Với mục tiêu xác định tình hình nhiễm Vibrio spp. trên thủy sản thương phẩm và nước nuôi tại huyện Cái Bè, tỉnh Tiền Giang, Việt Nam. Bài viết tiến hành nghiên cứu phân lập 501 mẫu gồm 311 mẫu nước nuôi và 190 mẫu thủy sản thương phẩm. Kết quả cho thấy có 161 mẫu nước và 82 mẫu thủy sản có chứa 8 loài Vibrio spp., nhiều nhất là V. parahaemolyticus, V. mimicus và V. alginolyticus.
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC TÌNH HÌNH NHIỄM VIBRIO SPP PHÂN LẬP TỪ THỦY SẢN VÀ NƯỚC NUÔI TẠI CÁI BÈ - TIỀN GIANG HUỲNH NGỌC TRƯỞNG Công ty TNHH Phân tích Kiểm nghiệm Việt Tín (Ngày đến tịa soạn: 28/5/2019; Ngày sửa sau phản biện: 18/8/2019; Ngày chấp nhận đăng: 30/8/2019) Tóm tắt Để xác định tình hình nhiễm Vibrio spp thủy sản thương phẩm nước nuôi huyện Cái Bè, tỉnh Tiền Giang, Việt Nam Nghiên cứu phân lập 501 mẫu gồm 311 mẫu nước nuôi 190 mẫu thủy sản thương phẩm Kết cho thấy có 161 mẫu nước 82 mẫu thủy sản có chứa lồi Vibrio spp., nhiều V parahaemolyticus, V mimicus V alginolyticus Từ khóa: Vibrio, thủy sản, tỉnh Tiền Giang MỞ ĐẦU Giống Vibrio thuộc họ Vibrionaceae, Vibrionales, lớp Gammaproteobacteria, ngành Proteobacteria Tất loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio vi khuẩn kỵ khí tùy nghi đa số phân bố môi trường nước mặn, nước lợ, vùng cửa sơng [3] Một số lồi vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio spp công bố tác nhân gây bệnh nghiêm trọng số động vật thủy sản [6] Đối với cá, Vibrio spp chủ yếu gây bệnh nhiễm khuẩn máu Đối với tôm, Vibrio spp gây bệnh phát sáng, đỏ dọc thân, ăn mòn vỏ kitin Một số trường hợp điển V anguillarum V vulnificus gây bệnh nhiễm khuẩn máu cá Chình [7] V alginolyticus gây nhiễm khuẩn máu cho cá Tráp cá Mú [8] Tiền Giang địa phương có mơ hình ni cá bè sơng phát triển mạnh vùng Đồng sơng Cửu Long Tồn tỉnh có 1500 lồng bè, tập trung cồn Thới Sơn, Tân Long (Thành Phố Mỹ Tho) số khu vực ven sông Tiền huyện Châu Thành, Cai Lậy, Cái Bè Trong q trình ni loại thủy sản, người dân thường sử dụng nhiều loại kháng sinh vào mục đích chữa bệnh hay phịng bệnh Trong đó, vi khuẩn Vibrio gây bệnh cho động vật thủy sản đối tượng người ni đối phó kháng sinh nhiều Việc sử dụng kháng sinh thường mang tính tự phát, khơng theo dẫn chuyên gia quan chức Điều dẫn đến tình trạng kháng kháng sinh điều trị bệnh khơng hiệu Với mục đích khảo sát tình hình nhiễm Vibrio spp nước nuôi thủy sản thương phẩm nhằm giúp hộ nuôi chuyên gia nắm tình hình để chữa bệnh phịng bệnh cho thủy sản hiệu hơn, đề tài tiến hành phân lập 311 mẫu nước nuôi 190 mẫu thủy sản thương phẩm tỉnh Tiền Giang Điện thoại: 0936036028 18 Email: ngoctruongbio@gmail.com Tạp chí KIỂM NGHIỆM VÀ AN TOÀN THỰC PHẨM (Số 3-2019) NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Các chủng Vibrio phân lập từ mẫu thủy sản thương phẩm mẫu nước nuôi ao tỉnh Tiền Giang 2.1.2 Môi trường hóa chất sử dụng nghiên cứu Dung dịch pepton muối kiềm - ASPW Môi trường Thiosulphate Citrate Bile Sucrose Agar TCBS Môi trường Triphenyl tetrazolium Chloride Soya Tryptone - TSAT Môi trường Trypticase Soya Agar 1,5% NaCl - TSA 1,5% NaCl Các môi trường hấp khử trùng 121oC, 15 phút trước sử dụng Các hóa chất môi trường cho xác định chủng Vibrio theo SMEWW 9260 H: 2017 “Phát Vibrio cholerae nước” theo “ISO/TS 21872-1,2: 2017 “Phát loài Vibrio spp thực phẩm” PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1.1 Phương pháp lấy mẫu nước mẫu thực phẩm thủy sản Địa điểm thu mẫu: Mẫu thu nhận bảo quản từ khu vực nuôi trồng thủy sản chợ huyện Cái Bè - tỉnh Tiền Giang Số lượng mẫu thu gồm 311 mẫu nước nuôi trồng thủy sản 190 mẫu thực phẩm thủy sản bao gồm loài cá cá mè đen, cá trắm cỏ, cá tra, cá diêu hồng, cá lóc… tôm Mẫu nước: Dùng chai hấp khử trùng 121oC, 15 phút có bổ sung 0,1mL dung dịch 1,8% sodium thiosulfate (Na2S2O3.5H2O) vào bình trước khử trùng Chọn 05 vị trí thu mẫu khác theo đường chéo (04 mẫu góc ao mẫu ao) ao ao ni có diện tích khoảng hecta Chọn 03 vị trí thu mẫu ao ni khoảng 0,5 hecta (02 mẫu góc ao mẫu ao) Các ao có diện tích nhỏ 0,3 hecta lấy điểm khoảng ao nuôi Mẫu bảo quản với đá khô, không để đá khô tiếp xúc trực tiếp với mẫu vận chuyển nhanh phịng thí nghiệm để phân tích Mẫu thực phẩm thủy sản: Dùng dao, kéo vơ trùng cho mẫu vào dụng cụ chứa vô trùng, khối lượng mẫu cần thu 100 g Mẫu lấy ao nuôi chợ lân cận vùng nuôi Mẫu bảo quản thùng làm lạnh đá khô, tránh việc đá khô tiếp xúc trực tiếp với mẫu Mẫu chuyển phòng thí nghiệm tiến hành phân tích chậm 12 sau thu mẫu, trữ tủ lạnh -20oC đến phân tích Xử lý mẫu: - Mẫu nước: Lấy 100 ml phần mẫu thử lọc qua màng lọc cho vào 100 ml môi trường tăng sinh ASPW Ủ huyền phù ban đầu 35oC 6h - 8h - Mẫu thực phẩm thủy sản: dùng kéo vô trùng cắt 25g mẫu cho vào 225 mL môi trường tăng sinh ASPW, đồng ủ 37oC 6h - 8h 3.1.2 Phương pháp phân tích xác định Vibrio spp Thực phương pháp nuôi cấy truyền thống gồm bước tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập thử nghiệm đặc tính sinh hóa Sau tham chiếu theo SMEWW 9260 H: 2017 - Phát Vibrio cholerae nước” theo “ISO/TS 21872-1,2: 2017 “Phát loài Vibrio spp thực phẩm” để xác định lồi Vibrio có mẫu [4] Vibrio phân lập môi trường chọn lọc thứ TCBS Các lồi Vibrio phân biệt Tạp chí KIỂM NGHIỆM VÀ AN TOÀN THỰC PHẨM (Số 3-2019) 19 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC đặc điểm kiểu khuẩn lạc khác thể qua lên men sucrose Trên môi trường TCBS: V cholerae V alginolyticus lên men đường sucrose nên khuẩn lạc có màu vàng, ngược lại V parahaemolyticus V vulnificus lên men sucrose nên khuẩn lạc có màu xanh KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1 Phân lập xác định chủng Vibrio spp Mẫu nước ao nuôi thủy sản thương phẩm thu nhận huyện Cái Bè, tỉnh Tiền Giang, phân tích phịng Vi sinh Mẫu đồng tăng sinh mơi trường muối kiềm, sau ni cấy môi trường chọn lọc TCBS TSAT Các khuẩn lạc nghi ngờ hai môi trường nuôi cấy phục hồi TSA chứa 1% NaCl, sau ni cấy khẳng định mơi trường sinh hóa Hình Hình thái khuẩn lạc chủng Vibrio spp mơi trường chọn lọc Hình A: Khuẩn lạc V Cholerae hi có màu vàng mơi trường TCBS; Hình B: Khuẩn lạc V parahaemolyticus có màu xanh mơi trường TCBS; Hình C: Khuẩn lạc V vulnificus có màu xanh mơi trường TCBS; Hình D: Khuẩn lạc V parahaemolyticus có màu nâu đỏ môi trường TSAT Sau phát vi khuẩn định danh thử nghiệm sinh hóa, kết cho thấy 501 mẫu nước thủy sản thương phẩm có 243 mẫu xuất Vibrio Có 08 lồi Vibrio định danh Các loài diện với tần số khác mẫu Bảng Các phép thử sinh hóa phân biệt lồi Vibrio spp V cholerae V mimicus V parahaemolyticus V vulnificus V fluvialis Oxidaza + + + + + Sinh khí (glucoza) - - - - - Lactoza - - - + - Phép th͵ 20 Tạp chí KIỂM NGHIỆM VÀ AN TỒN THỰC PHẨM (Số 3-2019) NGHIÊN CỨU KHOA HỌC V cholerae V mimicus V parahaemolyticus V vulnificus V fluvialis Oxidaza Sacaroza + +- +- +- + Sinh khí ODC (glucoza) LDC Lactoza ADH +- +- +- +- - + - + - + - + + - + Thӫy phân ONPG + + - + + Sinh indol + + + + + % NaCl + + - - - % NaCl + + + + + % NaCl - - + + + % NaCl - - + - - 10 % NaCl - - - - - Phép th͵ Sinh trѭӡng nѭӟc pepton vӟi 4.2 Tỷ lệ chủng Vibrio spp phân lập Bảng cho thấy tỷ lệ chủng phân lập 501 mẫu Trong đó, chủng V parahaemolyticus gây bệnh xuất huyết, lở loét cho cá bệnh gan tụy cấp cho tơm xuất nhiều (70/501) Đặc biệt, lồi xuất cá thương phẩm 29/190 mẫu thủy sản khảo sát, chiếm tỷ lệ 15,3%, cao so với mẫu nước (41/311), chiếm 13,2%, V mimicus (43 mẫu) V alginolyticus (39 mẫu Lồi V metschnikovii diện ít, mẫu 501 mẫu phân tích Bảng Tần số xuất chủng Vibrio spp Vibrio 24 (7,7%) 19 (10,0%) 43 41 (13,2%) 29 (15,3%) 70 V alginolyticus 29 (9,3%) 10 (5,3%) 39 V furnissii 16 (5,2%) (2,1%) 20 V cholerae 17 (5,5%) (4,7%) 26 V fluvialis 12 (3,9%) (2,6%) 17 V vulnificus 16 (5,2%) (3,2%) 22 V metschnikovii (1,9%) 161/311 82/190 243/501 V mimicus V parahaemolyticus Sӕ mүu phát hiӋn/sӕ mүu kiӇm tra Tạp chí KIỂM NGHIỆM VÀ AN TỒN THỰC PHẨM (Số 3-2019) 21 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Tổng số mẫu khảo sát: 501 mẫu có 243 mẫu nhiễm Vibrio spp Trong mẫu nước ni trồng thủy sản 311 mẫu có 161 mẫu phát Vibrio spp Mẫu sản phẩm thủy sản 190 mẫu có 82 mẫu nhiễm Vibrio spp Kết nghiên cứu không phát vi khuẩn V harveyi gây bệnh phát sáng tôm hay V carchriae vùng nghiên cứu Hai loại vi khuẩn diện ao nuôi tôm Cần Thơ báo cáo trước [1], [2] Nghiên cứu không phát V anguillarum gây nhiễm trùng máu cá Trong nghiên cứu thành phần loài Vibrio gây bệnh tơm tác giả Hồng Oanh [2] Tuyết Hoa [4] không thấy xuất V metschnikovii, tìm thấy nghiên cứu lồi cá da trơn [6] Như thấy loài vi khuẩn diện chủ yếu cá mà chưa thấy tôm KẾT LUẬN Trong 501 mẫu khảo sát, đề tài phân lập 243 chủng Vibrio diện mẫu, thuộc 08 loài Trong có 43 chủng V mimicus, 70 chủng V parahaemolyticus, 39 chủng V alginolyticus, 20 chủng V furnissii, 26 chủng V cholerae, 17 chủng V fluvialis, 22 chủng V vulnificus 06 chủng V metschnikovii Như vậy, tỷ lệ diện Vibrio spp thủy sản nước nuôi cao (48,5%) Vì vậy, quan quản lý cần thơng tin rộng rãi tình trạng nhiễm Vibrio gây bệnh ni trồng thủy sản Tiền Giang nói riêng địa phương khác nói chung, giúp quan chức năng, trung tâm khuyến nông khuyến cáo người dân cách xử lý mơi trường ni phịng trị bệnh cho động vật thủy sản cách hiệu TÀI LIỆU THAM KHẢO GARP - Nhóm nghiên cứu Quốc gia Việt Nam (2010), “Phân tích thực trạng: Sử dụng kháng sinh kháng kháng sinh Việt Nam”, Hà Nội, Việt Nam Đặng Thị Hoàng Oanh, Đoàn Nhật Phương, Nguyễn Thị Thu Hằng Nguyễn Thanh Phương (2006), “Xác định vị trí phân loại khả kháng kháng sinh vi khuẩn Vibrio phát sáng phân lập từ hậu ấu trùng tôm sú (Penaeus monodon)”, Tạp chí nghiên cứu khoa học, tr 42 – 52 Bùi Quang Tề (2006), “Bệnh học thủy sản”, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I, phần 2, Nhà Xuất Bản Bắc Ninh SMEWW 9260 H: 2017- Phát Vibrio cholerae nước, ISO/TS 21872 (2017) Part 1: Detection of potentially enteropathogenic Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae and Vibrio vulnificus ISO/TS 21872 (2007) Part 2: Detection of species other than Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholerae Samira Sarter, Hoang Nam Kha Nguyen, Le Thanh Hung, Jérome Lazard, Didier Montet (2007), “Antibiotic resistance in Gram-negative bacteria isolated from farmaed catfish”, Food Control 18, 1391-1396 Austin, B & D.A Austin (1993), “Bacterial fish pathogens, Diseases in farmed and wild fish” 2nd edn Ellis Horwood Ltd., Chichester Biosca, E G., C Amaro, C Esteve, E Alcaide & E Garay (1991), “First record of Vibrio vulnificus biotype from diseased European eel, Anguilla anguilla L”, Journal of Fish Diseases, 14: 103-109 Lee, K.K (1995), “Pathogenesis studies on Vibrio alginolyticus in the grouper, Epinephelus malabaricus”, Microbial Pathogenesis, 19: 39-48 22 Tạp chí KIỂM NGHIỆM VÀ AN TỒN THỰC PHẨM (Số 3-2019) NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Summary PREVALANCE OF VIBRIO SPP ISOLATED FROM AQUACULTURE AND ENVIRONMENT IN CAI BE DISTRICT, TIEN GIANG PROVINCE HUYNH NGOC TRUONG Viet Tin Analysis Testing Company Limited The prevalence of Vibrio spp incommercial seafood and the aquaculture water collected in Cai Be district, Tien Giang province, Viet Nam was studied More than five hundred samples including 311 aquaculture water samples and 190 seafood samples were collected and analyzed The results showed that there were 161 water samples and 82 seafood samples containing species of Vibrio spp Among those V parahaemolyticus, V mimicus, and V alginolyticus were the most abundant Keywords: Vibrio, aquaculture, Tien Giang province Tạp chí KIỂM NGHIỆM VÀ AN TỒN THỰC PHẨM (Số 3-2019) 23 ... +- +- +- + Sinh khí ODC (glucoza) LDC Lactoza ADH +- +- +- +- - + - + - + - + + - + Thӫy phân ONPG + + - + + Sinh indol + + + + + % NaCl + + - - - % NaCl + + + + + % NaCl - - + + + % NaCl - -. .. thủy sản Địa điểm thu mẫu: Mẫu thu nhận bảo quản từ khu vực nuôi trồng thủy sản chợ huyện Cái Bè - tỉnh Tiền Giang Số lượng mẫu thu gồm 311 mẫu nước nuôi trồng thủy sản 190 mẫu thực phẩm thủy sản. .. + % NaCl - - + + + % NaCl - - + - - 10 % NaCl - - - - - Phép th͵ Sinh trѭӡng nѭӟc pepton vӟi 4.2 Tỷ lệ chủng Vibrio spp phân lập Bảng cho thấy tỷ lệ chủng phân lập 501 mẫu Trong đó, chủng V parahaemolyticus