(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu kỹ thuật làm giàu nhằm xác định salbutamol trong mẫu nước tiểu và thịt lợn bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Dƣơng Thị Nhàn NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT LÀM GIÀU NHẰM XÁC ĐỊNH SALBUTAMOL TRONG MẪU NƢỚC TIỂU VÀ THỊT LỢN BẰNG PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN SỬ DỤNG DETECTOR ĐỘ DẪN KHÔNG TIẾP XÚC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Dƣơng Thị Nhàn NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT LÀM GIÀU NHẰM XÁC ĐỊNH SALBUTAMOL TRONG MẪU NƢỚC TIỂU VÀ THỊT LỢN BẰNG PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN SỬ DỤNG DETECTOR ĐỘ DẪN KHÔNG TIẾP XÚC Chun ngành : Hóa Phân Tích Mã số : 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS PHẠM THỊ NGỌC MAI Hà Nội - 2016 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn cô giáo, PGS.TS Phạm Thị Ngọc Mai giao đề tài, nhiệt tình hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi giúp em thực luận luận văn Em xin chân thành cám ơn nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Quỳnh Hoa hỗ trợ em trình thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn GS Peter C Hauser, TS Mai Thanh Đức ThS Bùi Duy Anh thiết kế lắp đặt hỗ trợ trang thiết bị tư vấn kỹ thuật trình thực nghiên cứu Em xin chân thành cám ơn công ty 3SAnalysis cung cấp thiết bị CE-C4D cho nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn thầy, mơn Hóa Phân tích nói riêng khoa Hóa học nói chung dạy dỗ, bảo động viên em suốt thời gian em học tập trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, anh, chị nghiên cứu sinh, bạn học viên, em sinh viên Bộ mơn Hóa phân tích ln động viên tinh thần, tận tình giúp đỡ em thời gian học tập thực luận văn Hà Nội, ngày 05 tháng 12 năm 2015 Học viên Dương Thị Nhàn MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 11 1.1 Tổng quan Salbutamol 11 1.1.1 Giới thiệu chung Salbutamol 11 1.1.2 Vấn đề sử dụng Salbutamol giới 12 1.1.3 Vấn đề sử dụng Salbutamol Việt Nam 13 1.2 Các phƣơng pháp xác định Salbutamol 14 1.2.1 Phương pháp điện hóa 1.2.2 Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 1.2.3 Các phương pháp sắc ký 1.2.3.1 Các phương pháp sắc ký lỏng 1.2.3.2 Phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS) 1.2.4 Các phương pháp điện di mao quản 1.3 Phƣơng pháp xác định Salbutamol CE-C4D 18 1.3.1 Cấu tạo nguyên tắc hoạt động hệ CE 18 1.3.2 Giới thiệu detector đo độ dẫn không tiếp xúc C4D 20 1.3.3 Một số cơng trình xác định Salbutamol CE 21 1.4 Các phƣơng pháp làm giàu chất phân tích 23 1.4.1 Phương pháp chiết lỏng – lỏng 23 1.4.2 Phương pháp chiết pha rắn (SPE) 24 1.4.2.1 Nguyên tắc chiết pha rắn 25 1.4.2.2 Cơ chế chiết pha rắn 26 1.4.2.3 Các loại cột SPE 28 1.4.2.4 Một số cơng trình làm giàu Salbutamol chiết pha rắn 29 CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 32 2.1 Mục tiêu nội dung nghiên cứu 32 2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu 32 2.1.2 Nội dung nghiên cứu 32 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 32 2.2.1 Phương pháp phân tích 32 2.2.2 Phương pháp lấy mẫu phân tích 33 2.2.3 Phương pháp xử lý mẫu 33 2.2.4 Quy trình xử lý mẫu nước tiểu phương pháp chiết pha rắn 34 2.2.5 Quy trình xử lý mẫu thịt phương pháp chiết pha rắn 36 2.3 Trang thiết bị hóa chất 37 2.3.1 Các dụng cụ thiết bị sử dụng 37 2.3.2 Hóa chất 39 2.3.2.1 Chất chuẩn 39 2.3.2.2 Hóa chất dung mơi 39 2.3.2.3 Chuẩn bị dung dịch hóa chất 39 2.4 Các thông số đánh giá độ tin cậy phƣơng pháp phân tích 40 2.4.1 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 40 2.4.2 Độ lặp lại phương pháp 40 2.4.3 Độ (độ thu hồi) thiết bị, phương pháp 41 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 3.1 Đánh giá phƣơng pháp phân tích CE-C4D 42 3.1.1 Xây dựng đường chuẩn cho Salbutamol 42 3.1.2 Giới hạn phát (LOD), giới hạn phát (LOQ) thiết bị 43 3.1.3 Đánh giá độ lặp lại thiết bị 44 3.2 Nghiên cứu, tối ƣu điều kiện chiết pha rắn làm giàu Sabutamol mẫu nƣớc tiểu 45 3.2.1 Khảo sát lựa chọn cột chiết 45 3.2.2 Khảo sát đệm chiết 46 3.2.3 Khảo sát trình rửa tạp 47 3.2.4 Khảo sát dung môi rửa giải 48 3.2.5 Đánh giá phương pháp phân tích Salbutamol mẫu nước tiểu kĩ thuật CE-C4D kết hợp chiết pha rắn 50 3.2.5.1 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng phương pháp 50 3.2.5.2 Đánh giá độ lặp lại phương pháp 51 3.2.5.3 Đánh giá độ phương pháp 51 3.2.6 Phân tích mẫu thực tế 52 3.3 Nghiên cứu, tối ƣu điều kiện trình chiết pha rắn làm giàu Sabutamol mẫu thịt lợn 53 3.3.1 Chuẩn bị mẫu 53 3.3.2 Khảo sát lựa chọn cột chiết 53 3.3.3 Khảo sát lựa chọn quy trình rửa tạp 54 3.4 Đánh giá phƣơng pháp phân tích Salbutamol mẫu thịt kĩ thuật CE-C4D 56 3.4.1 Đánh giá hiệu suất thu hồi 56 3.4.2 Đánh giá độ lặp phương pháp phân tích Salbutamol CE-C4D 57 3.4.3 Kết phân tích mẫu thịt lợn thực tế 57 3.5 Kết phân tích đối chứng với phƣơng pháp LC/MS/MS 58 KẾT LUẬN 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các phương pháp phân tích Salbutamol 14 Bảng 3.1 Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ Salbutamol 42 Bảng 3.2 Giới hạn phát Salbutamol xác định phương pháp điện di mao quản CE-C4D 43 Bảng 3.3 Kết xác định độ lặp lại phương pháp CE-C4D định lượng Salbutamol 44 Bảng 3.4 Kết hiệu suất thu hồi loại cột chiết 46 Bảng 3.5 Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp dựa thêm chuẩn Salbutamol 51 Bảng 3.6 Kết khảo sát độ phương pháp dựa thêm chuẩn Salbutamol 52 Bảng 3.7 Kết phân tích hàm lượng Salbutamol 08 mẫu nước tiểu cung cấp .52 Bảng 3.8 Kết hiệu suất thu hồi loại cột chiết 54 Bảng 3.9 Kết hiệu suất thu hồi quy trình rửa tạp .56 Bảng 3.10 Khảo sát đánh giá độ thu hồi 56 Bảng 3.11 Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp dựa thêm chuẩn Salbutamol 57 Bảng 3.12 Kết phân tích đối chứng với phương pháp LC/MS/MS 58 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ cấu tạo hệ thiết bị phân tích điện di mao quản 19 Hình 2.1 Các bước chiết pha rắn 34 Hình 2.2 Ảnh chụp hệ thiết bị CE-C4D triển khai Việt Nam .38 Hình 3.1 Đường chuẩn Salbutamol 43 Hình 3.2 Điện di đồ so sánh kết phân tích sử dụng (1) cột C18,(2) cột SCX 3ml (3) cột SCX 6ml .45 Hình 3.3 Điện di đồ so sánh kết phân tích khảo sát đệm chiết (1) đệm photphat pH = 6, (2) đệm axetat pH=5,2 .47 Hình 3.4 Điện di đồ kết khảo sát với quy trình rửa tạp khác (1; 2; 3; tương ứng với quy trình 1; 2; 3; 4) 48 Hình 3.5 Điện di đồ kết khảo sát với quy trình rửa giải (1; 2; tương ứng với quy trình 1; 2; 3) 49 Hình 3.6 Điện di đồ giới hạn phát Salbutamol mẫu nước tiểu .50 Hình 3.7 Điện di đồ so sánh kết phân tích sử dụng(1) cột C 18 , (2) cột SCX 3ml (3) cột SCX 6ml 54 Hình 3.8 Điện di đồ so sánh kết phân tích sử dụng dung dịch rửa tạp khác (1; 2; tương ứng với quy trình 1; 2; 3) 55 Hình 3.9 Điện di đồ so sánh kết phân tích sử dụng dung dịch rửa tạp khác (4; 5; tương ứng với quy trình 4; 5; 6) 55 Hình 3.10 Điện di đồ kết phân tích mẫu thịt thực tế 58 DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên đầy đủ Ace Acetic Arg L- arginin C4D Detector đo độ dẫn kết nối kiểu tụ điện CE Phương pháp điện di mao quản EOF Dòng điện di thẩm thấu GC Sắc ký khí GC-MS Sắc ký khí khối phổ HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao HPLC-MS Sắc ký lỏng hiệu cao – khối phổ… LOD Giới hạn phát LOQ Giới hạn định lượng LC-MS/MS Sắc ký lỏng khối phổ ba tứ cực LC-ESI-MS/MS Sắc ký lỏng ghép với ion hóa khối phổ MeOH Methanol Ppm Parts per million: phần triệu %RSD % độ lệch chuẩn tương đối Sal Salbutamol SD Độ lệch chuẩn UPLC Sắc ký lỏng siêu hiệu LỜI MỞ ĐẦU Sử dụng chất tạo nạc mà phổ biến Salbutamol chăn ni vấn đề nóng nước ta Lợn ăn thức ăn có chứa Salbutamol tăng trọng nhanh, tỉ lệ nạc cao, thịt có màu đỏ tươi Tuy nhiên thịt lợn chứa dư lượng Salbutamol gây ảnh hưởng xấu tới sức khỏe người tiêu dùng làm tăng huyết áp, tim đập nhanh, nhức đầu, tay chân run, buồn nơn, rối loạn tiêu hóa Mặc dù vậy, số người chăn nuôi thương lái lợi nhuận bất chấp sức khỏe người tiêu dùng, sử dụng Salbutamol chăn nuôi gây hoang mang dư luận, Để đảm bảo sức khỏe cho người dân, lấy lại niềm tin người tiêu dùng vào ngành chăn nuôi lợn đảm bảo tính cơng cho người chăn ni chân chính, việc nghiên cứu phát triển quy trình phân tích, kiểm tra hàm lượng Salbutamol có thức ăn chăn nuôi đối tượng chăn nuôi, thực phẩm cần thiết Việc xác định Salbutamol nước ta chủ yếu thực phịng thí nghiệm phương pháp HPLC với quy trình phân tích phức tạp, giá thành phân tích cao Phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D) gần biết đến phương pháp phân tích với nhiều ưu điểm, nghiên cứu, ứng dụng để phân tích Salbutamol mẫu thức ăn chăn nuôi [9, 20] Tuy nhiên, mẫu nước tiểu, mẫu thịt lợn phức tạp thường có hàm lượng Salbutamol thấp mà giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng phương pháp CE-C4D cịn hạn chế nên việc phân tích Salbutamol phương pháp CE-C4D mẫu gặp khó khăn [12, 14] Vì vậy, việc nghiên cứu kỹ thuật làm mẫu làm giàu Salbutamol mẫu nước tiểu, mẫu thịt lợn làm tăng độ nhạy phương pháp, giúp xác định hàm lượng nhỏ Salbutamol mẫu nước tiểu, mẫu thịt lợn phương pháp CE-C4D, góp phần quản lý việc sử dụng Salbutamol chăn ni Do chúng tơi lựa chọn đề tài “Nghiên cứu kỹ thuật làm giàu nhằm xác định Salbutamol mẫu nƣớc tiểu thịt lợn phƣơng pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc” 10 ... Dƣơng Thị Nhàn NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT LÀM GIÀU NHẰM XÁC ĐỊNH SALBUTAMOL TRONG MẪU NƢỚC TIỂU VÀ THỊT LỢN BẰNG PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN SỬ DỤNG DETECTOR ĐỘ DẪN KHÔNG TIẾP XÚC Chuyên ngành :... tài ? ?Nghiên cứu kỹ thuật làm giàu nhằm xác định Salbutamol mẫu nƣớc tiểu thịt lợn phƣơng pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc? ?? 10 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Salbutamol. .. làm giàu Salbutamol mẫu nước tiểu lợn mẫu thịt lợn - Áp dụng phân tích định lượng Salbutamol số mẫu nước tiểu lợn mẫu thịt lợn thực tế 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp phân tích Sử dụng