấp phụ nhôm (VERALVAX) (Bảng 3) Bảng Kết kiểm tra tính an tồn chung vắcxin dại ni cấy tế bào Vero Kết theo dõi sau ngày Chuột nhắt trắng VERAPVAX Chuột lang VERALVAX VERAPVAX VERALVAX Loạt 0209 Loạt 0309 Loạt 0210 Loạt 0209 Loạt 0309 Loạt 0210 Số chuột chết 0/5 0/5 0/5 0/2 0/2 0/2 Trung bình tăng trọng 125,23% 127,77% 116,03% 105,36% 108,14% 110,47% Kết luận 108 Đạt yêu cầu Đạt yêu cầu Tập 60 - Số 7-2020 Website: yhoccongdong.vn Đạt yêu cầu Đạt yêu cầu Đạt yêu cầu Đạt yêu cầu EC N KH G NG VI N S C NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Tất loạt thử nghiệm đánh giá có kết đạt u cầu tính an toàn chung Bảng Kết kiểm tra an toàn đặc hiệu vắcxin dại nuôi cấy tế bào Vero Kết theo dõi sau 14 ngày Số chuột chết, liệt có bệnh lý Trung bình tăng trọng Kết luận VERAPVAX VERALVAX Loạt 0209 Loạt 0309 Bán thành phẩm Loạt 0210 0/10 0/10 0/10 212,09% 224,53% 206,26% Đạt yêu cầu Đạt yêu cầu Đạt yêu cầu Kết nghiên cứu cho thấy loạt thử nghiệm đánh giá tính an tồn đặc hiệu đạt u cầu Bảng Kết kiểm tra chất gây sốt vắcxin dại nuôi cấy tế bào Vero dạng lỏng (VERALVAX) Sản phẩm Nhiệt độ tăng thỏ Thỏ Tiêu chuẩn Thỏ Thỏ