Sự đa dạng di truyền của chủng IHHNV đã được xác định trên nhiều vùng địa lý khác nhau trên thế giới. Trong nghiên cứu này, khi phân tích và giải trình tự gen IHHNV trên những mẫu tôm sú nuôi ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) cho thấy đã có sự hiện diện chủng virus IHHN type A không lây bệnh, đoạn gen khuếch đại 1100 bp của chủng này có độ tương đồng rất cao với đoạn gen chủng IHHNV type A phân lập ở Úc và Mandagasca là 100%.
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN ĐẶC TRƯNG DI TRUYỀN CỦA CHỦNG IHHNV PHÂN LẬP TÔM NUÔI Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG Cao Thành Trung1, Nguyễn Thị Kim Mỹ2 Phạm Hùng Vân3 TÓM TẮT Sự đa dạng di truyền chủng IHHNV xác định nhiều vùng địa lý khác giới Trong nghiên cứu này, phân tích giải trình tự gen IHHNV mẫu tôm sú nuôi Đồng sơng Cửu Long (ĐBSCL) cho thấy có diện chủng virus IHHN type A không lây bệnh, đoạn gen khuếch đại 1100 bp chủng có độ tương đồng cao với đoạn gen chủng IHHNV type A phân lập Úc Mandagasca 100% Đồng thời, chủng virus IHHN type lây nhiễm xác định diện tôm sú nuôi vùng Phân tích trình tự cho thấy chủng có kí hiệu KG phân lập tơm ni Kiên Giang chủng kí hiệu ST phân lập tơm Bình Thuận ni Sóc Trăng đoạn khoảng 79 nucleotide, nhiên không ảnh hưởng đến vùng đọc mở gen để mã hóa protein virus Phân tích trình tự chủng IHHNV KG có tương đồng cao với chủng IHHNV Hawaii, Mexico, Đài Loan C Ecuador, độ tương đồng gen 95% Và chủng IHHNV type lây nhiễm khác có kí hiệu ST, phân tích trình tự chủng cho thấy có độ tương đồng thấp chủng có kí hiệu KG chủng IHHNV phân lập Hawaai, có độ tương đồng cao với chủng IHHNV phân lập Đài Loan A, B Thái Lan Trình tự gen chủng KG ST có kích thước khoảng 3824 bp Kết nghiên cứu cho thấy, tơm sú ni ĐBSCL có diện chủng IHHNV type lây nhiễm chủng IHHNV type A khơng lây nhiễm Từ khóa: Đồng sơng Cửu Long (ĐBSCL), virus IHHN, tôm sú P monodon I ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh virus vấn đề nghiêm trọng ngành cơng nghiệp ni tơm tồn cầu Hàng loạt dịch bệnh bùng phát gây thiệt hại kinh tế đến người dân nuôi tôm Bệnh hoại tử quan tạo máu quan lập biểu mơ virus có tên infectious hypodermal and hemotopoietic necrosis virus (IHHNV), số bệnh nguy hiểm tôm xanh Litopenaeus stylirostris Bệnh IHHN lần mô tả hệ thống nuôi siêu thâm canh tôm xanh L stylirostris Hawaii năm 1981 (Lightner, 1983) Khi mắc bệnh này, tơm xanh L stylirostris có tỷ lệ chết lên đến 90% Tôm thẻ chân trắng tơm sú ni nhiễm vi virus có tượng dị hình chậm lớn (Rai ctv., 2013) IHHNV virus có kích thước nhỏ phát tơm he Virus có đường kính 22nm, cấu trúc khối cầu đa diện khơng có vỏ ngồi Dựa kích thước, hình thái học hóa sinh, IHHNV xếp vào họ Parvoviridae thành viên giống Brevidensovirus (Bonami, 1990) Virus mang phân tử DNA mạch đơn, kích thước gen 4,1kb chứa trình tự ORF Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ - Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản Email: thanhtrung77@yahoo.com Trường Đại học khoa học Tự Nhiên Tp Hồ Chí Minh Cơng Ty TNHH Dịch Vụ Và Thương Mại Nam Khoa TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 7/2013 49 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN (1, 3) (Nunan ctv 2000, Shike ctv 2000) Trong đó, ORF1 có kích thước khoảng 2001 bp chiếm 50% trình tự gen dự đốn mã hóa cho chuỗi peptide 666 amino acid với trọng lượng phân tử 75.77 kDa, sở tương đồng trình tự với virus Brevidensoviruses muỗi, trình tự amino acid dự đốn protein giả định (non-structural protein - NS1) ORF2 có kích thước khoảng 1092 bp nucleotide thứ 56 nằm phía trước ORF1 giao trình tự với ORF1, vùng ORF2 có khả mã hóa cho chuỗi peptide mang 343 amino acid gọi non-structural protein (NS2) Cuối cùng, ORF3 có kích thước khoảng 990 bp giao trình tự với ORF2 (56 nucleotide) mã hóa cho chuỗi peptide chứa 329 amino acid Có protein khác phát từ thể virus IHHN nguyên vẹn chúng có trọng lượng phân tử 74, 47, 39, 37.5 kDa Trong protein có kích thước 47 kDa xác định có nguồn gốc từ ORF3 Có nhiều nghiên cứu đặc tính di truyền chủng IHHNV nhiễm tơm ni công bố giới Chủng IHHNV phân lập từ tôm L stylirostris nuôi siêu thâm canh Hawaii năm 1981 phân lập trình tự gen chúng công bố ngân hàng gen (genbank No AF218226) Sau đó, có nhiều nghiên cứu cho thấy có có type IHHNV bao gồm: IHHNV Type có nguồn gốc Mỹ Đơng Á; IHHNV Type có nguồn gốc từ Đơng Nam Á; IHHNV type 3A có nguồn gốc từ Đơng Phi, Ấn Độ Úc có chiều dài 4655 bp nucleotide (Genbank DQ228358.1) (Krabsetsve ctv., 2004; Tang ctv., 2003); cuối IHHNV type 3B với trình tự vật liệu di truyền dài 2935 bp (Genbank AY123937) có nguồn gốc khu vực western Indo-Pacific bao gồm Madagascar, Mauritius Tanzania (Tang ctv, 2003) Các nhà khoa học Việt Nam giải trình tự gen chủng IHHNV phân lập từ mẫu tôm Cần Thơ, kết cho thấy gen IHHNV từ mẫu nghiên cứu có kích thước 3815 bp, có 50 độ tương đồng cao 98% với chủng IHHNV phân lập Đài Loan, 97% với chủng IHHNV Thái Lan (An ctv., 2009) Tuy nhiên, du nhập tơm bố mẹ từ nhiều nguồn khác nên có đa dạng di truyền chủng IHHNV truyền nhiễm diện ĐBSCL cao Do vậy, việc phân lập IHHNV nhiều chủng giải trình tự cho biết cấu trúc vật liệu di truyền chủng IHHNV Việt Nam mối quan hệ di truyền với chủng giới Qua hiểu rõ đặc tính di truyền đột biến dẫn đến ảnh hưởng độc lực chủng IHHNV tiến hóa di truyền chủng IHHNV phân lập tôm sú nuôi ĐBSCL, để tìm kỹ thuật chẩn đốn phù hợp nhằm phát hiệu bệnh Đây yêu cầu cấp thiết nghiên cứu phịng ngừa bệnh IHHNV cho tơm ni cung cấp thơng tin đặc tính di truyền chúng cho nhà quản lý để kiểm soát lan rộng IHHNV tôm nuôi Việt Nam Trong nghiên cứu này, chúng tơi phân lập giải trình tự di truyền chủng IHHNV phân nhiễm tôm sú ni ĐBSCL Giải trình tự gen IHHNV type lây nhiễm đoạn gen IHHNV type A/B không gây bệnh từ mẫu phân lập tôm nuôi ĐBSCL Đánh giá tương đồng trình tự gen IHHNV type lây nhiễm, type A/B Việt Nam so với trình tự gen IHHNV nước khác công bố genbank II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Địa điểm thời gian thực Đề tài thực phịng thí nghiệm sinh học phân tử thuộc Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường Và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Khảo sát, thu mẫu tôm sú sàng lọc mẫu tôm nhiễm IHHNV Mẫu tôm sú nuôi tỉnh ĐBSCL tất giai đoạn (tơm post, tơm ni thương phẩm TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 7/2013 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN tôm bố mẹ) thu từ cuối tháng 12 năm 2010 đến tháng 11 năm 2011 Tôm sau thu bảo quản cồn 95% chuyển phịng thí nghiệm để làm nguồn vật liệu nghiên cứu Do IHHNV có type lây nhiễm type A/B không lây nhiễm nên sàng lọc mẫu cần sử dụng nhiều cặp mồi khác nghiên cứu, đặc hiệu cho type Dựa vào điều kiện tối ưu chu trình luân nhiệt cặp mồi công bố thiết lập lại phản ứng PCR với hóa chất có phịng thí nghiệm Các mẫu tơm ly trích DNA sàng lọc mẫu tơm có nhiễm IHHNV quy trình PCR chẩn đốn IHHNV type A/B Tang ctv (2007) với cặp mồi MG831F/R, dựa theo công bố tác giả sử dụng cặp mồi MG831F MG831R để thực PCR với điều kiện phản ứng quy trình: tổng thể tích 50 µl hỗn hợp phản ứng PCR, thành phần cho phản ứng sau: 10 µl Buffer Flexi 5X, µl MgCl2 (25 mM), µl dNTP (10 mM) (Promega, Mỹ), 0,5 µl MG831F (50 µM) 0,5 µl MG831R (50 µM), 0,25 µl Go Taq Flexi polymerase U/µl (Promega, Mỹ), thêm H20 khử ion cho đủ 48 µl, µl mẫu DNA Chu kì ln nhiệt cho phản ứng sau: chu kì gồm: 94°C phút; 30 chu kì gồm: 94°C 30 giây, 56°C 45 giây, 72°C 45 giây; chu kì: 72°C phút, 4°C sử dụng Quy trình chẩn đốn IHHNV type lây nhiễm OIE (2009) với cặp mồi IHHNV 77012F/77353R IHHNV 309F/R Quy trình chẩn đốn IHHNV type lây nhiễm với cặp mồi IHHNV 279F/940R Saksmerprome ctv (2010) Các điều kiện phản ứng sau: tổng thể tích 50 µl hỗn hợp phản ứng PCR, thành phần cho phản ứng chu trình luân nhiệt giống với quy trình MG 831F/R sử dụng 0,5 µl cho mồi IHHNV 279F (50 µM) IHHNV 940R (50 µM) Các quy trình ứng dụng để sàng lọc mẫu nhiễm IHHNV typeA/B mẫu tôm sú thu thập ttừ tỉnh ĐBSCL Phương pháp sàng lọc theo bảng Bảng Giả định kết sàng lọc mẫu nhiễm IHHNV type A/B Kết giả định IHHNV 77012F/77353R IHHNV 279F/940R IHHNV 309F/R MG831F/R IHHNV ABF/R Chọn mẫu giải trình tự Mẫu nhiễm IHHNV type lây nhiễm (+) (+) (+) (-) (-) √ Mẫu nhiễm IHHNV type A/B (-) (-) (-) (+) (+) √ Sau phản ứng PCR, chọn mẫu không nhiễm virus IHHN type lây nhiễm (xác nhận âm tính với IHHNV type lây nhiễm phương pháp PCR với với cặp mồi IHHNV 279F/940R IHHNV 77012F/77353R đặc hiệu cho virus IHHN gây bệnh) Sau sử dụng phương pháp PCR với cặp mồi MG831F/MG831R để xác định diện IHHNV type A/B mẫu nghi nhiễm IHHNV type A/B chọn Ngược lại, mẫu DNA thỏa điều kiện sàng lọc nhân dòng giải trình tự Những mẫu nhiễm IHHNV type lây nhiễm (xác nhận dương tính với với cặp mồi IHHNV 279F/940R IHHNV 77012F/77353R) chọn giải trình tự gen cho chủng IHHNV lây nhiễm 2.2.2 Dịng hóa giải trình tự Đối với virus IHHN type A/B TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 7/2013 51 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Khuếch đại đoạn DNA IHHNV type A/B mẫu tôm phương pháp PCR với cặp mồi IHHNV ABF IHHNV ABR (Tang ctv., 2001) với enzyme DNA polymerase Pfu (Invitrogen, Mỹ) để sửa sai trình tổng hợp DNA Sau gắn poly A vào sản phẩm khuếch đại nối với vector pGEM T-easy Vector tái tổ hợp pGEM T-easy-IHHNV type A/B biến nạp vào tế bào vi khuẩn E coli JM 109 Tế bào vi khuẩn mang gen tái tổ hợp nhân sinh tinh Kit Wizard®Plus SV Miniprep DNA purification system (Promega, Mỹ) từ sinh khối nói Vector pGEM T-easy chứa đoạn sản phẩm khuếch đại sau ly trích hóa chất SV Winzad miniprep (Promega, Mỹ) giải trình tự mạch mồi vector pGEM T-easy (thực giải trình tự Cty Nam Khoa) Đối với virus IHHN type lây nhiễm Sau sàng lọc mẫu tơm nhiễm IHHNV quy trình PCR chẩn đốn IHHNV type lây nhiễm OIE (2009) với cặp mồi IHHNV 77012F/77353R, IHHNV 309F/R quy trình Saksmerprome ctv (2010) với cặp mồi IHHNV 279F/940R khẳng định mẫu tôm không nhiễm virus IHHN type A/B cặp mồi MG831F/MG831R Tiến hành gửi mẫu cho công ty Nam Khoa giải trình tự cặp mồi genome walking bảng Phân tích giải trình tự đoạn DNA IHHNV tinh máy 313xl Genetic Anzyzer với kít BigDye® Terminator V3.1 Cycle Sequencing Sau giải trình tự, dùng phần mềm BioEdit nối trình tự lại thành gen hoàn chỉnh Bảng Trình tự cặp mồi để khuếch đại gen IHHNV trình giải trình tự Số thứ tự Tên mồi Trình tự mồi (5’-3’) IHHNV9-5F IHHNV9-696R IHHNV10-643F GCTTCGCAGGAAACCGTTAC GGGTGAGAAGGCTTGGAGAAA AACGCACGAACGAAACTCACT IHHNV10-1297R GGTTTTTCTCTGATGACGAAGGTG IHHNV11-1223F GCGACTGGAAGAGAGTGAGATTG IHHNV11-1870R AGTTGGCTTTGGTTTGACTTTTT IHHNV12-1838F CAACAACAAGAAAAAGTCAAACCA IHHNV12-2520R GGTTGTCTATGATGTCGTCGATTT IHHNV13-2456F CAGCGACGACTTCCTAGGACTC IHHNV13-3107R TGTTGGATTGGGTCTTCATAGTTT IHHNV14-2936F AGACTCTCACATTTACAGACACCCC IHHNV14-3556R GGTAAAAGCTGGATATAATCGGGT IHHNV15-3316F IHHNV15-3830R ATGAGAATGTCACCAATCAAAGG CAGAAACCGTTAACTTAATATGTGA 2.2.3 Phân tích trình tự DNA Trình tự DNA đoạn gen IHHNV type A/B gen IHHNV type lây nhiễm phân lập tỉnh phân tích nhiều phần mềm máy tính trang web, so sánh độ 52 Kích thước khuếch đại 691bp 635bp 627bp 662bp 631bp 600bp 495bp tương đồng chủng phân lập từ ĐBSCL chương trình Clustal W 2.1 phần mềm DNASTAR Lasergene V7.1.0 Để khẳng định trình tự chủng IHHNV phân lập sử dụng chương trình phân tích, so sánh Basic local TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 7/2013 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN alignment search tool (BLAST) (http://www ncbi.nlm.nih.gov) tìm kiếm khung đọc mở mã hóa protein (ORF) gen virus IHHN phân lập chương trình (http://www.ncbi.nlm.nih gov/gorf/gorf.html) Chương trình mã hóa cho trình tự DNA gen thành amino acid giả định ExPASy (http://us.expasy.org) dùng để phân tích tương đồng trình tự amino acid đoạn ORF mã hóa thành protein thu ao tơm sú nuôi ĐBSCL Hai mẫu tôm xác định nhiễm IHHNV type lây nhiễm ao tôm nuôi hai tỉnh Sóc Trăng Kiên Giang Hai mẫu có ký hiệu lần lược ST KG Mẫu tôm nhiễm IHHNV type A xác định ao ni tơm sú Sóc Trăng có kí hiệu 6419 Xác định mối quan hệ tiến hóa di truyền chủng IHHNV phân lập ĐBSCL thu nghiên cứu so sánh với chủng IHHNV khu công bố ngân hàng gen giới So sánh trình tự gen chủng IHHNV phân lập từ tôm sú (P monodon) với nhau, so sánh với gen IHHNV công bố giới (AY124937, DQ228358, AY102034, AY355306, AY355308, AY355307, AY362547, EU675312, GQ411199, AY362548, EF633688, AY218266) III KẾT QUẢ 3.2.1 Xác định mẫu nhiễm IHHNV type A/B 3.1 Thu mẫu sàng lọc mẫu 3.2 Dịng hóa giải trình tự IHHNV type A/B Sau sàng lọc kiểm tra, mẫu tôm nuôi thương phẩm (ký hiệu 6419) Trần Đề, Sóc Trăng cho kết âm tính quy trình PCR chẩn đốn IHHNV type lây nhiễm hình 3.1A cho kết dương tính quy trình chẩn đốn IHHNV type A/B Tang ctv (2007) quy trình PCR với cặp mồi MG 831F/R Kết điện di sản phẩm gel agarose 1,5 %, mẫu tôm sú ni có ký hiệu 6419 Sóc Trăng xuất băng sản phẩm khuếch đại có kích thước đặc trưng cho virus IHHN type A/B (hình 3.1) Chúng tơi tiến hành sàng lọc mẫu Hình 3.1 Kết điện di sàng lọc mẫu không nhiễm virus IHHN type lây nhiễm với quy trình cặp mồi IHHNV 309F/309R, IHHNV 77012F/77353R, IHHNV 279F/940R kết sàng lọc mẫu nhiễm IHHNV type A/B với quy trình cặp mồi MG831F/R, IHHNV ABF/R; giếng 6419: mẫu nghi nhiễm IHHNV type A/B; giếng M: thang DNA 100 bp; giếng (+): mẫu DNA IHHNV type lây nhiễm; giếng (-): mẫu nước cất Qua kết sàng lọc quy trình PCR cơng bố với hóa chất có phịng thí nghiệm, chúng tơi thấy mẫu (có ký hiệu 6419) Sóc Trăng đạt yêu cầu, mẫu chọn để nhân dịng giải trình tự 3.2.2 Dịng hóa giải trình tự Sử dụng cặp mồi IHHNV ABF/R enzyme DNA polymerase Pfu để khuếch đại mẫu kí hiệu 6419 Sau gắn poly A vào sản phẩm khuếch đại Tinh sản phẩm khuếch đại dự đốn từ gel với kích thước 1200 bp Dịng hóa vào vector pGEM T-easy Sản phẩm dịng hóa nhân lên vi khuẩn E coli JM 109 Sau chọn khuẩn lạc tiến TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 7/2013 53 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN hành phản ứng PCR với quy trình sử dụng để khuếch đại DNA ban đầu, nhằm mục đích kiểm tra dòng tế bào E coli JM 109 chứa vector pGEM T-easy-DNA IHHNV type A/B Tách chiết, thu plasmid tái tổ hợp pGEM T-easy-IHHNV type A/B từ dòng tế bào E coli JM 109 nhân dòng Điện di kiểm tra diện plasmid tái tổ hợp pGEM T-easy - IHHNV type A/B dịch tách chiết gel 1% 4215 bp Hình 3.2 Kết điện di kiểm tra plasmid sau tinh M: thang DNA kb; giếng 1: dịch Hình 3.3 Trình tự nucleotide phần gen IHHNV type A từ mẫu phân lập ĐBSCL/Việt Nam Sau giải trình tự, chúng tơi đem phân tích đối chiếu trình tự gen IHHNV type A/B vừa thu nhận với trình tự IHHNV công bố ngân hàng gen chương trình NCBI BLAST Kết phân tích cho thấy trình tự vừa thu nhận chủng IHHNV type A 54 plasmid pGEM T-easy-IHHNV type A/B sau tinh Theo hình 3.2 plasmid sau điện di cho tín hiệu vạch với kích thước tương đương 4215 bp so với thang DNA kb, với kích thước plasmid pGEM T- easy - IHHNV type A/B Vậy chúng tơi tạo dịng thành cơng thu plasmid pGEM T-easy - IHHNV type A/B tinh Plasmid vừa thu nhận giải trình tự máy 3130xl Gennetic Analyzer với kít BigDye®Ternminator v3.1 Cycle Sequencing công ty Nam Khoa (Việt Nam) Kết phân tích giải trình tự đoạn gen chủng IHHNV type A/B tôm sú nuôi ĐBSCL (hình 3.3) 3.3 Giải trình tự phân tích gen IHHNV Mẫu tôm sau sàng lọc PCR với cặp mồi công bố (OIE, 2009; Tang ctv., 2007) để khẳng định mẫu tôm nhiễm IHNNV Mẫu tơm ly trích DNA tổng số gửi cho cơng ty Nam Khoa giải trình tự cặp mồi genome walking Phân tích giải trình tự đoạn DNA IHHNV tinh máy 313xl Genetic Anzyzer với kít TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 7/2013 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN BigDye® Terminator V3.1 Cycle Sequencing Sau giải trình tự dùng phần mềm BioEdit nối trình tự lại thành gen hoàn chỉnh Sử dụng phần mềm DNASTAR Lasergene V7.1.0, với chương trình phân tích đa trình tự MegaAli (Clustalw) Kết phân tích trình tự DNA mẫu IHHNV kí hiệu ST, KG chủng IHHNV phân lập Hawaii genbank AF218266 (hình 3.4 hình 3.5) Cấu trúc gen phân lập chủng IHHNV có kí hiệu ST A (36,27%), G (19,35%), T (20,55%), C (23,82%) A+T (56,83 %), C+G (43,17%) chủng IHHNV có kí hiệu KG A (36,17%), G (19,06%), T (20,87%), C (23,90%) A+T (57,03 %), C+G (42,97%) Hình 3.4 Kết phân tích so sánh trình tự chủng IHHNV phân lập tỉnh ĐBSCL Hình 3.5 Cây di truyền so sách với chủng IHHNV phân lập tỉnh ĐBSCL chủng IHHNV phân lập Hawaii So sánh trình tự gen chủng IHHNV phân lập ĐBSCL với trình tự gen IHHNV phân lập Hawaii (AF28266), hai chủng virus IHHN phân lập ĐBSCL đoạn 79 nucleotide so với gen IHHNV phân lập Hawaii từ vị trí 1-78 nuclotide Tuy nhiên, thay đổi không ảnh hưởng đến q trình mã hóa đến chuỗi amino acid chủng phân lập ĐBSCL Kết phân tích cho thấy chủng virus IHHN phân lập có kí hiệu KG với chủng có kí hiệu ST trình tự tương đồng chủng có độ tương đồng thấp khoảng 96.3%, tương đồng cao so với chủng IHHNV phân lập Hawaii 98.8% Khi phân tích gen chủng IHHNV phân lập có kí hiệu KG, ST cho thấy gen chủng có nhiều nucleotide vị trí gen có khác biệt so với chủng IHHNV phân lập Hawaii Kích thước trình tự xếp vị trí nucleotide chủng IHHNV phân lập từ chủng ĐBSCL cho thấy tương đồng cao với chủng phân lập khu vực khác giới Rõ trình tự nucleotide ORF1 mã hóa cho protein giả định NS1 chiếm lớn đoạn đọc mở ORF, chiếm khoảng 50% gen virus với kích thước khoảng 2001 bp chủng phân lập giới TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 7/2013 55 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN Bảng 2: Trình tự tương đồng nucleotide gen chủng phân lập ĐBSCL với số chủng nước khác giới Phân tích trình tự gen hai chủng phân lập cho thấy, chủng IHHNV có kí hiệu ST có độ tương độ cao 99.4% gần với chủng phân lập Đài Loan A (AY355306), Đài Loan B (AY355306) Thái Lan (AY102034) lên 99.3% Đối với chủng IHHNV kí hiệu KG, trình tự gen chủng khơng tương đồng cao với chủng phân lập có kí hiệu ST (96,2%), so sánh trình tự chủng với chủng khác giới (bảng hình 3.7) chủng có trình tự nucleotide tương đồng cao so với chủng phân lập Hawaii AF218266 (98,8%), Đài Loan C AY355308 (98,7%), Mexico AY273215 (98,6%), Trung Quốc EF633688 (98,6%) Vì vậy, chủng IHHNV lây nhiễm phân lập có kí hiệu KG có quan hệ gần với chủng IHHNV phân lập Hawaii Đài Loan C xa với chủng IHHNV Úc 86,1% (EU675312), Tanzania AY124937 (91,7%), Ấn Độ GQ411199 (93,5%) Úc GQ475529 (94,3%) IV THẢO LUẬN Trình tự gen IHHNV type A/B nhiễm tôm sú nuôi nhiều nhà nghiên cứu phân tích giải trình tự (Tang ctv., 2006) Trên sở chúng tơi tiến hành so sánh trình tự 56 mối quan hệ di truyền IHHNV type A phân lập tơm sú ni ĐBSCL với trình tự IHHNV type lây nhiễm type A/B khu vực type lây nhiễm Ecuador (AY362548), Thái Lan (AY362547), Phúc Kiến-Trung Quốc (EF633688), type B Tanzania (AY124937) type A Úc, Madagascar (DQ228358) Sau so sánh trình tự IHHNV type A phân lập từ ĐBSCL với trình tự IHHNV nước: Ecuador, Thái Lan, Phúc Kiến-Trung Quốc, Tanzania Úc, Madagascar cho thấy trình tự IHHNV type A Việt Nam có tương đồng cao so với trình tự gen IHHNV type A Úc, Madagascar (DQ228358) Tang ctv công bố (2006) Độ tương đồng cao với trình tự IHHNV type A Việt Nam 100% với chủng IHHNV type A phân lập Úc Sự tương đồng cao IHHNV type A Việt Nam có nguồn gốc từ Úc, Châu phi (Madagascar) tơm bố mẹ Việt Nam nhập từ nhiều nước có Úc Châu Phi Trái lại trình tự IHHNV type A Việt Nam có độ tương đồng thấp với trình tự IHHNV type B Tanzania AY124937 86% Ngồi chúng tơi thiết lập di truyền so sánh trình tự IHHNV type A Việt nam với khu vực ngân hàng gen hình 3.6 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 7/2013 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN Hình 3.6 Kết di truyền IHHNV type A từ mẫu phân lập ĐBSCL/VN với chủng Ecuador (AY362548), Thái Lan (AY362547), Phúc Kiến-Trung Quốc (EF633688), Tanzania (AY124937), Úc, Madagascar (DQ228358) Việc xác định diện IHHNV type A Việt Nam, có ý nghĩa to lớn Hình 3.7 Cây di truyền so sách chủng IHHNV phân lập tỉnh ĐBSCL với chủng IHHNV ngân hàng gee giới phần mềm DNASTAR Lasergene V7.1.0 Phân tích trình tự virus IHHN type lây nhiễm nhiễm tôm khu vực khác việc chẩn đoán IHHNV Khuyến cáo trung tâm, phịng thí nghiệm nghiên cứu chẩn đốn IHHNV Việt Nam cần cẩn trọng xét nghiệm loại virus này, để tránh tượng dương tính giả với chủng virus chèn vào genome tơm, chủng virus khơng có gây bệnh tơm (Tang Lightner, 2006) giới cơng bố Nhiều trình tự chủng phân lập có kích thước mức độ tương đồng chủng khác Các chủng virus khu vực đa dạng, biến đổi theo thời gian vị trí địa lý khác (Rai ctv., 2013) Cấu trúc trình tự genome IHHNV TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 7/2013 57 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN kí hiệu ST so với chủng IHHNV phân lập Thái Lan Đài Loan có độ tương đồng cao lên đến 99,3% Tuy nhiên chủng IHHNV có kí KG có trình tự lại tương đồng cao với chủng IHHNV phân lập Hawaii 98%, so với chủng IHHNV Mexico, Đài Loan C Ecuador 95% Theo nghiên cứu trước, Rai ctv (2011), hầu hết chủng IHHNV lây nhiễm có khung đọc mở mã hóa cho protein ORF (open reading frame): ORF1 mã hóa cho protein giả định (NS1) có kích thước khoảng 2001 bp, đoạn ORF2 mã hóa cho protein giả định (NS2) có kích thước khoảng 1092 bp ORF3 mã hóa cho protein vỏ virus (VP) có kích thước khoảng 990 bp Ở chủng IHHNV có kí hiệu ST KG có vùng đọc mở mã hóa protein (OFR1, OFR2 OFR3) ORF1 vị trí 570-2570 có kích thước 2001 bp mã hóa cho protein NS1, vùng mã hóa cho protein NS2 ORF2 vị trí 5141605 nucleotide có kích thước 1092 bp, mã hóa cho protein vỏ ORF3 có vị trí 2512-501 nucleotide có kích thước 990 bp So sánh trình tự đoạn ORF1 chủng kí hiệu KG với chủng khác độ tương đồng cao với chủng IHHNV Hawaii, Đài Loan A, Đài Loan C Ecuador (99,5%), tỷ lệ tương đồng thấp chủng IHHNV Madagasca (87,2%), Tanzania (92,3%) Úc (GQ411199, 94,8%), tỷ lệ tương đồng so với chủng IHHNV phân lập ĐBSCL Ấn Độ (≥ 96,3%) Kết tương đương với trình tự amino aicd, tương đồng cao với chủng Hawaii (98,8%), Đài Loan A, C Ecuador (98,5%) Mặc dù tỷ lệ nucleotide chủng Ấn Độ chủng có tỷ lệ trung bình cao (96,3%), trình tự amino acid tương đồng thấp (91,3%), ngược lại chủng IHHNV phân lập Úc có trình tự nucleotide tương đồng thấp (94,8%) có trình tự amino acid cao (95,9%) Kết cho thấy, chủng có khác biệt độc lực biến đổi trình tự nucleotide dẫn đến khác biệt mã hóa amino acid cấu trúc virus Đặc biệt, khác biệt rõ rệt vị trí đọc mở ORF1 chủng phân lập tơm sú ĐBSCL, chủng kí hiệu KG đoạn OFR1 mã hóa amino acid (ATG) vị trí 514 nt gen đoạn OFR1 mã hóa amino acid (ATG) vị trí 570 nt chủng kí hiệu ST Nếu đột biến nhiều dẫn đế thay đổi tổng hợp amino acid dẫn đến tượng đột biến chủng tính độc lực biến đổi theo (Tang Lightner., 2002) Vì khác biệt dẫn đến độc lực lây nhiễm hai chủng IHHNV có kí hiệu ST KG khác Khi so sánh trình tự gen chủng IHHNV kí hiệu KG với chủng IHHNV khác giới cho thấy độ tương đồng cao chủng phân lập Hawaii, Mỹ (AF28266) lên đến 98,8 %, chủng phân lập Mexico (AF273215), Trung Quốc (EF633688) 98,6% xa với chủng Úc type A (86,1%), Tanzania type A 91,7% Bảng 3: So sánh trình tự nucleotide đoạn mã hóa cho protein virus IHHN phân lập ĐBSCL với chủng giới 58 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 7/2013 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN Chủng virus IHHN phân lập có kí hiệu ST, kích thước khoảng 3824 bp Chủng tương đồng cao, với A+T toàn gen 56,82% tương tự virus IHHN phân lập Thái Lan (AY102034) 56,9 % Chủng IHHNV phân lập có kí hiệu ST có trình tự tương đồng cao với chủng IHHNV Thái Lan (AY102034), Đài Loan A (AY355306) Chủng IHHNV phân lập có kí hiệu ST có trình tự ORF1 tương đồng cao với chủng IHHNV Thái Lan (AY102034) 99,8%, Đài Loan B (AY355307) 99,8% chủng IHHNV phân lập Kiên Giang có kí hiệu KG 96,5% ORF1 chủng mã hóa cho protein giả định NS1 có vị trí (570-2570 nucleotide), chiều dài đoạn protein khoảng 666 amino acid với mã khởi động ATG vị trí 570 nucleotide gen mã kết thúc TAA vị trí 2570, có trọng lượng phân tử 75,8 kDa Đoạn ORF2 có vị trí (514-1605 nt) mã hóa cho protein NS2 với khoảng 363 amino acid có trọng lượng phân tử 42,1 kDa, trình tự vùng mã hóa tương đồng cao với chủng Thái Lan 2000, Đài Loan B (99,9%) ORF3 mã hóa protein vỏ virus có vị trí gen (25123501 nucleotide) với chiều dài 990 bp mã hóa cho protein 329 amino acid Trình tự tương đồng đoạn ORF3 so với chủng giới Đài Loan B, Thái Lan (99,5%) Kết cho thấy chủng phân lập IHHNV kí hiệu TG chủng phân lập ST chủng chủng có họ hàng gần với chủng phân lập Đài Loan B, Thái Lan 2000 V KẾT LUẬN Trong nghiên cứu này, xác định chủng virus IHHN type A diện Việt Nam, trình tự chủng phân lập phân tích đoạn gen cho thấy chủng có độ tương đồng cao với chủng IHHNV type A Madagascar Úc (100%) Phân lập gen chủng IHHNV type lây nhiễm tôm sú nuôi tỉnh ĐBSCL thành cơng việc giải hồn tồn trình tự gen chủng virus Phân tích trình tự cho thấy chủng IHHNV phân lập có kí hiệu ST có độ tương đồng cao lên đến 99,7% có họ hàng gần với chủng IHHNV phân lập Đài Loan A, B Thái Lan Chủng IHHNV phân lập có kí hiệu KG có trình tự họ hàng gần với chủng Hawaii, Mexico, Đài Loan C Ecuador, độ tương đồng gen 95%.Trong nghiên cứu khẳng định diện IHHNV type A gắn vào genome tôm sú diện IHHNV type lây nhiễm (1 2) tơm sú ni ĐBSCL Trình tự genome hai chủng IHHNV phân lập ĐBSCL có kí hiệu ST KG đăng kí ngân hàng gen với mã số KC513422 JX84006 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bonami JR, Trumper B, Mari J, Brehelin M, Lightner DV, 1990 Purification and characterization of the infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus of penaeid shrimps J Gen Virol 71, 2657-2664 Flegel TW, 2006 Detection of major penaeid shrimp viruses in Asia, a historical perspective with emphasis on Thailand Aquaculture 258, 1-33 Krabsetsve K, Cullen BR, Owens L, 2004 Rediscovery of the Australian strain of infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus Dis Aquat Organ 61, 153-158 Lightner DV, Redman RM, and Bell TA, 1983 Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis, a newly recognized virus disease of penaeid shrimp J Invertebr Pathol 42, 62-70 Nunan L, Poulos BT, Lightner DV, 2000 Use of polymerase chain reaction for the detection of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus in penaeid shrimp Mar Biotechnol (4), 319-328 OIE, 2009 Diagnostic Manual for Aquatic Animal Diseases 6th Edition Office International des Epizooties (OIE), Paris Chapter 2.2.2 Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis, pp 7895 Phạm Đặng Thiên An, Phạm Văn Hùng, Hoàng Hiếu Ngọc, Phạm Hùng Vân, 2009 Giải trình tự gen infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus gây bệnh hoại tử tôm Y học thành phố Hồ Chí Minh, 13 (2), 129-137 Rai P, Safeena M.P, Karunasagar I, Karunasagar I, TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 7/2013 59 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2011 Complete nucleic acid sequence of Penaeus stylirostris densovirus (PstDNV) from India Virus Research 158, 37-45 Rai P, Safeena MP, Karunasagar I, Karunasagar I, 2009 Simultaneous presence of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) and Type A virus-related sequence in Penaeus monodon from India Aquaculture, 295, 168-174 Rai P, Pradeep B, Safeena MP., Krabsetsve K, La Fauce K, Owens L and Karunasagar I, 2013 Genomics, molecular epidemiology and diagnostics of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus Indian Journal of Virology, 23 (2), pp 203-214 Saksmerprome V, Puiprom O, Noonin C, Flegel TW, 2010 Detection of infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus (IHHNV) in farmed Australian Penaeus monodon by PCR analysis and DNA sequencing Aquaculture 298, 190-193 Shike H, Dhar AK, Burns JC, Shimizu C, Jousset FX, Klimpel KR, Bergoin M, 2000 Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus of shrimp is related to mosquito brevidensoviruses Virology 277, 167-177 Sukhumsirichart W, Attasart P, Boonsaeng V, Panyim S., 2006 Complete nucleotide sequence and genomic organization of hepatopancreatic parvovirus (HPV) of Penaeus monodon Virology 346, 266 - 277 Tang KFJ and Lightner DV, 2002 Low sequence variation among isolates of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) originating from Hawaii and the Americas Dis Aquat Org 49, 93-97 Tang KFJ and Lightner DV, 2006 Infectious hypodermal and hernatopoietic necrosis virus (IHHNV)-related sequences in the genome of the black tiger prawn Penaeus monodon from Africa and Australia Virus Research, 118, 185-191 Tang KFJ, Navarro SA and Lightner DV, 2007 A PCR assay for discriminating between infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) and the virus-related sequences in the genome of Penaeus monodon Dis Aquat Org 74, 165-170 Tang KFJ, Poulos BT, Wang J, Redman RM, Shih HH, Lightner DV, 2003 Geographic variations among infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) isolates and characteristics of their infection Dis Aquat Organ 53, 91-99 Website: http://www.ncbi.nlm.nih.gov http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html http://us.expasy.org SEQUENCE AND CHARACTERISTIC OF INFECTIOUS HYPODERMAL AND HEMATOPOIETIC NECROSIS VIRUS (IHHNV) ISOLATED FROM THE CULTURED BLACK TIGER SHRIMP (Peneaus monondon) IN MEKONG DELTA Cao Thanh Trung1, Nguyen Thị Kim My2 and Pham Hung Van3 ABSTRACT Genetic IHHNV genome of variants has been charateristed in different geographical areas in the word In this study, analyzing and sequencing of IHHNV were isolated in the black tiger shrim in Mekong Delta The type A IHHNV-related sequence has been detected in cultured P monodon in Mekong Delta An amplified 1200 fragment of type A IHHNV-related sequence is highest identity with type A IHHNV-related sequence isolated shrimp from Australia and Madagasca (100%) For type IHHNV infection, the infectious IHHNV strain isolated from the shrimps in Kieng Giang province was designated IHHNV-KG and the strain isolated from postlarve shrimp in the Soc Trang was designated IHHNV-TS Used overlapping PCR primers to amplify all of the IHHNV genome 60 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 7/2013 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN from the Mekong Delta samples to sequence were analized Comparison of IHHNV-KG sequence with GenBank records of IHHNV isolates Comparing the genomes of IHHNV infected in P monodon in Mekong Delta with the genome of IHHNV of Hawaii that were lost a 79 nucleotides However, it did not impact to open reading frame (ORFs) coding protein of virus The IHHNV-KG strain was found that it had more 95% identity to sequences of infectious IHHNV from American, Mexico, Taiwan C and Ecuador Other infectious IHHNV-ST, it had a low similar sequence with IHHNV-KG, but it had a high sequence identity with the infectious IHHNV from Taiwan A, B and Thailand The size genome of two IHHNV strains isolated from Mekong Delta is 3825 bp In this study, the IHHNV-related sequence and infectious IHHNV were detected in the cultured P monodon in Mekong Delta Key words: Mekong Delta, Peneus monodon, Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) Người phản biện: ThS Nguyễn Thị Hiền Ngày nhận bài: 6/6/2013 Ngày thông qua phản biện: 6/7/2013 Ngày duyệt đăng: 8/7/2013 Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment & Epidemic - Research Institute for Aquaculture No.2 Email: thanhtrung77@yahoo.com Faculty of Biology – Ho Chi Minh city University of Science, 227 Nguyen Van Cu st, District 5, Ho Chi Minh City, Vietnam Nam khoa Biotech Company, 793/58 Tran Xuan Soan st - Tân Hưng ward, distric 7, Ho Chi Minh City, Vietnam TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THAÙNG 7/2013 61 ... với chủng IHHNV phân lập tỉnh ĐBSCL chủng IHHNV phân lập Hawaii So sánh trình tự gen chủng IHHNV phân lập ĐBSCL với trình tự gen IHHNV phân lập Hawaii (AF28266), hai chủng virus IHHN phân lập. .. dạng di truyền chủng IHHNV truyền nhiễm di? ??n ĐBSCL cao Do vậy, việc phân lập IHHNV nhiều chủng giải trình tự cho biết cấu trúc vật liệu di truyền chủng IHHNV Việt Nam mối quan hệ di truyền với chủng. .. hệ di truyền với chủng giới Qua hiểu rõ đặc tính di truyền đột biến dẫn đến ảnh hưởng độc lực chủng IHHNV tiến hóa di truyền chủng IHHNV phân lập tôm sú nuôi ĐBSCL, để tìm kỹ thuật chẩn đốn phù