Nghiên cứu và sử dụng chế phẩm vi sinh vật bản địa đối kháng với một số nấm gây hại rễ cây hồ tiêu tại đăk lắk tt

1 MỞ ĐẦU Tây Nguyên có gần triệu đất bazan màu mỡ, chiếm đến 60 % đất bazan nước, phù hợp với công nghiệp cà phê, ca cao, hồ tiêu, dâu tằm, chè Hồ tiêu công nghiệp quan trọng Tây Nguyên Theo số liệu Bộ NN PTNT, năm 2019, nước có gần 145.447 hồ tiêu Diện tích hồ tiêu Tây Nguyên chiếm 1/2 diện tích hồ tiêu nước Khu vực Tây Nguyên, tiêu thường bị bệnh thối rễ tác nhân loại nấm bệnh Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Rhizoctonia solani, Phytophthora sp.và số tác nhân gây hại khác làm tình trạng hồ tiêu chết hàng loạt diễn biến phức tạp Việc sử dụng thuốc hóa học nơng nghiệp có thuốc trừ nấm ngày nhiều gây ảnh hưởng xấu đến môi trường làm giảm chất lượng sản phẩm dư lượng thuốc cao Tây Nguyên từ lâu xem mỏ “vàng đen” Việt Nam, “vàng đen” giúp nhiều nông dân trở thành tỷ phú Nhưng nay, “thủ phủ vàng đen” vòng xoáy nợ nần Nguyên nhân hàng loạt rẫy tiêu bị dịch bệnh chết cây, héo rũ phủ kín Diên tích hồ tiêu tăng nhanh, người nơng dân sản xuất hồ tiêu theo kiểu tận thu, áp dụng nhiều biện pháp canh tác đạt mục đích suất cao dẫn đến tình trạng bệnh hại nặng Chính vậy, đề tài “Nghiên cứu sử dụng chế phẩm vi sinh vật địa đối kháng với số nấm gây hại rễ hồ tiêu Đăk Lắk” sử dụng kỹ thuật metagenomics phân tích đầy đủ hơnvề tác nhân gây bệnh hồ tiêu ứng dụngsản xuất chế phẩm vi sinh từ vi sinh vật địa khu vực nghiên cứu đểphòng trừ nấm bệnh hại rễ, tăng suất, tạo sản phẩm sạch, an tồn, có tiêu chuẩn chất lượng đáp ứng nhu cầu nước xuất khẩu, qua góp phần phát triển kinh tế xã hội cách bền vững Mục tiêu nghiên cứu: - Xác định tác nhân gây bệnh hồ tiêu dựa vào sở liệu gene 18s RNA metagenome tách chiết từ đất hồ tiêu bị bệnh không bị bệnh - Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật địa có khả ức chế tác nhân gây bệnh hồ tiêu - Sản xuất 01 chế phẩm dựa vi sinh vật địa tuyển chọn có khả đối kháng với số bệnh hại rễ hồ tiêu xây dựng mơ hình thử nghiệm Nội dung luận án - Đánh giá quần thể eukaryote đất vùng rễ hồ tiêu khu vực bị bệnh không bị bệnh Đăk Lắk - Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật địa để phòng chống số tác nhân gây bệnh rễ hồ tiêu - Đánh giá khả phòng trừ bệnh hại rễ hồ tiêu Đăk Lắk chế phẩm vi sinh vật địa kháng nấm bệnh Những đóng góp luận án - Bằng kỹ thuật metagenomic đánh giá đa dạng vi nấm giới phụ Stramenopiles đất trồng vùng rễ hồ tiêu Đăk Lắk - Phân lập tuyển chọn số chủng vi sinh vật địa hữu ích kháng số nấm gây bệnh hồ tiêu - Đánh giá hiệu việc sử dụng chế phẩm Polyfa – TN3 hồ tiêu Cấu trúc luận án Luận án gồm 119 trang bao gồm: Mở đầu (3 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (26 trang); Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu (15 trang); Chương 3: Kết nghiên cứu (40 trang); Chương 4: Bàn luận (17 trang); Kết luận, kiến nghị (2 trang) Danh mục cơng trình cơng bố (1 trang).Tóm tắt luận án tiếng Anh (6 trang); Tài liệu tham khảo (28) có 193 tài liệu, có 47 tài liệu nước 146 tài liệu ngồi nước, có 40 tài liệu từ 2014 trở lại CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan hồ tiêu 1.Cây hồ tiêu 2.Tình hình sản xuất tiêu thụ hồ tiêu giới 3.Tình hình sản xuất tiêu thụ hồ tiêu Việt Nam 4.Một số bệnh hại hồ tiêu 5.Vi sinh vật đối kháng nấm bệnh hồ tiêu 1.2 Vai trò vi sinh vật đất trồng tiêu 1.3 Đánh giá khu hệ vi sinh vật kỹ thuật metagenomics 1.4 Tình hình ứng dụng chế phẩm vi sinh vật phòng trừ bệnh hồ tiêu CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Vật liệu phân tích metagenome đất vùng rễ hồ tiêu khu vực bị bệnh không bị bệnh Nguồn mẫu: mẫu đất thu thập từ vườn hồ tiêu bị vàng lá, thối rễ vườn không bị bệnh huyện Cư M’gar, tỉnh Đăk Lăk (tọa độ thu mẫu 12o49’48.9”N, 108o05’22.5”E) Các mẫu đất lấy độ sâu 5-30 cm, vườn lấy 10 điểm trộn chia phần theo đường chéo, chọn hai phần đối diện để lấy mẫu trung bình, lượng mẫu 1kg, cho mẫu đất vào túi polypropylen khử trùng ghi đầy đủ địa điểm, ngày, tên người lấy mẫu giữ oC, đem phòng thí nghiệm để tách chiết DNA tổng số bảo quản -20 oC cho nghiên cứu tiếp theo.Sử dụng túi polypropylen khử trùng, nhãn ghi chép bút; hộp giữ lạnh Vật liệu tách chiết DNA metagenome - Dung dịch Lysozyme (10% w/v); dung dịch RNase không chứa DNase (1% w/v); Proteinase K (1% w/v); dung dịch SDS (10% w/v); dung dịch Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) 10% w/v hoà 0,7 M NaCl; ChCl3 :Isoamyl alcohol; Isopropanol; Ethanol (70% v/v); đệm TE pH 8,0 - Tách chiết DNA metagenome Kit thương mại: Bộ KIT tách chiết DNA từ đất PowerMax® Catalog No.12988-10 cơng ty MO BIO Laboratories Xác định nồng độ DNA metagenome: QuantiT™ PicoGreen® Kit 2.1.2 Vật liệu tạo nguồn gene vi sinh vật phục vụ nghiên cứu - Các mẫu đất thu thập từ vùng trồng công nghiệp (hồ tiêu, cà phê, cao su) đất hoàn thổ sau khai thác bauxit Tây Nguyên - Các chủng vi sinh vật hữu ích lựa chọn sản xuất chế phẩm - Môi trường MPA (pH: 7.4); Môi trường Gauze II (pH: – 7.4); Mơi trường Czapek-Dox (pH : 7); hóa chất hệ thống lên men cần thiết (phụ lục III) 2.1.4 Vật liệu bố trí thí nghiệm xây dựng mơ hình sử dụng sản phẩm nghiên cứu đất trồng hồ tiêu Vật liệu nghiên cứu vườn hồ tiêu nằm vùng đất có dấu hiệu bị thối hoá đất, vườn bị sâu bệnh gây hại Các vườn hồ tiêu lựa chọn huyện Cư M’gar, Đắk Lắk Hồ tiêu 10 năm tuổi, giống tiêu Vĩnh Linh; mật độ 1.600 cây/ha Thời gian: Diện hẹp: từ tháng 3/2014 đến tháng 12/2014; Diện rộng từ tháng 11/2014 đến tháng 12/2015 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp phân tích metagenome đất vùng rễ hồ tiêu khu vực bị bệnh không bị bệnh Phương pháp tách chiết DNA tổng số hai mẫu đất lấy từ vườn tiêu bị bệnh không bị bệnh: nguyên lý tách DNA metagenomics gồm ba bước: (1) phá vỡ tế bào, (2) loại bỏ thành phần không mong muốn, (3) thu nhận DNA Sử dụng KIT tách chiết DNA metagenome từ đất PowerMax® - Catalog No.12988-10 công ty MO BIO Laboratories Phương pháp phân tích tin sinh học Cơ sở liệu 18S metagenome giải trình tự chiều (paired-end) thiết bị giải trình tự hệ Illumina HiSeq Dữ liệu thô lưu trữ dạng file fastq Chất lượng trình tự đánh giá phần mềm FastQC Hai file fastq ghép với phần mềm FLASH (Magoč, 2011) Các đoạn trình tự chất lượng bị loại bỏ phần mềm Qiime (Caporaso, Gregory cộng sự, 2010; Bokulich, Nicholas cộng sự, 2013) Dữ liệu sau tinh chia thành đơn vị phân loại OTUs phần mềm Upase Trong đó, đoạn trình tự giống ≥97% xếp vào OTU (Wang, Qiong cộng sự, 2007) Các OTUs giải phân loài thuật toán RDP classifier phiên 2.2, sở liệu SILVA (Quast, Pruesse cộng sự, 2013) Sắp xếp chuỗi thực phần mềm MUSCLE (Phiên 3.8.31) Chuẩn hóa liệu, thơng tin đa dạng OTUs chuẩn hóa theo tiêu chuẩn số thứ tự tương ứng với mẫu có trình tự 2.2.2 Phương pháp tạo nguồn gene vi sinh vật phục vụ nghiên cứu 2.2.2.1 Phương pháp phân lập Loại bỏ rác từ mẫu đất, sau nghiền nhỏ cối chày sứ (đã khử trùng) Hòa 10 g mẫu bình nón chứa 90ml nước cất vơ trùng, lắc máy lắc 200 vòng/phút 10-20 phút, lấy mL dung dịch sang ống nghiệm có mL nước vơ trùng tiếp tục pha lỗng tới 10 -3, 10-4, 10-5 Từ nồng độ pha lỗng cấy 100 µL vào đĩa petri chứa mơi trường phân lập thích hợp (MPA vi khuẩn, ISP4 xạ khuẩn, Czapek – Dok vi nấm), ủ 37 oC vi khuẩn, 30 oC xạ khuẩn 25-30 oC vi nấm Quan sát phát triển khuẩn lạc sau khoảng thời gian ni cấy thích hợp Mật độ vi sinh vật tổng số tính theo cơng thức sau: Trong đó: A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) mL mẫu; N: tổng số khuẩn lạc đếm đĩa chọn; ni: số lượng đĩa cấy độ pha loãng I; V: thể tích dịch mẫu (mL) cấy vào đĩa; fi: độ pha loãng tương ứng 4 Các khuẩn lạc mọc riêng rẽ làm giữ giống glyxerol lỏng (70 % giống + 30 % Glyxerol) -80 oC 2.2.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính đối kháng nấm bệnh vi sinh vật Các chủng vi khuẩn/xạ khuẩn nuôi môi trường dịch thể, lắc máy lắc 220 vòng/phút Sau 1-2 ngày, lọc lấy dịch trong, nhỏ vào lỗ thạch đục sẵn đĩa petri cấy vi sinh vật kiểm định Để tủ lạnh 30 phút cho chất khuếch tán vào thạch, sau ni 30 oC Sau 1-3 ngày, xác định vòng đối kháng HTKS = D-d (mm); D: Đường kính vòng kháng khuẩn; d: Đường kính lỗ 2.2.2.3 Phương pháp xác định khả ức chế nấm bệnh chủng nấm (Abdel-Motaal FF cộng sự, 2010) Hai khoanh nấm (nấm phân lập nấm bệnh) cấy đối xứng đĩa Petri bên cách tâm 3cm, nấm bệnh cấy trước ngày Đánh giá khả ức chế phát triển hệ sợ nấm(PIMG): Sau ngày ni cấy đối kháng trực tiếp, đo đường kính khuẩn lạc nấm bệnh đĩa có cấy chủng cho có hoạt tính đối kháng (R2) đường kính khuẩn lạc nấm bệnh đĩa đối chứng (R1) Phần trăm ức chế tính theo cơng thức: PIMG = (R1 –R2)/R1 ×100 R1, R2 - đường kính khuẩn lạc nấmbệnh; T- khuẩn lạc chủng nấm đối kháng Đánh giá mức độ đối kháng: (+++) Đối kháng mạnh: chủng nấm phân lập mọc trùm lên lấn át phát triển nấm bệnh, làm cho sợi nấm chết lụi dần; (++) Đối kháng trung bình: chủng nấm phân lập mọc trùm lên nấm bệnh sợi nấm bệnh không bị chết lụi; (+) Đối kháng yếu: chủng nấm phân lập lúc đầu phát triển mạnh, bị chậm lại không phủ lên nấm bệnh; (-) Không đối kháng: nấm bệnh phát triển mạnh phủ lên chủng nấm phân lập 2.2.2.4 Phương pháp tách chiết DNA tổng số Cặn tế bào sau ly tâm 10000 rpm phút hòa lại dung dịch đệm TE 10:1 (Tris HCl + EDTA), ly tâm tiếp 10000 rpm phút, loại bỏ dịch Bổ sung 400 μL TE, 20μL SDS 10 % μL proteaza K, đảo ủ 37 oC khoảng 1h để phá vỡ tế bào loại bỏ protein Bổ sung tiếp100 μL NaCl 5M, đảo đều, ủ 65 oC 10 phút Thu dịch, loại bỏ polysaccrit chất bẩn đáy Chiết DNA hai lần 500 μL dung dịch chloroform:isomylalcohol (24:1) Tủa DNA cách bổ sung NAOAc 3M, cồn 100 % giữ -20 oC tối thiểu 1h Ly tâm loại bỏ dịch nổi, rửa cặn DNA cồn 70 %, làm khơ DNA Hòa lại cặn đệm TE chứa RNAaza (100 µg/mL), ủ 37 oC 1h để loại RNA Nồng độ độ DNA xác định phổ hấp phụ máy quang phổ tử ngoại điện di gel agaroza 1% 2.2.2.5 Phương pháp PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRNA Bảng 2.1 Cặp mồi sử dụng cho PCR khuếch đại gen 16S rRNA vi khuẩn Mã hiệu 16SF 16SR Trình tự AGA GTT TGA TCA TGG CTC A AAG GAG GTG ATC CAG CC Tm(oC) 51 56 %GC 42 59 Cặp mồi sử dụng để khuếch đại gen 16S rRNA Streptomyces spp có trình tự: (St-F): 5´- AAGCCCTGGAAACGGGGT - 3´ (St-R): 5´- CGTGTGCAGCCCAAGACA - 3´) cho sản phẩm PCR ~ 1500 bp 5 Chu trình nhiệt PCR cho gen 16S rRNA vi khuẩn: 94 oC - phút; 30 chu kỳ (94 oC - phút; 56 oC - 50 giây; 72 oC - phút 30 giây); 72 oC - phút; kết thúc oC Chu trình nhiệt PCR cho gen 16S rRNA xạ khuẩn: 94 oC-5 phút; 35 chu kỳ (94oC - phút; 57oC - phút; 72oC - phút 30 giây); 72oC - 10 phút; kết thúc - 4oC Bảng 2.2 Thành phần PCR khuếch đại gen 16S rRNA Thành phần phản ứng H2O khử ion vô trùng Taq buffer (+ MgCl2) DNTP 16SF 16SR Taq-polymeraza DNA khuôn Nồng độ nMol 10 pMol/ µL 10 pMol/ µL U/ µL 50 ng/ µL Lượng (µl) 15,7 2,5 2,5 1,5 1,5 0,3 1,0 2.2.2.6 Phương pháp giải trình tự gen xây dựng phát sinh loài Sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rRNA sau tinh giải trình tự máy giải trình tự tự động ABI PRISM 3100 (Applied Bioscience) Xử lý trình tự nhận phần mềm Bioedit v.2.7.5 so sánh với sở liệu ngân hàng gen NBCI phần mềm BLASTn nhằm tìm chủng có độ tương đồng cao với chủng nghiên cứu Cây phát sinh loài chủng nghiên cứu xây dựng phần mềm DNASTAR Lasergene v.710 2.2.2.7 Phương pháp xác định đặc tính sinh hóa vi khuẩn - Phương pháp nhuộm gram: Chuẩn bị vết bôi, cố định tế bào, sau nhuộm dung dịch Tím kết tinh phút, thấm khô Nhuộm lại dung dịch Iod phút, thấm khô Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây, rửa nước, thấm khô Nhuộm bổ sung dung dịch Safranin - phút, rửa nước, để khơ khơng khí Soi kính: dùng vật kính dầu 100x - Xác định khả sử dụng đường - Xác định khả lên men – oxi hóa - Xác định khả phân giải tinh bột casein - Xác định khả phân giải gelatin - Xác định hoạt tính catalaza - Xác định khả sử dụng citrate 2.2.2.8 Xác định đặc tính sinh hóa xạ khuẩn - Khả sử dụng nguồn cacbon (đường - Sự hình thành sắc tố melanin - Khả sinh enzyme ngoại bào - Khả chịu muối 2.2.2.9 Xác định đặc tính sinh học nấm - Khả sử dụng nguồn cacbon nitơ - Xác định khả chịu muối nấm - Thử khả sinh enzyme cellulase, protease, amylase 2.2.2.10 Phương pháp đánh giá độc tính cấp chế phẩm vi sinh vật gốc Động vật thí nghiệm chuột nhắt trắng chủng Swiss, giống, khoẻ mạnh, trọng lượng 18 – 22 g Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp Chuột thí nghiệm ni phòng thí nghiệm, thực kỹ thuật cần đủ trước thử nghiệm với chế phẩm vi sinh vật gốc Xác định LD50 loại chế phẩm chuột nhắt trắng đường uống theo phương pháp Litchfield – Wilcoxon hướng dẫn WHO 2.2.3 Phương pháp nghiên cứu hồn thiện quy trình cơng nghệ lên men chủng vi sinh vật nghiên cứu - Thực hiên phương pháp lên men chìm quy mơ phòng thí nghiệm bình tam giác - Thực quy mơ pilot với hệ thống lên men thể tích 70 lít - Thực lên men xốp trùng (bề mặt) buồng lên men 3m3 - Thực phương pháp lên men không trùng buồng lên men 70 -100 m3 2.2.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm xây dựng mơ hình sử dụng sản phẩm nghiên cứu đất trồng hồ tiêu Phương pháp bố trí thí nghiệm (theo QCVN-01-172:2014/BNNPTNT) Đối với thí nghiệm diện hẹp: bố trí khối ngẫu nhiên đầy đủ lần lặp lại gồm công thức (CT), công thức 30 cây; lượng phân bón cơng thức sau tính cho 01 Lượng phân POLYFA-TN3 thí nghiệm áp dụng sở quy trình bón phân hữu cho hồ tiêu đặc tính phân POLYFA-TN3 với khả bổ sung dinh dưỡng khoáng số lượng VSV hữu ích Nền phân vơ đồng loạt cho tồn thí nghiệm (phân NPK 16:8:16) 1,0 tấn/ha Phân hữu có CT: CT1: (đối chứng) bón kg phân chuồng hoai mục CT2: bón 1,0 kg phân POLYFA-TN3 CT3: bón 1,5 kg phân POLYFA-TN3 CT4: bón 2,0 kg phân POLYFA-TN3 Lượng phân bón bón lần: tháng tháng Diện tích sở: 310 m2 tương đương với 60 cây, tổng diện tích thí nghiệm 3.500 m (bao gồm hàng cách ly bảo vệ) Giữa cơng thức thí nghiệm có hàng bảo vệ Hiệu lực phòng trừ tính theo cơng thức Henderson – Tilton Đối với thí nghiệm diện rộng: sử dụng CT: đ/c bón 2,0 kg/cây phân chuồng hoai mục 2,0 kg/cây phân POLYFA-TN3 phân vơ thí nghiệm diện hẹp; diện tích rộng 10.000 m 2; Các biện pháp kỹ thuật áp dụng Phân bón vơ chia làm lần/năm theo tỷ lệ: 40 % - 20 % - 20 % - 20 % vào tháng: tháng (mưa ổn định), tháng 7, tháng tháng 11 Cách bón phân (cả phân vơ lẫn phân hữu cơ) hồ tiêu: rạch hàng theo tán lá, sâu 6-8 cm, rải phân Tưới nước lần/trong mùa khô Các biện pháp làm cỏ, cắt tỉa cành, vét bồn, thu hoạch thủ công Tất biện pháp đồng cho công thức Các tiêu, phương pháp theo dõi số liệu Chỉ tiêu đánh giá (theo QCVN – 01 – 172:2014/BNNPTNT) Đánh giá số gié (chùm quả) cây; Yếu tố cấu thành suất tiêu: số gié/khung (khung 40x50cm); số quả/gié; Năng suất thực thu (tiêu tươi): dùng cân, cân suất thực thu nọc; đơn vị tính (kg); Điều tra bệnh lá: điểm điều tra trụ, trụ điều tra tầng tán (tầng gốc, tầng tầng ngọn), tầng điều tra hướng đơng, tây, nam, bắc; Tính tỷ lệ bệnh (%); Điều tra bệnh cành, thân Tính tỷ lệ (%) thân bị bệnh Điều tra định kỳ 30 ngày lần; Tần số bắt gặp: 1- 25 %: phổ biến (+); ≥ 25 – 50 %: Phổ biến (++); > 50 %: Rất phổ biến (+++) Hiệu lực phòng trừ tính theo cơng thức Henderson – Tilton: Ta x Cb Hiệu lực (%) = (1 - ) x 100 Ca x Tb Thu thấp số liệu diện rộng Chọn mẫu điểm cho trồng, mẫu điểm 50 cây, từ quy đổi cho 01 hecta - Chỉ tiêu suất bệnh hại: diện rộng lấy số liệu suất bệnh hại chính; chia lô lấy điểm với số 50 cây; quy đổi cho 01 hecta Ước tính hiệu kinh tế Lợi nhuận tăng thêm = tổng thu sản phẩm cơng thức thí nghiệm – (tổng thu phân chuồng + chi phí tăng thêm thí nghiệm) Tỷ suất lợi nhuận tăng thêm (VCR) = lợi nhuận tăng thêm/(tổng chi cơng thức thí nghiệm – tổng chi phân chuồng (Đ/C)) Tỷ suất lợi nhuận tăng thêm (VCR) tính: 2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu thu thập, tính tốn xử lý thống kê sinh học phần mềm Excel, IRISTAT 5.0 SAS 9.1 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Phân tích metagenome đất vùng rễ tiêu khu vực bị bệnh không bị bệnh 3.1.1 Tạo sở liệu 18S rRNA metagenome từ mẫu đất * Tách chiết DNA Mẫu đất vùng rễ vườn bị bệnh không bị bệnh từ vùng trồng hồ tiêu huyện Ea H’Leo tỉnh Đắk Lắk dùng để tách DNA metagenome DNA metagenome tách KIT tách chiết DNA từ đất PowerMax® - Catalog No.12988-10 cơng ty MO BIO Laboratories theo hướng dẫn sử dụng nhà cung cấp DNA sau tinh chạy điện di để kiểm tra chất lượng Kết cho thấy, băng DNA rõ nét, khơng bị đứt gãy (Hình 3.1) để sử dụng cho phân tích metagenome * Đọc trình tự gen 18S rRNA Gen 18S rRNA nhân lên cặp mồi EUK1A – 499R với khuôn ADN metagenome tách giải trình tự máy lllumina Hiseq Dữ liệu sau tinh chia thành OTUs phần mềm Upase 8 Hình 3.1 Kết điện di ADN tổng số tách chiết từ hai mẫu đất nghiên cứu Mẫu điện di với thể tích 5µl thời gian 30 phút điện 100V (D1: mẫu đất vườn hồ tiêu bị bệnh; D2: mẫu đất vườn hồ tiêu không bị bệnh) Giếng 1: ADN maker chuẩn Giếng D1, D2: ADN tách từ mẫu D1 D1 * Phân tích liệu Kết cho thấy mẫu D1 đất vườn tiêu bị bệnh, tổng số tag phân tích 121.432; số tag làm 105.323; số tag chưa phân loại 15.073, số tag có mẫu phân tích 1.036; số OTUs 1.574 Mẫu D2 đất vườn tiêu không bị bệnh, tổng số tag phân tích 103.827; số tag làm 97.102; số tag chưa phân loại 4.484, số tag có mẫu phân tích 2.241; số OTUs 1.318 Hình 3.2 Phân tích thống kê tag số lượng OTUs hai mẫu đất phân tích 3.1.2 Thành phần tỷ lệ eukaryote (sinh vật nhân chuẩn) hai mẫu đất trồng tiêu Dữ liệu trình tự 18S rRNA metagenome sau sử dụng phần mềm Mothur để phân tích, thành phần eukaryote có đất vườn tiêu bị bệnh gồm animalia (42 %), alveolta (18 %) vi nấm (9 %); Rhizaria (7 %), stramenopiles (6 %), tuyến trùng (2 %), amoebozoa(2 %) số giới, giới phụ khác chiếm tỷ lệ % Đất vườn tiêu không bị bệnh gồm animalia (63 %), alveolta (6 %), vi nấm (16%); Rhizaria (3 %), stramenopiles (6 %), tuyến trùng (4 %), amoebozoa(2 %) so với tổng số sinh vật có hai mẫu đất (Hình 3.3; Hình 3.4) Hình 3.3 Biểu đồ Krona biểu thị thành phần tỷ lệ giới sinh vật mẫu đất trồng hồ tiêu bị bệnh Tây nguyên (mẫu D1) Hình 3.4 Biểu đồ Krona biểu thị thành phần tỷ lệ giới sinh vật mẫu đất trồng hồ tiêu không bị bệnh Tây nguyên (mẫu D2) 10 3.1.3 Thành phần vi nấm đất trồng tiêu Trong nghiên cứu metagenome thường phân tích liệu 16S rRNA metagenome vi khuẩn 18S rRNA metagenome eukaryote (bao gồm animalia, stramenopiles, fungi, rhizari, amoebozoa,…) Với mục tiêu nghiên cứu vi sinh vật đối kháng với nấm bệnh hại tiêu nghiên cứu trước cho thấy tác nhân gây bệnh hồ tiêu chủ yếu vi nấm giới phụ stramenopiles vậy, chúng tơi tập trung đánh giá phân tích liệu 18S rRNA metagenome vi nấm stramenopiles đất vùng rễ trồng hồ tiêu.Thành phần vi nấm mẫu đất tiêu bị bệnh thuộc ngành: Ascomycota (34 %), Zygomycota (34 %), Basidiomycota (21 %), Zoopagomycota (8 %), Chytridiomycota (3 %) so với tổng số vi nấm mẫu đất vườn tiêu bị bệnh Trong mẫu đất hồ tiêu không bị bệnh, ngành Ascomycota (81 %); Basidiomycota (7 %), Chytridiomycota (1 %), Zygomycota (8 %), Zoopagomycota (3 %) so với tổng số vi nấm (Hình 3.5) Hình 3.5 Thành phần tỷ lệ ngành so với tổng số vi nấm mẫu đất vườn tiêu bị bệnh không bị bệnh So sánh thành phần tỷ lệ chi xuất hai mẫu đất cho thấy mẫu đất tiêu bị bệnh D1 có 27 chi mẫu đất tiêu khơng bị bệnh có 28 chi nấm xác định tên chi tập trung ngành Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, Zygomycota Ngành Zoopagomycota chi xác định tên hai mẫu đất Có chi xuất mẫu đất bị bệnh chi có mặt mẫu đất không bị bệnh Bảng 3.1 Thành phần tỷ lệ (%) chi nấm chiếm ưu so với Eukaryote tổng số hai mẫu đất vườn tiêu Tây Nguyên Ngành Ascomycota Basidiomycota TT Chi Đất bị bệnh Acrospermum Aspergillus Calcarisporiell a Chaetomella Cochliobolus Davidiella Exophiala Knufia Penicillium Jamesdicksonia Malassezia Phanerochaete Rhizoctonia Rhodotorula Schizophyllum Tapinella Trechispora Trichosporon 0,06 0,2 0,02 10 11 12 13 14 15 16 17 18 0,6 0,09 0,08 0,05 0,05 0,04 0,05 0,05 0,02 0,002 0,07 0,2 0,04 Đất không bị bệnh 0,02 0,8 0,05 0,2 0,3 0,1 0,004 0,004 0,05 0,02 0,4 0,01 0,01 0,03 0,02 0,008 0,01 11 Ngành Chytridiomycota Zygomycota TT Chi Đất bị bệnh 19 20 21 22 23 24 25 26 Blyttiomyces Rhizidium Rhizophydium Spizellomyces Absidia Allomyces Amylomyces Cunninghamell a Edogone Gongronella Lichtheimia Mortierella Physoderma Ramicandelabe r 0,05 0,004 0,02 0,03 0,006 0,006 27 28 29 30 31 32 0,006 0,004 0,001 0,04 Đất không bị bệnh 0,04 0,02 0,03 0,006 0,008 0,06 0,004 0,03 0,2 0,03 0,004 Số liệu bảng 3.1 cho thấy đa dạng thành phần tỷ lệ chi nấm Qua kết phân tích thấy rõ rằng, đất trồng hồ tiêu bị bệnh chi gây bệnh chiếm tỷ lệ cao nhiều so với đất trồng tiêu khơng bệnh chi Rhizoctonia, Rhizophydium Trong đó, đất tiêu không bị bệnh, tỷ lệ chi đối kháng tác nhân gây bệnh cao so với đất trồng tiêu bị bệnh Penicillium Có 40 lồi nấm có mặt hai mẫu đất, 14 lồi có mẫu đất bị bệnh 11 lồi có mặt mẫu đất trồng tiêu khơng bị bệnh Trong đó, loại định danh tên gồm 25 lồi nấm có mặt hai mẫu đất, lồi có mẫu đất bị bệnh lồi có mặt mẫu đất trồng tiêu không bị bệnh (Bảng 3.2) Bảng 3.2 Thành phần tỷ lệ (%) loài nấm so với Eukaryote tổng số hai mẫu đất vườn tiêu Tây Nguyên TT 10 11 12 13 14 15 16 Loài Talaromyces purpurogenus Aspergillus penicillioides Hamigera avellanea Knufia perforans Exophiala dermatitidis Cephaliophora tropica Calcarisporiella sp NBRC 105922 Mycosphaerella mycopappi Cochliobolus sativus Davidiella tassiana Chaetomella oblonga Trichosporon coremiiforme Phanerochaete chrysosporium Tapinella atrotomentosa Schizophyllum commune Sterigmatomyces halophilus Đất bị bệnh 0,000374067 0,0000591 0,0000197 0,000521725 0,000492194 0,000954856 0,000196878 0,000846573 0,000895793 0,000777666 0,005896482 0,000364223 0,000511882 0,001545489 0,000669384 0,000108283 Đất không bị bệnh 0,000521725 0,00000984 0,0000197 0,0000394 0,0000394 0,0000984 0,000502038 0,004823499 0,002687378 0,0009647 0,00157502 0,000118127 0,000118127 0,000226409 0,000492194 0,000452818 12 TT 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 Loài Spizellomycetes sp JEL355 Gongronellasp.w5 Physoderma maydis Conidiobolus firmipilleus Ramicande laber cf Longisporus Endogonelactiflua Mortierella wolfii Mortierella alpina Rhizidium endosporangiatum Yarrowia lipolytica Geastrumsaccatum Rhodotorula glutinis Rhizidiumendosporangiatum Hortaea werneckii Trechispora alnicola Sympodiomycopsispaphiopedili Asterotremellahumicola Amylomycesrouxii Đất bị bệnh 0,0000984 0,0000394 0,00000984 0,0000984 0,000315004 0,0000591 0,010916859 0,006300081 0,0000394 0,0000492 0,00000984 0,0000197 0,0000394 - Đất không bị bệnh 0,000157502 0,0000394 0,000295316 0,0000197 0,0000295 0,000561101 0,000590633 0,001643927 0,0000394 0,00000984 0,0000788 0,0000394 0,0000394 0,0000591 Như vậy, loài phổ biến bao gồm Mortierella wolfii (1,09 %), Mortierella alpina (0,66 %), Ramicandelabercf L KYK00166 (0,03 %), Tapinella atrotomentosa (0,15 %), Chaetomella oblonga (0,59 %), Cephaliophora tropica (0,095 %) mẫu đất bị bệnh Mortierella wolfii (0,06 %), Mortierella alpina (0,16 %), Ramicandelabercf L KYK00166 (0,002 %), Tapinella atrotomentosa (0,02 %), Chaetomella oblonga (0,16 %) Cephaliophora tropica (0,001 %) mẫu đất không bị bệnh Trong hai mẫu xuất chi nấm Mortierella thuộc họ Mortierellaceae với tỷ lệ cao, chi xuất phổ biến loại hình sinh thái đất, sống hoại sinh đất, thực vật mục nát vật liệu hữu khác 3.1.4 Thành phần loài phân loại giới phụ Stramenopiles có đất trồng tiêu Kết phân tích cho thấy, chi nấm gây bệnh trồng mẫu đất vườn tiêu bệnh cao so với vườn tiêu không bị bệnh Bảng 3.3 Thành phần tỷ lệ (%) chi Stramenopiles chiếm ưu so với Eukaryote tổng số hai mẫu đất vườn tiêu Tây Nguyên TT 10 11 Chi Amphora JBNA46 cafeteria Pythium Phytophthora Pytium Orchromonas Poterioochromonas Spumella Nitzschia Skeletonema Đất bị bệnh 0,08 0,4 0,5 0,05 0,008 0,004 0,5 0,5 0,2 0,1 Đất không bị bệnh 0,5 0,4 0,2 0,03 0,002 0,2 0,1 0,1 0,03 0,003 13 Các chi Pythium, Phytophthora, Pytium chi có nhiều lồi gây bệnh thực vật chiếm tỷ lệ %, 0,05 % 0,008 % đất tiêu bị bệnh Trong đó, đất khơng bị bệnh tỷ lệ thấp nhiều 0,2 %, 0,03 % 0,002 % Có 16 lồi định danh tên xuất trùng giới phụ Stramenopiles (năm1989, Stramenopiles Patterson đặt tên giới) Trong mẫu đất trồng tiêu bị bệnh Stramenopiles chiếm % so với Eukaryote tổng số; mẫu đất trồng tiêu không bị bệnh Stramenopiles chiếm % so với Eukaryote tổng số Kết Bảng 3.4 thể thành phần tỷ lệ loài thuộc giới phụ Stramenopiles xác định hai mẫu đất trồng tiêu Tây Nguyên Bảng 3.4 Thành phần tỷ lệ (%) loài thuộc giới phụ Stramenopiles xác định hai mẫu đất tiêu TT 10 11 12 13 14 15 16 Loài Cyclotella meneghiniana Cyclotella choctawhatcheeana Skeletonema subsalsum Ditylum brightwellii Phytophthora nicotianae Pythium splendens Pythium monospermum Poterioochromonas malhamensis Ochromonadaceae environmental sample Ochromonadaceae environmental sample Eustigmatos magnus Diplophrys sp ATCC 50360 Caecitellus parvulus Stramenopile sp MAST-12KKTS_D3 Adriamonas peritocrescens Oikomonas sp SA-2.1 [%]/Eukaryote tổng số D1 0,000656667 0,000656667 0,000328333 0,000328333 0,008531367 0,2415031 0,001313333 0,082196367 0,058407 0,042328667 0,000164 0,011648583 0,008859483 0,00082 0,00082 0,00344535 [%]/Eukaryote tổng số D2 0,000246 0,000738 0,028301 0,000246 0,007629 0,013781 0,000493 0,035684 0,022641 0,028547 0,000493 0,00566 0,008613 0,013535 0,015504 0,000246 3.1.4.1 Trong mẫu đất vườn tiêu bị bệnh Có 29 lồi xác định thuộc giới phụ Stramenopiles với 16 loài định danh tên trùng với loài thuộc giới phụ Stramenopiles mẫu đất vườn tiêu không bị bệnh Trong đó, lớp Diatomea Peronosporomycetes chiếm 49 % tổng số giới phụ Stramenopiles Lớp Diatomea chiếm 19 % giới tảo so với lớp khác Lớp Peronosporomycetes chiếm 30 % giới tảo so với lớp khác Trong lớp Peronosporomycetes, chi Pythium (84 %) lại chi Phytophthora (3 %) chi khác chưa xác định 12 % Trong chi Pythium lồi P.splendens (99,4 %) loài P monospermum (0,55 %) loài chưa xác định rõ tên chiếm 0,6 % So với tỷ lệ loài xuất giới phụ Stramenopiles, chi Pythium chiếm tỷ lệ cao cao với 25 % Bảng 3.5 Thành phần tỷ lệ (%) loài thuộc giới phụ Stramenopiles xác định có mẫu đất tiêu bị bệnh không bị bệnh 14 TT [%]/tổng số Eukaryote Trong mẫu đất tiêu bị bệnh Lithodesmium undulatum 0,00000984 Skeletonema menzellii 0,00000984 Amphora montana 0,000846573 Pelagomonas calceolata 0,0000591 Bicosoeca petiolata 0,000442974 Leukarachnion sp ATCC_PRA-24 0,000315004 Trong mẫu đất tiêu không bị bệnh Melosira varians 0,000265785 Oikomonas sp SA-2.1 0,00000984 Spumella like flagellate JBC27 0,000108283 Spumella like flagellate JBNZ43 0,0000788 Chrysophyceae sp CCMP2296 0,0000492 Loài [%]/Stramenopiles tổng số 0,000164 0,000164 0,01410955 0,000985 0,0073829 0,005250067 0,006644625 0,000246 0,002707075 0,00197 0,00123 3.1.4.2 Trong mẫu đất vườn tiêu khơng bị bệnh Có lồi Stramenopiles xác định tên diện mẫu đất vườn tiêu bị bệnh, loài Stramenopiles diện mẫu đất vườn tiêu bị bệnh trình bày Bảng 3.5 Trong đó, lớp Diatomea Peronosporomycetes chiếm 24% tổng số giới phụ Stramenopiles Lớp Diatomea chiếm 13 % giới tảo so với lớp khác Lớp Peronosporomycetes chiếm 11 % giới tảo so với lớp khác Trong lớp Peronosporomycetes, chi Pythium chiếm tỷ lệ 43 % lại chi Phytophthora có loài Phytophthora nicotianae %, chi Aphanomyces % chi khác chưa xác định 47 % So với đất vườn tiêu bị bệnh, chi Pythium % đó, hai lồi P splendens P monospermum nhiều, 1,48 % 0,05 % so với Stramenopiles tổng số 3.1.5 Một số nấm bệnh nấm đối kháng với nấm gây bệnh hồ tiêu hai mẫu đất nghiên cứu 3.1.5.1 Một số nấm gây bệnh hồ tiêu chiếm ưu hai mẫu đất nghiên cứu Kết liệu phân tích metagenome hai mẫu đất cho thấy, tác nhân gây bệnh hồ tiêu phổ biến bao gồm loài thuộc chi Pytium, Pythium Phytophthora Rhizoctonia Kết thể Hình 3.6 Chi Rhizoctonia thuộc lớp Agaricomycetes, ngành Basidiomycota, giới nấm mẫu đất bị bệnh chiếm 0,02 % so với Eukaryote tổng số đất bị bệnh Trong lúc đó, chi Rhizoctonia chiếm 0,01 % so với Eukaryote tổng số mẫu đất không bị bệnh Trong mẫu đất trồng tiêu bị bệnh, chi Phytophthora thuộc phân lớp Oomycota, lớp Peronosporomycetes, giới phụ Stramenopiles chiếm % so với chi thuộc lớp Peronosporomycetes; chiếm 0,05 % so với tổng số Eukaryote Trong mẫu đất trồng tiêu không bị bệnh, chi Phytophthora chiếm % so với chi thuộc lớp Peronosporomycetes; chiếm 0,03 % so với tổng số Eukaryote Cả hai mẫu đất xuất đối tượng gây bệnh thuộc chi Pythium, Pytium, Rhizoctonia Phytophthora Trong đó, tỷ lệ chi gây bệnh thực vật đất bị bệnh cao so với đất không bị bệnh, chi Rhizoctonia Phytophthora mẫu đất bị bệnh cao 15 không chênh lệch so với tỷ lệ hai chi mẫu đất không bị bệnh Trong lớp Peronosporomycetes, chi Pytium xuất với tỷ lệ thấp 0,008 % đất tiêu bị bệnh 0,002 % đất tiêu không bị bệnh Đáng quan tâm chi Pythium, tỷ lệ chi diện đất trồng tiêu bị bệnh cao vượt trội so với mẫu đất vườn tiêu không bị bệnh Chi Pythium chiếm 25 % mẫu đất vườn tiêu bị bệnh % mẫu đất vườn tiêu không bị bệnh Hình 3.6 Thành phần tỷ lệ số chi nấm bệnh hồ tiêu phổ biến hai mẫu đất nghiên cứu Mặc dù hai mẫu đất có diện tác nhân gây bệnh mẫu đất bị bệnh, tỷ lệ tác nhân gây bệnh xuất cao vượt ngưỡng gây bệnh nên xuất triệu chứng bệnh vườn hồ tiêu bị bệnh Ngược lại, đất hồ tiêu khỏe, có xuất chi gây bệnh tỷ lệ không vượt ngưỡng gây bệnh nên vườn không xuất triệu chứng hồ tiêu bị bệnh 3.1.5.2 Chi nấm đối kháng nấm bệnh hại hồ tiêu xuất hai mẫu đất nghiên cứu Dữ liệu phân tích cho thấy, hai mẫu đất phân tích xuất chi Penicillium có khả đối kháng với đối tượng gây bệnh thực vật Chi Penicillium thuộc họ Trichocomaceae, Eurotiomycetes, ngành Ascomycota Mẫu đất vườn tiêu bị bệnh, chiếm 0,4 % so với Eukaryote tổng số Mẫu đất vườn tiêu không bị bệnh, chi Penicillium chiếm đến % so với Eukaryote tổng số Nghiên cứu lựa chọn Penicilium oxalicum – phân lập từ mẫu đất trồng hồ tiêu Tây Nguyên, thuộc chi nấm Penicilium để đưa vào vi sinh vật sử dụng để sản xuất chế phẩm vi sinh vật tăng khả kháng nấm bệnh hồ tiêu 3.2 Tạo nguồn gene vi sinh vật phục vụ nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật 3.2.1 Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật đối kháng từ vùng sinh thái Tây Nguyên 16 Qua phân lập, thử hoạt tính đối kháng, bốn chủng vi khuẩn (CM4.10crk, CM5.5crk, CS1.5 trk CM5crk), chủng xạ khuẩn (CS2.6trk, CM5.11cdk) có hoạt tính đối kháng loài nấm gây bệnh F.oxysporium, Rh.solani P splendens tuyển chọn 3.2.2 Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử định danh chủng vi sinh vật có hoạt tính cao tuyển chọn làm chế phẩm vi sinh vật 3.2.2.1 Định danh vi sinh vật kháng nấm gây bệnh thối rễ vàng tiêu Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử định danh chủng vi sinh vật có hoạt tính cao tuyển chọn làm chế phẩm vi sinh vật Chúng định danh vi khuẩn CM4.10 crk tương đồng với Pseudomonas fulva 2-5 (Acc No EU594555.1); chủng xạ khuẩn CS2.6trk tương đồng 99% với trình tự chủng Streptomyces sp YIM30823 (Acc.NoAY237555.1); chủng xạ khuẩn CM5.11cđk có trình tự gen 16S tương đồng 99% với trình tự chủng Streptomyces diastatochromogenes (Acc NoAB026218.1) Chủng CS1.5trk có trình tự 16S rRNA tương đồng 99 % với với chủng Enterobacter ludwigii PUFSTb09(Acc No KR476387.1), trình tự gen 16S chủng CM5.5crk tương đồng 99 % với trình tự chủng Kosakonia cowanii G5C (Acc No KM041130.1), trình tự gen 16S chủng CM5crk tương đồng 99% với trình tự gen 16S chủng Bacillus subtilis NB-12 (Acc No HQ222831.1) Riêng chủng vi nấm N1CS1trk có hoạt tính đối kháng định danh dựa khóa phân loại Gevens, Barnet et Hunter (1973); Booth (1971); Domsch, Gams (1980); Raper Thom (1968), Raper Fennell (1965) đặc điểm hình thái Các đặc điểm hình thái tương đồng với đặc điểm Penicillium oxalicum (a) (b) (c) Hình 3.10 Hình ảnh chủng N1CS1trk: (a) khuẩn lạc môi trường Czapek-Dox 20 oC/ 48 giờ; (b, c) quan sinh bào tử bào tử kính hiểu vi 40X 3.2.2.2 Phân tích đặc tính sinh học kết hợp phân loại theo khóa phân loại truyền thống chủng vi sinh vật lựa chọn làm chế phẩm Để nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất phân bón hữu đa chức ứng dụng cho vùng Tây Nguyên, tuyển chọn chủng vi sinh vật đối kháng nguồn bệnh, chủng vi sinh vật có hoạt tính sinh học khác Cụ thể, dựa vào hoạt tính sinh học chủng vi sinh vật tuyển chọn nhận dạng chủng phân tích gen 16S rRNA, chọn chủng để sử dụng làm chế phẩm vi sinh vật gốc để cung cấp sản xuất phân bón hữu Polyfa TN3 (Bảng 3.9) Bảng 3.9 Hoạt tính sinh học chủng sử dụng sản xuất chế phẩm ST Chủng Tên khoa học Hoạt tính sinh học 17 T BX-F9 Bacillus megaterium Sinh chất kết tụ sinh học, chịu Fe,Al TIVP18 Bacillus subtilis CF-vp17 CM5crk CFB3 Ti6 CM5.11cdk N1CS1trk TiN1 Bacillus megaterium Bacillus subtilis Bacillus megaterium Bacillus flexus Streptomyces diastatochromogenes Penicilium oxalicum Penicilium oxalicum Phân giải P, kháng nấm, sinh chất kết tụ sinh học, chịu Fe, Al Phân giải P, kháng nấm, chịu Fe, Al Kháng nấm, chịu Fe, Al Sinh IAA, cố định N, chịu Fe, Al Phân giải thuốc BVTV, chịu Fe, Al Kháng nấm, chịu Fe,Al Kháng nấm, chịu Fe,Al Phân giải P, chịu Fe,Al Chín chủng vi sinh vật lựa chọn để sản xuất chế phẩm gốc có chủng có khả đối kháng nấm bệnh vi khuẩn Bacillus subtilis; xạ khuẩn Streptomyces diastatochromogenes vi nấm Penicilium oxalicum Đặc tính sinh học chủng vi khuẩn CM5crk Kết nghiên cứu cho thấy chủng Bacillussubtilis mang hầu hết tính chất vi khuẩn chi Bacillus Đặc tính sinh học chủng xạ khuẩn CM5.11 cdk Chủng xạ khuẩn chọn để sử dụng sản xuất chế phẩm định danh đến loài Streptomyces diastatomonogenes Một số đặc điểm hình thái sinh hóa chủng xạ khuẩn tiến hành nghiên cứu Kết nhận cho thấy chủng xạ khuẩn CM5.11 cdk sau 14 ngày môi trường ISP-6 nhiệt độ 30 oC làm cho màu môi trường chuyển từ vàng nhạt sang nâu đậm, điều chứng tỏ chủng CM5.11cdk có khả hình thành sắc tố melanin mơi trường có chứa sắt Ngồi ra, đặc điểm hình thái sinh hóa cho thấy chủng CM5.11cdk mang nhiều đặc tính lồi Streptomyces diastatomonogenes Đặc điểm hình thái sinh hóa chủng vi nấm N1CS1trk Đặc điểm hình thái sinh hóa chủng vi nấm N 1CS1trk nghiên cứu Dựa vào phân loại theo hình thái, chủng vi nấm thuộc chi Penicilium, đặc điểm hình thái sinh hóa khẳng định định danh 3.2.2.3 Đánh giá khả đối kháng chủng vi sinh vật lựa chọn làm chế phẩm Đã đánh giá khả đối kháng lẫn chủng vi sinh vật chọn để sản xuất chế phẩm phương pháp cấy vng góc mơi trường MPA Kết cho thấy chủng vi sinh vật có khả kháng nấm bệnh chủng vi sinh vật hữu ích khác phát triển đồng thời không đối kháng lẫn môi trường MPA (Bảng 3.10 Hình 3.8) Bảng 3.10 Xác định tính đối kháng chủng vi sinh vật tuyển chọn Tên chủng TI6 TIVP18 CM5crk CF-VP17 TIVP18 CM5crk – – – – – – CFVP17 – – – CFB3 – – – – BXF9 – – – – CM5.11 cdk – – – – N1CS1 trk – – – – 18 Tên chủng CFB3 BX-F9 CM5.11 cdk N1CS1trk TiN1 TIVP18 CM5crk – – – – – – – – – – CFVP17 – – – – – CFB3 – – – – BXF9 – – – – CM5.11 cdk – – – – N1CS1 trk – – – – Hình 3.8 Khả đối kháng chủng vi khuẩn lựa chọn làm chế phẩm 3.3 Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật gốc Luận án thực nghiên cứu đầy đủ đưa tất thông số kỹ thuật cần thiết để hồn thiện quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật gốc Các thơng số cơng nghệ lên men chìm quy mơ phòng thí nghiệm thích hợp bao gồm: nhiệt độ, pH tốc độ lắc thích hợp để lên men chìm chủng vi khuẩn Bacillus CM5crk 35 oC – 37 o C ; pH 7, lắc 175-200 vòng/phút Xác định nhiệt độ, pH tốc độ lắc thích hợp để lên men chìm chủng vi nấm tuyển chọn sau: nhiệt độ 25 oC – 30 oC, pH 6-7, tốc độ lắc 175200 vòng/phút, thời gian nuôi cấy 72-96 Đã xác định nhiệt độ pH thích hợp để lên men chìm chủng xạ khuẩn CM5.11cdk 30 oC, pH 7, tốc độ lắc 175-200 vòng/phút, thời gian ni cấy 48 ± Trên sở này, tiếp tục nghiên cứu cho kết thơng số cơng nghệ lên men chìm quy mơ pilot với thiết bị lên men 70 lít/mẻ thích hợp Từ kết nghiên cứu xác định điều kiện thích hợp cho trình lên men xốp chủng vi sinh vật lựa chọn làm chế phẩm: nhiệt độ lên men xốp thích hợp cho chủng vi khuẩn Bacillus CM5crk 37 oC; cho nấm P.oxalicum N1CS1trk/N1EH3td, xạ khuẩn S.diastatochromogenes CM5.11cdk 30 oC, pH thích hợp cho chủng vi khuẩn xạ khuẩn tuyển chọn 6,8-7,0; cho chủng vi nấm 6,5-7,0 Độ ẩm thích hợp cho trình lên men xốp chủng vi khuẩn nghiên cứu 40 % - 50 % cho chủng vi nấm, xạ khuẩn 50-60 % 3.3.1 Xác định thời gian bảo quản Các chủng vi sinh vật có hoạt tính sinh học tuyển chọn lên men rắn riêng rẽ điều kiện thích hợp Sau lên men, sản phẩm làm khô 50 oC để ẩm độ khoảng 12-14 %, sau phối trộn với theo tỷ lệ 1:1, đóng gói bao kẽm có trọng lượng 500 g, bảo quản điều kiện tự nhiên khơ ráo, thống, nhiệt độ mơi trường khơng khí khoảng 18 oC mùa đơng 35 oC mùa hè Sau khoảng thời gian định, chế phẩm kiểm tra mật độ vi sinh vật hoạt tính Tỷ lệ sống sót vi khuẩn xác định cách cấy trải môi trường MPA (đối với chủng thuộc chi Bacillus), môi trường ISP4 (cho xạ khuẩn) CzapekDox (cho vi nấm) 19 Bảng 3.11 Mật độ chủng vi sinh vật theo thời gian bảo quản (CFU/g) Chủng vi sinh vật Bacillus spp CM5.11cdk N1CS1trk 2,9x109 2,0x109 2,7x109 Thời gian bảo quản (tháng) 1,7x109 1,3x109 1,7x109 1,3x109 4,7x108 1,0x109 5,4x108 1,4x108 5,4x108 10 1,5x108 4,7x108 2,7x108 12 3,4x107 1,2x106 4,3x106 1,3x106 4,0x107 1,7x106 Kết nhận cho thấy, tỷ lệ sống sót chủng vi sinh vật nghiên cứu giảm dần theo thời gian Tuy nhiên, sau tháng bảo quản túi kẽm, mật độ chúng đạt 1,45,4x108 CFU/g sau 12 tháng, mật độ chúng giảm xuống 10 CFU/g Thí nghiệm nhắc lại lần Kết thể Bảng 3.12 Bảng 3.12 Hoạt tính sinh học chế phẩm vi sinh vật theo thời gian bảo quản Thời gian Kháng (tháng) P.splendens 10 12 (D-d) mm 24,0 ± 0,2 21,0 ± 0,3 19,4 ± 0,3 17,6 ± 0,3 16,1 ± 0,1 13,2 ± 0,3 10,8± 0,2 Kháng F Kháng oxysporum Rh.solani (D-d) mm (D-d) mm 23,0 ± 0,3 20,0 ± 0,2 18,5 ± 0,4 17,0 ± 0,3 15,3 ± 0,3 12,2 ± 0,2 10,4 ± 0,4 21,0 ± 0,5 19,5 ± 0,3 17,7 ± 0,3 16,0 ± 0,2 14,5 ± 0,1 11,0 ± 0,2 10,0 ± 0,3 Vòng S/trưởng p/giải P MT khó tan có muối (D-d)mm 12,0 ± 0,4 11,5 ± 0,3 10,7 ± 0,3 10,2 ± 0,5 9,4 ± 0,2 8,6 ± 0,2 7,2 ± 0,3 Fe +++ +++ ++ ++ ++ + + S/trưởng MT có muối Al +++ +++ ++ ++ ++ + + Sau tháng bảo quản, chế phẩm VSV giữ hoạt tính đối kháng hai chủng nấm gây bệnh F.oxysporum, Rh.solani P spledens tốt, với vòng đối kháng lớn 10 mm Khuyến cáo sử dụng chế phẩm vi sinh: bảo quản 12 tháng nhiệt độ phòng túi kẽm, mật độ VSV đạt 106-107 CFU/g 3.3.2 Đánh giá độ an toàn sản phẩm Kết theo dõi trọng lượng chuột Theo dõi trọng lượng chuột sau ngày uống dịch chế phẩm POLYFA-TN3 Sau ngày, trọng lượng chuột tất liều thử nghiệm đối chứng tăng tương tự Do vậy, chế phẩm không gây ảnh hưởng đến phát triển trọng lượng chuột thử nghiệm Theo dõi tiêu thụ thức ăn chuột Chuột nhóm đối chứng hoạt động ăn uống bình thường, chuột nhóm sử dụng chế phẩm với liều lượng khác khơng nhận thấy dấu hiệu khác thường so với nhóm đối chúng thời gian thử nghiệm Quan sát dấu hiệu ngộ độc Chuột sử dụng chế phẩm mức liều khác khơng có biểu khác thường Khả ăn uống, hoạt động tăng trọng chuột thí nghiệm sử dụng chế phẩm khơng khác so với nhóm chuột đối chứng Khơng xác định liều gây chết 50 % động vật thí nghiệm (LD50) 20 Như kết thử nghiệm độ an toàn chế phẩm cho thấy chế phẩm vi sinh vật gốc khơng gây ngộ độc sử dụng thực tiễn 3.4 Đánh giá khả phòng trừ bệnh hại tiêu vùng Tây Nguyên chế phẩm vi sinh vật địa Mơ hình ứng dụng bón phân đa chức Polyfa TN3 sản xuất từ chế phẩm vi sinh vật gốc gồm chủng vi sinh vật tuyển chọn 3.4.1 Hiệu phân POLYFA-TN3 hồ tiêu 3.4.1.1 Đánh giá khả kháng bệnh vàng lá, thối rễ hồ tiêu diện hẹp Thí nghiệm thực vườn hồ tiêu huyện Cư M’gar, tỉnh Đăk Lăk Các công thức sử dụng cho khảo nghiệm Bảng 3.13 Sau thời gian bón chế phẩm tháng tỷ lệ số bệnh hại hồ tiêu ghi nhận sau: Bảng 3.13 Tỷ lệ bệnh chủ yếu vườn hồ tiêu thời gian thí nghiệm (%) Bệnh chết Bệnh vàng Bệnh thán thư nhanh CT1-ti (Đ/C) 1,86a ± 0,03 9,50a± 0,15 17,13a± 0,55 a a CT2-ti (1kg/trụ POLYFA-TN3) 1,78 ± 0,04 8,20 ± 0,17 14,67a± 0,60 CT3-ti (1,5kg/trụ POLYFA-TN3) 1,02 ab±0,03 6,58ab± 0,09 10,20ab± 1,02 b b CT4-ti (2,0kg/trụ POLYFA-TN3) 0,50 ± 0,03 3,60 ± 0,12 7,53b± 0,12 CV% 7,4 8,2 9,1 LSD0.05 0,86 3,02 8,54 Các giá trị ký hiệu chữ giống khác giá trị khơng có ý nghĩa thống kế (P