(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu phân loại nấm men moniliella phân lập tại việt nam 07

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Đinh Đức Hiền NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI NẤM MEN MONILIELLA PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Đinh Đức Hiền NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI NẤM MEN MONILIELLA PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Vũ Nguyên Thành PGS TS Bùi Thị Việt Hà `Lời cảm ơn Lời cảm ơn Hà Nội – 2014 Lời cảm ơn Lời em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Vũ Nguyên Thành PGS TS Bùi Thị Việt Hà - người thầy ln tận tình hướng dẫn, bảo, tạo điều kiện giúp em thực luận văn Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể cán Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp - Viện Công nghiệp Thực phẩm giúp đỡ, tạo điều kiện, hỗ trợ kỹ thuật, chia sẻ tài liệu kinh nghiệm nghiên cứu Qua đây, em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên tận tình truyền đạt kiến thức cho em suốt thời gian sinh viên học viên cao học Cuối cùng, em xin dành lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân bạn bè người ln động viên, khích lệ em đường học tập, nghiên cứu khoa học Hà Nội, ngày 25 tháng 11 năm 2014 Học viên Đinh Đức Hiền DANH MỤC HÌNH Hình Hình thái tế bào đặc trƣng Phaeococcus catenatus CBS 650 76 Hình Hình ảnh tế bào Exophiala salmonis CBS 157.67 Hình Hình ảnh tế bào Aureobasidium pullulans Hình Hình ảnh tế bào Moniliella suaveolens CBS 120.63 (trái) Moniliella acetoabuten CBS 169.66 (phải) Hình Cây phả hệ mơ tả mối quan hệ lồi thuộc chi Moniliella Hình Hình ảnh tế bào Geotrichum candidum (trái) Trichosporon beigelii (phải) Hình Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sử dụng mồi đặc hiệu phát Candida albicans Candida dubliniensis Hình Một số mẫu hoa phân lập đƣợc Moniliella Hình Vị trí địa điểm thu thập mẫu phân lập Moniliella Việt Nam Hình 10 Hình ảnh khuẩn lạc tế bào số chủng nấm men Moniliella phân lập đƣợc Hình 11 Phổ fingerprinting 126 chủng Moniliella phân lập đƣợc Hình 12 Vị trí chủng đại diện phân lập đƣợc thuộc chi Moniliella Hình 13 Phổ PCR fingerprinting với mồi (GAC)5 chủng Moniliella carnis Moniliella dehoogii Hình 14 Phổ PCR fingerprinting với mồi (GAC)5 chủng Moniliella byzovii Hình 15 Tế bào sinh dƣỡng Moniliella carnis (KFP 246T) sinh trƣởng môi trƣờng YM 25C sau ngày (trái) môi trƣờng tinh bột ngô Dalmau agar sau ngày (phải) Hình 16 Tế bào sinh dƣỡng Moniliella dehoogii KFP 211T sinh trƣởng YM 25C sau ngày (trái) môi trƣờng Dalmau tinh bột ngơ sau ngày (phải) Hình 17 Tế bào sinh dƣỡng chủng TBY 2041.7T sinh trƣởng môi trƣờng Dalmau tinh bột ngơ sau ngày Hình 18 Sự hình thành Chlamydospore chủng TBY 2041.7T sinh trƣởng mơi trƣờng Yeast Cacbon Base agar khơng có nguồn nito Hình 19 Hình thái khuẩn lạc Moniliella byzovii TBY 2041.7T (trái) TBY 2041.8 (phải) môi trƣờng Malt-Glucoseagar sau 45 ngày ni cấy 28C Hình 20 Hình thái khuẩn lạc M dehoogii KFP 211T TBY 2041.5 môi trƣờng Malt glucose 2°Bx sau 10 ngày nuôi cấy 28°C DANH MỤC BẢNG Bảng So sánh đặc điểm chi Moniliella số chi khác Bảng Phƣơng pháp trộn lẫn tế bào chủng loài để phát pha sinh sản hữu tính Bảng Các chủng nấm men đen Moniliella phân lập đƣợc Bảng Ký hiệu chủng PCR fingerprinting Bảng Kết phân nhóm chủng fingerprinting Bảng Danh sách chủng Moniliella mơ tả lồi Bảng Danh sách chủng thuộc nhóm M byzovii Bảng Sự khác đặc tính quan trọng M carnis, M dehoogii, M byzovii loài biết thuộc chi Moniliella Bảng Phân lập Moniliella Việt Nam giới DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CBS – Centraalbureau voor Schimmelcultures (Bảo tàng giống Vi sinh vật Hà Lan) h – hour (giờ) NRRL-Northern Regional Research Laboratory (hiện National Center For Agricultural Utilization Research) (Bảo tàng giống Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ) DGGE-Denaturing gradient gel electrophoresis rDNA-Ribosomal DNA rRNA-Ribosomal RNA PCR – Polymerase Chain Reaction (phản ứng trùng hợp chuỗi) RFLP-Restriction Fragment Length Polymorphism (đánh giá đa hình DNA theo phƣơng pháp cắt hạn chế) T – Type strain (chủng chuẩn) MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN 1.1 NHÓM NấM MEN ĐEN Một số chi nấm men đen 1.1.1 Chi Phaeococcomyces 1.1.2 Chi Exophiala 1.1.3 Chi Aureobasidium 1.1.4 Chi Moniliella 1.2 MộT Số PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOạI NấM MEN 10 1.2.1 Các phương pháp phân loại truyền thống 10 1.2.2 Các phương pháp hóa phân loại sinh học phân tử 12 1.3 MộT Số PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIệN VÀ ĐÁNH GIÁ ĐA DạNG VI SINH VậT 14 CHƢƠNG - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 ĐốI TƢợNG 18 2.2 HÓA CHấT, DụNG Cụ, TRANG THIếT Bị MÁY MÓC 18 2.2.1 Hóa chất 18 2.2.2 Dụng cụ trang thiết bị, máy móc 19 2.3 THÀNH PHầN MÔI TRƢờNG Sử DụNG TRONG NGHIÊN CứU 19 2.3.1 Mơi trường làm giàu có nồng độ đường cao 19 2.3.2 Môi trường Malt-Glucose 2Bx có axit lactic 1‰ 19 2.3.3 Môi trường Malt-Glucose 2Bx axit lactic 20 2.3.4 Mơi trường thử khả chuyển hóa nguồn cacbon khác 20 2.3.5 Môi trường thử khả đồng hóa nguồn nitơ khác 20 2.3.6 Thử khả sinh trưởng mơi trường có nồng độ đường muối cao 21 2.3.7 Môi trường xác định khả sinh trưởng điều kiện nhiệt độ khác 2.3.8 Mơi trường thử khả hình thành tinh bột 22 2.3.9 Mơi trường đánh giá hoạt tính phân giải urea 22 2.3.10 Môi trường đánh giá khả sinh trưởng có mặt Cycloheximide 23 2.3.11 Môi trường đánh giá khả chống chịu acid acetic % 23 2.4 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CứU 24 2.4.1 Phương pháp phân lập 24 2.4.3 Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào 25 2.4.4 Phương pháp tách chiết DNA tế bào nấm men 25 2.4.5 Phương pháp tinh chế DNA 25 2.4.6 Phương pháp tiến hành phản ứng PCR fingerprinting 26 2.4.7 Phương pháp điện di 26 2.4.8 Nhuộn gel đọc kết 27 2.4.9 Phương pháp phân loại nấm men dựa vào đọc trình tự rDNA 27 2.4.10 Đánh giá khả sử dụng nguồn cacbon khác 28 2.4.11 Đánh giá khả đồng hóa nguồn nito khác 28 2.4.12 Đánh giá khả sinh trưởng mơi trường có nồng độ đường nồng độ muối cao 29 2.4.13 Đánh giá khả sinh trưởng điều kiện nhiệt độ khác 29 2.4.14 Thử khả hình thành tinh bột 29 2.4.15 Thử khả phân giải urea 29 2.4.16 Thử khả chống chịu với cycloheximit 30 CHƢƠNG – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32 3.1 KếT QUả PHÂN LậP 32 3.2 QUAN SÁT HÌNH THÁI KHUẩN LạC, Tế BÀO 36 3.3 PHÂN NHÓM BằNG Kỹ THUậT FINGERPRINTING 37 3.5 MƠ Tả CÁC NHĨM LỒI MớI THUộC CHI MONILIELLA 44 3.5.1 Phân tích đặc tính di truyền lồi 46 3.5.2 Đặc tính kiểu hình, sinh lý, sinh hóa loài 48 3.6 Sự ĐA DạNG MONILIELLA PHÂN LậP TạI VIệT NAM 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 CÁC CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC ... Việt Nam - Phân nhóm, phân loại Moniliella phân lập đƣợc hình thái; PCR fingerprinting; giải trình tự DNA; phân tích phả hệ - Phân tích đa dạng nấm men Moniliella phân lập Việt Nam số loài, phân. .. đa dạng nấm men Moniliella Việt Nam, góp phần củng cố hệ thống phân loại chi tạo sở cho nghiên cứu cơng nghệ có sử dụng Moniliella, cụ thể nội dung nghiên cứu bao gồm: - Phân lập nấm men Moniliella. .. HỌC TỰ NHIÊN - Đinh Đức Hiền NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI NẤM MEN MONILIELLA PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420 107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA