Nghiên cứu này để xác định khả năng kháng V. parahaemolyticus của dịch trích lá, vỏ và hạt cây trâm bầu trong điều kiện in vitro. Nghiên cứu cho thấy, dịch trích cây trâm bầu kháng V. parahaemolyticus mạnh với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình 13,19 mm.
An Giang University Journal of Science – 2018, Vol 19 (1), – KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN Vibrio parahaemolyticus CỦA DỊCH TRÍCH CÂY TRÂM BẦU (Combretum quadrangulare) TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO Nguyễn Công Tráng1, Ngô Thị Kim Cúc1, Phan Ngọc Thịnh1 Trường Đại học Tiền Giang Thông tin chung: Ngày nhận bài: 05/08/2017 Ngày nhận kết bình duyệt: 08/10/2017 Ngày chấp nhận đăng: 04/2018 Title: A study on the anti-bacterial activity of extracts from sakae naa tree (Combretum quadrangulare) in Vitro Keywords: Sakae naa tree, hepatopancreas, EMS, herbal medicine, Vibrio parahaemolyticus Từ khóa: Cây trâm bầu, EMS, thảo mộc, Vibrio parahaemolyticus ABSTRACT Vibrio parahaemolyticus is a dangerous bacteria that caused a lot of diseases in a aquaculture, particularly EMS symtomp on the shrimp Over the years, Sakae naa tree (Combretum quadrangulare) has been considered a precious herb because of its benefits to cure health humans and aquatic animals This study was conducted to explore anti-bacterial activities of extracts from the sakae naa tree on Vibrio parahaemolyticus, together with seeds, leaves and the skin of the tree in vitro condition The finding showed that extracts from Combretum quadrangulare were resistant significantly on Vibrio parahaemolyticus with 13.19 mm of average diameter, in which the resistance from seed extracts was stronger than those leaves and bark of the tree with 16.29 mm, 11.84 mm, and 11.44 mm of diameter, respectively Anti-bacterial activities of extracts from sakae naa tree were in different ratios due to the mixed level of purified water The experiment 1, 2, and was at 14.15 mm, 13,25 mm, 14.09 mm, and 12.28 mm diameter accordingly MIC of seed extracts from sakae naa tree (one per five mixed with purified water) on Vibrio parahaemolyticus was 7.5 µL/mL TĨM TẮT Vibrio parahaemolyticus gây nhiều bệnh nguy hiểm cho động vật thủy sản, đặc biệt hội chứng EMS tôm Cây trâm bầu (Combretum quadrangulare) từ lâu xem loại thảo dược quý chữa nhiều bệnh người động vật thủy sản Nghiên cứu để xác định khả kháng V parahaemolyticus dịch trích lá, vỏ hạt trâm bầu điều kiện in vitro Nghiên cứu cho thấy, dịch trích trâm bầu kháng V parahaemolyticus mạnh với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình 13,19 mm Trong đó, dịch trích hạt cho tính kháng mạnh dịch trích từ vỏ với đường kính vòng kháng khuẩn 16,29 mm, 11,84 mm 11,44 mm Tính kháng khuẩn dịch trích trâm bầu tỷ lệ phối trộn nước cất, giảm dần theo tăng dần nước cất, cụ thể, đường kính vòng kháng khuẩn NT1 14,15 mm, NT2 13,25 mm, NT3 14,09 mm NT4 12,28 mm MIC dịch trích hạt trâm bầu (tỷ lệ trích 1/5) Vibrio parahaemolyticus 7,5 µL/mL An Giang University Journal of Science – 2018, Vol 19 (1), – GIỚI THIỆU parahaemolyticus màng tang (Litae cubela) thử nghiệm nghiên cứu Nguyễn Hải Vân cs (2015) Riêng trâm bầu, đặc biệt phận hạt có chứa nhiều tinh dầu hợp chất flavonoid (Bùi Xuân Hào, 2013) Theo Adnyana et al (2000), hạt trâm bầu có chứa loại glucosides triterpene ursane - (1 4), oleanane - loại lupane có tác dụng diệt lồi vi khuẩn Alcaligenes faecalis, Bacillus cereus Staphylococcus typhimurium Bên cạnh đó, hạt trâm bầu diệt lồi ký sinh trùng gây bệnh lồi động vật thủy sản ni (Bùi Quang Tề, 2011) Tuy nhiên nghiên cứu tính kháng Vibrio parahaemolyticus gây bệnh động vật thủy sản trâm bầu chưa thực Khi diện tích ni trồng thủy sản ngày mở rộng dịch bệnh yếu tố gây khó khăn lớn cho nghề ni Các loài vi khuẩn gây bệnh động vật thủy sản đa dạng phức tạp với nhiều dạng khác Aeromonas sp., Edwardsiella sp., Vibrio sp., Streptococcus sp., Trong đó, lồi gây bệnh nguy hiểm cho động vật thủy sản phổ biến loài vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus Chúng có khả bùng phát lây lan nhanh chóng vấn đề kiểm sốt, tiêu diệt lồi vi khuẩn gặp nhiều khó khăn Do tác nhân gây hội chứng EMS tôm loài vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus bị nhiễm bacteriophage ngày trở nên phổ biến, dẫn đến nhu cầu sử dụng kháng sinh để điều trị bệnh loài vi khuẩn gây ngày tăng cao, không xử lý triệt để gây mùa thiệt hại nặng nề, nhu cầu sử dụng kháng sinh để điều trị bệnh loài vi khuẩn gây ngày tăng cao Tuy nhiên, việc lạm dụng, sử dụng loại hố chất, kháng sinh khơng quy cách, khơng liều lượng gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe động vật thủy sản, môi trường sinh thái, an toàn vệ sinh thực phẩm đặc biệt tạo chủng vi khuẩn kháng lại thuốc kháng sinh, làm giảm hiệu điều trị bệnh; đồng thời tăng nguy nhiễm lồi vi khuẩn có khả kháng thuốc cho người, động vật tồn dư thịt động vật thủy sản (Thành Công, 2016) Trong nghiên cứu này, dịch trích từ trâm bầu dùng để thử nghiệm, đánh giá khả kháng Vibrio parahaemolyticus, làm sở khoa học cho việc chế tạo sản phẩm thảo dược để phòng trị bệnh cho tôm nuôi PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Các phận (vỏ, lá, hạt) trâm bầu thu hái vào tháng 01/2017, xã Thân Cửu Nghĩa Long An, huyện Châu Thành, tỉnh Tiền Giang Lá trâm bầu thu hái xanh, già, không sâu bệnh, nấm mốc hay vàng úa Vỏ trâm bầu tách từ thân trâm bầu tươi khỏe, chọn vỏ già, không bị sâu đục thân Trái trâm bầu thu hái trái già, nguyên vẹn, sau thu hái, trái tách lấy hạt sử dụng hạt để nghiên cứu Hiện có nhiều loại thảo mộc nhọ nồi, sài đất, chó đẻ, sim, củ tỏi ứng dụng rộng rãi thực tiễn nuôi trồng thủy sản, giúp đảm bảo an toàn hiệu cao việc điều trị bệnh cho động vật thủy sản Đặng Thị Lụa cs (2015), Nguyễn Thị Hạnh cs (2015), thử nghiệm tác dụng kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) tôm nuôi nước lợ dịch chiết hạt sim, sim dịch chiết diệp hạ châu đắng Khả kháng Vibrio Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus mua Phòng Thí nghiệm Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh Ngun vật liệu khác bao gồm môi trường chọn lọc vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus Chrom agar (thành phần gồm agar, peptone, dịch trích nấm men, chromogenic mix) sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn; môi trường MHA (thành phần gồm beef extract, casein thủy phân An Giang University Journal of Science – 2018, Vol 19 (1), – acid, tinh bột, agar) dùng để khảo sát tính kháng khuẩn; mơi trường BHIB (thành phần gồm brain heart infusion, pancreatic digest of casein, dịch trích nấm men, peptone, muối NaCl, agar, dextrose) dùng để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Nghiên cứu sử dụng môi trường dựa theo tham khảo tài liệu Lưu Thị Thanh Trúc (2014) Một số dụng cụ, thiết bị gồm pipet, đèn cồn, giấy lọc, ống nghiệm, tủ cấy vô trùng, tủ ủ, tủ sấy, máy quang phổ, nồi hấp, đĩa petri, que cấy, que trang, dụng cụ đục lỗ đĩa thạch, thước kẻ có chia vạch, đầu tips, kính hiển vi, v.v Hóa chất gồm cồn 90o, nước muối sinh lý, nước cất, H2SO4, BaCl2.2H2O, đĩa giấy tẩm hóa chất thực phản ứng oxidase, hóa chất nhuộm gram H2O2 10% Khảo nghiệm thực theo phương pháp Schillinger Luke (1989), Sarkar et al (1996) Chúng ta chuẩn bị vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus có thời gian phát triển từ 18 24 Sử dụng phương pháp đục lỗ đĩa thạch MHA với 20 ml MHA/đĩa, đục lỗ mặt thạch MHA vị trí 12 giờ, giờ, giờ, vị trí trung tâm, lỗ có đường kính mm Chuẩn bị huyền phù vi khuẩn, so sánh với độ đục McFarland 0.5 (OD = 0,125; λ=550 nm), sau pha lỗng huyền phù 100 lần trước sử dụng Nhỏ mL dung dịch huyền phù vi khuẩn lên đĩa thạch MHA, chan đều, đổ bỏ huyền phù dư dùng que cấy trải chan huyền phù đến khô Nhỏ 0,15 mL dịch trích vào lỗ (chỉ nhỏ lỗ, lỗ lại nhỏ 0,15 mL nước muối sinh lý để làm đối chứng) Ủ đĩa tủ ủ 30 0C 24 giờ, sau ta tiến hành đo đường kính vòng vơ khuẩn thước đo có chia vạch (mm) 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Trích dịch trâm bầu Theo phương pháp Dodia cs (2008), phận trâm bầu sau thu hái tiến hành rửa sạch, sau sấy 60 0C 30 phút Phân loại xay nhuyễn thành bột thô Ngâm bột nguyên liệu nước cất vô trùng theo tỷ lệ khối lượng nguyên liệu với nước cất 1/3 (NT1), 1/4 (NT2), 1/5 (NT3) 1/6 (NT4); sau hấp cách thủy hỗn hợp 98 0C giờ; để hỗn hợp nguội, lọc qua giấy lọc để thu dịch trích bảo quản dịch trích tủ lạnh Trước lần sử dụng, dịch trích khử trùng tia UV thời gian 30 phút 2.2.2 Chuẩn bị vi parahaemolyticus khuẩn 2.2.4 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC Minimum inhibitory concentration) Do hạt trâm bầu cho tính kháng Vibrio parahaemolyticus mạnh phận lại, nên định chọn hạt để thử nghiệm xác định MIC MIC xác định theo tiêu chuẩn NCCLS (2005), trích Lưu Thị Thanh Trúc (2014) Dịch trích hạt trâm bầu tỷ lệ trích 1/5 với nước cất xem dung dịch mẹ, môi trường BHIB (được hấp vơ trùng); pha lỗng dung dịch mẹ với nước cất để đạt nồng độ pha loãng khác Vibrio Chúng ta chuẩn bị huyền phù vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus có thời gian phát triển từ 18 24 giờ, so sánh với độ đục chuẩn McFarland 0.5 (OD = 0,125 với λ = 550 nm); pha loãng huyền phù 100 lần để sử dụng Sau đánh dấu ống nghiệm từ đến n; từ ống đến ống n nhỏ 1,98 mL môi trường BHIB; từ ống đến ống n - nhỏ mL dịch trích hạt trâm bầu pha lỗng với nồng độ tương ứng; riêng ống n không nhỏ dịch trích (ống đối chứng) mà nhỏ mL nước cất vô trùng Tiếp đến, nhỏ tiếp 0,02 mL Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus sau mua để nhiệt độ phòng giờ; sau cấy lên đĩa thạch chứa môi trường Chrom agar; tiến hành ủ đĩa nhiệt độ 30 0C 24 Sau đó, kiểm tra tính vi khuẩn trước sử dụng phương pháp quan sát màu sắc hình dạng khuẩn lạc, kiểm tra tính di động, nhuộm gram, thực phản ứng catalase, phản ứng oxidase 2.2.3 Khảo nghiệm tính kháng khuẩn An Giang University Journal of Science – 2018, Vol 19 (1), – tính kháng Vibrio parahaemolyticus cách đo đường kính vòng kháng khuẩn dịch trích trâm bầu từ tỷ lệ phối trộn nguyên liệu ban đầu với nước cất từ phận chúng lên chủng Vibrio parahaemolyticus dựa theo tiêu chuẩn Schillinger Luke (1989) đánh giá đường kính vòng kháng khuẩn huyền phù vi khuẩn vào tất ống nghiệm; lắc ống nghiệm, ủ 22 - 24 30 0C Đọc kết MIC, tìm MIC dịch trích hạt trâm bầu cho vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus Ống n (ống đối chứng) đục vi khuẩn phát triển khơng có dịch trích hạt trâm bầu Một loạt ống nghiệm đục hướng ống số n loạt ống nghiệm hướng ống số Quan sát dãy ống nghiệm, tìm xem ống cuối dãy ghi nhận nồng độ dịch trích hạt trâm bầu ống (đơn vị tính µL/mL) 2.3 Xử lý số liệu Nghiên cứu dùng phần mềm SPSS 16.0 Excel 2010 để nhập xử lý số liệu Nghiên cứu phân tích ANOVA phép thử Duncan để so sánh tính kháng khuẩn dịch trích hạt, vỏ trâm bầu tỷ lệ phối trộn khác bột nguyên liệu trâm bầu với nước cất vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus Kết thảo luận 3.1 Khả kháng Vibrio parahaemolyticus dịch trích trâm bầu Hình Đĩa thạch khảo sát khả kháng Vibrio parahaemolyticus dịch trích trâm bầu Với phương pháp đục lỗ thạch đĩa petri mơi trường MHA (Hình 1), chúng tơi khảo sát Bảng Khả kháng Vibrio parahaemolyticus dịch trích phận trâm bầu Bộ phận Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) Vỏ 11,44 ± 0,19a Lá 11,84 ± 0,29a Hạt 16,30 ± 0,38b Ghi chú: Các giá trị bảng giá trị trung bình sai số chuẩn Các giá trị cột có chứa ký tự khác khác biệt có ý nghĩa thống kê (p0,05) Điều cho thấy, khả kháng Vibrio parahaemolyticus dịch trích hạt trâm bầu mạnh so với vỏ lá, riêng vỏ trâm bầu dù sử dụng phận không làm ảnh hưởng đến khả kháng Vibrio parahaemolyticus 3.2 Xác định MIC dịch trích hạt trâm bầu An Giang University Journal of Science – 2018, Vol 19 (1), – Theo kết khảo sát khả kháng Vibrio parahaemolyticus dịch trích trâm bầu tốt Bên cạnh đó, khả kháng khuẩn dịch trích NT1, NT2 NT3 nhằm thuận tiện q trình lắng lọc dịch trích hạt trâm bầu nâng cao khả ứng dụng trâm bầu vào thực tiễn thời gian tới chúng tơi chọn tỷ lệ trích 1/5 để xác định MIC Đối với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, dịch trích từ hạt trâm bầu tỷ lệ 1/3 cho khả kháng mạnh Dịch trích từ hạt trâm bầu (tỷ lệ trích 1/5 với nước cất) nồng độ 7,5 µL/mL ức chế vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 4.2 Khuyến nghị Chúng ta cần có thêm nghiên cứu tính kháng khuẩn dịch trích trâm bầu đối Vibrio parahaemolyticus điều kiện in vitro mơi trường ni tơm để tìm khả ứng dụng trâm bầu thực tiễn Cần nghiên cứu thêm khả kháng khuẩn dịch trích trâm bầu xác định thêm MIC loài vi khuẩn khác gây bệnh cho động vật thủy sản Streptococcus agalactiae, Edwardsiella ictaluri, Vibrio vulnificus, Aeromonas hydrophila, v.v Từ kết thăm dò, chúng tơi định chọn dãy nồng độ 2,5; 5; 10; 20; 40; 80; 160; 320 µL/mL để xác định MIC; dịch trích hạt trâm bầu tỷ lệ trích 1/5 với nước cất xem dung dịch mẹ sau pha thành dãy nồng độ Kết MIC xác định MIC dịch trích hạt trâm bầu lồi Vibrio parahaemolyticus 7,5 µL/mL Thơng qua kết khảo sát nhận thấy, việc xác định MIC dịch trích hạt trâm bầu việc kết hợp với tính kháng khuẩn dịch trích trâm bầu mở hướng ứng dụng trâm bầu thực tiễn nuôi trồng thủy sản thời gian tới Từ đó, thấy triển vọng ứng dụng trâm bầu thay kháng sinh nuôi trồng thủy sản, khơng thay hồn tồn kháng sinh thực tiễn góp phần nhỏ việc điều trị bệnh cho số loài động vật thủy sản; đặc biệt khả ứng dụng phòng trị bệnh gan tụy, hội chứng EMS lồi tơm ni TÀI LIỆU THAM KHẢO Adnyana I K, Yasuhiro T, Suresh A, Arjun H B, Kim Qui T & Shigetoshi K (2000) Quandranosides VI-XI, Six New Triterpene Glucosides from the seeds of Combretum quadrangulare Chem Pharm Bull, 48(8), 1114 - 1120 Bùi Xn Hào (2013) Góp phần tìm hiểu thành phần hóa học trâm bầu Combretum quadrangulare kurz http://luanvan.co/luan-van/gop-phan-tim-hieuthanh-phan-hoa-hoc-cua-la-cay-tram-baucombretum-quadrangulare-kurz-37353/, truy cập ngày 30/5/2017 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Bùi Quang Tề (2011) Một số thảo dược thay kháng sinh http://thuocthuysannamthanh.com/blogs/thaod uocthiennhien, truy cập ngày 20/06/2017 Dịch trích trâm bầu có tính kháng mạnh Vibrio parahaemolyticus với đường kính vòng kháng khuẩn 13,2 mm Đường kính vòng kháng khuẩn dịch trích hạt, vỏ trâm bầu Vibrio parahaemolyticus 16,29 mm; 11,44 mm 11,84 mm Ở tỷ lệ phối trộn bột nguyên liệu trâm bầu với nước cất 1/3, 1/4, 1/5, 1/6 cho đường kính vòng kháng khuẩn 14,15 mm; 13,25 mm; 14,09 mm; 12,28 mm Dodia, D N., Patel, I S & Patel, G M (2008) Botanical pesticides for pest management Scientific publishere (India), 5, 276 - 282 Đặng Thị Lụa, Lại Thị Ngọc Hà & Nguyễn Thanh Hải (2015) Tác dụng diệt khuẩn dịch chiết sim hạt sim (Rhodomyrtus tomentosa) vi khuẩn gây bệnh hoại tử An Giang University Journal of Science – 2018, Vol 19 (1), – cấp tơm ni nước lợ Tạp chí Nghiên cứu Khoa học, 7, 1101 - 1108 Sarker, M G A, Faruk, M A R & Uddin, U U (2002) Virulence and drug sensitivity of Flavobaterium columnare, the causative agent of columnaris disease, the causative agent of Lưu Thị Thanh Trúc (2014) Thực hành chuẩn đoán bệnh động vật thủy sản TP HCM: Nhà xuất Nông Nghiệp columnaris disease Biological Science, 5, 204 207 Nguyễn Thị Hạnh & Đặng Thị Lụa (2015) Tác dụng diệt khuẩn diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tôm nuôi nước lợ Hội nghị Khoa học trẻ Thủy sản toàn quốc lần thứ VI, RIA3, trang Schillinger, V and Luke, K.K (1989) Antibacterial activity of Lactobacillus sake isolated from meat Appl Environ Microbiol, 55, 1091 - 1096 Thành Công (2016) Cần tăng cường quản lý kháng sinh nuôi thủy sản http://www.tiengiang.gov.vn/SNN/42/668/112 1/88241/An-toan-ve-sinh-thuc-pham/Cantang-cuong-quan-ly-khang-sinh-trong-nuoithuy-san.aspx, truy cập ngày 30/5/2017 Nguyễn Hải Vân, Caruso Domenico, Meile JeanChristophe, Trịnh Thị Trang, Nguyễn Ngọc Tuấn, Lebrun Marc, Chu Kỳ Sơn & Sarter Samira (2015) Khả kháng khuẩn màng tang (Litae cubela) Việt Nam ảnh hưởng tinh dầu lên đáp ứng sinh học cá chép (Cyprinus carpio) Hội nghị Khoa học trẻ Thủy sản toàn quốc lần thứ VI, RIA3, trang ... kháng khuẩn dịch trích trâm bầu đối Vibrio parahaemolyticus điều kiện in vitro môi trường nuôi tơm để tìm khả ứng dụng trâm bầu thực tiễn Cần nghiên cứu thêm khả kháng khuẩn dịch trích trâm bầu. .. tính kháng Vibrio parahaemolyticus dịch trích trâm bầu giảm dần từ dịch trích hạt, cuối vỏ với đường kính vòng kháng khuẩn 16,30 mm; 11,84 mm 11,44 mm Khả kháng Vibrio parahaemolyticus dịch trích. .. trích hạt trâm bầu An Giang University Journal of Science – 2018, Vol 19 (1), – Theo kết khảo sát khả kháng Vibrio parahaemolyticus dịch trích trâm bầu tốt Bên cạnh đó, khả kháng khuẩn dịch trích