Khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết và các cao phân đoạn từ cây lan một lá nervilia aragoana​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO CHIẾT VÀ CÁC CAO PHÂN ĐOẠN TỪ CÂY LAN MỘT LÁ NERVILIA ARAGOANA Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS Trần Thị Ngọc Mai Sinh viên thực : Trịnh Kim Thảo MSSV: 1311100686 Lớp: 13DSH04 TP Hồ Chí Minh, 2017 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan cơng trình nghiên cứu em Các số liệu kết nêu đồ án thật chƣa có cơng bố cơng trình khác TP.HCM, ngày tháng năm 2017 Sinh viên thực Trịnh Kim Thảo Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Lời em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Trần Thị Ngọc Mai – Giảng viên Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Công nghệ TPHCM, ngƣời tận tình dìu dắt, hƣớng dẫn bảo em suốt thời gian thực đồ án tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy Mai Đình Trị - Trƣởng phịng Hợp chất thiên nhiên hoạt tính sinh học, Viện Cơng nghệ Hóa học, ngƣời trực tiếp quản lí, giúp đỡ em suốt q trình hồn thành đồ án tốt nghiệp em xin cảm ơn đến anh chị cơng tác đơn vị nhiệt tình bảo để em hồn thành tốt đồ án nghiên cứu Xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Công nghệ TPHCM nhƣ nhà trƣờng tạo điều kiện tốt cho em đƣợc học tập nghiên cứu để hồn thành đồ án Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn đến chị Đỗ Phƣơng Vy, ngƣời hỗ trợ cho em nhiều kinh nghiệm quý báu suốt trình thực đồ án Xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè, anh chị nghiên cứu phịng thí nghiệm Khoa Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Cơng nghệ TPHCM tận tình hỗ trợ, giúp đỡ vƣợt qua khó khăn để hồn thành tốt đồ án tốt nghiệp Cuối xin cảm ơn ngƣời thân yêu gia đình dành cho tơi quan tâm, chia sẻ, động viên, khích lệ suốt thời gian học tập nghiên cứu để tơi hồn thành đồ án Do thời gian thực có hạn, kiến thức cịn nhiều hạn chế nên đồ án thực chắn không tránh khỏi sai sót định Em mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp thầy để em có thêm kinh nghiệm tiếp tục hoàn thiện đồ án tốt nghiệp TP.HCM, ngày tháng năm 2017 Sinh viên thực Trịnh Kim Thảo Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG BIỂU vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Tình hình nghiên cứu nƣớc Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu 5.1 Đối tƣợng nghiên cứu 5.2 Phạm vi nghiên cứu CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Lan (Nervilia aragoana) 1.1.1 Phân loại khoa học phân bố 1.1.1.1 Phân loại khoa học 1.1.1.2 Phân bố 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Thành phần hóa học 1.1.4 Giá trị dƣợc liệu 1.1.5 Các nghiên cứu giới Lan (Nervilia aragoana) 11 1.2 Tổng quan phƣơng pháp chiết xuất 12 1.2.1 Các trình xảy chiết xuất 12 1.2.1.1 Sự hòa tan 13 1.2.1.2 Sự khuếch tán 13 1.2.1.3 Q trình thẩm tích 14 1.2.2 Các yếu tố ảnh hƣởng đến trình chiết xuất 15 1.2.2.1 Nguyên liệu 15 i Đồ án tốt nghiệp 1.2.2.2 Dung môi 16 1.2.2.3 Kỹ thuật chiết 17 1.2.3 Các phƣơng pháp chiết 18 1.2.3.1 Phƣơng pháp ngâm 18 1.2.3.2 Chiết phƣơng pháp ngấm kiệt 20 1.2.3.3 Các phƣơng pháp chiết khác 21 1.3 Tổng quan hoạt tính kháng oxy hóa 21 1.3.1 Giới thiệu chung 21 1.3.1.1 Khái niệm stress oxy hóa 21 1.3.1.2 Sự hình thành gốc tự oxy thể .22 1.3.1.3 Sự phòng vệ thể chống lại gốc tự 24 1.3.2 Một số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính kháng oxy hóa .26 1.3.2.1 Flavonoid 26 1.3.2.2 Terpenoid 28 1.1.3 Các phƣơng pháp xác định tác dụng chống oxi hóa 29 1.1.3.1 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng MDA 29 1.1.3.2 Các phƣơng pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa 30 1.4 Tổng quan hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm 32 1.4.1 Khái niệm chung 32 1.4.2 Cơ chế đối kháng 33 1.4.3 Một số loài vi khuẩn, nấm gây bệnh thƣờng gặp 33 1.4.3.1 Tụ cầu khuẩn (Staphylococcus) 33 1.4.3.2 Trực khuẩn (Escherichia coli) 34 1.4.3.2 Nấm mốc Aspergillus 36 1.4.3.3 Nấm sợi Fusarium 37 1.4.3.4 Nấm Neoscytalidium dimidiatum 38 1.4.4 Các phƣơng pháp thử hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm in vitro 40 CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .42 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 42 ii Đồ án tốt nghiệp 2.1.1 Thời gian nghiên cứu 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 2.2 Vật liệu nghiên cứu 2.2.1 Nguồn mẫu 2.2.2 2.3 Vi sinh vật thị Thiết bị, dụng cụ hóa chất 2.3.1 Thiết bị 2.3.2 Dụng cụ 2.3.3 Hóa chất 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1 Phƣơng pháp thu xử lý mẫu 2.4.2 Phƣơng pháp tách chiết thu nhận cao chiết 2.4.2.1 Phƣơng pháp chiết ngâm dầm 2.4.2.2 Phƣơng pháp chiết máy Soxhlet 2.4.3 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa phƣơng pháp D 2.4.4 Đánh giá khả kháng khuẩn, kháng nấm phƣơ giếng thạch (well diffusion agar method) 2.4.5 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC 2.4.6 Phƣơng pháp xử lí số liệu 2.5 Bố trí thí nghiệm CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết khảo sát ảnh hƣởng phƣơng pháp tách chiết đến tỷ lệ thu cao chiết N aragoana 3.2 Kết khảo sát trình chiết phân đoạn từ cao chiết N aragoan 3.3 Kết khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bắt gốc tự DPPH cao cao phân đoạn từ N aragoana 3.4 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm cao chiết c phân đoạn N aragoana iii Đồ án tốt nghiệp 3.4.1 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết cao phân đoạn N aragoana 68 3.4.2 Kết khảo sát hoạt tính kháng nấm cao chiết cao phân đoạn N aragoana 70 3.5 Kết xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cao chiết cao phân đoạn chủng vi sinh vật gây bệnh 75 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 78 4.1 Kết luận 78 4.2 Kiến nghị 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO 80 iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DMSO : Dimethyl sulfoxide DPPH : 1,1 diphenyl – – picrylhydrazyl EA : Ethyl Acetate EtOH : Ethanol MeOH : Methanol MIC : Minimum Inhibitory Concentration : Nồng độ ức chế tối thiểu PDA : Potato Dextro Agar PE : Petroleum ether TSA : Tryptic Soy Agar TSB : Tryptone Soya Broth v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1 Giá trị I % ức chế gốc tự DPPH cao chiết Ethanol 63 Bảng 3.2 Giá trị I % ức chế gốc tự DPPH cao phân đoạn PE 64 Bảng 3.3 Giá trị I % ức chế gốc tự DPPH cao phân đoạn EA 65 Bảng 3.4 Giá trị I % ức chế gốc tự DPPH cao phân đoạn nƣớc .66 Bảng 3.5 Giá trị I % ức chế gốc tự DPPH Vitamin C 67 Bảng 3.6 Kết so sánh hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm cao chiết cao phân đoạn chủng vi sinh gây bệnh 74 Bảng 3.7 Kết xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cao chiết cao phân đoạn chủng vi sinh vật gây bệnh 76 vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Ảnh Nervilia aragoana Hình 1.2 Vi khuẩn Staphylococcus aureus 34 Hình 1.3 E.coli quan sát dƣới kính hiển vi với kích thƣớc µm 35 Hình 1.4 Nấm mốc Aspergillus 37 Hình 1.5 Nấm sợi Fusarium 38 Hình 1.6 Nấm Neoscytalidium dimidiatum 39 Hình 2.1 Mẫu bột N aragoana 44 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 54 Hình 2.3 Mẫu bột chiết hệ thống Soxhlet 56 Hình 3.1 Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ thu hồi cao chiết N aragoana 60 Hình 3.2 Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ thu hồi cao phân đoạn từ cao chiết N aragoana 62 Hình 3.3 Biểu đồ biểu diễn % ức chế cao Ethanol 63 Hình 3.4 Biểu đồ biểu diễn % ức chế cao phân đoạn PE .64 Hình 3.5 Biểu đồ biểu diễn % ức chế cao phân đoạn EA 65 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn % ức chế cao phân đoạn nƣớc 66 Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn % ức chế mẫu Vitamin C 67 Hình 3.8 Biểu đồ biểu diễn hoạt tính kháng khuẩn cao chiết, cao phân đoạn đối chứng kháng sinh Ampicillin vi khuẩn Escherichia coli .69 Hình 3.9 Biểu đồ biểu diễn hoạt tính kháng khuẩn cao chiết, cao phân đoạn đối chứng kháng sinh Ampicillin vi khuẩn S.aureus 70 Hình 3.10 Biểu đồ biểu diễn hoạt tính kháng nấm cao chiết, cao phân đoạn đối chứng thuốc Ketoconazole chủng nấm Aspergillus niger 71 Hình 3.11 Biểu đồ biểu diễn hoạt tính kháng nấm cao chiết, cao phân đoạn đối chứng thuốc Ketoconazole chủng nấm Fusarium solani .72 Hình 3.12 Biểu đồ biểu diễn hoạt tính kháng nấm cao chiết, cao phân đoạn đối chứng thuốc Ketoconazole chủng nấm Neoscytalidium dimidiatum 73 vii Đồ án tốt nghiệp [43] https://duongsinhnucuoixanh.wordpress.com/2013/09/27/cay-mot-la-thanh- thien-quy [44] http://tinhlasen.com/flavonoid-va-tac-dung-cua-flavonoid/ [45] http://www.cyberlipid.org/simple/simp0004.htm 84 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC PHỤ LỤC A: KẾT QUẢ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HĨA BẮT GỐC TỰ DO DPPH CỦA CAO CHIẾT VÀ CÁC CAO PHÂN ĐOẠN TỪ CÂY N ARAGOANA Kết khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bắt gốc tự DPPH cao chiết Ethanol từ N aragoana Giá trị OD 517 nm mẫu đối chứng lặp lại lần kết lần lƣợt là: 1,541 – 1,547 – 1,544 1000 400 350 300 Kết khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bắt gốc tự DPPH cao phân đoạn PE từ N aragoana Giá trị OD 517 nm 1,515 – 1,510 – 1,513 mẫu đối chứng lặp lại lần kết lần lƣợt là: Đồ án tốt nghiệp 1000 400 350 300 Kết khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bắt gốc tự DPPH cao phân đoạn EA từ N aragoana Giá trị OD 517 nm mẫu đối chứng lặp lại lần kết lần lƣợt là: 1,551 – 1,552 – 1,550 1000 400 350 300 Kết khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bắt gốc tự DPPH cao phân đoạn nƣớc từ N aragoana Giá trị OD 517 nm 1,556 – 1,559 – 1,554 mẫu đối chứng lặp lại lần kết lần lƣợt là: Đồ án tốt nghiệp Nồng độ (µg/ml) 1000 400 350 300 250 200 Kết khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bắt gốc tự DPPH mẫu Vitamin C Giá trị OD 517 nm mẫu đối chứng lặp lại lần kết lần lƣợt là: 1,557 – 1,559 – 1,553 Nồng độ (µg/ml) 30 25 20 15 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM CỦA CAO CHIẾT VÀ CÁC CAO PHÂN ĐOẠN CÂY N ARAGOANA Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết, cao phân đoạn N aragoana (nồng độ 200 mg/ml) kháng sinh Ampicillin (10 mg/ml) chủng vi khuẩn Escherichia coli, Staphylococcus aureus Vi khuẩn E coli S aureus Kết khảo sát hoạt tính kháng nấm cao chiết, cao phân đoạn N aragoana (nồng độ 200 mg/ml) Ketoconazole (10 mg/ml) chủng nấm Aspergillus niger, Fusarium solani, Neoscytalidium dimidiatum Vi nấm Aspergillus niger Fusarium solani Neoscytalidium dimidiatum Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC C: KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU THỐNG KÊ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM CỦA CAO CHIẾT VÀ CÁC CAO PHÂN ĐOẠN TỪ CÂY N ARAGOANA ĐỐI VỚI CÁC CHỦNG VI KHUẨN, NẤM GÂY BỆNH Kết xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết cao phân đoạn từ N aragoana vi khuẩn Escherichia coli Bảng One – Way ANOVA Source Between groups Within groups Total (Corr.) Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD Mẫu thử Cao PE Cao nƣớc Cao Ethanol Ampicillin Đồ án tốt nghiệp Kết xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết cao phân đoạn từ N aragoana vi khuẩn Staphylococcus aureus Bảng One – Way ANOVA Source Between groups Within groups Total (Corr.) Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD Mẫu thử Cao PE Cao nƣớc Cao Ethanol Ampicillin Kết xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng nấm cao chiết cao phân đoạn từ N aragoana chủng nấm Aspergillus niger Bảng One – Way ANOVA Source Between groups Within groups Total (Corr.) Đồ án tốt nghiệp Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD Mẫu thử Cao PE Cao nƣớc Cao Ethanol Ketoconazole Kết xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng nấm cao chiết cao phân đoạn từ N aragoana chủng nấm Fusarium solani Bảng One – Way ANOVA Source Between groups Within groups Total (Corr.) Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD Mẫu thử Cao PE Cao nƣớc Cao Ethanol Ketoconazole Đồ án tốt nghiệp Kết xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng nấm cao chiết cao phân đoạn từ N aragoana chủng nấm Neoscytalidium dimidiatum Bảng One – Way ANOVA Source Between groups Within groups Total (Corr.) Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD Mẫu thử Ketoconazole Cao PE Cao Ethanol Cao nƣớc Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC D: HÌNH ẢNH VỊNG KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG NẤM CỦA CAO CHIẾT VÀ CAO PHÂN ĐOẠN TỪ CÂY N ARAGOANA Hình ảnh vịng kháng khuẩn chiết cao phân đoạn từ N aragoana chủng Escherichia coli Hình a Vịng kháng khuẩn cao chiết, cao phân đoạn đối chứng kháng sinh Ampicillin vi khuẩn Escherichia coli Hình ảnh vòng kháng khuẩn chiết cao phân đoạn từ N aragoana chủng Staphylococcus aureus Hình b Vòng kháng khuẩn cao chiết, cao phân đoạn đối chứng kháng sinh Ampicillin vi khuẩn Staphylococcus aureus Đồ án tốt nghiệp Hình ảnh vòng kháng nấm chiết cao phân đoạn từ N aragoana chủng Aspergillus niger Hình c Vịng kháng nấm cao chiết Ethanol đối chứng thuốc Ketoconazole chủng nấm Aspergillus niger Hình ảnh vịng kháng nấm chiết cao phân đoạn từ N aragoana chủng Fusarium solani Hình d Vịng kháng nấm cao chiết Ethanol, cao nƣớc đối chứng thuốc Ketoconazole chủng nấm Fusarium solani 10 Đồ án tốt nghiệp Hình ảnh vịng kháng nấm chiết cao phân đoạn từ N aragoana chủng Neoscytalidium dimidiatum Hình e Vịng kháng nấm cao chiết, cao phân đoạn đối chứng thuốc Ketoconazole chủng nấm Neoscytalidium dimidiatum 11 ... sát hoạt tính kháng oxy hóa bắt gốc tự từ cao chiết cao phân đoạn Nervilia aragoana Xác định nồng độ ức chế 50% gốc tự (IC50) từ cao chiết cao phân đoạn Nervilia aragoana - Khảo sát hoạt tính kháng... Đồ án tốt nghiệp 3.4.1 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết cao phân đoạn N aragoana 68 3.4.2 Kết khảo sát hoạt tính kháng nấm cao chiết cao phân đoạn N aragoana ... Với sở khoa học ý nghĩa thực tiễn trên, tiến hành thực đề tài: ? ?Khảo sát hoạt tính sinh học cao chiết cao phân đoạn từ Lan (Nervilia aragoana)” nhằm nâng cao giá trị sử dụng góp phần vào kho tàng