Công nghệ sinh học được ứng dụng nhiều trong nuôi trồng thủy sản nói chung và trong chẩn đoán tác nhân gây bệnh thủy sản nói riêng. Bài viết này giới thiệu ứng dụng công nghệ sinh học trong chẩn đoán ký sinh trùng truyền lây qua cá, cụ thể là sán lá ruột nhỏ Haplorchis thường ký sinh ở ruột non của người và động vật ăn cá nhiễm ấu trùng sán chưa được xử lý triệt để.
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN ỨNG DỤNG CƠNG NGHỆ SINH HỌC TRONG CHẨN ĐỐN KÝ SINH TRÙNG TRUYỀN LÂY QUA CÁ Kim Văn Vạn1* TĨM TẮT Cơng nghệ sinh học ứng dụng nhiều nuôi trồng thủy sản nói chung chẩn đốn tác nhân gây bệnh thủy sản nói riêng Bài viết giới thiệu ứng dụng cơng nghệ sinh học chẩn đốn ký sinh trùng truyền lây qua cá, cụ thể sán ruột nhỏ Haplorchis thường ký sinh ruột non người động vật ăn cá nhiễm ấu trùng sán chưa xử lý triệt để Do trứng, ấu trùng sán trưởng thành có kích thước nhỏ, hình dạng giống số lồi sán khác nên dễ chẩn đoán nhận dạng nhầm Một phương pháp sinh học phân tử lần áp dụng Việt Nam nhằm xác định sán ruột nhỏ bao gồm H taichui H pumilio dựa phản ứng PCR gen ITS-2 với mồi xuôi 3SF: 5’-GGTACCGGTGGATCACTCGGCTCGTG-3’ mồi ngược BD2R: 5’-TATGCTTAAATTCAGCGGGT-3’), sử dụng chung cho loài sán nhiệt độ bám mồi 50oC, giải trình trình tự phân tích gen Nguồn mẫu dùng cho nghiên cứu gồm sán trưởng thành ký sinh người ấu trùng metacercaria ký sinh cá thu Nam Định (Việt Nam) Bangkok (Thái Lan) Chuỗi gen ITS-2 thu có độ dài 290 bp H pumilio 446 bp H taichui Trình tự xếp nucleotide gen ITS-2 H taichui chênh lệch so với H pumilio đoạn gen có độ dài 154 nucleotide chèn vào từ nucleotide thứ 198 đến 352 Có tương đồng cao (99100%) gen ITS-2 mẫu sán Việt Nam mẫu sán Thái Lan nghiên cứu Từ khóa: Haplorchis spp, H pumilio, H taichui, PCR, tương đồng I ĐẶT VẤN ĐỀ Nuôi trồng thủy sản thâm canh phát triển kéo theo nhiều dịch bệnh xảy ra, nhiều bệnh khó chẩn đốn Đặc biệt phương pháp chẩn đốn bệnh nhanh xác cần thiết Ứng dụng công nghệ sinh học, đặc biệt ứng dụng PCR cho kết chẩn đoán nhanh xác tác nhân gây bệnh cho động vật thủy sản xu hướng (Kim Văn Vạn ctv., 2007a, Kim Văn Vạn ctv., 2007b, Kim Văn Vạn ctv., 2007c; Kim Van Van Dinh Thi Thuy, 2008; Kim Văn Vạn ctv., 2009) Trong bệnh ký sinh trùng truyền lây qua cá, bệnh sán gan nhỏ nguy hiểm người gia súc, chúng gây tổn hại gan ống mật chí gây ung thư gan Trong bệnh sán ruột nhỏ gây nguy hiểm nhiều Nhưng phương pháp chẩn đoán bệnh truyền thống để phân biệt sán ruột nhỏ sán gan nhỏ giai đoạn phát triển vòng đời trứng, ấu trùng (redia, cercaria, metacercaria), sán trưởng thành chủ yếu phân biệt hình thái Rất nhiều giai đoạn vịng đời hình thái lồi sán giống khó phân biệt cụ thể phương pháp hình thái học (Tesana ctv., 1991) Học viện Nơng nghiệp Việt Nam *Email: kvvan@vnua.edu.vn 56 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 8/2015 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Trong tế bào thể động vật tồn hệ gen: hệ gen nhân tế bào hệ gen ty thể, hai hệ gen hoạt động có tính chất vừa độc lập vừa tương tác hệ gen ty thể chịu ảnh hưởng điều hòa hệ gen nhân tế bào Hệ gen nhân tế bào có hệ số đột biến thấp hệ gen ty thể Bất kể thay đổi gen dẫn đến biến đổi hệ gen có tính chất đặc trưng loài Hệ gen nhân chiều hướng bảo tồn cao có giá trị giám định Trong nhân tế bào có nhóm gen quan trọng 5,8S; 18S; 28S vùng nucleotide nối gen ITS1 ITS-2 (Internal transcribed spacer) dùng phân tích phân loại (Le Thanh Hoa ctv., 2002) (Hình 1) Nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tử bệnh ký sinh trùng truyền lây nhằm khắc phục tồn phương pháp nghiên cứu cổ truyền hướng quan tâm nhiều năm qua nước ta Mặc dù có số nghiên cứu sinh học phân tử giám định phân loại phả hệ dịch tễ học phân tử số sán lá, sán dây Việt Nam, sán ruột nhỏ Haplorchis, nay, nghiên cứu đề cập đến Với giúp đỡ dự án FIBOZOPA (Fishborne Zoonotic Parasites: Dự án ký sinh trùng truyền lây động vật thủy sinh, động vật cạn kể người) tạo điều kiện cho thực xác định, thẩm định loài phân biệt chúng với lồi sán khác Trong báo này, chúng tơi chủ yếu tập trung vào gen ITS-2 nhằm mục đích giám định phân tử loài sán ruột nhỏ nói trên, so sánh đặc điểm gen loài sán truyền lây cá - động vật cạn xây dựng phả hệ tìm mối liên quan sán ruột nhỏ Haplorchis với loài sán truyền lây khác II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Mẫu nguồn gốc mẫu Mẫu sán ruột nhỏ trưởng thành ấu trùng (metacercariae) Haplorchis đối tác tham gia dự án FIBOZOPA cung cấp: Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng Trung ương (NIMPE), Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản (RIA1) Nguồn mẫu thu từ người nhiễm sán ruột nhỏ cá nhiễm ấu trùng sán ruột nhỏ vùng Nam Định (Bảng 1) Mẫu sán (cả ấu trùng sán trưởng thành sán ruột nhỏ Haplorchis taichui H pumilio) xác định hình thái chuẩn khoa Ký sinh trùng, trường Đại học Mahidol, Bangkok, Thái Lan (TS Jitra Waikagul) cung cấp Mẫu sán ấu trùng sán lưu giữ cồn 70o bảo quản lạnh sử dụng Hình Vùng gen ribosom hệ gen nhân tế bào (18S-5,8S-28S) điểm bám mồi (3SF-BD2R) nhân đoạn gen ITS-2 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 8/2015 57 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Bảng Danh sách mẫu, nguồn gốc mẫu nghiên cứu nguồn gen tham khảo Loài sán Ký hiệu mẫu Loại mẫu (ADN) Sán trưởng thành Metacercaria Metacercaria H pumilio Hpu (TL1) H pumilio Haplorchis sp H pumilio Haplorchis sp HpM (TL) HspMND (VN) Hpu (AY245706) HspND(VN) Haplorchis sp HspNDV(VN) H taichui Hta(TL1) Haplorchis sp H taichui HspMND2(VN) Hta(AY245705) O viverrini Ovi(AY584735) O viverrini C sinensis Ovi(TL1) Csi(SKR) Ký chủ Nguồn gen ITS-2 Thái Lan Người Ando ctv., 2001 Thái Lan Việt Nam Cá Cá Việt Nam Người Nghiên cứu Nghiên cứu Dzikowski ctv., 2004; AY245706 Nghiên cứu Việt Nam Người Nghiên cứu Sán trưởng thành Sán trưởng thành Sán trưởng thành Metacercaria Thái Lan Người Ando ctv., 2001 Việt Nam Cá Sán + ấu trùng Thái Lan Người Nghiên cứu Dzikowski ctv., 2004; AY245705 Sanath ctv., 2004; AY584735 Ando ctv., 2001 Lee ctv., 1999; AF217095 2.2 Phân tích ITS-2 Q độ dài gen ITS2 290 bp 3.3 Sự tương đồng nucleotide gen ITS-2 Mức độ tương đồng nucleotide thể Bảng TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 8/2015 59 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Hình So sánh trình tự nucleotide gen ITS-2 mẫu sán ruột nhỏ Haplorchis Việt Nam, Thái Lan sán gan nhỏ (Clonorchis sinensis; Opisthorchis viverrini) Ghi chú: Sai khác trình tự chủng so với Hpu (TL1) biểu thị ký hiệu nucleotide chúng; dấu (.) biểu thị giống nhau; dấu (-) khơng có nucleotide tương ứng 60 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 8/2015 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Bảng Sự tương đồng nucleotide gen ITS-2 số loài sán truyền lây qua cá Ghi chú: 1: Hpu (TL1); 2: HpuM (TL); 3: Hpu (AY245706); 4: HspMND (VN); 5: HspND (VN); 6: HspNDV (VN); 7: Hta (TL1); 8: Hta (TL); 9: HspMND2 (VN); 10: Hta (AY245705); 11: Ovi (AY584735); 12: Ovi (TL1); 13: Csi (SKR) IV THẢO LUẬN Từ kết giải trình tự gen cho thấy có sai khác độ dài gen ITS-2 H taichui H pumilio Đối với H taichui, gen ITS2 có độ dài 445-446 bp mẫu sán H pumilio 290 bp Gen ITS-2 H taichui dài H pumilio có đoạn 154 nucleotide từ nucleotide thứ 198 đến nucleotide 352 chèn vào Sự sai khác nhiều trình tự xếp nucleotide H taichui H pumilio chủ yếu xảy vị trí sau đoạn chèn, cịn vị trí trước đoạn chèn có tương đồng lớn Các mẫu sán ruột nhỏ ấu trùng chúng thu từ người cá Việt Nam bao gồm mẫu HspMND2 (VN) có độ dài gen ITS-2 446 bp, tương đương ITS-2 H taichui; mẫu HspMND (VN) có độ dài gen ITS-2 290 bp, tương đương gen ITS-2 H pumilio So sánh mẫu sán ấu trùng thu Việt Nam với H taichui H pumilio Thái Lan so sánh với số sán truyền lây khác sán gan nhỏ (C sinensis O viverrini) mức độ tương đồng nucleotide cho thấy mẫu H pumilio ((HpuM (TL) nguồn gốc từ Thái Lan) phân tích nghiên cứu mẫu Ando ctv., (2001) (từ Thái Lan) có tương đồng nucleotide gen ITS-2 96% mẫu HspMND (VN) với mẫu H pumilio TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 8/2015 61 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Thái Lan nghiên cứu HpuM (TL) mẫu phân tích Ando ctv., (2001) có tương đồng nucleotide tương ứng 99 96% Trong tương đồng nucleotide mẫu H pumilio Thái Lan mẫu HspMND (VN) so với Hpu (AY245706) từ Ngân hàng gen đạt 94% Mức độ tương đồng nucleotide mẫu (1-4) đạt tỷ lệ tương đối cao (94-99%) tỷ lệ phản ánh tương đồng thường thấy lồi Như kết luận mẫu HspMND (VN) Việt Nam H pumilio Đối với mẫu H taichui có nguồn gốc Thái Lan nghiên cứu Hta (TL) với mẫu Hta (TL1) nghiên cứu Ando ctv., (2001) cho thấy có tương đồng nucleotide 99% Trong mẫu HspMND2 (VN) có tương đồng cao từ 99-100% so với mẫu H taichui Thái Lan có tương đồng thấp với mẫu H pumilio đạt từ 52-54%, mức độ tương đồng thường thấy lồi khác Vì kết luận mẫu HspMND2 (VN) Việt Nam H taichui Đối với mẫu ký hiệu HspNDV (VN) phân tích tương đồng nucleotide vùng gen ITS-2 cho thấy tương đồng tuyệt đối 100% so với O viverrini từ Ngân hàng gen Le Thanh Hoa ctv., (2003) cho sán gan nhỏ O viverrini chủ yếu phân bố vùng Nam Trung phía Nam, mẫu HspNDV (VN) chúng tơi phân tích lại tìm thấy vùng Nam Định Điều cho thấy cần thiết có nghiên cứu bổ sung nguồn gốc để có kết luận chắn Trình tự gen ITS-2 Hta (AY245705) thu thập từ Ngân hàng gen đem so sánh với mẫu nghiên cứu mẫu tham khảo khác cho thấy có tỷ lệ tương đồng thấp (45%) với nhóm H taichui 54-68% với nhóm H pumilio Vậy chắn trình tự Ngân hàng gen khơng với H taichui 62 V KẾT LUẬN Kết giải trình tự gen ITS2 sán ruột nhỏ Haplorchis spp giai đoạn cercariae, metacercariae sán trưởng thành thu từ ốc, cá, chó mèo, người Nam Định, Nghệ An Việt Nam vùng Đông Bắc Thái Lan cho thấy có sai khác độ dài đoạn gen ITS2 sán ruột nhỏ loài H taichui H pumilio Đối với H taichui, gen ITS2 có độ dài 445 - 446 bp cịn mẫu sán H pumilio 290 bp Giữa loài sán ruột nhỏ H taichui H pumilio có sai khác độ dài trật tự gen ITS-2 thể chèn đoạn gen 154 nucleotide, làm cho đoạn gen ITS-2 H taichui dài đoạn gen ITS-2 H pumilio Có sai khác trình tự nucleotide gen ITS-2 H pumilio mẫu sán Việt Nam mẫu sán Thái Lan nghiên cứu (tương đồng đạt 99%) có sai khác không đáng kể mẫu sán Thái Lan nghiên cứu với mẫu sán Thái Lan nghiên cứu tác giả khác Có giống hồn tồn trình tự xếp nucleotide gen ITS-2 H taichui mẫu sán Việt Nam mẫu sán Thái Lan nghiên cứu giống gần tuyệt mẫu sán Thái Lan tác giả Ando ctv., (2001) Nghiên cứu giúp rút ngắn nghiên cứu vòng đời sán ruột nhỏ nói riêng sán song chủ nói chung TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Kim Văn Vạn, Lê Thanh Hịa, Nguyễn Thị Bích Nga, Nguyễn Thị Tuyết Nhung Anders Dalgaard, 2007a Phân biệt sán ruột nhỏ Haplorchis taichui H pumilio với loài sán khác sử dụng thị ITS-2 (internal transcribed spacer) Tạp chí Khoa học kỹ thuật nơng nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Tập V số 1/2007 NXB Nơng nghiệp, Trang 36-43 ISSN: 1895-0004 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 8/2015 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Kim Văn Vạn, Lê Thanh Hịa, Nguyễn Văn Đề, Nguyễn Thị Bích Nga, Nguyễn Thị Tuyết Nhung Anders Dalgaard, 2007b Giám định sán ruột nhỏ Haplorchis taichui H pumilio sử dụng thị ITS-2 (internal transcribed spacer) Y học thành phố Hồ Chí Minh Chuyên đề ký sinh trùng, Trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Tập 11 *Phụ số 2* 2007 Trang 104-110 Kim Văn Vạn, Lê Thanh Hòa, Nguyễn Văn Đề Anders Dalgaard, 2007c Ứng dụng sinh học phân tử xác định giai đoạn phát triển sán truyền lây qua cá từ ký chủ vòng đời Hội nghị chuyên đề chào mừng 105 năm thành lập trường ĐH Y Hà Nội: “Y-sinh học phân tử ứng dụng ngành ký sinh trùng” Trường Đại học Y Hà Nội Trang 84-91 Tài liệu tiếng Anh Ando, K., Sathithaworn, P., Nuchjungreed, C., Tesana, S., Srisawangwong, T., Limviroj, W., and Chinzei, Y., 2001 Nucleotide sequence of mitochondrial CO I and ribosomal ITS-2 genes of Opisthochis viverrini in Northeast Thailand Southeast Asian J Trop Med Public Health 2001; 32: 17-22 Bowles, J., Blair, D., McManus, D.P., 1995 A molecular phylogeny of the human schistosomes Mol Phylogenet Evol 4: 103109 Dzikowski, R., Levy, M.G., Poore, M F., Flowers, J R., and Paperna, I., 2004 Use of rDNA polymorphism for identification of Heterophyidae infecting freshwater fishes Dis Aquat Org 2004; 59: 35-41 Kim Van Van and Dinh Thi Thuy, 2008 Comparison of Diagnostic Methods for the Detection of Parasites in Fish Journal of Science and Development Hanoi University of Agriculture Special Issue April 2008 Agricultural Publishing House, Pages 136144 ISSN: 1895-0004 Kim Van Van, Anders Dalgaard, David Blair and Thanh Hoa Le, 2009 Haplorchis pumilio & H taichui in Vietnam discriminated using ITS-2 DNA Se quence data from adults and larvae Experimental Parasitology 123 Issue 2, October, 2009 Pages 141-151 ISSN 0014-4894 Kumar, S., Tamura, K., Nei, M., 2004 MEGA3: Integrated Software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and Sequence Alignment Briefings in Bioinformatics 5, 150-163 Le, T.H., N.V., Chuong, N.V., De, P Sithitharworn, N.B., Nga, T.N., Trung, L.K., Thuan, 2003 Report on molecular analysis of Opisthorchis viverrini collected from Phu Yen province Proceedings of National Conference on Molecular Biology and Biochemistry, Hanoi (22-24.10.2003) Le, T.H., Blair, D., and McManus, D.P., 2002 Mitochondrial genomes of parasitic flatworms Trends Parasitol, 18: 206-213 Nicholas, K.B., and H.B., Nicholas, 1999 GeneDoc: a tool for editting and annotating multiple sequence alignments Distributed by authors Tesana, S., Srisawangwonk, T., Kaekes, S., Sithithaworn, P., Kanla, P., Arunyanart, C., 1991 Egg shell morphology of the small eggs of human trematodes in Thailand Southeast Asian J Trop Med Public Health 1991; 22: 631-6 LỜI CẢM ƠN Tác giả gửi lời cảm ơn Tổ chức DANIDA dự án FIBOZOPA cung cấp kinh phí tạo điều kiện thuận lợi cho nghiên cứu TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 8/2015 63 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN APPLIED BIOLOGY TECHNOLOGY IN DIAGNOSIS PARASITE TRANSMIT VIA FISH Kim Van Van1* ABSTRACT Biotechnology was applied in general aquaculture and special diagnostic aquaculture pathogents This paper will introduce applying biotechnology in zoonotic parasitological diagnostics as small intestine fluke: Haplorchis spp are tiny trematodes to be found in the small intestines of various definitive hosts such as human, birds, cats, dogs and rats Human and other definitive hosts are infected by eating raw freshwater fishes containing encysted metacercariae Haplorchis spp is not easy to discriminate from other trematodes due to their minute size, similar morphology of eggs, cercaria, metacercaria and adult worm A molecular method, for the first time in Vietnam, was applied to identify H pumilio and H taichui based on amplification of ITS-2 using forward primer, 3SF: 5’-GGTACCGGTGGATCACTCGGCTCGTG-3’ and reverse primer BD2R: 5’-TATGCTTAAATTCAGCGGGT-3-BD2R) with annealing at 50oC in the polymerase chain reaction (PCR) and sequencing for analyzing the nucleotide composition Samples including adult worm and metacercariae were collected on human and fish in Nam Dinh (Vietnam) and Bangkok (Thailand) Length of ITS2 specific for H taichui is 446bp; and for H pumilio is 290bp ITS-2 sequence in H taichui longer than that in H pumilio is due to the insertion of 154 nucleotides between nucleotide 198 and 352 There was high identity rate of nucleotides (99100%) in the ITS-2 gene between Vietnamese and Thai H taichui or H pumilii respectively Keywords: Haplorchis spp, H taichui, H pumilio, PCR, identity Người phản biện: TS Đinh Thị Thủy Ngày nhận bài: 29/5/2015 Ngày thông qua phản biện: 03/8/2015 Ngày duyệt đăng: 07/8/2015 Vietnam National University of Agriculture *Email: kvvan@vnua.edu.vn 64 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THAÙNG 8/2015 ... Nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tử bệnh ký sinh trùng truyền lây nhằm khắc phục tồn phương pháp nghiên cứu cổ truyền hướng quan tâm nhiều năm qua nước ta Mặc dù có số nghiên cứu sinh học phân..., 2007c Ứng dụng sinh học phân tử xác định giai đoạn phát triển sán truyền lây qua cá từ ký chủ vòng đời Hội nghị chuyên đề chào mừng 105 năm thành lập trường ĐH Y Hà Nội: “Y -sinh học phân tử ứng dụn... nhỏ nói trên, so sánh đặc điểm gen loài sán truyền lây cá - động vật cạn xây dựng phả hệ tìm mối liên quan sán ruột nhỏ Haplorchis với loài sán truyền lây khác II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Mẫu