Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng meloidogyne sp gây hại trên cây hồ tiêu​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP SẢN XUẤT CHẾ PHẨM NẤM PAECILOMYCES LILACINUS PHÒNG TRỪ TUYẾN TRÙNG MELOIDOGYNE SP GÂY HẠI TRÊN CÂY HỒ TIÊU Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : Ts Nguyễn Thị Hai Sinh viên thực : Đinh Thành Hiếu MSSV: 1311100296 Lớp: 13DSH03 TP Hồ Chí Minh, 2017 LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan nội dung đồ án tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu thực cá nhân em hướng dẫn TS Nguyễn Thị Hai – giảng viên Khoa Công Nghê Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, trường Đại học Công Nghệ Tp HCM Đề tài thực dựa sở nghiên cứu lý thuyết tiến hành nghiên cứu thực nghiệm phịng thí nghiệm Cơng Nghệ Sinh Học, Khoa Cơng Nghê Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, trường Đại học Công Nghệ Tp HCM Tất số liệu, hình ảnh, kết nghiên cứu hồn tồn trung thực Đồ án khơng chép hình thức nào, có phát gian lận em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm Tp HCM, ngày 26 tháng năm 2017 Sinh viên thực Đinh Thành Hiếu i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian từ bắt đầu học tập trường đến nay, em nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ q Thầy Cơ, gia đình bạn bè Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý Thầy Cô Khoa Công Nghệ Sinh học – Thực Phẩm – Môi Trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp HCM với tri thức tâm huyết để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em suốt thời gian học tập trường Và đặc biệt, học kỳ Nếu khơng có lời hướng dẫn, dạy bảo thầy em nghĩ thu hoạch em khó hồn thiện Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn thầy Bài báo cáo đồ án tốt nghiệp thực khoảng thời gian tháng Bước đầu vào thực tế em hạn chế nhiều bỡ ngỡ Do vậy, khơng tránh khỏi thiếu sót điều chắn, em mong nhận ý kiến đóng góp q báu q Thầy Cơ bạn học lớp để kiến thức em lĩnh vực hoàn thiện Em xin gởi lời cảm ơn chân thành tri ân sâu sắc thầy cô trường Đại học Công Nghệ Tp HCM, đặc biệt TS Nguyễn Thị Hai, giảng viên khoa Công Nghệ Sinh học – Thực Phẩm – Môi Trường trường tạo điều kiện cho em để em hồn thành tốt báo cáo đồ án tốt nghiệp Và em xin chân thành cám ơn thầy phịng thí nghiệm, anh chị, bạn nhiệt tình hướng dẫn giúp đỡ em hoàn thành báo cáo đồ án tốt nghiệp Trong trình thực đồ án tốt nghiệp, trình làm báo cáo, khó tránh khỏi sai sót đồng thời trình độ lý luận kinh nghiệm thực tiễn cịn hạn chế nên báo cáo khơng thể tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận ý kiến đóng góp Thầy/Cơ để em học thêm nhiều kinh nghiệm áp dụng vào công việc tới Em xin chân thành cảm ơn ! ii LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH ẢNH MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1:TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Giới thiệu nấm thuộc chi Paecilomyces 1.1.1 1.1.2 1.1.3 phòng từ tuyến trùng hại trồng 1.1.4 bảo quản chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus 1.2.Tổng quan tuyến trùng 1.2.1 CHƯƠNG 2:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.Thời gian địa điểm nghiên cứu 2.2.Thiết bị - hóa chất - vật liệu nghiên cứu 2.2.1 2.2.1.1 2.2.1.2 2.2.2 2.3.Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 2.3.2 2.3.3 Paecilomyces lilacinus 2.3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng độ ẩm ban đầu chất đến phát triển iii 2.3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng chất mang đến thời gian tồn trữ chế phẩm 27 2.3.4 nấm Paecilomyces lilacinus điều kiện phịng thí nghiệm K 2.3.4.1 Phương pháp tách tuyến trùng từ rễ tiêu (dẫn theo Lê Thị Mai Châm, 2.3.4.2 Phương pháp khảo sát khả ký sinh chế phẩm nấm P 2.3.5 tiêu chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus phạm vi đồng ruộng Đ 2.3.5.1 Điều tra mức độ tuyến trùng gây hại hồ tiêu 2.3.5.2 Đánh giá hiệu lực phòng tuyến trùng Meloidogyne sp hại hồ tiêu c 2.4.Phương pháp xử lý số liệu CHƯƠNG 3:KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1.Đặc điểm hình thái chủng nấm P1 phân lập 3.2.Khảo sát ảnh hưởng độ ẩm chất đến mực độ bào tử nấm Paecilomyces lilacinus q trình nhân ni 3.3 Kết mật độ chế phẩm nấm Paecilomyces lilac chất mang 3.4 Khảo sát khả phòng trừ tuyến trùng Paecilomyces lilacinus 3.4.1 3.5 Khảo sát khả phòng trừ tuyến trùng Paecilomyces lilacinus đồng ruộng 3.5.1 3.5.2 CHƯƠNG 4:KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1.Kết luận 4.2.Kiến nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO iv TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 52 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 52 TÀI LIỆU INTERNET 53 v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Bảng Hiệu phòng trừ chủng nấm Paecilomyces spp tuyến trùng hại thực vật 15 Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm đánh giá tác động chế phẩm Paecilomyces lilacinus 30 Bảng 3.1 Đánh giá ảnh hưởng độ ẩm chất 37 Bảng 3.2 Mật độ bào tử chế phẩm P.lilacinus sau tháng tồn trữ phối trộn với chất mang 39 Bảng 3.3 Tỷ lệ (%) tuyến trùng Meloidogyne sp bị nấm Paecilomyces lilacinus ký sinh 41 Bảng 3.4 Tỉ lệ trứng tuyến trùng bị nấm Paecilomyces lilacinus kí sinh 44 Bảng 3.5 Mật số tuyến trùng di động đất vùng rễ hồ tiêu ciing thức 45 Bảng 3.6 Hiệu lực phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp nấm Paecilomyces lilacinus 46 Bảng 3.7 Kết sử dụng nấm trừ tuyến trùng hại hồ tiêu xã Ea Nam, huyện Ea H’leo 47 vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Đại thể nấm Paecilomyces spp Hình 1.2 Đặc điểm vi thể nấm Paecilomyces lilacinus Hình 1.3 Đặc điểm vi thể nấm Paecilomyces lilacinus Hình 1.4 Vịng đời tuyến trùng hại rễ 14 Hình 2.1 Phịng ẩm 25 Hình 3.1 Nấm Paecilomyces lilacinus môi trường PDA 35 Hình 3.2 Sợi nấm, cành mang bào tử bào tử nấm Paecilomyces lilacinus sau tái nhiễm phân lập lại 36 Hình 3.3 Nấm P.lilacinus phát triển chất có độ ẩm 40%,80% 60% (A: độ ẩm 40%, B: độ ẩm 80%, C: độ ẩm 60%) 38 Hình 3.4 Chế phẩm sau phối trộn với chất mang 40 Hình 3.5 Nấm Paecilomyces lilacinus cơng trứng tuyến trùng Meloidogyne sp.; (A, B: tuyến trùng trước lây nhiễm nấm; C, E: tuyến trùng bị lây nhiễm nấm soi kính hiển vi; D, F: mang túi trứng tuyến trùng bị nhiễm nấm Paecilomyces lilacinus soi kính hiển vi sau nhuộm Methylene blue) 42 Hình 3.6 Trứng tuyến trùng Meloidogyne spp bị nấm Paecilomyces lilacinus kí sinh (mẫu soi kinh hiển vi nhuộm với Cottonblue) 43 Hình 3.7 Sinh viên pha chế phẩm P.lilacinus tưới vào gốc hồ tiêu 48 Hình 3.8 Trước sau phun chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus 15 ngày 49 Hình 3.9 Sinh viên xem rễ lấy mẫu đất hồ tiêu để quan sát tuyến trùng 50 Hình3.10 Quan sát trứng Tuyến trùng Meloidogyne spp bị nấm Paecilomyces lilacinus kí sinh đất hồ tiêu xử lí với chế phẩm 50 vii MỞ ĐẦU Hồ tiêu trồng công nghiệp xuất chủ lực Việt Nam Do giá trị xuất cao nên diện tích hồ tiêu ngày tăng Tuy nhiên, hồ tiêu bị gây hại nặng nhiều lồi dịch hại Trong đó, đáng kể tuyến trùng Meloidogyne sp Biện pháp hóa học áp dụng để quản lý loài dịch hại hiệu không cao nguy tồn lưu hóa chất sản phẩm vấn đề đáng quan tâm Trong năm gần đây, nhiều nghiên cứu nước giới cho thấy việc sử dụng loại nấm Paecilomyces lilacinus cho hiệu cao phòng trừ tuyến trùng gây hại (Burges H D., 1998; Butt T M Copping L., 2000) Tuy nhiên, Việt Nam, nghiên cứu ứng dụng lồi nấm có ích cịn hạn chế Tại trường đại học cơng nghệ thành phố Hồ Chí Minh, Phùng Lê Kim Yến (2014) phân lập chủng nấm Paecilomyces lilacinus có khả ký sinh tuyến trùng Meloidogyne gây hại hồ tiêu bước đầu đánh giá điểm sinh học loài tuyến trùng (Lê Trần Quang Huy, 2015, Phan Ánh Ngân, 2016) Tuy nhiên, nhiều vấn đề nhân sinh khối chủng nấm đánh giá khả ký sinh chế phẩm đồng ruộng chưa tiến hành được.Xuất phát từ tình hình trên, sinh viên tiếp tục với đề tài “Sản xuất chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp gây hại hồ tiêu” Tính cấp thiết đề tài Hồ tiêu xem trồng chủ lực Việt Nam Hồ tiêu (piper nigrumL.) xem “vua loại gia vị” trở thành sản phẩm nông nghiệp quan trọng Việt Nam Hiện nay, diện tích trồng hồ tiêu Việt Nam 100.000 (theo Hiệp hội hồ tiêu, 2016), tập trung tỉnh Đắc Lắc, Gia Lai, Bình Phước, Đồng Nai Bà Rịa, Vũng Tàu Tuy nhiên, sản xuất hồ tiêu tất vùng trồng tiêu nước chịu tổn thất đáng kể bệnh vàng chết chậm mà nguyên nhân gây bệnh chủ yếu tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne incognita ( Đào Thị Lan Hoa ctv, 2003; Trình, 2010) Ngoài gây hại trực tiếp đến sinh trưởng, phát triển trồng, tuyến trùng tạo điều kiện cho loài nấm Pythium, Fusảium, Phytopthora … xâm nhiễm gây hại cho trồng Biện pháp phòng trừ tuyến trùng sử dụng loại thuốc hóa học đặc hiệu Marshal, Oncol, Nokaph, Tervigo Vimoca (Đỗ Thị Kiều An ctv, 2015) Tuy thuốc hóa học có làm mật số tuyến trùng loại thuốc hóa học lại gây tác động xấu môi trường, để lại tồn dư nơng sản, tăng tính kháng sâu bệnh làm cho việc phịng trừ trở nên khó khăn Vì vậy, nay, tác nhân sinh học hướng tiềm việc phòng trừ tuyến trùng hồ tiêu Trên giới có nhiều nghiên cứu sử dụng tác nhân sinh học để phòng trừ tuyến trùng Đặc biệt, nấm Paecilomyces lilacinus xem tác nhân có khả phòng trừ tuyến trùng hiệu cao (Burges H D., 1998; Butt T M Copping L., 2000) Tuy nhiên Việt Nam, cơng trình nghiên cứu nấm Paecilomyces spp hạn chế Xuất phát từ tình hình trên, sinh viên chọn đề tài: “Sản xuất chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp gây hại hồ tiêu” Mục đích nghiên cứu Hồn thiện quy trình sản xuất chế phẩm phòng trừ tuyến trùng hại hồ tiêu từ nấm Paecilomyces lilacinus xác định hiệu phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp chế phẩm Paecilomyces lilacinus Hình 3.8 Trước sau phun chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus 15 ngày 49 Hình 3.9 Sinh viên xem rễ lấy mẫu đất hồ tiêu để quan sát tuyến trùng Hình 3.10 Quan sát trứng Tuyến trùng Meloidogyne spp bị nấm Paecilomyces lilacinus kí sinh đất hồ tiêu xử lí với chế phẩm 50 CHƯƠNG 4: 4.1 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Đã hoạt hóa thành cơng chủng nấm Paecilomyces lilacinus p1 cách lây nhiễm tuyến trùng Meloidogyne sp.gây nốt sần rễ hồ tiêu phân lập lại Độ ẩm chất gạo 60%, thích hợp cho nấm phát triển, - Sau tháng bảo quản nhiệt độ phòng chất mang bột bắp bột cao lanh, số lượng bào tử nấm giảm tương ứng 19,8 22% Khơng có sai khác rõ suy giảm bào tử loại chất mang Trong điều kiện phịng thí nghiệm, chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus P1 ký sinh 93,75% tuyến trùng Meloidogyne ngày sau phơi nhiễm tỉ lệ trứng bị chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus kí sinh lên đến 79,16% sau ngày phơi nhiễm Trên đồng ruộng, sau tưới 15 ngày, chế phẩm Paecilomyces lilacinus p1 làm giảm 57,7% số tuyến trùng di động so với đối chứng nông dân - Sau 15 ngày tưới nấm Paecilomyces lilacinus p1 tiêu bị hại có biểu xanh tốt trở lại, đối chứng có 60% bị chết 4.2 Kiến nghị  Xác định LD50 LC50 nấm Paecilomyces lilacinus tuyến trùng, xác định liều lượng sử dụng công tác bảo vệ thực vật cho hiệu tiết kiệm  Thử nghiệm diện rộng hiệu lực diệt trừ tuyến trùng nấm Paecilomyces lilacinus Có thể sử dụng kết hợp nấm Paecilomyces lilacinus với nấm Trichoderma harzianum với nano đồng loại thuốc trừ sâu 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Lê Thị Mai Châm (2014) Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne spp hồ tiêu Lê Trần Quang Huy (2015) Đánh giá khả kí sinh tuyến trùng Meloidogyne spp gây hại trồng chủng nấm Paecilomyces sp Bùi Cách Tuyến – Lê Đình Đơn Cây hồ tiêu Bệnh hại biện pháp phòng trừ Nhà xuất nông nghiệp Lê Hữu Phước (2009) Phân lập chọn mơi trường nhân sinh khối ba lồi nấm ký sinh tuyến trùng Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok, Beauveria bassiana (Bals.) Vuill Paecilomyces spp nhóm rau ăn Đồng Bằng Sông Cửu Long Trần Văn Mão (2002) Sử dụng trùng vi sinh vật có ích Tập II Hà Nội: Nhà xuất Nông Nghiệp TÀI LIỆU TIẾNG ANH Gortari, M C., 1,3 Galarza, B C., 1,3 Cazau, M C.2 and Hours, R A (2008) Comparison of the biological properties of two strains of Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson associated to their antagonistic effect onto Toxocara canis eggs Hussein H M Al Ajrami, Dr Abboud Y El Kichaoui, Dr Kamal J Elnabris, 2016 Evaluation the Effect of Paecilomyces lilacinus as a Biocontrol Agent of Meloidogyne javanica on Tomato in Gaza Trip Huma Abbas , Nazir Javed , Sajid Aleem Khan , Muhammad Kamran , Muhammad Atiq, 2016 Exploitation of Nematicidal Potential of Paecilomyces lilacinus against Root Knot Nematode on Eggplant 52 M Nars Esfahani and B Ansari Pour, 2006 The effects of Paecilomyces lilacinus on the Pathogenesis of Meloidogyne Javanica and Tomato plant growth parameters Nilsson (1972) A report to the goverment of Botswana on Plant Diseases Food and Agriculture Organization (FAO) of The United Nations Rome R Segers, T.M Butt, J.H Carder, J.N Keen, B.R Kerry, J.F Peberdy (1998) The subtilisins of fungal pathogens of insects, nematodes and plants: distribution and variation, Mycological Research, 395-402 R P Esser and N E El-Gholl, 1993 Paecilomyces lilacinus, a fungus that parasitizes nematode eggs SamsonR A (1974) Paecilomyces and some allied Hyphomycetes, Studies in Mycology, –199 TÀI LIỆU INTERNET - Wikipedia Paecilomyces lilacinus, http://eol.org/data_objects/13605842 - Bainier, Paecilomyces spp - https://translate.google.com.vn/translate? hl=vi&sl=en&u=https://en.wikipedi a.org/wiki/Purpureocillium&prev=search - https://en.wikipedia.org/wiki/Paecilomyces - https://en.wikipedia.org/wiki/Purpureocillium 53 PHỤ LỤC A XỬ LÝ THỐNG KÊ A1 Khảo sát ảnh hưởng chất mang đến thời gian tồn trữ chế phẩm sau 15 ngày B ‘KET QUA MAT DO SAU THOI GIAN XU LY’ The ANOVA Procedure Class Level Information Class MOITRUONG Number of Observations Read Number of Observations Used 54 ‘KET QUA MAT DO SAU THOI GIAN XU LY’ Dependent Variable: MATDO Source Model Error Corrected Total Source MOITRUONG 55 ‘KET QUA MAT DO SAU THOI GIAN XU LY’ The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for MATDO Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t Least Significant Difference Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N MOITRUONG A 3251649831 BB15NGAY A A3207117845 CL15NGAY 56 A2 Khảo sát ảnh hưởng chất mang đến thời gian tồn trữ chế phẩm sau 30 ngày ‘KET QUA MAT DO SAU THOI GIAN XU LY’ The ANOVA Procedure Class Level Information Class MOITRUONG Number of Observations Read Number of Observations Used 57 ‘KET QUA MAT DO SAU THOI GIAN XU LY’ Dependent Variable: MATDO Source Model Error Corrected Total Source MOITRUONG 58 ‘KET QUA MAT DO SAU THOI GIAN XU LY’ The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for MATDO Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t Least Significant Difference Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N MOITRUONG A 3070673398 BB30NGAY B 2966777779 CL30NGAY A3 Khảo sát ảnh hưởng chất mang đến thời gian tồn trữ chế phẩm sau 60 ngày MẬT ĐỘ BAO QUẢN TRÊN CAO LANH VÀ BỘT BẮP SAU THÁNG The SAS System The ANOVA Procedure Class Level Information Class MATDO Number of Observations Read Number of Observations Used 59 The SAS System Dependent Variable: Y Source Model Error Corrected Total Source MATDO 60 The SAS System The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t Least Significant Difference Means with the same letter are not significantly different t Grouping A A A 61 The SAS System The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t Least Significant Difference Means with the same letter are not significantly different t Grouping A A A 62 ... nghiên cứu Hồn thiện quy trình sản xuất chế phẩm phịng trừ tuyến trùng hại hồ tiêu từ nấm Paecilomyces lilacinus xác định hiệu phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp chế phẩm Paecilomyces lilacinus. .. nghiên cứu nấm Paecilomyces spp cịn hạn chế Xuất phát từ tình hình trên, sinh viên chọn đề tài: ? ?Sản xuất chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp gây hại hồ tiêu”... hiệu phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp hại hồ tiêu chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus phạm vi đồng ruộng  Mục đích: xác định hiệu phịng trị tuyến trùng hại hồ tiêu đồng ruộng chủng nấm Paecilomyces