Mục tiêu của nghiên cứu này là kiểm tra tính an toàn của cao chiết khổ sâm trong điều kiện in vitro để làm cở sở ứng dụng trong ao nuôi. Thí nghiệm kiểm tra độc tính của cao chiết khổ sâm qua đường ăn được thực hiện với các nồng độ trộn vào thức ăn từ 0 đến 45% (450 g/kg thức ăn).
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II ĐỘ AN TOÀN CỦA CAO CHIẾT KHỔ SÂM (Croton tonkinensis) ĐỐI VỚI TÔM THẺ (Penaeus vannamei) Ở ĐIỀU KIỆN IN VITRO Trương Hồng Việt1*, Đỗ Thị Cẩm Hồng1, Trần Bùi Trúc Quân2, Vũ Thiên Ân1 TÓM TẮT Các loại thảo mộc thuốc hứa hẹn trở thành nguồn cung cấp liệu pháp chữa bệnh cho ni tơm cá sản phẩm cung cấp với giá rẻ để điều trị không gây độc Dịch chiết từ khổ sâm (Croton tonkinensis) cho có chứa lớp chất chủ yếu hợp chất hữu flavonoid, alkaloid, polyphenol Mục tiêu nghiên cứu kiểm tra tính an tồn cao chiết khổ sâm điều kiện in vitro để làm cở sở ứng dụng ao ni Thí nghiệm kiểm tra độc tính cao chiết khổ sâm qua đường ăn thực với nồng độ trộn vào thức ăn từ đến 45% (450 g/kg thức ăn) Đối với thí nghiệm ngâm cao chiết vào nước ni tôm thực với nồng độ từ đến 160 ppm Kết nghiên cứu cho thấy cao chiết khổ sâm gây độc yếu tôm nuôi qua đường ăn Ở nồng độ cao chiết 45%, tỷ lệ trung bình tơm bị chết sau 48 15% tỷ lệ trung bình tơm chết 21,67% sau 96 Đối với thí nghiệm ngâm cao chiết khổ sâm vào nước nuôi tôm cho thấy nồng độ 20 ppm, tôm sống 100% sau 96 tiếp xúc với cao chiết tỷ lệ tôm chết 100% sau 96 nồng độ 150 ppm Giá trị LC50 cao chiết cho trực tiếp vào nước nuôi tôm xác định thời điểm 48, 72 96 cao, với nồng độ 93,02; 81,25, 81,25 ppm Trong LC50 nồng cao chiết trộn vào thức ăn không xác định tỷ lệ gây chết tôm thí nghiệm < 50% Từ kết trên, chúng tơi kết luận cao chiết khổ sâm an tồn tôm thẻ chân trắng điều kiện in vitro Từ khố: Cao chiết, Croton tonkinensis, khổ sâm, LC50, tơm thẻ chân trắng I ĐẶT VẤN ĐỀ Trong năm qua, việc sử dụng kháng sinh hoá chất để phịng trị bệnh nhiễm khuẩn gây tình trạng bất lợi lĩnh vực nuôi trồng thủy sản Điều làm xuất nhiều chủng vi khuẩn có khả kháng kháng sinh Ngồi ra, dư lượng khơng làm hại mơi trường ni thuỷ sản mà cịn ảnh hưởng khơng tốt đến sức khoẻ người (Syahidah, 2014) Các loại thảo mộc thuốc hứa hẹn trở thành nguồn cung cấp liệu pháp chữa bệnh cho ni cá sản phẩm cung cấp với giá rẻ để điều trị xác mà khơng gây độc (Madhuri & ctv., 2012) Các chế phẩm thảo dược có vai trị quan trọng kiểm sốt dịch bệnh chúng có chứa thành phần hoạt tính bao gồm chất chống oxy hố, chống vi khuẩn, chống stress, kích thích tăng trưởng, kích thích thèm ăn tăng cường miễn dịch cá tôm (Citarasu & ctv., 2001) Theo Lee & Gao (2012), loại thảo dược hoạt động hương vị nên có khả ảnh hưởng đến thèm ăn vật ni tiết dịch tiêu hóa tăng lượng thức ăn ăn vào, đồng thời yếu tố góp phần làm giảm hệ số chuyển hố thức ăn (Venketramalingam & ctv., 2007) Theo Đỗ Tất Lợi (2004), rễ, thân khổ sâm (Croton tonkinensis) có chứa lớp chất chủ yếu hợp chất diterpenoid flavonoid, alcaloid, polyphenol Nó thuộc nhóm thuốc vị thuốc dùng làm thuốc bổ, thuốc bồi dưỡng, có tác dụng tốt với tiêu hóa bệnh đau dày Trong hầu hết trường hợp, hoạt chất polyphenol, polysaccharides, proteoglycans flavonoids đóng vai trị Trung tâm Quan trắc Môi trường Bệnh Thủy sản Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II Đại học Quốc tế, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh *Email: truonghongviet@yahoo.com TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019 35 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN II việc ngăn ngừa kiểm soát vi khuẩn lây nhiễm (Citarasu & ctv., 2003) Để làm sở cho an tồn cao chiết việc ứng dụng phịng bệnh tơm, chúng tơi thực thí nghiệm đánh giá độ an toàn cao chiết khổ sâm qua đường ăn qua đường nước nuôi để xác định liều gây chết 50% sau 96 thí nghiệm (APHA, 2005) ml cồn thực phẩm, lấy với lượng xác định trộn vào thức ăn, sau thêm nước vào với tỷ lệ nước thức ăn 1:1 Bột thức ăn sau trộn đưa vào máy quay để tạo thành hạt, quạt gió cho khơ nhiệt độ phòng vòng 24 Thức ăn tách thành hạt riêng lẻ bảo nơi thoáng mát đến làm thí nghiệm II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.2.2 Xác định tính an tồn cao chiết khổ sâm trộn vào thức ăn tôm 2.1 Vật liệu + Cao chiết thô khổ sâm cung cấp Viện hoá học hợp chất thiên nhiên Dịch thô tách chiết cồn tuyệt đối, cô đặc bảo quản nhiệt độ phòng + Tôm thẻ chân trắng ương nuôi từ tôm ấu trùng đến đạt trọng lượng từ 2-3 gram, có nguồn gốc từ Trung tâm Giống Hải sản Nam Bộ thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản II Tôm thu mẫu kiểm tra mầm bệnh bao gồm WSSV (White Spot Syndrome Virus), TSV (Taura Syndrome Virus), IHHNV (Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus), YHV (Yellow Head Virus) bệnh hoại tử gan tuỵ cấp AHPND (Acute Hepatopancreatic necrosis disease) phương pháp PCR Ngoài ra, bệnh hoại tử gan tuỵ cấp kiểm tra phương pháp mô học + Nước biển khử trùng chlorine với liều 30 ppm, sục khí mạnh liên tục tuần (để trung hoà chlorine) trước dùng + Các thông số chất lượng nước nhiệt độ (28-29°C), độ mặn (20‰), oxi hồ tan (sục khí mạnh liên tục, DO > mg/l) pH (7,5-8,5) trì suốt thời gian thí nghiệm + Tơm trước làm thí nghiệm ni ngày phịng thí nghiệm thuộc Trung tâm Quan trắc Môi trường Bệnh Thủy sản Nam Bộ 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Trộn cao chiết thô vào thức ăn Thức ăn tôm nghiền thành bột mịn Cao chiết pha thành dung dịch gốc 0,5 g/ 36 2.2.2.1 Thí nghiệm thăm dị để xác định khoảng gây độc cao chiết khổ sâm trộn vào thức ăn Thí nghiệm thực với nồng độ cao chiết khổ sâm 0, 2, 4, 8, 16 20% lượng thức ăn tôm Mỗi nghiệm thức lặp lại lần bể nhựa 90 lít có chứa 30 lít nước biển, bể thí nghiệm có 20 tôm cỡ 3-4 g/tôm Tôm cho ăn lần/ngày với tỷ lệ 3% trọng lượng thân, bể sục khí liên tục, khơng thay nước suốt thời gian thí nghiệm, tơm chết vớt để không ảnh hưởng xấu đến chất lượng nước suốt thời gian thí nghiệm Ghi nhận số tôm chết hàng ngày theo dõi 96 để xác định khoảng gây độc (nồng độ cao mà tôm sống 100% nồng độ thấp gây chết tơm 100%) 2.2.2.2 Thí nghiệm xác định nồng độ gây chết 50% (LC50) cao chiết khổ sâm trộn vào thức ăn Thí nghiệm thực dựa theo phương pháp APHA (2005) Thí nghiệm bố trí nồng độ cao chiết khổ sâm nằm khoảng gây độc xác định từ thí nghiệm thăm dị Nghiệm thức đối chứng, tôm cho ăn thức ăn trộn 0% cao chiết Phương pháp thực giống thí nghiệm thăm dị mục 2.2.2.1 Ghi nhận số tôm chết hàng ngày theo dõi suốt 96 để xác định nồng độ gây chết 50% (LC50) chương trình máy tính (Stephan & Rodgers, 1985) theo hướng dẫn ASTM (American Society for Testing and Materials, Philadelphia) (1993) TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II 2.2.3 Xác định tính an tồn cao chiết khổ sâm ngâm vào nước nuôi tôm 2.2.3.1 Thí nghiệm thăm dị để xác định khoảng gây độc cao chiết khổ sâm ngâm vào nước nuôi tôm Thí nghiệm thực với nồng độ cao chiết khổ sâm 0, 20, 40, 80, 160 180 ppm cho trực tiếp vào bể thí nghiệm Mỗi nghiệm thức lặp lại lần bể nhựa 90 lít có chứa 30 lít nước biển, bể thí nghiệm có 20 tơm Tơm cho ăn với thức ăn thương mại lần/ngày với tỷ lệ 3% trọng lượng thân Các bể sục khí liên tục, khơng thay nước suốt thời gian thí nghiệm, tôm chết vớt để không ảnh hưởng xấu đến chất lượng nước suốt thời gian thí nghiệm Ghi nhận số tơm chết hàng ngày theo dõi suốt 96 để xác định khoảng gây độc (nồng độ cao mà tôm sống 100% nồng độ thấp gây chết tôm 100%) 2.2.3.2 Thí nghiệm xác định nồng độ gây chết 50% (LC50) cao chiết khổ sâm ngâm vào nước nuôi tôm Thí nghiệm thực dựa theo phương pháp APHA (2005) Thí nghiệm bố trí nồng độ cao chiết khổ sâm nằm khoảng gây độc xác định từ thí nghiệm thăm dị Nghiệm thức đối chứng không ngâm cao chiết Phương pháp thực giống thí nghiệm thăm dị mục 2.2.3.1 Ghi nhận số tôm chết hàng ngày theo dõi suốt 96 để xác định nồng độ gây chết 50% (LC50) 2.2.4 Phương pháp mơ học Quy trình xử lý mô học thực dựa theo phương pháp mô tả Bell & Lightner (1998) Tôm lờ đờ chết (tôm nằm nghiêng bên) tôm sống sau kết thúc thí nghiệm cố định vào dung dịch Davidson (330 ml ethanol 95%, 220 ml formalin 100%, 115 ml axít acetic đậm đặc, 335 ml nước cất) suốt 24 giờ, sau chuyển qua dung dịch ethanol 70% để bảo quản lâu Mô gan tuỵ tôm khử nước, đúc vào khối parafin, cắt thành lát mỏng μm, nhuộm với hai thuốc nhuộm hematoxylin eosin Kết quan sát cấu trúc mô bệnh học kiểm tra cách quan kính hiển vi III KẾT QUẢ 3.1 Kết thử nghiệm độc tính cao chiết khổ sâm qua đường ăn 3.1.1 Thí nghiệm thăm dò để xác định khoảng nồng độ gây độc cao chiết Tỷ lệ chết trung bình tơm thí nghiệm thời điểm 24, 48, 72, 96 cho tôm ăn với nồng độ cao chiết khổ sâm trộn vào thức ăn bao gồm 0, 2, 4, 8, 16, 20%, trình bày Bảng Khơng có tơm chết nghiệm thức đối chứng (0%), nghiệm thức 2% nghiệm thức 4% suốt 96 thí nghiệm Ở nồng độ 8%, tỷ lệ tơm chết trung bình từ 5±5% đến 8,33±5,77% sau 24 đến 96 Tỷ lệ trung bình tôm bị chết giống 72 96 nồng độ cao chiết 8, 16 20% 8,33±5,77%; 13,33±2,89% 16,67±2,89%; tỷ lệ khơng có khác biệt ý nghĩa thống kê (P > 0,05) (Bảng 1) Bảng 1: Tỷ lệ chết (trung bình ± sai số chuẩn) tơm thí nghiệm thăm dị sau tơm cho ăn cao chiết khổ sâm với nồng độ khác Tỷ lệ (%) trung bình tơm chết theo thời gian thí nghiệm Nồng độ cao chiết 24 48 72 96 0% 0±0 0±0 0±0 0±0 2% 0±0 0±0 0±0 0±0 4% 0±0 0±0 0±0 0±0 a 8,33a ± 5,77 8% 5±5 5±5 8,33 ± 5,77 13,33a ± 2,89 16 % 5±0 5±0 13,33a ± 2,89 16,67a ± 2,89 20 % 6,67 ± 2,89 16,67 ± 2,89 16,67a ± 2,89 * Các chữ thể khác biệt ý nghiã thống kê P < 0,05 theo cột (Tukey’ HSD) TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019 37 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II 3.1.2 Thí nghiệm xác định LC50 cao chiết trộn vào thức ăn ăn cao chiết, tôm chết sau 24 giờ, có tỷ lệ chết trung bình từ 1,67±2,89% đến 5±0% Tỷ lệ trung bình tơm bị chết sau 48 nồng độ cao chiết cao (45%) 15±5% Ở thời điểm 72 96 giờ, tỷ lệ trung bình tơm chết nồng độ cao thí nghiệm (45%) tương đương (21,67±2,89%) Kết phân tích thơng kê cho thấy tỷ lệ trung bình tơm chết khơng khác biệt ý nghĩa thống kê (P>0,05) nghiệm thức cho tôm ăn nồng độ cao chiết suốt 96 thí nghiệm Do kết tỷ lệ tôm chết