Nghiên cứu này để xác định khả năng kháng V. parahaemolyticus của dịch trích lá, vỏ và hạt cây trâm bầu trong điều kiện in vitro. Nghiên cứu cho thấy, dịch trích cây trâm bầu kháng V. parahaemolyticus mạnh với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình 13,19 mm.
Trang 1KH Ả NĂNG KHÁNG KHUẨN Vibrio parahaemolyticus CỦA DỊCH TRÍCH CÂY TRÂM BẦU (Combretum quadrangulare) TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO
Nguyễn Công Tráng1, Ngô Thị Kim Cúc1, Phan Ngọc Thịnh1
1 Trường Đại học Tiền Giang
Thông tin chung:
Ngày nh ận bài: 05/08/2017
Ngày nhận kết quả bình duyệt:
08/10/2017
Ngày chấp nhận đăng: 04/2018
Title:
A study on the anti-bacterial
activity of extracts from sakae
naa tree (Combretum
quadrangulare) in Vitro
Keywords:
Sakae naa tree,
hepatopancreas, EMS, herbal
medicine, Vibrio
parahaemolyticus
Từ khóa:
Cây trâm b ầu, EMS, thảo
mộc, Vibrio
parahaemolyticus
ABSTRACT
Vibrio parahaemolyticus is a dangerous bacteria that caused a lot of diseases
in a aquaculture, particularly EMS symtomp on the shrimp Over the years, Sakae naa tree (Combretum quadrangulare) has been considered a precious herb because of its benefits to cure health humans and aquatic animals This study was conducted to explore anti-bacterial activities of extracts from the sakae naa tree on Vibrio parahaemolyticus, together with seeds, leaves and the skin of the tree in vitro condition The finding showed that extracts from Combretum quadrangulare were resistant significantly on Vibrio parahaemolyticus with 13.19 mm of average diameter, in which the resistance from seed extracts was stronger than those leaves and bark of the tree with 16.29 mm, 11.84 mm, and 11.44 mm of diameter, respectively Anti-bacterial activities of extracts from sakae naa tree were in different ratios due to the mixed level of purified water The experiment 1, 2, 3 and 4 was at 14.15 mm, 13,25 mm, 14.09 mm, and 12.28 mm diameter accordingly MIC of seed extracts from sakae naa tree (one per five mixed with purified water) on Vibrio parahaemolyticus was 7.5 µL/mL
TÓM T ẮT
Vibrio parahaemolyticus gây nhi ều bệnh nguy hiểm cho động vật thủy sản, đặc biệt hiện nay là hội chứng EMS trên tôm Cây trâm bầu (Combretum quadrangulare) từ lâu được xem là loại thảo dược quý chữa nhiều bệnh trên người và động vật thủy sản Nghiên cứu này để xác định khả năng kháng V parahaemolyticus của dịch trích lá, vỏ và hạt cây trâm bầu trong điều kiện in vitro Nghiên c ứu cho thấy, dịch trích cây trâm bầu kháng V parahaemolyticus
m ạnh với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình 13,19 mm Trong đó, dịch trích hạt cho tính kháng mạnh hơn dịch trích từ lá và vỏ với đường kính vòng kháng khuẩn lần lượt là 16,29 mm, 11,84 mm và 11,44 mm Tính kháng khuẩn của dịch trích cây trâm bầu ở các tỷ lệ phối trộn nước cất, giảm dần theo sự tăng dần nước cất, cụ thể, đường kính vòng kháng khuẩn ở NT1 là 14,15 mm, ở NT2 là 13,25 mm, ở NT3 là 14,09 mm và ở NT4 là 12,28 mm MIC của dịch trích h ạt trâm bầu (tỷ lệ trích 1/5) đối với Vibrio parahaemolyticus là 7,5 µL/mL
Trang 21 GI ỚI THIỆU
Khi diện tích nuôi trồng thủy sản ngày càng được
mở rộng thì dịch bệnh là một trong những yếu tố
gây khó khăn lớn nhất cho nghề nuôi Các loài vi
khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản hiện nay rất đa
dạng và phức tạp với nhiều dạng khác nhau như
Aeromonas sp., Edwardsiella sp., Vibrio sp.,
Streptococcus sp., Trong đó, loài gây bệnh nguy
hiểm cho động vật thủy sản phổ biến là loài vi
khuẩn Vibrio parahaemolyticus Chúng có khả
năng bùng phát và lây lan nhanh chóng vì thế vấn
đề kiểm soát, tiêu diệt loài vi khuẩn này gặp rất
nhiều khó khăn
Do tác nhân gây hội chứng EMS trên tôm là loài
vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus khi bị nhiễm
bacteriophage hiện nay ngày càng trở nên phổ
biến, dẫn đến nhu cầu sử dụng kháng sinh để điều
trị bệnh do loài vi khuẩn này gây ra cũng ngày
một tăng cao, nếu không xử lý triệt để sẽ gây mất
mùa và thiệt hại nặng nề, vì vậy nhu cầu sử dụng
kháng sinh để điều trị bệnh do loài vi khuẩn này
gây ra cũng ngày một tăng cao Tuy nhiên, việc
lạm dụng, sử dụng các loại hoá chất, kháng sinh
không đúng quy cách, không đúng liều lượng đã
gây ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe động vật thủy
sản, môi trường sinh thái, an toàn vệ sinh thực
phẩm và đặc biệt là tạo ra các chủng vi khuẩn
kháng lại thuốc kháng sinh, làm giảm hiệu quả
điều trị bệnh; đồng thời tăng nguy cơ nhiễm các
loài vi khuẩn có khả năng kháng thuốc cho con
người, động vật và tồn dư trong thịt động vật thủy
sản (Thành Công, 2016)
Hiện nay có rất nhiều loại thảo mộc như cây nhọ
nồi, cây sài đất, cây chó đẻ, cây sim, củ tỏi đang
được ứng dụng rộng rãi trong thực tiễn nuôi trồng
thủy sản, giúp đảm bảo an toàn và hiệu quả cao
trong việc điều trị bệnh cho động vật thủy sản
Đặng Thị Lụa và cs (2015), Nguyễn Thị Hạnh và
cs (2015), đã thử nghiệm tác dụng kháng vi
khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử
gan tụy cấp (AHPND) trên tôm nuôi nước lợ của
dịch chiết hạt sim, lá sim và dịch chiết cây diệp hạ
châu đắng Khả năng kháng Vibrio
parahaemolyticus c ủa cây màng tang (Litae
cubela) đã được thử nghiệm trong nghiên cứu của Nguyễn Hải Vân và cs (2015) Riêng cây trâm
bầu, đặc biệt là bộ phận hạt có chứa nhiều tinh dầu và hợp chất flavonoid (Bùi Xuân Hào, 2013) Theo Adnyana et al (2000), hạt cây trâm bầu có chứa 6 loại glucosides triterpene là ursane - (1 - 4), oleanane - và các loại lupane có tác dụng diệt các loài vi khuẩn Alcaligenes faecalis, Bacillus
cereus và Staphylococcus typhimurium Bên cạnh
đó, hạt cây trâm bầu còn diệt các loài ký sinh trùng gây bệnh trên các loài động vật thủy sản nuôi (Bùi Quang Tề, 2011) Tuy nhiên nghiên cứu
về tính kháng Vibrio parahaemolyticus gây bệnh trên động vật thủy sản hiện nay của cây trâm bầu vẫn chưa được thực hiện
Trong nghiên cứu này, dịch trích từ cây trâm bầu được dùng để thử nghiệm, đánh giá khả năng
kháng Vibrio parahaemolyticus, làm cơ sở khoa học cho việc chế tạo các sản phẩm thảo dược để phòng trị bệnh cho tôm nuôi
2.1 Vật liệu nghiên cứu
Các bộ phận (vỏ, lá, hạt) của cây trâm bầu được thu hái vào tháng 01/2017, tại xã Thân Cửu Nghĩa
và Long An, huyện Châu Thành, tỉnh Tiền Giang
Lá trâm bầu được thu hái là các lá xanh, già, không sâu bệnh, nấm mốc hay vàng úa Vỏ cây trâm bầu được tách ra từ thân cây trâm bầu tươi
khỏe, chọn vỏ cây già, không bị sâu đục thân Trái trâm bầu được thu hái là những trái già, nguyên vẹn, sau khi thu hái, trái được tách lấy hạt và sử dụng hạt để nghiên cứu
Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus được mua tại
Phòng Thí nghiệm Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Nông Lâm thành phố
Hồ Chí Minh
Nguyên vật liệu khác bao gồm môi trường chọn lọc của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus là Chrom agar (thành phần gồm agar, peptone, dịch trích nấm men, chromogenic mix) được sử dụng
để nuôi cấy vi khuẩn; môi trường MHA (thành phần gồm beef extract, casein thủy phân trong
Trang 3acid, tinh bột, agar) dùng để khảo sát tính kháng
khuẩn; môi trường BHIB (thành phần gồm brain
heart infusion, pancreatic digest of casein, dịch
trích nấm men, peptone, muối NaCl, agar,
dextrose) dùng để xác định nồng độ ức chế tối
thiểu (MIC) Nghiên cứu sử dụng các môi trường
dựa theo tham khảo tài liệu của Lưu Thị Thanh
Trúc (2014) Một số dụng cụ, thiết bị gồm pipet,
đèn cồn, giấy lọc, ống nghiệm, tủ cấy vô trùng, tủ
ủ, tủ sấy, máy quang phổ, nồi hấp, đĩa petri, que
cấy, que trang, dụng cụ đục lỗ trên đĩa thạch,
thước kẻ có chia vạch, đầu tips, kính hiển vi, v.v
Hóa chất gồm cồn 90o, nước muối sinh lý, nước
cất, H2SO4, BaCl2.2H2O, các đĩa giấy tẩm hóa
chất thực hiện phản ứng oxidase, bộ hóa chất
nhuộm gram và H2O2 10%
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Trích dịch cây trâm bầu
Theo phương pháp Dodia và cs (2008), các bộ
phận cây trâm bầu sau khi thu hái tiến hành rửa
sạch, sau đó sấy ở 60 0C trong 30 phút Phân loại
và xay nhuyễn thành bột thô Ngâm bột nguyên
liệu trong nước cất vô trùng theo các tỷ lệ khối
lượng nguyên liệu với nước cất là 1/3 (NT1), 1/4
(NT2), 1/5 (NT3) và 1/6 (NT4); sau đó hấp cách
thủy hỗn hợp ở 98 0C trong 3 giờ; để hỗn hợp
nguội, lọc qua giấy lọc để thu dịch trích và bảo
quản dịch trích trong tủ lạnh Trước mỗi lần sử
dụng, dịch trích được khử trùng bằng tia UV trong
thời gian 30 phút
parahaemolyticus
Vi khuẩn thuần Vibrio parahaemolyticus sau khi
mua v ề để ở nhiệt độ phòng 6 giờ; sau đó cấy lên
đĩa thạch chứa môi trường Chrom agar; tiến hành
ủ các đĩa ở nhiệt độ 30 0C trong 24 giờ Sau đó,
chúng ta kiểm tra tính thuần của vi khuẩn trước
khi sử dụng bằng phương pháp quan sát màu sắc
và hình dạng khuẩn lạc, kiểm tra tính di động,
nhuộm gram, thực hiện phản ứng catalase, phản
ứng oxidase
2.2.3 Khảo nghiệm tính kháng khuẩn
Khảo nghiệm được thực hiện theo phương pháp
Schillinger và Luke (1989), Sarkar et al (1996)
Chúng ta chuẩn bị vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus có thời gian phát triển từ 18 -
24 giờ Sử dụng phương pháp đục lỗ trên đĩa thạch MHA với 20 ml MHA/đĩa, đục 5 lỗ trên mặt thạch MHA ở các vị trí 12 giờ, 3 giờ, 6 giờ, 9 giờ
và ở vị trí trung tâm, mỗi lỗ có đường kính 4 mm Chuẩn bị huyền phù vi khuẩn, so sánh với độ đục McFarland 0.5 (OD = 0,125; λ=550 nm), sau đó pha loãng huyền phù 100 lần trước khi sử dụng
Nhỏ 1 mL dung dịch huyền phù vi khuẩn lên đĩa thạch MHA, chan đều, đổ bỏ huyền phù dư và dùng que cấy trải chan huyền phù đến khi khô
Nhỏ 0,15 mL dịch trích vào mỗi lỗ (chỉ nhỏ 4 lỗ,
lỗ còn lại nhỏ 0,15 mL nước muối sinh lý để làm đối chứng) Ủ đĩa trong tủ ủ ở 30 0C trong 24 giờ, sau đó ta tiến hành đo đường kính vòng vô khuẩn
bằng thước đo có chia vạch (mm)
2.2.4 Xá c định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC - Minimum inhibitory concentration)
Do hạt cây trâm bầu cho tính kháng Vibrio
parahaemolyticus mạnh hơn 2 bộ phận còn lại, nên chúng tôi quyết định chọn hạt để thử nghiệm xác định MIC MIC được xác định theo tiêu chuẩn
của NCCLS (2005), trích bởi Lưu Thị Thanh Trúc (2014)
Dịch trích hạt trâm bầu ở tỷ lệ trích 1/5 với nước cất được xem là dung dịch mẹ, môi trường BHIB (được hấp vô trùng); pha loãng dung dịch mẹ với nước cất để đạt nồng độ pha loãng khác nhau Chúng ta chuẩn bị huyền phù vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus có thời gian phát triển từ 18 -
24 giờ, so sánh với độ đục chuẩn McFarland 0.5 (OD = 0,125 với λ = 550 nm); pha loãng huyền phù ra 100 lần để sử dụng Sau đó đánh dấu ống nghiệm từ 1 đến n; từ ống 1 đến ống n nhỏ 1,98
mL môi trường BHIB; từ ống 1 đến ống n - 1 nhỏ
2 mL dịch trích hạt trâm bầu được pha loãng với các nồng độ tương ứng; riêng ống n không nhỏ
dịch trích (ống đối chứng) mà nhỏ 2 mL nước cất
vô trùng Tiếp đến, chúng ta nhỏ tiếp 0,02 mL
Trang 4huyền phù vi khuẩn vào tất cả ống nghiệm; lắc
đều các ống nghiệm, ủ 22 - 24 giờ ở 30 0C
Đọc kết quả MIC, tìm MIC của dịch trích hạt trâm
bầu cho vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus Ống n
(ống đối chứng) đục do vi khuẩn phát triển và
không có dịch trích hạt trâm bầu Một loạt ống
nghiệm đục hướng về ống số n và một loạt ống
nghiệm trong hướng về ống số 1 Quan sát dãy
ống nghiệm, tìm xem ống nào cuối cùng trong dãy
và ghi nhận nồng độ của dịch trích hạt trâm bầu ở
ống đó (đơn vị tính là µL/mL)
2.3 Xử lý số liệu
Nghiên cứu dùng phần mềm SPSS 16.0 và Excel
2010 để nhập và xử lý số liệu Nghiên cứu phân
tích ANOVA bằng phép thử Duncan để so sánh
tính kháng khuẩn của dịch trích hạt, lá và vỏ cây
trâm bầu ở các tỷ lệ phối trộn khác nhau giữa bột
nguyên liệu cây trâm bầu với nước cất đối với vi
khuẩn Vibrio parahaemolyticus
3 K ết quả và thảo luận
3.1 Kh ả năng kháng Vibrio parahaemolyticus
c ủa dịch trích cây trâm bầu
Với phương pháp đục lỗ thạch trên đĩa petri bằng
môi trường MHA (Hình 1), chúng tôi đã khảo sát
được tính kháng Vibrio parahaemolyticus bằng
cách đo đường kính vòng kháng khuẩn của dịch trích cây trâm bầu từ các tỷ lệ phối trộn nguyên
liệu ban đầu với nước cất cũng như từ các bộ phận của chúng lên chủng Vibrio parahaemolyticus và dựa theo tiêu chuẩn của Schillinger và Luke (1989) đánh giá đường kính vòng kháng khuẩn
Hình 1 Đĩa thạch khảo sát khả năng kháng Vibrio
B ảng 2 Khả năng kháng Vibrio parahaemolyticus của dịch trích các bộ phận cây trâm bầu
Ghi chú: Các giá trị trong bảng là giá trị trung bình và sai số chuẩn Các giá trị trong cùng một cột có chứa các ký tự khác nhau thì khác bi ệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) Kết quả đã trừ ra 4 mm đường kính lỗ thạch
Kết quả Bảng 2 cho thấy, tính kháng Vibrio
parahaemolyticus của dịch trích cây trâm bầu
giảm dần từ dịch trích hạt, lá và cuối cùng là vỏ
với đường kính vòng kháng khuẩn lần lượt là
16,30 mm; 11,84 mm và 11,44 mm Khả năng
kháng Vibrio parahaemolyticus của dịch trích hạt
trâm bầu có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p <
0,05) so với dịch trích lá và vỏ, tuy nhiên tính
kháng Vibrio parahaemolyticus giữa dịch trích lá
và vỏ trâm bầu có sự khác biệt không có ý nghĩa
thống kê (p>0,05) Điều này cho thấy, khả năng
kháng Vibrio parahaemolyticus của dịch trích hạt
cây trâm bầu mạnh nhất so với vỏ và lá, riêng vỏ
và lá trâm bầu thì dù sử dụng bộ phận nào cũng không làm ảnh hưởng đến khả năng kháng Vibrio
parahaemolyticus
3.2 Xác định MIC của dịch trích hạt trâm bầu
Trang 5Theo kết quả khảo sát thì khả năng kháng Vibrio
parahaemolyticus của dịch trích cây trâm bầu là
tốt nhất Bên cạnh đó, do khả năng kháng khuẩn
của dịch trích ở NT1, NT2 và NT3 là như nhau và
nhằm thuận tiện trong quá trình lắng lọc dịch trích
hạt cây trâm bầu cũng như nâng cao khả năng ứng
dụng cây trâm bầu vào thực tiễn trong thời gian
tới thì chúng tôi chọn tỷ lệ trích 1/5 để xác định
MIC
Từ kết quả thăm dò, chúng tôi quyết định chọn
dãy nồng độ 2,5; 5; 10; 20; 40; 80; 160; 320
µL/mL để xác định MIC; dịch trích hạt trâm bầu ở
tỷ lệ trích 1/5 với nước cất được xem là dung dịch
mẹ và sau đó pha ra thành dãy nồng độ trên Kết
quả MIC đã xác định được MIC của dịch trích hạt
trâm bầu đối với loài Vibrio parahaemolyticus là
7,5 µL/mL
Thông qua kết quả khảo sát có thể nhận thấy, việc
xác định MIC của dịch trích hạt cây trâm bầu
cũng như việc kết hợp với tính kháng khuẩn của
dịch trích cây trâm bầu đã mở ra hướng ứng dụng
mới của cây trâm bầu trong thực tiễn nuôi trồng
thủy sản thời gian tới Từ đó, chúng ta có thể thấy
được triển vọng ứng dụng cây trâm bầu thay thế
kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản, tuy không
thay thế hoàn toàn kháng sinh trong thực tiễn
nhưng có thể góp một phần nhỏ trong việc điều trị
bệnh cho một số loài động vật thủy sản; đặc biệt
là khả năng ứng dụng phòng trị bệnh gan tụy, hội
chứng EMS trên các loài tôm nuôi hiện nay
4.1 Kết luận
Dịch trích cây trâm bầu có tính kháng mạnh đối
với Vibrio parahaemolyticus với đường kính vòng
kháng khuẩn 13,2 mm
Đường kính vòng kháng khuẩn của dịch trích hạt,
vỏ và lá cây trâm bầu đối với Vibrio
parahaemolyticus lần lượt là 16,29 mm; 11,44
mm và 11,84 mm Ở các tỷ lệ phối trộn bột
nguyên liệu cây trâm bầu với nước cất 1/3, 1/4,
1/5, 1/6 cho đường kính vòng kháng khuẩn lần
lượt là 14,15 mm; 13,25 mm; 14,09 mm; 12,28
mm
Đối với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, dịch
trích từ hạt cây trâm bầu ở tỷ lệ 1/3 cho khả năng kháng mạnh nhất
Dịch trích từ hạt cây trâm bầu (tỷ lệ trích 1/5 với nước cất) ở nồng độ 7,5 µL/mL ức chế được vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
4.2 Khuy ến nghị
Chúng ta cần có thêm nghiên cứu về tính kháng khuẩn của dịch trích cây trâm bầu đối Vibrio
parahaemolyticus trong điều kiện in vitro trong
môi trường nuôi tôm để tìm ra khả năng ứng dụng
của cây trâm bầu trong thực tiễn Cần nghiên cứu thêm khả năng kháng khuẩn của dịch trích cây trâm bầu và xác định thêm MIC đối với các loài vi khuẩn khác gây bệnh cho động vật thủy sản như
Streptococcus agalactiae, Edwardsiella ictaluri, Vibrio vulnificus, Aeromonas hydrophila, v.v
Adnyana I K, Yasuhiro T, Suresh A, Arjun H B, Kim Qui T & Shigetoshi K (2000) Quandranosides VI-XI, Six New Triterpene
Glucosides from the seeds of Combretum
quadrangulare Chem Pharm Bull, 48(8),
1114 - 1120
Bùi Xuân Hào (2013) Góp ph ần tìm hiểu thành phần hóa học của lá cây trâm bầu - Combretum quadrangulare kurz
http://luanvan.co/luan-van/gop-phan-tim-hieu- thanh-phan-hoa-hoc-cua-la-cay-tram-bau-combretum-quadrangulare-kurz-37353/, truy cập ngày 30/5/2017
Bùi Quang Tề (2011) Một số thảo dược thay thế
kháng sinh
http://thuocthuysannamthanh.com/blogs/thaod uocthiennhien, truy cập ngày 20/06/2017 Dodia, D N., Patel, I S & Patel, G M (2008) Botanical pesticides for pest management
Scientific publishere (India), 5, 276 - 282
Đặng Thị Lụa, Lại Thị Ngọc Hà & Nguyễn Thanh Hải (2015) Tác dụng diệt khuẩn của dịch chiết lá sim và hạt sim (Rhodomyrtus
tomentosa) đối với vi khuẩn gây bệnh hoại tử
Trang 6cấp trên tôm nuôi nước lợ Tạp chí Nghiên cứu
Khoa học, 7, 1101 - 1108
Lưu Thị Thanh Trúc (2014) Thực hành chuẩn
đoán bệnh trên động vật thủy sản TP HCM:
Nhà xuất bản Nông Nghiệp
Nguyễn Thị Hạnh & Đặng Thị Lụa (2015) Tác
dụng diệt khuẩn của cây diệp hạ châu đắng
(Phyllanthus amarus) đối với vi khuẩn gây
bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm nuôi nước
lợ Hội nghị Khoa học trẻ Thủy sản toàn quốc
l ần thứ VI, RIA3, trang 5
Nguyễn Hải Vân, Caruso Domenico, Meile
Jean-Christophe, Trịnh Thị Trang, Nguyễn Ngọc
Tuấn, Lebrun Marc, Chu Kỳ Sơn & Sarter
Samira (2015) Kh ả năng kháng khuẩn của
cây màng tang (Litae cubela) ở Việt Nam và
ảnh hưởng của tinh dầu lên đáp ứng sinh học
của cá chép (Cyprinus carpio) Hội nghị Khoa
học trẻ Thủy sản toàn quốc lần thứ VI, RIA3,
trang 7
Sarker, M G A, Faruk, M A R & Uddin, U U (2002) Virulence and drug sensitivity of
Flavobaterium columnare, the causative agent
of columnaris disease, the causative agent of
columnaris disease Biological Science, 5, 204 -
207
Schillinger, V and Luke, K.K (1989) Antibacterial activity of Lactobacillus sake
isolated from meat Appl Environ Microbiol,
55, 1091 - 1096
Thành Công (2016) C ần tăng cường quản lý
http://www.tiengiang.gov.vn/SNN/42/668/112 1/88241/An-toan-ve-sinh-thuc-pham/Can- tang-cuong-quan-ly-khang-sinh-trong-nuoi-thuy-san.aspx, truy cập ngày 30/5/2017